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Cincia Rural, Santa Maria, v.40, n.12, p.2521-2526, dez, 2010 de armazenagem sobre os parmetros hematolgicos.

Concentrao de anticoagulante, tempo e temperatura

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ISSN 0103-8478

Concentrao de anticoagulante, tempo e temperatura de armazenagem sobre os parmetros hematolgicos no hemograma automatizado

Anticoagulant concentration, time and storage temperature on hematological parameters in automated blood count

Acio Carlos de OliveiraI* Jos Dantas Ribeiro FilhoI Jos Domingos GuimaresI Andr Ricardo e SilvaI Waleska de Melo Ferreira DantasI Laila de Paula BonfI Sheila Kreutzfeld de FariasI

RESUMO O estudo teve como objetivo identificar os efeitos do tempo de estocagem, da temperatura de armazenamento e da quantidade de anticoagulante sobre parmetros hematolgicos de ces. Foram utilizadas amostras do sangue de dez ces de raas variadas, clinicamente hgidos. As alquotas foram colhidas com 1,8mg; 3,6mg; 7,2mg e 14,4mg de cido etilenodiaminotetractico (EDTA) por mL de sangue, distribudas em dois grupos: de 2C a 8C e temperatura ambiente. Aps a coleta, foram avaliadas em quatro tempos: 0, 12, 24 e 48 horas. Usando um contador automtico de clulas, foram avaliados leuccitos, eritrcitos, hemoglobina, hematcrito, volume corpuscular mdio (VCM), ndice de anisocitose eritrocitria (RDW), plaquetas e plaquetcrito (PCT). O valor do VCM diminuiu nas maiores concentraes de EDTA (7,2mg mL -1 e 14,4mg mL -1 ), com decrscimo de 2,36% na maior concentrao. A temperatura e o tempo de armazenagem tambm ocasionaram alterao nesse parmetro, ou seja, houve decrscimo no tempo 12 horas temperatura de 2 a 8C e aumento nos tempos 24 e 48 horas temperatura ambiente (P<0,05). A temperatura de conservao influenciou discretamente a contagem de leuccitos e eritrcitos, que apresentaram valores menores na temperatura ambiente. Hemoglobina, hematcrito, plaquetas e PCT no apresentaram alterao significativa. As alteraes observadas no comprometeram os resultados obtidos no contador automtico, mostrando que as amostras sanguneas, conservadas por 48 horas, mantiveram-se em boas condies para anlise, principalmente quando armazenadas temperatura de 2 a 8C. Palavras-chave: co, hemograma, temperatura. EDTA, tempo,

hematological parameters of dogs. Blood samples of ten, clinically healthy dogs, of different breeds were utilized. Aliquots were stored with 1.8mg, 3.6mg, 7.2mg and 14.4mg of ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) per mL of blood, divided into two groups: 2C to 8C and room temperature. Right after collection, they were evaluated in four times: 0h, 12h, 24h and 48h. White blood cells, red blood cells, hemoglobin, packed cell volume (PCV), mean corpuscular volume (MCV), red cell distribution width (RDW), platelet and thrombocrit (PCT) were evaluated in the automatic cell counter. In the automatic cell counter analysis, the MCV increased significantly with higher concentrations of EDTA (7.2mg mL -1 and 14.4mg mL -1 ) peaking at 2.36%, in the highest concentration. Temperature and time also influenced the MCV, which showed a decrease in time 12 under temperature of 2C to 8C and an increase in time 24 and 48 at room temperature. Storage temperature influenced leukocytes and erythrocytes counts, which showed lower values at room temperature. Hemoglobin, PCV, platelet and PCT did not change significantly. The changes observed did not compromise the results obtained by automatic cell counter, showing that blood samples stored for two days remained in good condition for processing, especially when stored under refrigeration. Key words : dog, hemogram, EDTA, time, temperature.

INTRODUO So vrios os fatores que contribuem para a m qualidade das amostras hematolgicas, dentre eles a pouca quantidade de sangue nos tubos de coleta, levando distoro da relao sangue/anticoagulante. Como existe uma relao ideal sangue anticoagulante, e os tubos so padronizados com uma quantidade fixa

ABSTRACT The study aimed to identify the effects of time, temperature of storage and excess of anticoagulant on
I

Departamento de Veterinria, Universidade Federal de Viosa (UFV), Avenida P.H. Holfs s/n , 36570-000, Viosa, MG, Brasil. E-mail: aecio@ufv.br. *Autor para correspondncia.
Recebido para publicao 22.02.10 Aprovado em 15.10.10 Devolvido pelo autor 20.11.10 CR- 3182

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de EDTA, percebe-se que, muitas vezes, hemogramas so realizados com amostras obtidas de maneira inadequada, ou seja, com excesso de anticoagulante. Tambm se observam, com frequncia, amostras velhas coletadas em finais de semana, em outras localidades ou a campo, durante aulas prticas, realizadas em locais e horrios que no permitem o envio e o processamento delas no mesmo dia. Estas alquotas muitas vezes so conservadas sob temperatura ambiente, por grandes perodos de tempo, o que pode comprometer a qualidade do resultado dos hemogramas. De uso de rotina como anticoagulante de amostras sanguneas, o cido etilenodiaminotetractico (EDTA) em excesso pode ocasionar diminuio do hematcrito e do volume corpuscular mdio (VCM), alm de aumentar a concentrao de hemoglobina corpuscular mdia (CHCM) sem interferir no resultado da concentrao de hemoglobina (DOYLE et al., 1967; PENNY et al ., 1970). Em amostras de sangue conservadas sob refrigerao por 24 horas, no h alterao nos valores do hematcrito, da hemoglobina e na contagem de clulas (SCHALM et al., 1986; MORRIS & DAVEY, 2008). O acondicionamento de um dia para outro, temperatura ambiente, leva a um pequeno aumento do VCM, o que no significante, pois permanece similar ao VCM do sangue acondicionado em geladeira (LAWRENCE et al., 1975). Segundo MORRIS & DAVEY (2008), em amostras com excesso de EDTA, o valor do hematcrito estar falsamente diminudo, devido contrao celular, mas a hemoglobina e as contagens celulares no estaro alteradas. Segundo WEISER (2007), no sangue mantido em temperatura ambiente, o aumento do volume dos eritrcitos entre 6 e 24 horas aumenta o hematcrito e o VCM (MORRIS & DAVEY, 2008). Em estudo experimental com ces saudveis e doentes, MEDAILLE et al. (2006), analisando amostras logo aps a coleta, com 24 e 48 horas de conservao, observaram que todas as variveis apresentaram diferena significativa, mas poucos resultados foram considerados inadequados, visto que as alteraes foram pouco expressivas. Os referidos autores reforaram a necessidade de se conhecer as variaes provocadas pela ao do tempo sobre as amostras, para que no ocorram equvocos na interpretao dos resultados, principalmente daqueles que se encontram em condies limtrofes.

ROCHA et al. (2001), avaliando sangue humano, concluram que no foram significativas as diferenas entre os resultados obtidos em diversos tempos de anlise (0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 e 24 horas), aps a colheita, nos valores de leuccitos, hemcias, hemoglobina, hematcrito, VCM, MCH, CHCM, RDW, plaquetas, volume plaquetrio mdio, neutrfilos, linfcitos, eosinfilos e basfilos. Em outro trabalho, LIPPI et al. (2005), analisando amostras de sangue de ciclistas, duas e 24 horas aps a coleta, conservadas a 4C, detectaram aumentos significativos nos seguintes parmetros: hematcrito, VCM, porcentagem de macrcitos, plaquetas e volume plaquetrio mdio (VPM). As variaes ocorridas foram modestas e ficaram, quase sempre, dentro dos valores clinicamente aceitveis. Em estudo realizado com ces da raa beagle, utilizando duas concentraes de EDTA: 1,8mg mL-1 de sangue e 5,4mg mL-1 de sangue, os resultados mostraram diminuio do hematcrito e do VCM e aumento no CHCM (NEMEC et al., 2005). O presente estudo teve como objetivo identificar os efeitos do tempo, da temperatura de armazenamento e do excesso de anticoagulante sobre parmetros hematolgicos de ces obtidos por automao. importante lembrar que, independente do tempo de estocagem da amostra, indispensvel que o esfregao sanguneo seja confeccionado no momento da coleta, preservando assim a morfologia dos leuccitos. MATERIAL E MTODOS Foram utilizados dez ces adultos (seis machos e quatro fmeas) de peso corporal, idade e raas variadas. Aps anti-sepsia, as amostras foram colhidas por venipuno da jugular, onde foi introduzido um cateter, acopladas as seringas e aspirado o sangue, que foi distribudo em 28 tubos plsticosa, totalizando 32 amostras para anlise (tempo 0 igual para temperatura ambiente e 2C a 8C), marcados com pincel, indicando o volume correto a ser coletado. As amostras sanguneas foram separadas em dois grupos: Grupo 1: amostras em temperatura ambiente e Grupo 2: amostras mantidas entre 2C a 8C. Em ambos os grupos, as alquotas de 0,25; 0,5; 1,0; e 2,0mL de sangue foram colhidas em tubos com 3,6mg de EDTA, proporcionando as seguintes concentraes de EDTA: 14,4; 7,2; 3,6 e 1,8mg mL-1 de sangue. As amostras foram avaliadas em quatro tempos: 0, 12, 24 e Cincia Rural, v.40, n.12, dez, 2010.

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48 horas aps a coleta. Cada tubo foi aberto e manipulado uma nica vez, no tempo da respectiva anlise. A temperatura do refrigerador foi monitorada com termmetro de mxima e mnima, permanecendo na faixa citada. A temperatura ambiente oscilou entre 22C e 30C. As amostras sanguneas foram analisadas com contador hematolgico automtico b, para a mensurao dos seguintes parmetros: leuccitos L-1, hemcias L-1, hemoglobina (g dL-1), hematcrito (%), volume corpuscular mdio (fL), ndice de anisocitose eritrocitria (RDW), plaquetas L-1 e plaquetcrito (%). Os dados foram arranjados em um esquema fatorial. Para proceder anlise dos dados, foram realizadas a anlise de varincia (ANOVA) e as mdias comparadas pelo teste de Tukey, com 5% de probabilidade. Foram verificadas as interaes entre tempo, temperatura de estocagem e concentrao de EDTA. Os dados so apresentados em anlise descritiva (mdias e desvios-padro). RESULTADOS E DISCUSSO Na avaliao de eritrcitos e VCM, a temperatura de conservao influenciou o resultado da contagem de eritrcitos com mdia 6,761,13 sob refrigerao e 6,441,14 em temperatura ambiente. Esse decrscimo provavelmente foi devido lise das hemcias durante o perodo de conservao, considerando-se o aumento da temperatura das amostras como provvel fator determinante da fragilidade eritrocitria. Entretanto, outros estudos em condies semelhantes (COHLE et al., 1981; HIRASE et al., 1992; FREISE et al., 2008), analisando sangue humano, no evidenciaram diferena significativa no nmero de eritrcitos em amostras mantidas sob refrigerao e em temperatura ambiente por 48 horas. Como expresso na tabela 1, o VCM apresentou decrscimo nas duas maiores concentraes de EDTA

(7,2 e 14,4mg mL-1 de sangue). Essa diminuio foi ocasionada pela crenao osmtica das hemcias decorrente do excesso de EDTA. NEMEC et al. (2005) tambm evidenciaram diminuio do VCM em amostras com alta concentrao de EDTA (5,4mg mL -1 de sangue). No estudo dos referidos autores, os valores do VCM passaram de 74,41,1fL para 65,43,0fL, diferena de 11,9%, sendo superior aos 2,36% de reduo no presente estudo, quando se utilizou 14,4mg de EDTA por mL de sangue. No presente ensaio, o tempo e a temperatura de armazenamento tambm influenciaram o VCM, ocorrendo interao entre os dois (Tabela 2). Sob refrigerao, o VCM apresentou diminuio (P<0,05) no tempo de 12h. Esta reduo pode ser explicada pela crenao osmtica dos eritrcitos. Na temperatura ambiente, o VCM permaneceu sem alteraes significativas durante as 12 primeiras horas, mas aumentou significativamente aps a 24a hora. Esse acrscimo possivelmente foi determinado pela tumefao celular, que ocorre em amostras mantidas sem refrigerao por longos perodos. Na comparao entre as duas temperaturas, os resultados do VCM permaneceram sem diferena significativa nos tempos 0h e 12h, mas apresentaram diferena (P<0,05) nos tempos 24h e 48h, com valores maiores na temperatura ambiente. Este aumento no VCM, com o passar do tempo, foi ocasionado tambm pela tumefao celular, corroborando os dados obtidos, em ces, por MEDAILLE et al. (2006) e em humanos por LAWRENCE et al. (1975), COHLE et al. (1981), LIPPI et al. (2005), WEISER (2007), ALMEIDA (2008) e FREISE et al. (2008). Por sua vez, ROCHA et al. (2001) no detectaram diferena no VCM, durante estudo realizado com sangue humano com vrios tempos de avaliaes (0, 2, 6, 8, 10, 12 e 24 horas). No entanto, apesar das diferenas, as alteraes observadas nos ndices do VCM, no presente estudo, mantiveram-se na faixa de referncia (SCHALM et al., 1986).

Tabela 1 Mdias e desvios padro do volume corpuscular mdio (VCM) de sangue total canino, conservado em diferentes concentraes de EDTA. -----------------------------------------------------EDTA (mg mL-1) ----------------------------------------------------Parmetro 1,8 VCM (fL) 69,15 4,22A 3,6 68,24 3,64AB 7,2 67,60 3,73B 14,4 67,52 3,64B

Mdias e desvios padro seguidos por letras iguais e na mesma linha no diferem estatisticamente entre si, a 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.

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Tabela 2 Mdias e desvios padro de volume corpuscular mdio (MCV) de sangue total canino, de acordo com a temperatura de conservao e com as medidas nos tempos 0h, 12h, 24h e 48h. --------------------------------------------Tempo em horas-------------------------------------------Temperatura 0 VCM (fL) 2C a 8C Ambiente 66,80 3,04 66,80 3,09 CBa
ABa

12 66,37 2,99 65,92 3,09 CBa


Ba

24 67,57 3,15 69,62 3,00 Ba


ABb

48 68,32 2,99 ABb 73,60 3,36 ABa

Nota: Mdias e desvios padro seguidos por letras maisculas iguais na mesma linha no diferem entre si (P>0,05), pelo teste de Tukey. Mdias seguidas por letras minsculas iguais, na mesma coluna e parmetro, no diferem entre si (P>0,05), pelo teste F.

Os valores de hemoglobina, hematcrito, ndice de anisocitose eritrocitria (RDW), plaquetas e plaquetcrito no apresentaram alteraes entre grupos e nos grupos ao longo do tempo (Tabela 3), corroborando os dados obtidos por HIRASE et al. (1992), FREISE et al. (2008) e IMERI et al. (2008). Por sua vez, COHLE et al. (1981) tambm detectaram estabilidade da hemoglobina, durante 48 horas, em amostras de sangue humano, conservadas sob refrigerao e em temperatura ambiente. Entretanto registraram aumento no hematcrito, a partir da 48a hora, em amostras conservadas em temperatura ambiente. Ausncia de alterao na concentrao de hemoglobina com alta concentrao de EDTA (5,4mg mL-1) tambm foi constatada por NEMEC et al. (2005). Porm, os referidos autores registraram decrscimo no hematcrito, com aumento da concentrao de EDTA, o que no foi observado no presente estudo. A concentrao de EDTA e o tempo de armazenagem no influenciaram os resultados da contagem de leuccitos, nem houve interao entre eles ou deles com a temperatura de conservao. Observou-se que a contagem de leuccitos foi influenciada pela temperatura de conservao apresentando de mdia 12,975,33 sob refrigerao e 11,903,59 em temperatura ambiente. A mdia menor nas amostras conservadas sob temperatura ambiente provavelmente se deveu ao fato de que, em temperaturas mais elevadas, a lise de leuccitos maior. Estudando a influncia do tempo e da temperatura de armazenagem na conservao sangunea em trs equipamentos distintos, IMERI et al. (2008) detectaram diminuio no nmero de leuccitos na temperatura ambiente, no tempo 48 horas, em um dos trs equipamentos utilizados, enquanto nos resultados obtidos nos outros dois equipamentos, no foi observada diferena. COHLE et al. (1981); HIRASE et

al. (1992) e FREISE et al. (2008) no observaram alterao nos valores dos leuccitos em amostras de sangue humano, armazenadas sob refrigerao ou temperatura ambiente, por 48 horas. O nmero de plaquetas e o plaquetcrito (PCT) tambm no apresentaram alterao nos estudos feitos por HIRASE et al. (1992) e FREISE et al. (2008). J IMERI et al. (2008), observando o nmero de plaquetas de sangue humano, conservado em temperatura ambiente e sob refrigerao em diferentes equipamentos, observaram variaes desta estabilidade entre os equipamentos. Esses resultados demonstraram que amostras conservadas sob as mesmas condies de tempo e temperatura podem apresentar alteraes importantes, dependendo do aparelho utilizado. CONCLUSO O aumento da concentrao de EDTA diminui os valores do VCM. Por sua vez, a temperatura de conservao tambm ocasiona alterao nos valores do VCM, ou seja, h aumento nos seus ndices na 24a e 48ah na temperatura ambiente e diminuio na 12ah na temperatura de 2 a 8C. A temperatura ambiente diminui o nmero de leuccitos e eritrcitos durante a conservao. As alteraes observadas no comprometeram os resultados obtidos no contador automtico de clulas, mostrando que as amostras sanguneas, conservadas por 48 horas, mantiveram-se em boas condies para anlise, principalmente quando armazenadas temperatura de 2 a 8C. FONTES DE AQUISIO
a - Vacuette do Brasil LTDA, Campinas. b - Humancountplus, Human do Brasil, ItabiraMG

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Tabela 3 Mdias* e desvios padro de hemoglobina, hematcrito, RDW, plaquetas e plaquetcrito de amostras coletadas em diferentes concentraes de EDTA, armazenadas em duas temperaturas e analisadas em quatro intervalos de tempo. --------------------------------Concentrao de EDTA por ml de sangue-------------------------------Tempo em horas 1,8 ------Temperatura-----2C a 8C Hemoglobina (g dL-1) 0 12 24 48 Hematcrito (%) 15,34 2,93 15,35 2,90 15,29 3,14 15,65 2,78 44,42 9,36 45,80 9,68 44,98 8,65 45,79 8,87 15,92 0,65 16,07 0,60 15,96 0,72 15,66 0,90 295,1 167,77 278,0 189,05 254,5 183,28 239,8 161,74 0,26 0,14 0,26 0,17 0,24 0,17 0,24 0,16 Ambiente 15,34 2,93 15,51 3,03 15,34 2,83 15,43 2,89 44,42 9,36 44,21 9,98 43,80 8,74 48,75 6,61 15,92 0,65 15,95 0,62 15,59 0,41 15,99 0,62 295,10 167,77 296,00 160,95 265,60 148,34 263,50 147,38 0,26 0,14 0,27 0,15 0,26 0,14 0,26 0,14 3,6 ------Temperatura-----2C a 8C 15,32 2,89 15,45 2,79 15,39 2,82 15,50 2,67 44,60 9,16 44,52 8,85 45,40 7,83 46,43 9,73 21,04 16,51 15,93 0,55 15,88 0,59 15,97 0,56 298,6 156,34 262,0 196,09 247,9 162,18 231,2 167,53 0,26 0,13 0,23 0,18 0,23 0,15 0,22 0,16 Ambiente 15,32 2,89 15,45 2,81 15,30 2,58 15,42 2,74 44,60 9,16 42,65 9,44 42,74 6,98 44,83 6,57 21,04 16,51 15,82 0,72 15,83 0,36 15,80 0,59 298,6 156,34 280,5 175,94 259,90 154,78 242,80 151,95 0,26 0,13 0,25 0,16 0,26 0,16 0,24 0,15 7,2 ------Temperatura-----2C a 8C 15,26 2,52 15,37 2,74 15,29 2,73 15,49 2,57 44,22 8,00 44,57 8,76 45,27 9,26 45,23 8,06 15,73 0,66 15,75 0,56 15,80 0,49 15,70 0,61 278,3 161,66 263,7 180,76 246,20 159,82 202,50 128,23 0,25 0,14 0,24 0,16 0,23 0,15 0,20 0,12 Ambiente 15,26 2,52 15,41 2,83 15,35 2,80 15,59 2,64 44,22 8,00 42,42 10,35 41,53 7,75 44,74 9,21 15,73 0,66 16,30 0,71 16,22 0,69 15,64 0,56 278,30 161,66 289,1 152,94 269,40 153,52 240,20 121,16 0,25 0,14 0,27 0,13 0,26 0,15 0,23 0,12 14,4 ------Temperatura-----2C a 8C 15,96 2,70 15,74 2,53 15,67 2,45 15,86 2,83 47,65 9,35 46,13 9,95 46,18 9,36 47,21 8,14 15,90 0,61 15,71 0,74 15,81 0,60 15,76 0,52 234,00 121,87 222,90 149,84 214,50 145,04 203,50 143,63 0,20 0,10 0,20 0,14 0,21 0,14 0,20 0,15 Ambiente 15,96 2,70 15,84 2,99 15,66 2,74 16,04 2,45 47,65 9,35 43,61 9,52 43,85 7,65 46,94 10,93 15,90 0,61 16,68 0,90 16,75 0,92 16,37 1,00 234,00 121,87 241,60 134,82 259,60 163,99 235,00 113,21 0,20 0,10 0,22 0,12 0,25 0,15 0,23 0,11

0 12 24 48

RDW

0 12 24 48

PLT (mil-L-1)

0 12 24 48

PCT (%)

0 12 24 48

*P>0,05.

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COMISSO DE TICA DA UNIVERSIDADE FEDERAL DE VIOSA


Trabalho aprovado pela comisso de tica da Universidade Federal de Viosa (UFV) sob o nmero 505542577.

REFERNCIAS
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