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PCR e Eletroforese de

Nucleotídeos
Dalvania Pinho Domingues
Fralini dos Santos Marcilio
Gabriel Machado Carvalho
Leonardo Teles Faber
Patricia de Sá Almeida
Rita de Cássia Costa de Carvalho
Kary Banks Mullis

PCR
PCR=Polymerase Chain Reaction

Reação em Cadeia da
Polimerase –técnica que
utiliza a enzima DNA
polimerase ,responsável
pela síntese de DNA ,para
amplificar in vitro,qualquer
segmento de DNA utilizado
como molde através de
ciclos .
PCR amplifica uma sequência alvo:

Sequência alvo
Histórico

 1983 – Kary Banks Mullis.


Reação em cadeia da polimerase.
Conceito de primer
 1987– Primeira publicação:Science.
 1989 – Automação do processo pelo uso do
primeiro termociclador automático.
 1983 – Prêmio Nobel de Química:Kary Banks Mullis
Princípios
 Consiste de três etapas:

Denaturação– 95 ºC por 30 segundos

Anelamento-ligação dos primers(64ºC)

Polimerização-síntese de cadeia
complementar de DNA
Princípios
 Requer:
DNA molde
DNA polimerase termoestável
2 primers
Deoxinucleotídeos trifosfato(dNTPs)
Cátion divalente(MgCl2)
Tampão
Termociclador
Ciclos:são repetidos de 30 a 45 vezes.
Limitações
 Contaminação por DNA estranho
 Incorporação errônea de bases
 Difícil aplicação a sequências maiores que 500
Daltons
 Inibidores:
• Fenol
• Proteinase K
• Agentes quelantes em excesso(EDTA)
• Hemoglobinas e outras proteínas das hemácias
• SDS(dodecil sulfato de sódio)
• Elevadas concentrações de sal
Aplicações
1.Estudo do padrão de expressão gênica
(transcritos raros)

2.Seleção de clones recombinantes, com


primers complementares a seqüências do vetor.

3.Sequenciamento direto de produtos


amplificados
Aplicações
 4.Detecção de mutações em genes específicos
(diagnóstico precoce em estudos de câncer e
doenças genéticas, estudos terapêuticos para a
determinação do mecanismo de ação de substâncias
mutagênicas)

 5.Estudos diagnósticos de doenças infecciosas,


detecção de bactérias, vírus e protozoários parasitos

 6.Diagnóstico pré-natal em caso de risco


Aplicações
 7.Elucidar relações evolutivas entre espécies,
utilizando material arqueológico

 8.Na Medicina Forense,análises em cenas de


crimes (impressão digital de DNA-Fingerprint)

 9.Teste de paternidade
Avanços
 Utilização de DNA polimerase termoestável(Taq
polimerase)

 Novas DNA polimerases(Pfu DNA polimerase,Tli


DNA polimerase,Vent DNA polimerase)

 Novas estratégias de análise(Nested


PCR,Touchdown PCR,Inverse PCR,PCR-
ELISA,Multiplex PCR,HotStart PCR,RT-PCR,PCR-
Competitiva.)
Eletroforese
Eletroforese de Nucleotídeos

Método padrão para


análise,identificação e purificação
de fragmentos de DNA ou RNA
que diferenciam-se em tamanho
ou conformação.
Histórico
1933-Tiselius:eletroforese para separar proteínas em
solução
1955-Smithies:géis de amido para separar proteínas
do soro
Frederick Sanger:análise completa da insulina
bovina
1956-Ingran:primeiro mapa peptídico
1959-Raymond:géis de poliacrilamida
1966-Maizel:uso de SDS
1975-O´Farrel:gel bidimensional
1981-Jorgenson e Lukacs :Eletroforese Capilar(EC)
Princípios
 Aplicação de uma diferença de
potencial
 Migração de partículas em um
determinado gel
 Separação molecular na amostra
 Visualização das “bandas”
Princípios
 Requer:
• Amostra(livre de contaminação)
• Gel (agarose ou poliacrilamida)
• Tampão(TBE:Tris-Borato EDTA e TAE:Tris-
Acetato EDTA)
• Equipamento para Eletroforese
• Corantes:Prata,Ponceau,Azul de
Bromofenol,Xileno-Cianol.
• Ladders(marcadores de tamanho)
Visualização

Eletroforese
Capilar
Limitações
 Taxa de migração do DNA nos géis de
agarose
1.Tamanho molecular do DNA
2.Concentração da agarose
3.Conformação do DNA
4.Presença de Brometo de Etídio
5.Voltagem aplicada
6.Tipo de agarose
7.Tampão
Limitações
 Não é adequada para determinação
de compostos voláteis,não-polares e
de massa molar baixa(menores que
200 Daltons)

 Não é adequada para polímeros não-


iônicos com massa molar alta(maiores
que 500 Daltons)
Aplicações

 Sequenciamento de DNA(eletroforese
capilar)

 Separação de misturas complexas de


macromoléculas
Avanços
 Western blotting
 Eletroforese Capilar em Solução
Livre(ECSL)
 Eletroforese Capilar em Gel(ECG)
 Eletrocromatografia Capilar Micelar(ECCM)
 Eletroforese Capilar com Focalização
Isoelétrica(ECFI)
 Isotacoforese Capilar(IC)
Vídeos

PCR

Teste de paternidade
Referências
Alberts B, Jonhson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. Biologia
Molecular da Célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed; 2004.

http://www.dbbm.fiocruz.br/helpdesk/mbiology/PCRcurso.pdf
(Acesso em 08 de agosto de 2008)

http://www.chemkeys.com/bra/md/mds_11/elecap_4/elecap_4.htm
(Acesso em:18 de agosto de 2008

http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/1993/illpres/pcr.html
(Acesso em 18 de agosto de 2008)

http://www.etall.hpg.com.br
(Acesso em 18 de agosto de 2008)
Discussão
 Porque foi tão importante o
desenvolvimento da PCR?
 É possível extrair-se DNA de um fio de
cabelo,uma célula do epitélio oral ou
de uma gota de sangue?
 A eletroforese de nucleotídeos é mais
simples do que a de proteínas?