Validacin de un mtodo analtico

Laboratorio de control fisicoqumico y microbiolgico II Jueves 13-16 Educador: Oscar A. Flrez Acosta Estudiante: Ivon Aristizabal Garca Documento: 1128432070 Fecha de entrega: 02-04-2013 OBJETIVO Comprobar la idoneidad de los mtodos analticos utilizados durante la prctica para evaluar una muestra de cido ascrbico, a fin de asegurar la calidad y confiabilidad en los resultados. INTRODUCCIN La validacin de mtodos analticos es importante desde el campo del qumico farmacutico porque permite emitir juicios y resultados ciertos con un nivel de confiabilidad bastante irrefutable mediante comprobacin por medio de parmetros estadsticos que prevn la funcionalidad adecuada de todos los procedimientos nuevos o antiguos, claro que con pequeas modificaciones que se realizan en el laboratorio, incluso si provienen de farmacopeas oficiales. En este orden de ideas se requiere que los procedimientos estn totalmente documentados y revisados peridicamente porque sus resultados emitidos durante prueba y prueba no son absolutos en el tiempo (requieren revalidar), ya que hay muchos factores que pueden alterar la confiabilidad de los mismos como el cambio de equipo, proveedor de reactivos e incluso el cambio de muestra de anlisis. MARCO TERICO Validar es evidenciar y documentar con alto grado de seguridad, que los procedimientos analticos puedan cumplir con las especificaciones predeterminadas y las caractersticas de calidad Adems aseguran que un mtodo de anlisis es lo suficientemente fiable y reproducible para producir el resultado previsto dentro de intervalos de tiempo definidos [1] La validacin analtica tiene como objetivo principal asegurar que un procedimiento analtico seleccionado arroje resultados reproducibles y confiables que sean adecuados para el propsito previsto. De ah que sea necesario definir debidamente tanto las condiciones en que el mtodo ha de emplearse como el objetivo propuesto para el mismo. Estos principios se aplican a todos los procedimientos descritos en la farmacopea y tambin a los no incluidos en la misma, pero que se utilizan en un laboratorio de anlisis. Si bien estas pautas son aplicables a los mtodos usados para examinar atributos qumicos y fisicoqumicos, muchas de ellas son igualmente aplicables a los ensayos biolgicos y microbiolgicos. La presentacin de los datos que arroje un procedimiento analtico y que concuerde la especificacin especificacin propuesta, deben tener una justificacin que indique por qu es idneo ese mtodo en comparacin con otros, descripcin detallada desde procedimientos hasta reactivos y una comprobacin de datos. Los procedimientos analticos pueden tener caractersticas como: 1. Exactitud: proximidad de los valores obtenidos a un valor real. Puede determinarse comparando los resultados con los obtenidos empleando otro procedimiento ya comprobado. AL determinar la exactitud se tiene en cuenta tanto los errores aleatorios como los sistemticos. Los errores aleatorios son una medida de la dispersin entre los datos y tienen causa no asignable o desconocida. Por otro lado los errores sistemticos se presentan por causas controlables como los causados por un operario inexperto, clculos incorrectos, calibraciones vencidas, estndares en mal estado, entre otras. [2]

2. Precisin: Grado de concordancia entre los resultados de los anlisis individuales. Se mide por la dispersin de los resultados individuales de la media y usualmente se expresa como el coeficiente de variacin cuando el procedimiento completo se aplica repetidas veces a muestras separadas e idnticas obtenidas del mismo lote de material homogneo. [2] a. Repetibilidad: Es la medida de la dispersin que muestren los datos obtenidos en el anlisis que realiza el mismo analista en las mismas condiciones y en corto perodo de tiempo. Se expresa matemticamente con el coeficiente de variacin (%CV) o desviacin estndar relativa (RSD) de una serie de medidas. b. Reproducibilidad: Se realiza con el fin de verificar que el mtodo ofrece resultados similares calculando la diferencia entre las medidas realizadas en los diferentes laboratorios (precisin interlaboratorios) para una misma prueba. c. Especificidad: Se emplea cuando se necesita discriminar la presencia de impurezas o mezclas de sustancias en un ensayo en relacin con un analito. Pretende determinar qu tan selectivo e inequvoco es el mtodo para identificar exclusivamente (aunque no siempre es completamente determinado) el analito de inters. [1] 3. Linealidad: Demuestra la capacidad que tiene el mtodo para generar resultados que sean directamente proporcionales a la concentracin del analito en la muestra. Cuando la relacin entre la respuesta y la concentracin de analito no es lineal, se puede lograr la normalizacin por medio de una curva de calibracin. [2] 4. La tcnica denominada Anlisis de varianza (ANOVA), tiene como objetivo bsico la comparacin de las medias de ms de dos poblaciones y se hace a travs de un contraste de hiptesis donde siempre se analizan estos tres elementos: dispersin, diferencias de medias y tamao muestral. [3] DATOS Tabla A. Datos del placebo utilizado para la validacin de los mtodos de anlisis para cido ascrbico PRODUCTO Placebo LOTE N/A MUESTRA NO. 20 FECHA 11-04-2013 PROVEEDOR Laboratorio de control fisicoqumico y microbiolgico II CANTIDAD 1 gramo EXCIPIENTES N/A Estndar de cido ascrbico Potencia: 0,997 RESULTADOS ULTRAVIOLETA Tabla 1. Valores de absorbancia obtenidos por los 3 analistas durante el anlisis de sus 3 muestras UV ABS 1 ABS 2 ABS 3 Valor ref. (mg) 80 0,5082 0,5109 0,5087 20 100 0,6064 0,557 0,5416 25 120 0,9083 1641 0,7832 30 Estndar 0,637 0,6117

Tabla 2. Peso de las muestras del analista 1 20 mg W obtenido mtra. 1 20 mtra. 2 20,2 mtra. 3 19,8 promedio 20 SD 0,2 % Cv 0,9

Tabla 3. Peso de las muestras Tabla 4. Peso de las muestras del analista 2 del analista 3 25 mg W obtenido 30 mg W obtenido mtra. 1 23,5 mtra. 1 35,8 mtra. 2 22 mtra. 2 42 mtra. 3 21,5 mtra. 3 28,9 promedio 22,3 promedio 35,6 SD 1 SD 6,6 % CV 4,7 % CV 18,4

Tabla 5. Relacin entre la masa de muestra pesada y la obtenida con sus Tabla 6. Porcentaje de respectivas diferencias recuperacin % pesado obtenido diferencias Recuperacin 20 21 20 1 20 4,76 20 20,6 20,2 0,5 20 2,18 20 20,9 19,8 1,1 20 5,31 25 25,9 23,5 2,4 25 9,27 25 25,9 22 3,9 25 156 25 25,3 21,5 3,8 25 152 30 36,5 35,8 0,7 30 1,92 30 33,1 42 8,9 30 26,89 30 30,3 28,9 1,4 30 4,62

Tabla 7. Factor respuesta %F Respuesta 20 95,2 20 97,8 20 94,7 25 90,7 25 84,9 25 85 30 98,1 30 126,9 30 95,4

Tabla 9. Resumen estadstico Tabla 8. Linealidad del mtodo 20 25 30 Estadsticas de la regresin 19,98 22,33 35,57 Coeficiente de correlacin mltiple Coeficiente de determinacin R^2 R^2 ajustado Error tpico Observaciones 0,9274 0,8601 0,7202 4,4458 3

Tabla 10. ANOVA Grados de libertad Regresin 1 Residuos 1 Total 2 Suma de cuadrados Promedio de los cuadrados F Valor crtico de F 121,5241 121,5241 6,1483 0,2440 19,7654 19,7654 141,2894 Estadstico t Probabilidad -0,8172 0,5638 2,4796 0,2440 Inferior Superior 95% 95% -215,3811 189,3511 -6,4298 9,5478 Inferior Superior 95,0% 95,0% -215,3811 189,3511 -6,4298 9,5478

Coeficientes Error tpico Intercepcin -13,015 15,9266 Variable X 1 1,559 0,6287

Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) Tabla 11. Resultados arrojados en el anlisis por el mtodo HPLC AREAS PESO (mg) % 1 2 3 1 2 3 20 80 5422 4527 4932 20,8 20,9 20,3 25 100 6296 6501 5891 25,4 25,6 25,2 30 120 7283 7843 7363 30,8 30,8 29,7 ST 7513 6619 26,7 26,5 Tabla 12. Valores de las diluciones realizadas y las concentraciones que se obtienen DILUCIONES (ml) CONCENTRACIONES volumen alcuota volumen 1 2 3 inicial tomada final 0,3842 0,3208 0,3495 50 10 25 0,4462 0,4607 0,4175 0,5161 0,5558 0,5218 Tabla 13. Valores de peso promedio de muestra, desviacin estndar y coeficiente de variacin PESO OBETENIDO PROMEDIO DS % CV RESULTADO 1 2 3 19,21 16,04 17,47 17,58 1,2966 7,38 NO PRECISO 22,31 23,03 20,87 22,07 0,8980 4,07 NO PRECISO 25,80 27,79 26,09 26,56 0,8762 3,30 NO PRECISO Tabla 14. Linealidad 20 17,58 25 22,07 30 26,56 Tabla 15. Valores del porcentaje de recuperacin del mtodo, el factor respuesta y del estadstico T % FACTOR DE DIFERENCIA % RECUPERACION T STUDENT RESPUESTA 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1,59 4,86 2,83 7,94 24,30 14,13 96,06 80,20 87,37 -4,86 -4,37 3,09 2,57 4,33 12,37 10,26 17,31 87,83 89,98 82,83 -17,63 -15,05 5,00 3,01 4,71 16,65 10,04 15,71 83,78 90,22 87,84 -20,21 Tabla 16. Resumen estadstico Estadsticas de la regresin Coeficiente de correlacin mltiple Coeficiente de determinacin R^2 R^2 ajustado Error tpico Observaciones

1 1 1 1,77636E-15 3

ANLISIS DE VARIANZA Grados de libertad 1 1 2 Promedio Suma de de los cuadrados cuadrados 40,3202 40,3202 3,15544E3,15544E-30 30 40,3202

Regresin Residuos Total Coeficientes Intercepcin -0,38 Variable X 1 0,898

F Valor crtico de F 1,2778E+31 1,78094E-16

Error tpico Estadstico t Probabilidad 6,36356E-15 -5,9715E+13 1,0661E-14 2,51215E-16 3,57463E+15 1,78094E-16

Inferior Superior Inferior Superior 95% 95% 95,0% 95,0% -0,38 -0,38 -0,38 -0,38 0,898 0,898 0,898 0,898

Grafico 1. Absorbancia de las muestras analizas por espectrofotometra UV vs masa pesada de la misma.

Grafico 2. Absorbancia de la muestra vs masa obtenida de la misma.

Absorbancia vs Wpesado
1.2 1 Absorbancia 0.8 0.6 0.4 0.2 0 18.0 23.0 28.0 Wpesado 33.0 38.0 y = 0.0328x - 0.2073 R = 0.8221 Absorbancia

Absorbancia vs Wobtenido
1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 18.0 28.0 W obtenido 38.0 y = 0.0255x + 0.0029 R = 0.9933

Grafico 3. Linealidad entre masa terica y el promedio de la masa obtenida.

Grafica 4. reas de las muestras analizadas por HPLC vs masa de las mismas.

Wterico vs Promedio Wobtenido

35 30 W terico 25 20 15 10 5 0 18 23 28 33 Promedio Wobtenido y = 0.5517x + 10.678 R = 0.8601 reas 7850 7350 6850 6350 5850 5350 4850 4350

reas vs masa de las muestras

y = 259.27x - 382.66 R = 0.9299

15

20

25 Wpeasdo

30

35

Grafico 5. reas de las muestras analizadas por HPLC Vs masa obtenida.

Grafico 6. Linealidad entre la masa terica y el promedio de la masa obtenida.

reas de las muestras vs W obtenido

10000 8000 reas 6000 4000 2000 0 0.00 10.00 20.00 30.00 Wobtenido y = 282.23x - 5E-11 R = 1 35 30 W terico 25 20 15 10 5

Wterico vs promedio Wobtenido

y = 1.1129x + 0.439 R = 1

0 17.00

19.00

21.00

23.00

25.00

27.00

Wobtenido

ANALISIS DE RESULTADOS Segn los datos obtenidos para la cuantificacin de vitamina C por ejecucin del mtodo de anlisis espectrofotomtrico ultravioleta, se evidencia que este no se trata de un mtodo ni preciso ni exacto ya que sus valores arrojados (absorbancia) no se aproximan al valor real (determinado por el estndar) y tampoco entre s mismos. La precisin se evala por el %CV tal y como se evidencia en las tablas 1, 2 y 3 donde se pone en evidencia que valores muy dispersos entre s causan dificultad para su validez. Adems la desviacin estndar que presentan los datos de las 3 muestras preparadas en igualdad de condiciones por los 3 analistas (repetibilidad), supera el criterio de aceptacin propuesto en valores menores e iguales a 2, es decir que segn como se observa en la tabla 3 que es donde mayor SD se presenta, hay menor cercana de los valores al promedio de la muestra. La linealidad es un parmetro que exige proporcionalidad entre valores de comportamiento supuesto lineal y su demostracin se realiza por utilizacin del mtodo de mnimos cuadrados en donde la mnima condicin para que haya buena linealidad es que el error sea lo suficientemente pequeo como para permitir que la ecuacin de la recta explique la mayor cantidad de datos; aqu el coeficiente de determinacin R2 dicta cunto determina X a Y y su valor aceptado es 0,98. El coeficiente de correlacin refiere que las variables X y Y no dependan entre s . En la tabla 9 se puede observar que no hay buena linealidad ni siquiera ignorando los errores inherentes de cada variable, por lo tanto la construccin de una curva con estas variables conlleva a la emisin de resultados con error estimado en 4,4% que es bastante elevado. El anlisis de varianza ANOVA disponible en la tabla 10. Permite decir que el intercepto de la curva con valor negativo expresa un comportamiento de decrecimiento con un error del 15.9 % y sus valores de F critico, F experimental, T de tablas y T experimental indican que el mtodo se debe rechazar puesto que no muestra resultados confiables. Para que sea de otra manera y el mtodo se acepte, el Valor crtico de F debe ser mayor e igual al F experimental y tambin que T de tablas (2,228) sea mayor e igual al T experimental. El mtodo analtico por cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) no es exacto y tiene errores sistemticos con causa asignable y solucin, esto se evidencia cuando se observa la tabla 11 donde 10 de las 11 muestras preparadas (el 91%) tenan materia prima en exceso -incluyendo los dos estndares-, sus valores de reas son diferentes entre s, es decir, tampoco es preciso y el %CV lo corrobora en las muestras correspondientes al analista 1 por ejemplo, dnde se encuentra un coeficiente de variacin igual a 7,38% cuando el lmite aceptado es del 5%. Para el resto de analistas se tienen valores tolerables.

La repetibilidad del mtodo se evidencia con la desviacin estndar (SD) y dicta que entre ms pequea sta, ms estrecha ser la relacin de datos con el promedio de la muestra, es decir, qu tan preciso es el mtodo. De igual manera, es de esperar que los datos del analista 1 -que realiza el anlisis por HPLC- estn ms desviados de la media muestral puesto que tiene valor SD ms elevado. La linealidad es un parmetro que se evala teniendo en cuenta la proximidad que tiene el coeficiente de determinacin R2 a 0,98 tomado en este caso como valor aceptado; es decir, que tan dependiente es la variable y de la variable X. Para el caso del anlisis de cido ascrbico por HPLC se puede decir que no es lineal o se duda de su linealidad puesto que su coeficiente de determinacin y de correlacin son iguales a 1 indicando en el primer caso que una variable depende de la otra y en el segundo caso que ambas son independientes; todo lo anterior refiere un error del 15% que parece pequeo para tal incoherencia. El anlisis de varianza ANOVA permite entonces decidir por medio de sus valores de T experimental y F experimental que el mtodo debe rechazarse por ser en ambos casos mayores que sus respectivos valores de tablas o tericos. En ambos casos se realiz un anlisis del comportamiento de los residuos pero no se observ ningn patrn de comportamiento significativo. CONCLUSIN Para el caso, ninguno de los mtodos sera validado por presentar imprecisin, inexactitud y carecer de linealidad, pero se considera ms conveniente la utilizacin del mtodo HPLC donde el comportamiento de la precisin evaluado por el %CV fue mejor que en el mtodo ultravioleta, y se puede mejorar con unos procedimientos de pesaje ms estrictos sobre la magnitud deseada de materia prima que se requiera para cada anlisis. BIBLIOGRAFA / CIBERGRAFA [1] Bedoya A, Flrez O, Holgun G. EVALUACIN DE LA CALIDAD DE LOS PRODUCTOS FARMACUTICOS. Ed. Universidad de Antioquia, Ciencia y Tecnologa, 2011. Validacin de tcnicas analticas (6), pg. 43-54, 227 [2] Validacin de los procedimientos analticos empleados en el examen de los materiales farmacuticos. Anexo 5 informe 32 de la OMS. Presentacin en PDF, visitado el 26 de abril de 2013. http://www2.paho.org/hq/dmdocuments/2008/2_anexo_5_informe_32.pdf [3] Jaume Llopis Prez. Curso de Estadstica. LA ESTADSTICA: UNA ORQUESTA HECHA INSTRUMENTO. Visitado el 28 de abril de 2013. Disponible en http://estadisticaorquestainstrumento.wordpress.com/2012/12/20/tema-15-anova/