PRCTICA 2.

- CICLO CELULAR EN CLULAS VEGETALES Recordatorio terico El estudio citolgico del ciclo celular se bas tradicionalmente en el anlisis de la mitosis, ya que ste es el momento en que se producen alteraciones morfolgicas de las clulas fcilmente apreciables. Mitosis es sinnimo de cariocinesis o divisin del ncleo y su punto de comienzo se identifica al microscopio ptico por las transformaciones que sufre el ncleo en el que empiezan a hacerse patentes los cromosomas. El final de la mitosis se produce al terminar la desespiralizacin de los cromosomas que dejan as de ser visibles. Solapada con el final de la mitosis se produce la divisin del citoplasma o citocinesis. El conjunto de la mitosis ms la citocinesis es la divisin celular. Al finalizar sta comienza la interfase. Meristemo radicular. Material biolgico: cebolla (Allium cepa). Cerca del extremo apical de las races se encuentra un conjunto de clulas que proliferando hacen que crezca la raz. Es la zona meristemtica cuyas clulas sufren ciclos celulares continuos y en condiciones normales no tienen sincronizacin alguna entre ellas.
CORTE TRANSVERSALDE PICE DE RAZ DE CEBOLLA clulas diferenciadas divisin celular interfase ciclo celular clulas con estatolitos cofia meristemo eje de crecimiento Al dividirse las clu la s se o rien tan seg n el eje de crecimiento de la ra z. A s, a l h ac er la s pr e pa ra c io n e s se o b s e rv a r n n o rm a lm e n te d es d e u na p e rs p e ctiva la te ra l . s o n m u y ra r a s l a s clulas que presenten una perspectiva polar

Si se pudiera hacer una pelcula del desarrollo de un meristemo radicular se podra observar cmo cada clula despus de la interfase entrara en divisin y dara lugar a dos clulas hijas. Se podra calcular directamente la duracin de cada etapa lo que proporcionara una idea de la complejidad de cada proceso y su intensidad metablica. Sin embargo al hacer una preparacin lo que se obtiene es una instantnea, una foto fija del meristemo a travs de la cual tambin pueden determinarse parmetros de inters ya que al no existir sincronizacin cada clula sigue ciclos celulares independientemente del resto y, mientras ms largo sea un proceso o una etapa del ciclo celular, ms clulas se encontrarn en ella mientras que si la etapa es corta las clulas pasarn poco tiempo en ella y ser ms difcil que en la foto fija se encuentren muchas clulas de esa fase. Si en una preparacin se localiza una zona meristemtica y se contabilizan clulas en divisin y clulas en interfase, se puede tener una estima indirecta del tiempo de duracin de una respecto a la otra o a todo el ciclo celular. La citocinesis (que es parte de la divisin celular) se desarrolla en su mayor parte de manera coincidente con el final de la mitosis, de tal forma que la divisin termina slo un poco despus del final de la cariocinesis. Teniendo en cuenta esto y la dificultad que entraa la determinacin del final de la citocinesis, para el desarrollo de la prctica se puede asumir como mnimo el error de contabilizar las clulas que no estn en mitosis como clulas en interfase. Para poder realizar el conteo y teniendo en cuenta que el lmite entre interfase y principio de mitosis es tambin difcil de determinar, deben precisarse caractersticas celulares observables al microscopio ptico que permitan la identificacin sin duda alguna de la etapa en que se encuentre la clula que se analiza. b) FOTO G RA FA S DE CO RTE LON GIT UDIN AL DE RAZ DE Allium cepa. a)40 aumentos. b)100 aumentos
a)

CLULA EN INTERFASE: Presenta un ncleo redondeado con un granulado muy fino y continuo (algunas zonas ms intensamente teidas y otras menos pero sin discontinuidades). La envoltura nuclear aunque no se ve, forma un crculo que limita el ncleo. En nmero de 1 o 2 se aprecian zonas ms claras, transparentes, que son los nucleolos (1). Cuando las clulas van a entrar en mitosis aparecen ms voluminosas y el ncleo mucho ms grande (2). CLULA EN MITOSIS: Estn en mitosis todas las clulas en las que se observan cromosomas. El principal problema consiste en identificar en comienzo de la mitosis, que coincide con el de la divisin celular, y el final de la mitosis que se solapa con la citocinesis. Comienza la mitosis con el inicio de la espiralizacin de los cromosomas. En la prctica se consideran en mitosis las clulas en las que se puede apreciar una tenue concentracin de la cromatina dejando espacios ms claros a modo de canales entre los grumos alargados (3).

Los ltimos momentos de la mitosis estn definidos por la desespiralizacin de los cromosomas en telofase (12). Mientras se observen, aunque sea como tenues cmulos de cromatina con canales entre ellos, se considera que persiste la mitosis Para diferenciar clulas en profase temprana de clulas en telofase tarda debe tenerse en cuenta que en esta ltima suele haber dos clulas del mismo tamao, sincrnicas y juntas. Si por causa de la tcnica se separasen las clulas hijas se tendran en cuenta otros criterios como que los ncleos en profase son mayores que los de las clulas en interfase y los de telofase no; los estrechos canales entre los cromosomas en telofase son muy paralelos mientras que en profase son ms irregulares. NDICE DE MITOSIS: Una vez establecidos los lmites, se pueden clasificar las clulas meristemticas que se cuenten; por ejemplo, si se contabilizan 100 clulas del meristemo, habr X en mitosis y 100-X ser el resto que se toman como interfases. Las 100 clulas tomadas de forma aleatoria son representativas de todo el meristemo y, por tanto, de todo el ciclo celular. De esta manera las X que estn en mitosis son una muestra proporcional de todas las que estn en mitosis y 100-X de las que estn en interfase. Se define el ndice mittico (Im) como la relacin entre el nmero de clulas que estn en mitosis dividido por el nmero total de clulas contabilizadas. En el ejemplo: Im = X/100 Im resulta ser una estima del tiempo del ciclo celular que est dedicado a la mitosis. Es una medida relativa y por tanto carece de unidades.
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ANLISIS DE LA MITOSIS: Del mismo modo que se hace el estudio de la mitosis dentro del ciclo celular se pueden analizar las fases de la mitosis en la divisin del ncleo. Sin olvidar en ningn momento que la cariocinesis es un proceso continuo, para su estudio se divide en varias etapas que tienen que ver con cambios conformacionales, es decir que pueden diferenciarse por la observacin en el microscopio ptico de clulas en divisin. Desde el comienzo de la espiralizacin hasta la desorganizacin de la envoltura nuclear se le denomina profase; desde la rotura de la envoltura hasta la colocacin de los cromosomas en un plano y en el centro de la clula se le llama prometafase; la disposicin de los cromosomas en el plano central de la clula con los centrmeros tensionados por su unin a la fibras de huso mittico constituye la metafase; la migracin de las cromtidas a los polos se conoce como anafase y la organizacin de la envoltura nuclear y desespiralizacin de los cromosomas constituye la telofase. IDENTIFICACIN DE LOS LMITES DE LAS FASES MITTICAS: El comienzo de la profase se identifica como el comienzo de la divisin (3). Se consideran en profase aquellas clulas que tienen envoltura nuclear que se intuye al microscopio ptico por el contorno redondeado que tiene el ncleo o el conjunto de los cromosomas sea cual sea el grado de espiralizacin de stos (4). 1 2 3 4 5 6

interfase

clula preparada para divisin 8 9

profase temprana 10

profase media 11

prometafase temprana 12

prometafase 13

metafase

anafase temprana

anafase media

anafase tarda

telofase

telofase tarda

interfase

Empieza la prometafase cuando se desorganiza la envoltura nuclear que se detecta porque el conjunto de los cromosomas pierde su contorno circular (5). La prometafase media presenta los cromosomas dispersos por la clula (6) y dura hasta que todos los cromosomas se colocan en la placa ecuatorial o plano central de la clula, despus de unirse los centrmeros a las fibras del huso. La colocacin de todos los centrmeros en el plano central identifica el comienzo de la metafase (7). El nmero de cromosomas de Allium cepa (2n=16) hace difcil que se puedan ver bien independientemente por lo que se clasifican las clulas en metafase por la existencia de una marcada banda central y la ausencia de centrmeros fuera de esa banda. El comienzo de la anafase (migracin de cromtidas hermanas a polos diferentes) es difcil de ver por la gran cantidad de material cromatnico que hay en la zona central de la clula. En la prctica se puede determinar porque la escisin del centrmero y el arrastre de las zonas pericentromricas en el comienzo de la migracin , hacen que se forme una sub-banda ms clara dentro de la marcada banda central (8); de esta forma puede determinarse el comienzo de la anafase. Adems se identifican como anafases las clulas en las que hay dos grupos de cromosomas migrando a los polos y cada uno de estos grupos tiene un contorno de trapecio issceles con los centrmeros coincidiendo con la base pequea (9). Termina la migracin con un grupo de centrmeros en las proximidades de cada polo (10). Se identifica el comienzo de la telofase por el contorno redondeado de cada bloque de cromosomas en el que adems, por esa disposicin convergente en un espacio pequeo, puede quedar algn brazo cromosmico situado hacia el exterior de la clula (11). El final de la telofase se considera que coincide con la desespiralizacin de los cromosomas (12) y se identifica como se ha descrito en el final de la divisin.
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REALIZACIN DE PREPARACIONES: Material biolgico: races de cebolla de 2 - 3 cm. de longitud GERMINACIN: Se limpian las zonas radiculares de las cebollas eliminando las capas secas. Se coloca la zona radicular en contacto con agua, si es posible bien aireada, entre 20 y 22 C. Cambiar el agua al menos 2 veces al da. FIJACIN: Cortar races de 2 a 3 centmetros y sumergir en etanol-actico 3:1 recin hecho durante un mnimo de 20 minutos. CONSERVACIN: En el congelador, si es posible a -18C. PREPARACIN DE MUESTRAS (Las preparaciones pueden hacerse con material fijado o fresco) TINCIN: Se colocan 3 o 4 races en un vidrio de reloj con orcena clorhdrica al 2%. Se calienta sobre un mechero hasta la emisin de vapores blanquecinos y se deja enfriar durante 5 minutos. Repetir la operacin. Calentar igual por tercera vez y dejar enfriar 10 minutos. Aadir orcena clorhdrica al 2% siempre que se corra el riesgo de que se sequen las races. REALIZACIN DE PREPARACIONES: Se toma una de las raicillas teidas y se deposita sobre un porta limpio. Se separan 1,5 o 2 mm. del extremo apical de la raz (es el ms redondeado) y el resto se tira. Se aade una gota de orcena actica al 1% o de actico al 45% sobre el meristemo separado y con cuidado se deposita un cubre y se golpea suavemente con el mango de una lanceta para lograr la extensin de las clulas. Con un trozo de papel de filtro se elimina el exceso de colorante sujetando con el papel porta y cubre para que este no se desplace lateralmente y presionando sobre el cubre con el dedo. A partir de este momento pueden realizarse las observaciones al microscopio. PREPARACIONES PERMANENTES: Se enfra la preparacin con un chorro de nieve carbnica o por inmersin en nitrgeno lquido. Cuando est congelada la zona de material biolgico se separa con una cuchilla el cubre y se introduce el porta, al que se habr quedado pegado el material, en alcohol etlico al 100% durante un mnimo de 15 minutos. Se saca el porta del alcohol, se seca y se le coloca un cubre limpio con una gota de Entellan o similar. OBSERVACIN DE LA PREPARACIN Objetivo 4x: Se observa la bondad de la extensin y aplastamiento de las clulas, si se ha conseguido o no una monocapa celular (esto se detecta moviendo ligeramente el tornillo micromtrico para enfocar distintos planos) y si el grado de tincin es el adecuado. Con estos aumentos los ncleos se ven como diminutos puntos oscuros. Las clulas meristemticas son ligeramente mayores y ms cuadradas que el resto que son ms rectangulares. Objetivo 10x: Se localiza la zona en la que se observan clulas en divisin. (Los cromosomas se aprecian como manchas ms intensamente coloreadas). Localizada la zona meristemtica se proceda a la identificacin y estudio de las clulas en divisin (objetivo 40x). DATOS DE LA MITOSIS. -Recuento de 100 clulas seguidas, diferenciando las que estn en divisin de las que estn en interfase. -Determinacin del ndice de mitosis o de divisin: ID= Im = n cels. en div./ n cels. en div. + n cels. en interfase DATOS PERSONALES: DATOS DE GRUPO: n cels. div.= n total cels. div.= n cels. interf.= n total cels. interf.= n total cels.= n total cels.=
Im = = Im = =

COMENTARIOS:

ANLISIS DE LAS FASES MITTICAS: S obr e la m is m a preparacin utilizad a par a el anterior estud io, buscar la zona m eris tem tica y contabilizar con el objetivo de 40 aumentos todas las clulas en divisin nuclear que vayan apareciendo en el campo hasta un mnimo de 50 por equipo. -Recuento de 50 clulas en mitosis anotando la fase en que se encuentran PROFASE n PROMETAFASE n METAFASE n ANAFASE n TELOFASE n

-Clculo de los ndices de fase: (relacin entre el n de clulas en cada fase y el n de clulas en divisin). n total de mitosis = profases + prometafases + metafases + anafases + telofases = I prof.= n prof. = n mit. = n ana. I ana.. = = n mit. n promet. I promet. = = n mit. = = I tel. = n tel. = n mit. I met. = n met. = n mit. = =

Teniendo en cuenta el bajo nmero de clulas contadas, el nmero relativamente elevado de clases y, como se ver ms adelante los diferentes valores esperados para cada clase, es fcil que en este conteo se encuentren errores de muestreo considerables. par evitarlos se procede a la suma por clases de los d atos de tod os los equipos d el gr upo de prc ticas, repitiend o e l an lis is d espus c on nm er os suficientemente altos para realizar el anlisis estadstico con ciertas ,garantas. DATOS DEL GRUPO: n n n n n PROFASE I prof.= n prof. = n mit. PROMETAFASE = n ana. I ana.. = = n mit. METAFASE n promet. I promet. = = n mit. = = I tel. = n tel. = n mit. ANAFASE TELOFASE =

I met. = n met. = n mit. =

-Comentar y explicar las diferencias entre los datos personales y los del grupo de prcticas. -Relacionar estos ndices de grupo con la duracin de cada fase en la mitosis -Comparar los resultados con los tericos que indican que, en condiciones normales por cada anafase deben encontrarse 2 metafases (se consideran metafases como la suma de prometafases y metafases), por cada metafase deben encontrarse 2 telofases y por cada telofase 2 profases.. proporcin
53,33%

DATOS TERICOS DATOS DE GRUPO DATOS PERSONALES

26,67% 13,33% 6,67%

PROFASE

PROMETAFASE + METAFASE

ANAFASE

TELOFASE

COMENTARIOS: (aadir hoja)

TRATAMIENTO CON COLCHICINA COLCHICINA: Generalidades El nmero de cromosomas de una clula es caracterstico de la especie, es decir, todos los individuos de una especie tienen el mismo nmero de cromosomas en cada una de sus clulas somticas. Para la determinacin del nmero de cromosomas de una clula se buscar aquella fase mittica en la que los cromosomas estn ms espiralizados e independientes entre s: la metafase. No obstante en muchas ocasiones resulta muy difcil el conteo an en metafase por lo que se recurre a tratamientos especiales para aumentar la espirilizacin de los cromosomas. La colchicina es una droga que se extrae del Colchicum hispanicum y cuyo efecto tiene como consecuencia la despolimerizacin de la tubulina que forma las fibras del huso. Al no formarse huso los cromosomas no se colocan en placa y siguen espiralizndose, acortando su longitud, separndose ms entre s y facilitando su conteo. La colchicina acta de forma casi instantnea pues penetra en las clulas rpidamente, y de la misma manera se elimina fcilmente lavando y poniendo de nuevo agua en la germinacin de los bulbos. Si el tiempo de tratamiento es muy largo las clulas tratadas se mueren, pero si el tratamiento no es suficientemente largo como para producir el bloqueo de la clula, cuando se elimina la colchicina se recupera la actividad metablica normal y se contina la divisin. Si el tratamiento con colchicina es muy corto, slo se alterarn las etapas de la mitosis muy prximas al momento de accin de la droga y mientras ms se prolongue el tratamiento ms se extendern los efectos, alcanzando as progresivamente distintas fases mitticas. tiempo de tratamiento
poblacin de clular afectadas por el tratamiento tiempo de tratamiento

unin de cromosomas al huso (si existe).

CICLO CELULAR +

mitosis

CICLO CELULAR clulas en mitosis clulas acumuladas clulas en interfase As a la vez que se estudian los efectos de la colchicina sobre la divisin, puede determinarse, la fase en que se unen los cromosomas al huso (habr acumulacin en ese momento), las fases anteriores (tericamente no deben presentar modificaciones en sus ndices), y el orden de las fases posteriores (irn rebajando sus ndices hasta desaparecer, tanto ms tempranamente cuanto ms cercanas sean al momento de unin de los cromosomas al huso). Durante la acumulacin las clulas no avanzan en la mitosis pero los cromosomas siguen espiralizndose, lo que acorta su longitud y facilita el estudio de su morfologa y la determinacin del nmero cromosmico de la especie. Por ltimo, si el tratamiento se prolonga, las cromtidas terminan por separarse y si se elimina despus de este momento la colchicina las clulas pueden pasar directamente a interfase, producindose la duplicacin del nmero de cromosomas (en este caso de 2n pasara a 4n, siendo las clulas tetraploides viables, de mayor tamao y, si despus de completar la interfase entran de nuevo en mitosis pueden observarse los 4n cromosomas).

TRATAMIENTO CON COLCHICINA: (Se parte de bulbos de cebolla germinados con races de entre dos y tres centmetros). 1.- Preparar colchicina al 0.1% (0.1 g. de colchicina en 100 c.c. de agua. (Agitar sin formar espuma). 2.- Sumergir las races en la solucin y seguir el siguiente protocolo: a los 20 min.- Cortar races y fijar en etanol actico 3:1 recin hecho. Conservar en el congelador (-18C) a los 40 min.- idem a los 60 min.- idem a los 90 min.- idem a los 120 min.- idem

3.- Hacer preparaciones (con el mismo procedimiento anteriormente utilizado) con races tratadas durante distintos tiempos. 4.- Contar 50 clulas en divisin y determinar los ndices de fase en cada preparacin:.
PROFASE PROMETAFASE METAFASE ANAFASE TELOFASE

20 40 60 90 120 150 Para evitar en lo posible los errores de muestreo que se pueden cometer al contabilizar un nmero tan pequeo de clulas por persona se procede a sumar los datos de todos los equipos del grupo de prcticas. DATOS GLOBALES: n 20 40 60 90 120 150 Representar grficamente para cada fase mittica la evolucin de los porcentajes a lo largo de los tiempos de tratamiento, y tomando como datos de tiempo cero los obtenidos en el anlisis de lo mitosis sin colchicina (1 parte de la prctica). % 50 40 30 20 10 5 0 20 40 60 90 120
ANAFASE PROFASE PROMETAFASE

METAFASE

ANAFASE

TELOFASE

tiempo de 150tratamiento

Tericamente, si la acumulacin se produce en prometafase, al representar grficamente porcentajes de cada fase a lo largo del tiempo de tratamiento, se esperara: % GRFICA TERICA 50
40 30 20 10 5 0
ANAFASE

tiempo de 150tratamiento

40 90 120 20 60 Sin embargo, de modo sistemtico se observan ligeras modificaciones a estas grficas producidas por los siguientes fenmenos: -La colchicina alarga ligeramente la profase (al no formarse el huso la envoltura nuclear parece que resulta ms persistente) por lo que se espera que la grfica de las profases no sea plana sino que tenga un ligero repunte a los 20 o 40 minutos de tratamiento. -Aunque en los primeros momentos de tratamiento entran en mitosis tantas clulas como salen, cuando se agoten las fases posteriores a la acumulacin y sigan entrando el mismo nmero de clulas en profase, cada vez habr ms clulas en mitosis por lo que la proporcin de profases decrecer ligeramente. (Como de profase a prometafase siguen pasando el mismo nmero de clulas tambin se ralentizar ligeramente el aumento en la proporcin de prometafases). % GRFICA ESPERADA 50
40 30 20 10 5 0
ANAFASE

40 90 120 20 60 COMENTARIOS: (comparar la grfica obtenida con la esperada tratando de justificar razonadamente las diferencias existentes). (Aadir hoja si es necesario).

tiempo de 150tratamiento