Programa ANALISYC-II

S-2009/AGR-1464

Metodologas analticas innovadoras para el control de la calidad y la seguridad de los alimentos

GRUPO DE INVESTIGACIN: UAH-QA

QUMICA ANALTICA- UNIVERSIDAD DE ALCAL QUMICA ANALTICA-UNIVERSIDAD REY JUAN CARLOS

ACTIVIDADES CIENTFICAS Y TECNOLGICAS

Nuevos marcadores de adulteraciones de aceites de oliva: betainas y aminocidos por CE-UV, CE-MS2(IT) y FIA-MS/MS(QqQ). Obtencin rpida de hidrolizados peptdicos mediante sonda de ultrasonidos focalizada.

Separacin rpida de hidrolizados peptdicos por HPLC-Capilar. Estudio de la equivalencia de cultivos transgnicos y no transgnicos.
Determinacin de pptidos bioactivos en alimentos por HPLC-Capilar. Determinacin de proteinas anticarcinognicas en alimentos por HPLC de perfusin. Separacin y caracterizacin de protenas en aceituna y aceite de oliva por HPLC y CE. Aplicacin a la diferenciacin varietal. Separacin y determinacin quiral de insecticidas piretroides y fungicidas por CE. Determinacin de metabolitos de xenobiticos en alimentos por GC multidimensional. Nuevas estrategias de SPE para la determinacin de mercurio y hormonas.

Nuevos marcadores de adulteraciones en aceites de oliva Aminocidos no proteicos y betanas

Por primera vez se han estudiado componentes minoritarios aminoacdicos (betanas y aminocidos no proteicos) de la fraccin hidrosoluble de los aceites vegetales en busca de marcadores novedosos de adulteraciones de aceites de oliva. Estrategia innovadora: la sola presencia del marcador en el aceite de oliva muestra la adulteracin. Betanas
H3C + H3C N H3C OH O
CH3 N
+

Aminocidos no proteicos
H2N OH O

H2N O

OH

OH O N H O

OH O

Glicina Betana
H3C + H3C N H3C OH

Trigonellina
OH N
+

-Alanina
NH2 H3C OH H3C O
H2N

GABA
NH2 OH O

cido piroglutmico
NH2 H2N O NH OH O

OH

H3C

CH3 O

carnitina

Prolina betana

Allo-isoleucina

Ornitina

Citrulina

Para la bsqueda de estos compuestos en aceites vegetales se utiliz la tcnica de Espectrometra de Masas en tndem.

Los compuestos se derivatizaron a butil steres con butanol, derivatizacin rpida, sencilla y de bajo coste, para mejorar la S/N y la selectividad a travs de experimentos MS/MS gracias a la obtencin de ms iones fragmento:
R O OH

HCl
HO CH3

R O

CH3

Nuevos marcadores de adulteraciones en aceites de oliva Mtodo separativo de confirmacin

Se ha desarrollado y validado un mtodo de CE-MS2(IT) para el estudio simultneo e inequvoco de cuatro betanas o de seis aminocidos no proteicos en aceites vegetales.
Intens. 7 x10 1.25 1.00 0.75 0.50 0.25 0.00 0 2 4 6 8 10 Time [min]
0 0
0

BPE

Intens. Intens. 6 6 x10 x10

6

BPE

Betanas

1 3 2

Aminocidos
1 3 2 5

10

10

15 Time [min] [min] 15 Time

ACEITES SEMILLA OLIVA

GB SI SI

Betanas Trig PB SI NO POCO NO

Intens. 4 x10 3

Carn SI NO

GABA SI SI

Aminocidos no proteicos -Ala Pirog Orn Allo-Ile SI SI SI SI SI SI NO NO

Intens. 4 x10 6 4

Cit NO NO

marcadores de adulteraciones

Carnitina EIE

Ornitina EIE

Intens.
x105 1.0 0.8

Allo-isoleucina

La presencia de carnitinas, ornitina o allo-isoleucina en los aceites de oliva indicara de forma inequvoca su adulteracin. El mtodo permite detectar adulteraciones por debajo del 1% de aceites semilla en aceites de oliva.

0.6
0.4

1 0
x10

2 0 4 x10 6 4 2

Aceite de Soja
EIE

0.2 0.0 x105 1.0 0.8

0.6

4 3 2 1

EIE

0 4 x10 2.0

EIE

0.4 0.2 0.0 x105 1.0

0.8

0 4 x10 3 2 1
0
2 4 6 8

EIE

Aceite de Oliva virgen extra Aceite de Oliva virgen extra con 2 % de aceite de soja
20 25

Adulteraci n
1.5
1.0 0.5 0.0

0.6
0.4

Adulteraci n
EIE
25 5 Time [min]

EIE
10 Time [min]

EIE
5 10 15 Time [min]

0.2
20 0.0

Intens. 4000 3000 2000 1000 0

50 75

103.1 159.0
85.2

+MS2 (

218.0 )

Intens.

4000
3000

172.0

+MS2 (189.0)

Intens. 4 x10 1.0 0.8

10

15 Time [min ]

30

69.4 86.3

+MS2 (188.0 )

2000
1000

115.1 70.3
50 75 100 125 150 175 200 225 250 m/z

0.6 0.4 0.2 0.0 60 80 100 120 140 160 180 m/z

100

125

150

175

200

225

250

m/z

Nuevos marcadores de adulteraciones en aceites de oliva Mtodo no separativo de cribado

Se ha desarrollado y validado un mtodo de cribado por FIA-MS/MS (QqQ) en modo MRM para el estudio simultneo de cinco aminocidos no proteicos y de tres betanas en aceites vegetales.
3 x10 + Product Ion (0,156-0,966 min, 100 scans) (146,2 -> **) 4,0 57,1072,00
3,0

4 x10 + Product Ion (0,109-0,823 min, 86 scans) (200,2 -> **) 144,10 2,4 2,0
1,6 1,2 0,8 0,4 58,00 84,00 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

90,10 2,0
1,0

-Alanina

Prolina betaina
ACEITES SEMILLA OLIVA Betanas GB Trig PB SI SI NV SI SI NV -Ala NV NV Aminocidos no proteicos Pirog Allo-Ile Orn SI NV SI SI NV NO Cit SI NO

60

80

100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

3 x10 + Product Ion (0,115-0,823 min, 87 scans) (232,2 -> **) 113,10 8 6 4 2 0
60 80 159,08

70,00

Citrulina
215,20

4 x10 + Product Ion (0,124-0,817 min, 85 scans) (189,3 -> **) 70,10 1,0

0,8
0,6 0,4 0,2

Ornitina

116,10 60 80

172,19

100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

4 x10 + Product Ion (0,123-0,820 min, 86 scans) (260,2 -> **) 84,00 1,2
0,8 0,4 0

4 x10 + Product Ion (0,127-0,804 min, 81 scans) (174,2 -> **) 2,4 118,10 2,0

cido Piroglutmico
130,10

1,6 59,10
1,2

Glicina betana

158,10 102,09
60 80 186,10

0,8
0,4 0 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

Aceite Girasol Maz Soja Oliva Mezcla 10 % Mezcla 5 % Mezcla 2 %

Cit 0.15-0.16 0.17-0.2 0.23-0.24 <0.06 <0.06 <0.06 <0.06

Orn 1.1-2.9 1.4-1.6 1.1-2.2 <0.06 0.21 0.01 0.15 0.02 0.10 0.06

Aceites de semilla Aceites Oliva

100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

4 x10 + Product Ion (0,125-0,810 min, 83 scans) (194,2 -> **) 138,10 1,6 1,2 0,8 92,00

4 x10 + Product Ion (0,124-0,817 min, 85 scans) (188,2 -> **) 86,10 1 0,8
0,6

Adulteracin

Trigonellina

Allo-isoleucina
69,10

0,4 0,2

0,4
0

60

80

100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

60

80

100 120 140 160 180 200 220 240 260 Counts (%) vs. Mass-to-Charge (m/z)

El mtodo permite, sin un paso previo de separacin, realizar un cribado de las muestras de aceites de oliva no adulteradas de las posibles adulteradas en tan solo 2 minutos. Las muestras no conformes (adulteradas) se analizaran por el mtodo de confirmacin CE-MS2.

Separacin de hidrolizados peptdicos por HPLC Capilar Estudio de la equivalencia de cultivos transgnicos y no transgnicos.
Se ha desarrollado un mtodo de digestin asistida por ultrasonidos de alta intensidad para la digestin de las protenas presentes en la soja. Este mtodo ha permitido aumentar considerablemente la velocidad de la digestin permitiendo disminuir el proceso de unas 16 h a tan slo unos 30 min. Se ha desarrollado un mtodo para la separacin de los hidrolizados peptdicos por HPLC Capilar y se ha aplicado al estudio de las diferencias a nivel peptdico entre cultivos transgnicos y no transgnicos.
mAU (210 nm)

150

100

50

0 10 20 30 40 50 60

t (min)

Es posible diferenciar entre cultivos de soja transgnica y soja no transgnica

16 17 18 min

26

27

28

29 min

50 51 52 53 54 min

Determinacin del pptido bioactivo Soymetide en productos comerciales de soja por HPLC Capilar
Se ha desarrollado un mtodo por HPLC Capilar para la determinacin de soymetide, pptido con actividad inmunoestimuladora procedente de la hidrlisis enzimtica con tripsina de la soja.

Se han establecido por primera vez las cantidades de soymetide presentes en los cultivos de soja, as como en sus productos comerciales (bebidas de soja y formulas infantiles).
Los resultados han permitido establecer que en dichos productos el soymetide se encuentra en cantidades suficientes para llevar a cabo su actividad bioactiva tras su ingesta. Se ha evaluado el efecto del procesado del alimento en la cantidad de soymetide, revelando una menor relacin soymetide/protena en los productos procesados.
mAU 80

soymetide

SOYBEAN Haba de soja

60

0.5-1.7 mg/g producto

40

20

0 10 15 20 25 30 35 min

mAU 175 150 125 100 75 50 25 0

soymetide

SM1

0.1-0.2 mg/g producto

15

20

25

30

35

t (min)

 El maz contiene tres pptidos (LQP, LSP y LRP) con demostrada actividad antihipertensiva. Estos tres pptidos proceden de la fraccin proteica de las -zeinas y se obtienen a partir de la digestin de esta fraccin con la enzima termolisina. Teniendo en cuenta que el contenido en -zeinas puede variar en funcin de la variedad de maz y que no existe ningn mtodo que permita la evaluacin del contenido en estos pptidos bioactivos, se ha desarrollado, por primera vez, un mtodo que permite la extraccin de las -zenas (10 min), su purificacin, su digestin con termolisina (3 h) y su separacin por RPLC (12 min) con deteccin UV. La presencia de los tres pptidos de inters se ha confirmado mediante RPLC-ESI-Q-TOF.
Digestion de zeinas TIC Patrones de peptidos

Determinacin de pptidos antihipertensivos en maz y alimentos derivados para consumo humano

LQ P LR P LSP

EIC 357

EIC 316

EIC 316

Una vez desarrollado el mtodo, se pretende su evaluacin mediante la determinacin de algunos parmetros como son los lmites de deteccin y determinacin, reproducibilidad y recuperacin. Asimismo, se prev aplicar el mtodo a la determinacin de estos pptidos en variedades de maz de forma que sea posible encontrar qu variedades resultan ms favorables desde el punto de vista de su bioactividad. Tambin se aplicar el mtodo a la determinacin del contenido en estos pptidos en productos derivados del maiz para consumo humano.

Determinacin simultnea de las protenas anticancergenas Inhibidor Bowman-Birk y Lectina en cultivos de soja
La soja es una leguminosa con un elevado contenido en protenas habindose observado en el inhibidor Bowman-Birk (IBB, 8 kDa) y en la lectina (120 kDa) propiedades anticancerigenas. Concretamente, el IBB ha sido reconocido por la FDA como un nuevo frmaco en investigacin. Se ha desarrollado, por primera vez, un mtodo que permite la extraccin (5 min) y determinacin (8 min) simultnea y rpida de ambas protenas. Se ha confirmado la identidad de las protenas mediante RP-HPLC-MS.

La evaluacin del contenido de estas protenas en diferentes variedades de soja ha demostrado que no todas las variedades de soja son equivalentes observando claras diferencias en los contenidos de IBB que variaban entre 0.28-1.03 mg/100 mg y en los contenidos de lectina que variaban entre 0.22 y 0.62 mg/100 mg.

Desarrollo de metodologas para la obtencin de perfiles proteicos a partir de hueso y pulpa de aceituna por UHPLC. Aplicacin a la diferenciacin varietal.
Existen ms de 2000 variedades de olivo muchas de las cuales se consideran homnimas o sinnimas lo que dificulta an ms la diferenciacin de este cultivo. Con fines a proteger la diversidad gentica del olivo, facilitar su mejora gentica y asegurar la trazabilidad del cultivo y del aceite de oliva extrado se ha evaluado, por primera vez, la capacidad de las protenas contenidas en la aceituna como marcadores de origen de este cultivo. Se han desarrollado mtodos cromatogrficos empleando, por primera vez, fases estacionarias con tamao de partcula inferior a los 2 m (columnas de UHPLC) para separar protenas intactas.
19
Discriminant function 2
Arbequina Bouteillan Carrasqueo Changlot Real Cobrancosa Corbella Cordovil Dokkar Dolce Agogia Erbek Yaglik Frantoio Kalokerida

11
Discriminant function 3

14 9 4 -1 -6 -11 -10 -6 -2 2 6 10
Discriminant function 1

6 1 -4 -9 -8 -4 0 4 8 12
Discriminant function 1

Arbequina Bouteillan Carrasqueo Changlot Real Cobrancosa Corbella Cordovil Dokkar Dolce Agogia Erbek Yaglik Frantoio Kalokerida

Los mtodos desarrollados han permitido obtener perfiles proteicos a partir del hueso de la aceituna que han permitido la diferenciacin entre variedades de aceituna.

En el caso de la pulpa de la aceituna se ha observando por SDS-PAGE la presencia de una amplia banda con un peso molecular de 23 kDa en todas las variedades estudiadas. La digestin y anlisis por espectrometra de masas de esta banda ha permitido la identificacin de una protena mayoritaria de carcter alergnico de la familia de las taumatinas y de otras protenas minoritarias como una superxido dismutasa, una protena portadora de grupos acilo o una protena inducida por sequa.

Caracterizacin de protenas de aceituna y diferenciacin de distintos tipos de aceitunas mediante Electroforesis Capilar
25.3 KDa

4
13.9 KDa 22.1 KDa

30.0 KDa

16.3 KDa

4 8.1 KDa

53.5 KDa

11.1 KDa

Se ha determinado la masa molar de las protenas presentes en aceituna por electroforesis capilar en gel (CGE-DAD). Se han identificado ocho protenas, de las cuales siete son comunes en veinte variedades de aceituna.

mUA

20 KDa

-2
10 KDa

50 KDa 35 KDa 100 KDa 'Alameo de Cabra' 150 KDa 225 KDa

-4

Size standards

10

15

20

25

min

Se ha combinado un mtodo de extraccin de protenas en aceituna sencillo con una metodologa por electroforesis capilar selectiva para obtener, por primera vez, perfiles proteicos caractersticos para cada tipo de aceituna de mesa estudiada: Gordal, Manzanilla y Cacerea.
180 160 140 120

* * *
Manzanilla

180 160 140

MAZ2 MAZ5

180

* * ** * ** * * * * * ** * * * * * * * * ** * * *

Gordal

160
GOR5

**

* * * **

Cacerea

* ** * * ** * ** * * * * ** * *
25 30 35
GOR2

* *

* * *
CAC4 CAC5

mUA

100 80 60 40 20 0

* * ** ** ** * ** * * **
15

* * ** * * * * ** * * * * * * * * ** *

140 120 100

120 100

** *

* * ** * * * *

mUA

mUA

MAZ1

80 60

GOR1

80 60

**

* * *

CAC3

*
GOR3

MAZ4

40 20

40 20

** * ** **
20

* **
25

CAC1

* * **
20 25 30 35 40

GOR4

MAZ3

** min
30 35 40

0 15 20 40 45

CAC2

0 15 45

45

min

min

 Desarrollo y validacin de un mtodo por CD-MEKC para la separacin y determinacin quiral del

Separacin y determinacin quiral de insecticidas piretroides y fungicidas por CE

40

insecticida piretroide cis-Bifentrina.

cis-Bifentrina
100 mM SC - 20 mM TM--CD en 100 mM tampn borato (pH 8.0) con 2 M urea
mAU

commercial formulation
20

standard solution
0 4 6 8 10 12

t (min)

Desarrollo y validacin de mtodos por CD-EKC para la separacin quiral de los fungicidas metalaxil y benalaxil y la determinacin de cualquiera de stos en mezclas binarias con el fungicida folpet. Aplicacin al control de productos comerciales y la determinacin del porcentaje de impureza enantiomrica.
Benalaxil Metalaxil Impureza enantiomrica

5 mM succ--CD en 50 mM tampn MES (pH 6.5) con 2 M urea

15 mM succ--CD en 50 mM tampn MES (pH 6.5) con 2 M urea

10

a)

Folpet Enantiomers of benalaxyl

80

Folpet
a)

Metalaxyl-M S-metalaxyl Standard solution

68

5%

Enantiomeric impurity S-metalaxyl

Standard solution
b)

66

mAU

mAU

Folpet
0
b)

mAU

Metalaxyl-M

Sample 1
64

4%

Enantiomers of benalaxyl Sample 3

60

c)

Metalaxyl-M

Folpet

Sample 2

62

-5
10 12
t (min)

14

8
t (min)

10

12

10
t (min)

12

14

Determinacin de xenobiticos en alimentos por GC multidimensional (Heart-cut GC)

Se ha evaluado la capacidad de resolucin quiral de cuatro columnas diferentes hacia una serie de PCBs y sus
metil sulfonados (MeSO2-PCBs) utilizando la cromatografa de gases multidimensional en su modo heart-cut.
5-MeSO2-CB 132 4-MeSO2-CB 132 4-MeSO2-CB 149 5-MeSO2-CB 174 5-MeSO2-CB 149 4-MeSO2-CB 91

metabolitos

El empleo de las columnas DB-5/BGB-176SE, ha permitido

la separacin simultnea MeSO2-PCBs quirales. de 6 PCBs quirales y 6

PCB 149

PCB 176

El mtodo desarrollado se ha aplicado al anlisis de dos

muestras de aceites de pescado y una muestra de hgado de ternera.

Se ha observado un enriquecimiento enantioselectivo de los PCBs 91 y 176 en las muestras de aceite de pescado
4-MeSO2-CB 91

PCB 136

PCB 45

PCB 95

PCB 91

4-MeSO2-CB 132

5-MeSO2-CB 132

5-MeSO2-CB 174

5-MeSO2-CB 149

4-MeSO2-CB 149

Spiked sample (10 pg/L) Codfish oil sample

Se ha detectado la presencia de algunos de los MeSO2-PCBs en alguno de los alimentos analizados

ACTIVIDADES DE DIFUSIN
Resumen publicaciones 2010: 2 captulos de libro internacionales 13 artculos cientficos en revistas de reconocido prestigio internacional (SCI)

J. Chromatogr. A Electrophoresis J. Agric. Food Chem. Food Chem.

4 4 4 1

ACTIVIDADES DE DIFUSIN
Resumen publicaciones 2011: 1 captulos de libro internacional 7 artculos cientficos en revistas de reconocido prestigio internacional (SCI)

J. Chromatogr. A Electrophoresis Anal. Chim. Acta Crit. Rev. Food Sci. Nutr.

3 2 1 1

ACTIVIDADES DE DIFUSIN

Participacin en congresos 28th International Symposium on Chromatography, ISC 2010. Valencia. Septiembre 2010.

ACTIVIDADES DE DIFUSIN
Participacin en la X Semana de la Ciencia Noviembre 2010 La quiralidad en el control de la calidad y seguridad de los alimentos Antonio Crego, Maria Luisa Marina, Laura Snchez, Elena Domnguez Alimentos funcionales por qu y para qu? Maria Concepcin Garca, Clara Esteve.

ACTIVIDADES DE DIFUSIN
Participacin en el Taller Qumica en accin 9 Edicin. Enero 2010. Maria Luisa Marina y Maria Concepcin Garcia. 10 Edicin. Enero 2011. Maria Concepcin Garca y Maria Angeles Garca.

ACTIVIDADES DE DIFUSIN

EXPRESIONES DE INTERS MARZO 2011

TV Castilla La Mancha. Reportaje en CM en vivo. Revista Mercacei. Publicacin aceite de oliva y olivar. Difusin internacional. www.mercacei.com. Noticia. Diario digital de la UAH Notiweb. Madri+d Revistas y plataformas de difusin

EXPRESIONES DE INTERS DE EMPRESAS

GRUPO HOJIBLANCA Carretera de Crdoba s/n 29200 Antequera (Mlaga)

CURSOS Y SEMINARIOS
1. X Curso de Cromatografa de Lquidos acoplada a la Espectrometra de Masas como herramienta analtica. PPQF Organizador y participante: Dr. Antonio Crego. Junio 2010.
XI Curso de Cromatografa de Lquidos acoplada a la Espectrometra de Masas como herramienta analtica. PPQF Organizador y participante: Dr. Antonio Crego. Junio 2011. Curso terico-prctico de Cromatografa de Lquidos acoplada a la Espectrometra de Masas. Aula Cientfica Organizador y participante: Dr. Antonio Crego. Febrero 2010. Cursos de Sistemas de Calidad en Laboratorios de Ensayo y Calibracin. RLA Participante: Dr. Antonio Crego. Mayo 2010 y Marzo 2011.

2.

3.

4.

CURSO TERICO-PRCTICO de Cromatografa de Lquidos acoplada a la Espectrometra de Masas

23-26 febrero 2010