IMVIC El IMVIC es una prueba utilizada en microbiologa para la identificacin bacterias.

Se compone de cuatro pruebas: Indol, Rojo de metilo, Voges-Proskauer y Citrato. El resultado de este test se expresa mediante simbolos de positivo o negativo(+ o -) segn el resultado de cada prueba, siguiendo siempre el orden establecido por las iniciales del mtodo. As por ejemplo, el IMViC de la bacteria Salmonella y Citrobacter es -+-+. Para E.coli es ++-- y para Klebsiella y Enterobacter es --++. Indol (I) [editar] Consiste en cultivar al microorganismo en estudio en un caldo rico en triptfano; despus de 24-48 horas de crecimiento se adiciona al tubo sobre el caldo xilol, para conseguir separar el indol producido, y tras agitar se incorpora el reactivo de Kovacs (p-dimetil animo benzaldehido) un resultado positivo mostrar la formacin de un anillo de color rojo sobre el caldo de cultivo, lo cual pondra de manifiesto la presencia de Indol debido a la utilizacin del triptfano por el microorganismo (la molcula de tritfano se rompe y uno de esos productos es el Indol), un resultado negativo solo mostrara un anillo de color amarillo propio del reactivo de Kovacs.

Resultado Positivo para prueba de Indol Rojo de Metilo (M) [editar] El rojo de metilo es un indicador de pH. (Frmula: C15H15N3O2). Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formacin de cidos organicos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. El microorganismo en estudio se cultiva en un caldo de cultivo con algn carbohidrato fermentable, el ms comn es la glucosa aunque se pueden utilizar otros carbohidratos como lactosa, sacarosa, manitol, etc, adicionado con el rojo de metilo como indicador de pH. Una

reaccin positiva, es decir, el viraje del medio a un color rojo, indica que el microorganismo realiza la fermentacin de la glucosa por la va cido-mixta y el pH del medio se torna hasta 4.2 por la gran cantidad de cidos orgnico producidos. Una prueba negativa no cambia el color del medio (color amarillo) Voges-Proskauer (VI) [editar] Algunos microorganismos producen acetona o acetil metil carbinol por descarboxilacin de dos molculas de cido pirvico (producto final de la gluclisis). La acetona es un producto intermedio de la fermentacin butiln-gliclica, que conduce a la formacin de 2, 3 butanodiol. Tanto la acetona como el 2,3 butanodiol son productos neutros de la fermentacin de la glucosa que llevan el pH del medio a un valor aproximado de 6 o ms, y un aumento en la produccin de dixido de carbono, respecto a la prueba Rojo de Metilo. La acetona en un medio fuertemente alcalino (NaOH o KOH) y en presencia de Oxgeno se oxida a diacetilo. El diacetilo reacciona con compuestos que contengan ncleos de guanidina, como la arginina, presente en el medio (peptona por ejemplo), y da un compuesto color rojo-rosado-violceo. Se agrega -naftol para aumentar la sensibilidad. Esta prueba caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae, e indicar que la glucosa es fermentada por la va butanodilica. Citrato (C) [editar] Sirve para determinar si un microorganismo puede crecer utilizando citrato como nica fuente de carbono debido a la sntesis de la enzima citrato permeasa la cual permite la introduccin del citrato al interior de la clula, una vez dentro, el citrato es incorporado al ciclo de los cidos tricarboxilicos o ciclo de Krebs. Se hace crecer al microorganismo en estudio en caldo citrato. Un resultado positivo es cuando se observa turbidez en el tubo, debido al crecimiento bacteriano. Un resultado negativo es cuando no se observa crecimiento. Actualmente el medio ms utilizado es el Agar Citrato de Simmons un medio slido en tubo con pico de flauta el cual posee un indicador de pH (azul de bromotimol) si el microorganismo es capaz de crecer, producira cidos organicos provenientes de la utilizacin del citrato, el medio se alcaliniza y el indicador vira a color azul, esto ser un resultado positivo, el medio sin inocular es de color verde, de esta manera un resultado negativo no habr crecimiento y el color seguir siendo verde. 3. IMVIC. Las bacterias pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, pueden identificarse a travs de una serie de pruebas bioqumicas, que permiten determinar la presencia o ausencia de ciertas enzimas y a veces incluso permiten determinar la existencia de una secuencia metablica. Con este fin se han desarrollado diversos esquemas de clasificacin, uno de los ms conocidos y utilizados corresponde al IMVIC que se desarroll para clasificar especies de la familia antes mencionada y correspondientes al grupo de bacterias coliformes (bacterias aerbicas o anaerbicas facultativas, Gram(-), bacilares, no esporgenas que producen cido y gas durante la fermentacin de la lactosa). Consiste en las siguientes pruebas:

a) Indol (I). consiste en cultivar la especie en estudio en un caldo rico en triptofano; despus de 24-48 horas de crecimiento se determina la presencia de indol con reactivos especficos como P-dimetil-aminobenzaldehido (reactivo de Kovack) el que adquiere un color rojo en presencia de indol.

b) Rojo de metilo (M). El rojo de metilo es un indicador de pH. Acta entre pH 4,2 y 6,3 variando desde rojo (pH 4,2) a amarillo (pH 6,3). Por lo tanto, permite determinar la formacin de cidos que se producen durante la fermentacin de un carbohidrato. El rojo de metilo se prepara con 0,1 g de este reactivo en 300 ml de alcohol etlico y se diluye en 500 ml de agua.

c) Voges-Proskauer (VI). Permite determinar la formacin de acetil metil carbinol, el que es un producto intermediario de la fermentacin que conduce a la formacin de 2,3 butanodiol y que caracteriza a ciertas especies de las Enterobacteriaceae.

d) Agar-citrato (C). Determina si el organismo bacteriano en cuestin se desarrolla o no en un medio mineral que contiene citrato como nica fuente de carbono. VERONICA Cuadro 3. Medios de cultivo, reactivos y caractersticas de las reacciones del IMVIC. Pruebas Indol Medio de cultivo Caldo 523 Reactivos a usar Reaccin positiva

1 ml reactivo Kovack* Color rojo al medio cultivo

Rojo de Metilo

Caldo peptonado

5 ml cultivo 5 gotas rojo de metilo

Color rojo

Voges- Proskauer

Caldo peptonado

1 ml cultivo 0,6 ml naftol 5% 0,2 ml KOH 40%

Color rojo luego de 5-10 min

Agar- citrato

Agar-citrato (tubos)

Ninguno

Desarrollo acompaado cambio de color de

* 75 ml n-alcohol amlico, 25 ml cido clorhdrido concentrado y 5 g p-dimetil aminobenzaldehido. Las especies tipo del grupo coliforme son Escherichia coli y Enterobacter aerogenes. E. coli es un habitante normal del intestino del hombre y animales; en cambio E. aerogenes se presenta con mayor frecuencia en los vegetales y sus semillas, por ello no indica obligadamente contaminacin fecal, pero s sospechas, ya que tambin se encuentra en las heces del hombre y animales. Ambas especies tienen caractersticas morfolgicas y de cultivo muy semejantes, por ello es necesario recurrir a las pruebas bioqumicas antes mencionadas para su identificacin (IMVIC).

Cuadro 4. Test de IMVIC para diferenciar entre Escherichia coli y Enterobacter aerogenes.

Bacteria Escherichia coli Enterobacter aerogenes

I + -

M + -

VI +

C +

Antes de realizar el IMVIC y con el objeto de determinar la presencia de bacterias coliformes en una muestra de agua por ejemplo; se procede a investigar la fermentacin de la lactosa con produccin de gas. Para lo cual se inocula con la muestra de agua un tubo con caldo lactosado y se incuba a 37C por 24-48 horas. Si no se produce gas el resultado es negativo y por ende no existira contaminacin fecal; si se produce gas podra tratarse de contaminacin fecal. Si el resultado es positivo se procede a confirmar la presencia de bacterias coliformes; para ello se siembra a partir del tubo con caldo lactosado positivo, en un medio diferencial o indicador. El medio ms utilizado para reconocer las colonias de E. coli es el agar-eosina-azul de metileno (EAM), que contiene peptona, lactosa y los colorantes eosina y azul de metileno. En dicho medio se inhibe el crecimiento de otras bacterias, pero no el de las coliformes (stas desarrollan colonias tpicas). E. coli: colonias grandes, oscuras, negro-azuladas, centro casi negro, con brillo metlico verdoso causado por la luz reflejada. Enterobacter: colonias grandes, rosado plido, mucosas, centro oscuro sin brillo metlico.

La presencia de estas bacterias confirman la existencia de bacterias coliformes en la muestra y la prueba definitiva se obtiene con el IMVIC. 333333333333333333333333333 MTODOS RPIDOS MODERNOS Dra. Norma Laura Heredia Rojas Depto. de Microbiologa, Facultad de Ciencias Biolgicas, U.A.N.L. Apdo. Postal 124F San Nicols, N.L. 66451, Correo electrnico: norma@microbiosymas.com Los mtodos rpidos y la automatizacin en microbiologa es un campo de estudio dinmico que conjunta la utilizacin de mtodos microbiolgicos, bioqumicos, fisiolgicos, inmunolgicos y serolgicos para el aislamiento ms efectivo, la deteccin, caracterizacin y enumeracin ms rpida de microorganismos y sus productos en muestras clnicas, ambientales o de alimentos.

El avance reciente de muchos de los mtodos nuevos, ha sido posible gracias a los avances tecnolgicos que se han dado en los ltimos aos tales como los microprocesadores y las computadoras. Las enfermedades alimentarias constituyen uno de los problemas ms dispersados del mundo contemporneo. La gran mayora de las enfermedades alimentarias tiene un origen microbiolgico. Por lo que la bsqueda de metodologas rpidas que puedan asegurar una buena calidad de los productos es una necesidad real. En los ltimos 15 a 20 aos los microbilogos de alimentos han empezado a adaptar tecnologas rpidas y automatizadas en sus laboratorios y actualmente existe un gran inters por su bsqueda y su utilizacin rutinaria. Se puede decir que un mtodo rpido es aquel que es ms rpido, sencillo o confiable que lo convencional. Sin embargo, siempre al hablar de metodologas rpidas estamos tratando subjetivamente. Sin embargo, en lo que todos concuerdan es que estos mtodos han revolucionado y lo seguirn haciendo, la forma de realizar los anlisis microbiolgicos. Aunque un mtodo rpido pueda ser llevado a cabo en un tiempo muy corto, como es el caso de un ensayo serolgico, que puede tardar 10 min, estos mtodos siempre partirn de un cultivo aislado o al menos de un medio de enriquecimiento, lo cual alargar el tiempo real del ensayo de 24 a 48 h. Aparte de todo esto, los mtodos rpidos tambin tienen limitaciones como lo son la aparicin de tecnologas nuevas que en muchas ocasiones requieren de tiempo para estandarizarse, la ya mencionada dependencia de enriquecimiento, en la mayora de los casos se requiere confirmacin de resultados positivos, se debe tomar en cuenta que en ocasiones se presentan interferencias con los componentes del alimento, los mtodos moleculares se basan en la deteccin de gen no de su actividad, lo que no nos demuestra que en ese momento el gen de inters est activado. Los ensayos rpidos normalmente estn dirigidos contra un solo microorganismo y en la mayora de los casos, se requiere buscar un grupo de microorganismos, lo que provoca una elevacin en el costo del anlisis final. Otra dificultad radica en la existencia de una abundancia de ensayos, lo cual hace difcil la seleccin del ms adecuado y tambin que muy pocos mtodos se encuentran validados, lo que hace difcil tambin su utilizacin. Los mtodos rpidos los hemos clasificado en reas de acuerdo a lo que se busca: Sistemas para facilitar la toma de muestras Mtodos para ayudar al procesamiento de las muestras Sistemas de cuantificacin microbiolgica Mtodos para identificacin y cuantificacin de microorganismos Sistemas especiales para anlisis de muestras de aguas, ambientales y superficies Sistemas para deteccin/cuantificacin de toxinas microbianas Sistemas de identificacin mediante mtodos moleculares Mtodos inmunolgicos para deteccin y/o cuantificacin de microorganismos Otros mtodos miscelneos

A continuacin se har una descripcin muy breve de algunos de estos grupos de ensayos: Sistemas de Cuantificacin Microbiolgica.

1.- Las placas 3MT PetrifilmT ayudan a maximizar la productividad en el laboratorio. Estas placas listas para usarse reducen el tiempo y optimizan el espacio. 2.- El sistema Dip NCount frascos con esponjas cuadriculadas con agar permitiendo contar diferentes tipos de organismos. Los resultados que se obtienen no son exactos, y son aproximaciones. 3.- El sistema Simplate sirve para realizar recuento de organismos selectos: Cuenta total, coliformes totales y fecales, Hongos, levaduras y Campylobacter. 4.- La Compaa Spiral Biotechnology ofrece el Sistema Autoplate 4000 que puede ser usado para enumeracin bacteriana, anlisis de susceptibilidad antimicrobiana, ensayos de mutagenicidad. 5.- Sistema Protocol es un sistema modular que abarca desde un sistema para la cuenta de las colonias, hasta el clculo de las diluciones, pudiendo leer placas tipo espiral, ahorrando medio de cultivo. Se conecta a una computadora bsica y funciona con Windows. 6.- Rabit Impedance Detection System y el Lactmetro que se basan en el concepto de impedancia (resistencia al flujo de una corriente alternante que es pasada a travs de un material conductor). 7.- El sistema Malthus es un sistema para cuantificar microorganismos basado en cambios de conductancia. 8.- Otros mtodos mas sofisticados que incluyen al sistema ChemScan RDI, Sistema D Count (se basa en una combinacin de marcaje celular, exitacin laser y procesamiento digital). Sistemas de Identificacin Microbiana Existen muchos mtodos, algunos de ellos son: 1.- Los sistemas de identificacin api comprende celdillas con 20 pruebas bioqumicas en miniatura. Sistema Mirobac, tambin consiste de plaquitas con 16 pruebas bioqumicas. 2.- El sistema de identificacin Micro-ID. Principio: Estos sistemas incluyen 15 celdillas con discos de papel filtro impregnados con reactivos para detectar la presencia especfica de enzimas o productos metablicos. 3.- Sistema ColiTrak da un resultado presuntivo de cuentas de coliformes, reemplazando al NMP y especialmente aplicado a ensayos de aguas. 4.- Sistema Vitek automtico que iidentifica en 2 a 24 h y realiza tambin confirmacin de Patgenos. Los equipos son expandibles con 32, 60, 120, 240 480 exmenes y adems realiza el antibiograma y CMI. 5.- El sistema PASCO es semejante al sistema Vitek. 6.- El sistema Biolog es capaz de identificar encima de 1400 especies de bacterias aerobias, anaerobias, hongos filamentosos y levaduras.

Sistemas de Identificacin mediante Mtodos Moleculares. Los que son ms comunes y actualmente estn en el mercado incluyen, 1.- Los sistemas BAX utilizan el poder del PCR para lograr resultados rpidos y confiables. Cada prueba esta diseada para amplificar un segmento de DNA especfico de cada organismo, produciendo en pocas horas niveles tales para ser detectados. 2.- Los sistemas BAX simplifican el PCR ya que incluyen todos los primers requeridos, polimerasa y nucletidos en una pastilla nica, empaquetada dentro del tubo de muestra, evitando errores de manipulacin 3.- The RiboPrinter Microbial Characterization System. Este sistema detecta mltiples copias del gen RNAr 16 s logrando la identificacin de cualquier bacteria en menos de 8 horas. 4.- El sistema DARAS es un equipo robtica totalmente automatizado, el cual combinado con las columnas DARAS componen todos los pasos asociados con los anlisis rutinarios de Biologa Molecular. Mtodos inmunolgicos para deteccin y/o cuantificacin de microorganismos. Estos mtodos estn sumamente difundidos. Algunos de los ensayos ofrecidos actualmente incluyen: 1.- VIDAS y mini VIDAS. Emplea la tecnologa ELFA (Enzyme Linked Fluorescent Assay) que utiliza el principio de determinacin que asocia el marcaje por una enzima y una medida por fluorescencia. 2.- Sistemas VIP. Es un ensayo de inmuno-precipitacin, fcilmente leble y de alta reproducibilidad. 3.-Sistemas EIA (Inmunoensayo Policlonal). Son sistemas que se corren en microplacas. Hay para la deteccin de diferentes patgenos: Assurace Salmonella EIA, Assurace GoldSalmonella EIA, EHEC EIA, Listeria EIA y Campylobacter EIA. 4.- Sistema EZ ColiTM, Rapid Detection System. Este sistema es utilizado para cultivar y presumiblemente identificar a EHEC. 5.- Sistemas Tek. Ensayos de tipo ELISA para detectar patgenos a partir de muestras de alimentos. 6.- Sistemas Reveal. Estos sistemas combinan Elisa tipo sandwich con el poder de la cromatografa para dar resultados rpidos y confiables 7.- Sistemas Tecra. Utiliza un "hisopo" recubierto con anticuerpos que captura a los microorganismos. Toda la reaccin toma lugar en los contenedores del mdulo. Los resultados se indican visiblemente. 8.- Salmonella Immunocapture. Este sistema provee resultados mas rpidos que los mtodos tradicionales y se utiliza junto con TECRA Inmunoensayo Visual (VIA).