B.cel. Extraccion Del Adn 2

Bruce Wallace
FHE=H7C7:;BB78EH7JEH?E
:;8?EJ;9DEBE=7
0uia para el estudiante
5ta. edicin
Prefacio
Prefacio
La importancia de la ciencia que estn por aplicar a veces se da
por sentada ya que los protocolos se han estudiado y se han
vuelto a estudiar una y otra vez, de modo que exista una
alta probabilidad de que tengan xito y obtengan el producto
molecular deseado. El trabajo que estn a punto de realizar se
basa en una ciencia desarrollada por cientcos galardonados
con el Premio Nobel. Werner Arbor, Daniel Nathans y Hamilton
Smith recibieron este premio por su trabajo con enzimas de
restriccin. Stanley Cohen, Paul Berg y Herb Boyer lo recibieron
por obtener la primera molcula de ADN recombinante. La
molcula de ADN recombinante que ustedes utilizarn va
ms all de su trabajo porque emplea el gen de un organismo
eucariota, en lugar de uno procariota. Hace apenas unos
aos, en 1993, Kary Mullis recibi el Premio Nobel por el
descubrimiento de la reaccin en cadena de la polimerasa, una
suerte de qumica elegante que utilizarn en el Laboratorio 8.
De modo que la ciencia que aprendern durante las prximas
semanas es muy importante y continuar teniendo un papel
importante en el desarrollo de la biotecnologa y la medicina.
Su profesor merece buena parte del crdito por hacer que
esta experiencia de laboratorio sea posible. Si bien Amgen
provee los equipos y suministros necesarios para implementar
los laboratorios, para que fuera posible utilizarlos, su profesor
ha aportado muchas horas de preparacin, a menudo durante
las noches y los nes de semana. Si han disfrutado de esta
experiencia de laboratorio, recuerden agradecerle a su profesor
por haberla hecho realidad.
Este programa de extensin educativa es en gran medida
el resultado del esfuerzo del Dr. Bruce Wallace, cientco
de Amgen, que crea fervientemente que la industria de
la biotecnologa tena la responsabilidad de contribuir a
la educacin cientca de nuestra sociedad. Antes de su
fallecimiento, el Dr. Wallace logr ver su programa de
extensin educativa crecer y evolucionar hacia la aventura del
descubrimiento que usted est a punto de iniciar.
Estamos en condiciones de traer este programa a su
establecimiento gracias a varias sociedades importantes: la
Fundacin Amgen, la Fundacin de Pierce College, el Centro de
Biotecnologa del Condado de Orange/Los Angeles, el Instituto
Bio-Bridge (biobridge.ucsd.edu/a1), New England Biolabs,
Fotodyne, Invitrogen, Rainin Pipettes, VWR y Bio-Rad.
Si tienen alguna pregunta sobre estas prcticas de laboratorio,
no duden en enviarme un correo electrnico a la direccin que se
indica a continuacin.
Martin Ikkanda
Profesor de Biologa
Los Angeles Pierce College
IkkandMJ@piercecollege.edu
Diseo del manual de laboratorio por Lucy Reading
lustracin de la tapa, cortesia de Ken Eward
Tabla de Contenidos
DC;HE:;
B78EH7JEH?E
'
Tabla de
Contenidos
(
(W
)
*
+
*W
+W
,
-
.
DEC8H;:;BB78EH7JEH?E
Introduccin a los
microvolmenes y el pipeteado
Anlisis de restriccin de
pARA y pKAN-R
Digestin de restriccin de pARA-R
Introduccin a los plsmidos y
las enzimas de restriccin
Ligacin de fragmentos de
restriccin de pARA y pKAN-R
Produccin de un plsmido
recombinante: pARA-R
Conrmacin de la restriccin y
la ligacin utilizando
electroforesis en gel de agarosa
Conrmacin de la digestin de
restriccin de pARA-R
Transformacin de la
Escherichia coli con un
plsmido recombinante
Transformacin de la
Escherichia coli
con pARA-R

Preparacin de un cultivo
overnight de la Escherichia coli
Puricacin de mFP a partir de
un cultivo overnight
Extraccin del ADN genmico de
clulas epiteliales bucales
F=?D7I
1.1 1.6
2.1 2.3
2a.12a.4
3.13.3
4.14.4
4a.14a.4
5.15.6
5a.15a.4

6.1 6.2

7.1 7.6
8.1 8.5
Tabla de Contenidos
Laboratorio 11
1.1
Introduccin a los
microvolmenes y el pipeteado
El propsito de esta prctica de laboratorio
es ofrecerles experiencia en el uso de algunas de las
herramientas y las tcnicas importantes ms comunes
en la biologa molecular y presentarles algunas de las
mediciones volumtricas de uso ms frecuente en este
campo de la ciencia. Se les brindar la oportunidad de
practicar algunas de las destrezas que necesitarn para
construir una molcula de ADN recombinante. Los
instrumentos y suministros que utilizarn durante las
prximas semanas son idnticos a los que se utilizan en los
laboratorios de investigacin.
Si bien los fundamentos tericos sobre los que se han
construido la biotecnologa y las ciencias de ADN se
remontan a principios de 1900, la mayora de las tcnicas
de laboratorio empleadas son relativamente recientes.
Y, aunque las tcnicas que irn aprendiendo en las
prximas semanas se han vuelto de rutina en los modernos
laboratorios de investigacin, son pocos los estudiantes
secundarios y universitarios que tienen la oportunidad
de experimentar la biologa molecular con tal grado de
sosticacin.
Cada vez que asistan a una clase de qumica, una de las
cosas que notarn rpidamente ser las diferencias en las
cantidades de reactivos y productos qumicos que em-
plean. En un laboratorio de qumica tpico, los volmenes
se miden en grandes cilindros graduados. Por lo general,
las soluciones se miden en volmenes de 50, 100 200
mililitros (ml). Generalmente, el peso de los elementos
slidos se expresa en gramos (g). En el laboratorio de
biologa molecular, por lo general los volmenes se miden
en microlitros (l); donde 1 l equivale a 0.001 ml. El peso
a menudo se expresa en trminos de microgramos (g) o
nanogramos (ng), donde 1 g equivale a 0.000001 gramo
y 1 ng equivale a 0.000000001 gramo.
Quizs se estn preguntando por qu los bilogos
moleculares emplean volmenes y cantidades de material
tan pequeos. El motivo se relaciona con el costo de estos
materiales y lo difcil que resulta obtenerlos. Por ejemplo,
en el prximo laboratorio recibirn algunos plsmidos
diseados especialmente (ADN). Si este ADN se vendiera
por libra, sta costara unos 360 millones de dlares.
De modo que no se sorprendan si slo les entregamos una
cantidad diminuta de molculas de ADN. La razn por la
que estos productos qumicos son tan costosos se relaciona
con la dicultad para prepararlos en forma pura. Muchos
de estos productos qumicos se producen en organismos
vivos, como las bacterias, y deben puricarse y separarse
de las otras miles de sustancias presentes en la clula. Sin
embargo, la biologa molecular realmente requiere este
nivel de pureza y precisin. A medida que realicen este
trabajo de laboratorio, recuerden que estn realizando
biologa molecular como en el mundo real.
Laboratorio 11
1.2
Los protocolos de biologa molecular exigen la utilizacin
de micropipetas ajustables. Las micropipetas se emplean
para verter diferentes volmenes de lquidos. Si bien los
investigadores tienen varios tipos de micropipetas en su mesa
de trabajo, estos laboratorios han sido diseados para utilizar
una P-20. Esta pipeta est fabricada para verter entre 2 y 20
l. Se trata de un instrumento de precisin de alta calidad y es
fundamental que aprendan a usarlo correctamente.

Les pedimos que lean y sigan estas precauciones:
La micropipeta digital
No denan el ajuste por debajo de 2 l ni por encima
de 20 l, a menos que su profesor se los indique.
No usen la micropipeta sin la punta desechable
adecuada rmemente ajustada al cilindro. Si no
utilizan una punta para pipeta contaminarn el
cilindro de la pipeta.
No dejen la micropipeta con lquido en la punta ni
la sostengan con la punta hacia arriba. Si la punta
desechable no est bien ajustada al cilindro, el lquido
puede caer nuevamente dentro de la pipeta.
Eviten que el mbolo haga un chasquido al retirar o
eyectar lquido; con el tiempo esto destruir el pistn.
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Tubos de microfuga de 1.5 ml
Micropipeta P-20 (2-20 l)
Puntas para pipeta desechables
Marcador indeleble
Equipo de electroforesis
Suministro elctrico
Gradilla plstica para tubos de
microfuga
Materiales
H;79J?LE
Solucin 1
Solucin 2
Solucin 3
H
2
O destilada (dH
2
O)
Gel de agarosa al 0.8%
(preparado con anterioridad)
1 x NaB (o TBE 0.5x)

Mtodos
Botn del mbolo
Eyector de
la punta
Ventana del visor
Cilindro
Laboratorio 11
Al aspirar (succionar) una solucin, presionen
el mbolo hacia la primera marca y bajen la
punta de la pipeta por debajo del nivel de la
solucin de la que estn
tomando una muestra.
Deben sostener el tubo
que contiene la solucin
en la mano a la altura de
los ojos. Es importante
ver que la solucin entre
realmente en la punta de
la pipeta.
Lentamente suelten el mbolo y
dejen que el lquido ingrese a la
punta de la pipeta. Asegrense
de no aspirar aire en la punta.
Al verter (vaciar) el lquido,
coloquen la punta de la pipeta en
el tubo que recibir la solucin.
Ubiquen la punta de manera que toque la
pared interior del tubo y se acerque al fondo.
Lentamente empujen el mbolo hacia la
primera marca y luego hacia la segunda.
Mantengan el pulgar en
el mbolo y retiren la
punta del tubo en el que
estn vertiendo el lquido.
Esto evitar que vuelvan
a aspirar el lquido en
la punta de la pipeta.
Asegrense de ver que la
solucin salga de la punta.
Retiren la punta: para ello
utilicen el botn eyector de la
pipeta y arrjenla a un recipiente
de residuos. Si vierten el mismo
reactivo en tubos separados y no
hay peligro de contaminacin
cruzada, pueden utilizar la misma
punta varias veces. Para evitar la
contaminacin, es bueno depositar
cada reactivo sobre la pared lateral
cerca del fondo del tubo de microfuga sin tocar
ninguno de los dems reactivos. Esta tcnica
les permite utilizar la misma punta para verter
el reactivo en varios tubos que contengan un
reactivo diferente.
Al verter un nuevo reactivo, utilicen siempre
una punta nueva para evitar la contaminacin.

1.3
'
Ejercicio de pipeteado N 1
Busquen la pantalla en el mango de la micropipeta y observen su
conguracin. Giren la perilla estriada del mango en el sentido
de las agujas del reloj para disminuir el volumen, o en sentido
contrario a las agujas del reloj para aumentar el volumen. Al girar
esta perilla, cambia la distancia que viaja el mbolo. Las cifras a
continuacin representan algunas de las conguraciones de la
pipeta y los volmenes de lquido vertido.
Coloquen una punta desechable en el extremo del cilindro de la
pipeta. En un movimiento de torsin con el dedo pulgar e ndice,
veriquen que la punta est rmemente ajustada al cilindro.
Eviten tocar el extremo de la punta porque pueden contaminarla.
Recuerden que la punta debe estar en su lugar al utilizar
la pipeta.
Coloquen el pulgar sobre el botn que activa el mbolo. Presionen
el botn y observen que tiene una marca de detencin. Si
ejercen un poco ms de presin con el pulgar, pueden presionar
el botn del mbolo hasta llegar a una segunda marca. En esta
marca se introduce un pequeo volumen de aire en la punta para
eyectar la solucin.
(
)
20.0 L 12.4 L 5.5 L 2.0 L
2
0
0
1
2
4
0
5
5
0
2
0

Laboratorio 11
1.4
Ejercicio de pipeteado N 2
Utilicen un marcador indeleble para rotular los tres tubos de reaccin: A, B y C.
En la tabla de la pgina 1.4 se resumen los contenidos de cada tubo, pero sigan
las instrucciones que comienzan en el paso 3 para preparar las muestras.
Coloquen la micropipeta P-20 en 2 l y viertan dH
2
O en los tubos
A, B y C.
Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plstico y
reemplcenla por una nueva.
Coloquen 4 l de la solucin 1 en el tubo A.
Expulsen la punta en el recipiente de residuos de plstico y
reemplcenla por una nueva.
Utilicen una punta nueva y viertan 4 l de la solucin 3 en el tubo A.
Utilicen una punta nueva y viertan 8 l de la solucin 2 en el tubo B.
Utilicen una punta nueva y viertan 8 l de la solucin 3 en el tubo C.
Guarden los tres tubos para la prxima parte de la experiencia.
Comprobacin de la precisin y la consistencia del pipeteado
Los tubos A, B y C deben contener 10 l de solucin.
Preparen su micropipeta P-20 en 10 l y coloquen una punta
nueva en el cilindro.
Veriquen con cuidado el volumen de cada tubo de microfuga.
Debe haber 10 l en cada uno de ellos.
Guarden los tubos A, B y C para la prxima parte de la
experiencia.
'
(
)
*
+
,
-
.
/
'&
'
(
)
*
Tubo dH20 Solucin 1 Solucin 2 Solucin 3 Volumen total
A 2 L 4 L 4 L 10 L
2 L 8 L 10 L
2 L 8 L 10 L
B
C
Laboratorio 11
Add comb
Agarose
dissolved in
elecrophoresis buffer
Pipette tip TBE buffer
Well
Agarose gel
Fig. 1.3
Gel de agarosa Orificio
Punta para pipeta
Solucin reguladora de NaB
Utilizacin de la electroforesis en gel para separar molculas
La electroforesis en gel
es un mtodo en el que se
utiliza corriente elctrica y una
matriz de gel (red) para separar
molculas como el ADN y las
protenas. Las molculas que se
separan tienen carga negativa
o se cargan negativamente.
Con la corriente elctrica, las
molculas cargadas son atradas
y atraviesan una red del material
que separar las molculas de
acuerdo con su tamao, aunque
la forma molecular y el grado de
electronegatividad inuirn en
el movimiento al atravesar el gel.
Debido a que las molculas tienen
carga negativa, se trasladarn por
el gel hacia el electrodo positivo
(rojo). A mayor carga negativa,
mayor velocidad en la migracin de
la molcula.
En este laboratorio, su profesor
ha preparado un gel compuesto
por agarosa, un polisacrido
(azcar compuesto). La agarosa
se mezcla con una solucin
electroltica llamada borato de
sodio (NaB). Esta solucin contiene
iones que son tomos cargados
elctricamente. Estos iones ayudan
a conducir la corriente elctrica a
travs del gel. Como las molculas
son atradas hacia el electrodo
positivo, las ms pequeas
pueden moverse en esta red de
agarosa mucho ms rpido que
las molculas ms grandes. Por
lo tanto, en toda la extensin del
gel, las molculas se separan por
tamao.
Su profesor ya ha preparado un gel de agarosa, pero debern cubrir el gel de agarosa
con la cantidad adecuada de la solucin reguladora de NaB para que el gel acte
adecuadamente. Dos grupos compartirn un gel. Lleven la cubeta hacia el suministro
elctrico que utilizarn para activar el gel.
Controlen que el gel est ubicado en la cubeta de modo que los oricios estn ubicados
hacia el electrodo negativo (negro). Los colorantes estn cargados negativamente y se
movern hacia el electrodo positivo (rojo).
Rellenen la cubeta con solucin reguladora de NaB 1x (hay varios envases plsticos que contienen
esta solucin reguladora en el laboratorio) hasta un nivel que cubra toda la supercie del gel a una
profundidad entre 1 y 2 mm. Controlen que el gel est cubierto con la solucin reguladora y que no
aparezcan hoyuelos en los oricios; agreguen ms solucin reguladora si es necesario.
Preparen la micropipeta en 10 l y carguen cada muestra en un oricio separado como lo
indica su profesor. Usen una punta nueva para cada muestra. Recuerden que su grupo
compartir este gel. Un grupo cargar sus muestras en tres separaciones a la izquierda
mientras que el otro utilizar las tres separaciones a la derecha. Es recomendable que
tomen nota de la solucin que colocan en cada separacin.
Al cargar cada muestra, coloquen la punta de la pipeta en el centro
y suavemente bajen el mbolo de la pipeta para expulsar lentamente
la muestra. Utilicen ambas manos para sostener la pipeta
para evitar que se mueva. Dado que sus densidades son mayores que la
solucin reguladora de NaB, los colorantes se hundirn en los oricios.
Cierren la tapa con rmeza sobre la cmara de electroforesis. Conecten los cables
elctricos al suministro de energa. Asegrense de que ambos cables estn conectados
al mismo canal con el ctodo () al ctodo (negro con negro) y nodo (+) al nodo (rojo
con rojo).
Enciendan el suministro elctrico y establezcan el voltaje en 130135 v.
Luego de dos o tres minutos, observen los colorantes para asegurarse de que se estn
moviendo hacia el electrodo positivo (rojo). Comenzarn a ver que el colorante prpura
(llamado azul de bromofenol) comienza a separarse del colorante azul (xilenocianol).
En aproximadamente 10 minutos, o cuando puedan distinguir los tres colorantes, apaguen
el interruptor de energa y desconecten los electrodos del suministro elctrico. Hganlo
tomando el enchufe del suministro elctrico, no jalando el cable con fuerza. Retiren con
cuidado la tapa de la cubeta de gel para que puedan ver mejor los colorantes en el gel.
En un papel, registren las bandas o esquema de colores en cada una de las franjas que
contienen sus muestras. Utilicen esta informacin para responder las preguntas en la
seccin Conclusiones.
Dejen los geles en la cubeta de gel.
)
,
(
*
+
-
.
/
'&
1.5
''
'
Laboratorio 11
Los colorantes que separaron utilizando la electroforesis en gel fueron:
naranja G (amarillo), azul de bromofenol (prpura) y xilenocianol (azul).
Qu carga elctrica transportaron estos colorantes?
Qu evidencia les permiti arribar a esta conclusin?
El tamao molecular puede cumplir un rol importante en la separacin ya que las molculas
pequeas se mueven por la matriz del gel con mayor rapidez que las molculas ms grandes.
El peso formular o molecular de estos colorantes son: naranja G (452.38), azul de bromofenol
(669.98) y xilenocianol (538.62). Segn sus resultados, les parece que estas molculas se
separaron claramente por el tamao?

Qu otros factores pueden haber jugado un rol importante en la separacin de estos colorantes?

Qu tubo contena un solo colorante? El A, B o C?
Nombren este colorante.
Al aspirar una solucin, por qu es importante ver que realmente la solucin ingresa
a la punta de la pipeta?
Luego de cargar el gel, permanece alguna solucin en los tubos A, B o C?
Cmo se puede explicar que la solucin quede en estos tubos?
'W
Conclusiones
1.6
'X
(W
(X
(Y
(Z
)
*W
*X
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
.......................................................................................................................................
Laboratorio 1 2
Anlisis de restriccin de
pARA y pKAN-R
Los plsmidos son piezas circulares de ADN que
se encuentran naturalmente en las clulas bacteriales. Los
plsmidos utilizados en la biologa molecular han sido
modicados a travs de la ingeniera gentica para facilitar
la clonacin de genes y la produccin de protenas (expresin
del gen) en bacterias. Los genes resistentes a los antibiticos
han sido diseados en estos plsmidos y funcionan como
marcadores seleccionables; es decir, estos genes nos permiten
seleccionar las bacterias que albergan los plsmidos de aqullas
que no lo hacen. Si una bacteria contiene un plsmido con
un gen resistente a los antibiticos, la bacteria podr crecer y
reproducirse en presencia de ese antibitico; aquellas bacterias
sin el plsmido no podrn crecer. Por lo tanto, se pueden
utilizar antibiticos para seleccionar las bacterias que son
resistentes y que probablemente tienen un plsmido con el gen
resistente de aquellas bacterias que no portan el plsmido. En
este laboratorio se utilizarn dos plsmidos: el pARA contiene un
gen de resistencia a la ampicilina, amp
r
, y el pKAN-R contiene un
gen con resistencia a la kanamicina, kan
r
.
El objetivo de este laboratorio tiene tres aspectos: 1)
presentar un mtodo comnmente utilizado para analizar
los elementos genticos del plsmido de ADN; 2) analizar
el papel y la naturaleza de las enzimas de restriccin; y 3)
realizar los primeros pasos para producir una molcula de
ADN recombinante.
El plsmido pARA tiene 4058 pares de base (pb) de
tamao. Un par de base sera la adenina:timina o
guanina:citosina y es el mtodo ms comn que se utiliza
para expresar el tamao de las molculas de ADN. El
plsmido tiene el gen amp
r
, que codica la protena
betalactamasa, una enzima que destruye el antibitico de la
ampicilina. As, la betalactamasa le permite a las bacterias
reproducirse en presencia de la ampicilina. Adems, el
pARA porta un gen para la protena AraC, una protena
que ayuda a la bacteria a hacer protenas codicadas por
genes insertados en este plsmido. Un gen, incluso uno
extrao, se puede expresar (producir) si est dentro de una
ubicacin especca en este plsmido. La regin del pARA
rotulada como p
BAD
, en el mapa del plsmido, indica el
lugar donde la ARN polimerasa necesita unirse para iniciar
la transcripcin. Los sitios rotulados como BamH I y
Hind III representan los lugares de restriccin de estas
dos enzimas de restriccin. Analicen el mapa del plsmido a
continuacin y ubiquen estos componentes del plsmido.
El plsmido pKAN-R porta el gen resistente a la
kanamicina, kan
r
, que codica una fosfotransferasa,
enzima que transere un grupo de fosfato a la molcula
de kanamicina destruyendo sus efectos antibiticos. La
kanamicina es un antibitico que mata a las bacterias
evitando que se hagan protenas. Si una clula no puede
sintetizar protenas, morir. El gen kan
r
le otorga resistencia
a la kanamicina a las bacterias que absorbi este gen.
Adems de kan
r
, el plsmido tiene el gen para la protena
uorescente mutada, mFP, llamada protena uorescente
roja rfp. El plsmido pKAN-R tiene aproximadamente
5,408 pb de tamao.
El gen de la protena uorescente originalmente fue
aislado del Discosoma sp, una anmona de mar encontrada
en el ocano Indo-Pacco. El gen en estado natural ha sido
mutado mediante un proceso llamado evolucin dirigida, de
modo que produzca colores que son mucho ms brillantes
que las protenas en estado natural. El trmino en estado
natural se reere al gen original, el que encontrara en la
naturaleza. El gen rfp ha sido transformado en un plsmido
pKAN-R. Observen que el gen rfp de la mFP tiene ambos
sitios de restriccin: BamH I y Hind III en cada lado. Un
sitio de restriccin marca la ubicacin especca donde la
enzima cortar al plsmido de ADN. Si pKAN-R se digiere
con BamH I y Hind III, el gen rfp se cortar fsicamente
del plsmido. Durante este laboratorio, sacarn el gen rfp
del pKAN-R y sacarn el pequeo fragmento de 40 pb del
plsmido pARA utilizando las mismas enzimas. Durante
el prximo laboratorio, insertarn el gen rfp en el pARA
generando una molcula de ADN recombinante.
pARA
4058 bp
a
m
p
r

P
B
A
D
B
a
m
H
I
H
i
n
d

I
I
I

a
r
a
C
pKAN-R
5408 bp
K
a
n
r
rfp
702 bp
B
a
m
H
I
H
i
n
d

I
I
I

r
f
p
2.1
Laboratorio 1 2
2.2
A + = pARA
+ enzimas
+ solucin
reguladora
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Micropipeta P-20 y puntas
Minicentrifugador
Bao Mara a 37 C
Marcador indeleble
Materiales
En este protocolo de laboratorio se utilizan las enzimas de restriccin BamH I
y Hind III para digerir los plsmidos pARA y pKAN-R. Este es el primer paso para
fabricar una molcula recombinante de ADN.
Preparacin de la digestin de restriccin de pARA-R

H;79J?LE
pARA (80 ng/l)
pKAN-R (80 ng/ L)
Enzimas de restriccin
(BamH I + Hind III)
Solucin reguladora de
restriccin 2.5x
Agua destilada, dH
2
O
Mtodos
'
(
)
*
+
,
-
.
/
'&
Tubo
Solucin
reguladora 2.5x
dH
2
0 pARA
A+
A-
K+
K
-
4L
4L
4L
4L
2L
2L
4L
4L
4L
4L
2L
2L
10L
10L
10L
10L
pKAN-R Enzimas Volumen Total
Consigan los siguientes cuatro tubos de microfuga: pARA, pKAN-R,
BamH I y Hind III (mezcla de enzimas) y solucin reguladora 2.5x.
Tomen cuatro tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen
un marcador para rotularlos de la siguiente manera:
A + = pARA + BamH I y Hind III
A - = pARA no digerido (pARA sin enzima)
K+ = pKAN-R+ BamH I y Hind III
K- = pKAN-R no digerido (pKAN-R sin enzima)
La matriz de reaccin resume los reactivos utilizados en la digestin de restriccin.
Para preparar la solucin de digestin, sigan las instrucciones especcas a partir del paso 4.
Utilicen una punta nueva y agreguen 4l de solucin reguladora de restriccin 2.5x en
todos los tubos.
Agreguen 2l de dH
2
O a los tubos rotulados A- y K -.
Cul es el objetivo de este paso?
Utilicen una punta nueva y agreguen 4l de pARA a los tubos rotulados con A+ y A-.
Utilicen una punta nueva y agreguen 4l de pKAN-R a los tubos rotulados con K + y K -.
Agreguen 2l de la mezcla de enzimas que contiene BamH I y Hind III, a los tubos A+ y K +.
Agreguen las enzimas directamente a la solucin en el fondo del tubo de microfuga.
Asegrense de utilizar una punta nueva para cada tubo para evitar la contaminacin.
Luego de agregar las enzimas, bombeen suavemente la solucin hacia adentro y hacia
afuera con la pipeta para que se mezclen los reactivos y tapen los tubos.
Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurndose de
que los tubos estn en una conguracin equilibrada y centrifuguen los tubos durante
cuatro segundos. Este breve giro combinar todos los reactivos en el fondo de cada tubo.
Coloquen los cuatro tubos a bao Mara a 37 C e incuben durante por lo menos 60 minutos.
Luego de los 60 minutos de incubacin, la solucin de digestin se puede
mantener congelada, a 20 C, hasta que sea el momento de la electroforesis.
Laboratorio 1 2
5
,
.......................G G A T C C.......................3
,

3
,
.......................C C T A G G.......................5
,
5
,
.......................A 3
,

3
,
.......................T T C G A 5
,
BamH I
5
,
A G C T T......................3
,

3
,
A .................... 5
,
Extremo cohesivo
5
,
.......................A A G C T T.......................3
,

3
,
......................T T C G A A.......................5
,
Hind III
Extremo cohesivo
Analicen los mapas de restricciones de los plsmidos pARA y pKAN-R. Dado que BamH I y Hind
III son endonucleasas de restriccin especca, cortarn de manera consistente el ADN cuando ste
se encuentre con las secuencias de reconocimiento de base seis como se indica a continuacin. La
ubicacin exacta donde se corta se llama sitio de restriccin. La molcula de ADN consta de dos cade-
nas de componentes bsicos de nucletidos. Estos componentes bsicos estn orientados en direccin
opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la molcula de ADN
son antiparalelas. Para comodidad, podemos decir que una cadena est orientada en direccin de
5 (5 primo) a 3 (tres primo), mientras que la otra cadena est orientada de 3 a 5. Un cuidadoso
anlisis de las secuencias de restriccin revelar que la secuencia de los nucletidos es un palndromo,
es decir, dice lo mismo en ambas cadenas cuando se lee en direccin 5 3.
Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortar la hlice de ADN entre
las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un extremo cohesivo.

Cul es la secuencia de reconocimiento del BamH I?

En una direccin de 5 3, qu secuencia de bases representa los extremos cohesivos de cada uno?

Analicen los mapas de plsmidos pARA y pKAN-R y completen lo siguiente:
la digestin pARA producir fragmentos y tendr pares de base de largo.

la digestin pKAN-R producir fragmentos y tendr pb y pb de largo.

Supongan que reciben un cultivo de bacterias que tiene uno o ambos plsmidos.
Diseen un experimento simple que puedan usar para determinar cul de estos plsmidos,
pARA o pKAN-R, portaba las bacterias del cultivo.
Conclusiones
'W
)
'X
(W
(X
2.3
Laboratorio 1 2
Laboratorio 1 2a
2a.1
Introduccin a los plsmidos y las enzimas de restriccin
Dos herramientas poderosas pero fundamentales
que se utilizan en la biotecnologa son las enzimas de
restriccin y los plsmidos bacteriales. Las enzimas de
restriccin les permiten a los bilogos moleculares cortar las
molculas de ADN de diferentes organismos y recombinar
las piezas moleculares para producir molculas de ADN
recombinantes. Los plsmidos son piezas circulares de ADN
que se encuentran naturalmente en las bacterias. Mediante
la tecnologa del ADN recombinante y las enzimas de
restriccin, los plsmidos de ADN recombinante se
pueden disear para que clonen genes o expresen protenas
codicadas por genes.
Las enzimas de restriccin fueron observadas por
primera vez por Werner Arbor en 1962. Arbor descubri
que, al parecer, algunas bacterias utilizaban un sistema
inmunolgico primitivo que no dejaba que el ADN
viral se duplicara dentro de la clula husped infectada.
Algunos aos ms tarde, se descubri que este mecanismo
inmunolgico involucraba una clase de protenas ahora
conocidas como enzimas de restriccin. El nombre deriva
de la capacidad de las enzimas de restringir el crecimiento
de los virus en las clulas bacteriales. Las enzimas de
restriccin logran esto al romper un enlace en la cadena
fosfato-azcar del ADN viral; las enzimas cortan el ADN
viral en pequeos fragmentos.
Las enzimas de restriccin que se identicaron en primer
lugar, al parecer, realizaron la digestin de la molcula de
ADN al azar. Posteriormente, se encontraron y puricaron
las enzimas de restriccin que cortaban la cadena de fosfato-
azcar en un lugar especco o dentro de una secuencia
de nucletidos especca, por lo general, de cuatro a seis
nucletidos de largo. En la Tabla 1 se identican algunas
de estas enzimas de restriccin especcas, su origen y las
secuencias de nucletidos que cada una reconoce. En 1978,
Daniel Nathans (Universidad Johns Hopkins), Hamilton
Smith (Universidad Johns Hopkins) y Werner Arbor
recibieron el Premio Nobel de Medicina por su trabajo con
las enzimas de restriccin.
Tabla 1. Enzimas de restriccin utilizadas en este laboratorio.
indica los sitios donde se corta o se separa la
cadena fosfato-azcar.
Cuando las enzimas de restriccin cortan o digieren el
ADN, los fragmentos que se obtienen, llamados fragmentos
de restriccin, poseen varias bases no apareadas que se
extienden desde los extremos de corte. Estos son llamados
extremos cohesivos. Si las molculas de ADN de origen
diferente se digieren utilizando la misma enzima de
restriccin, las bases no apareadas de cada pieza deben
poder unirse (o recocerse), dado que las bases no apareadas
en los extremos cohesivos sern complementarias, A:T y G:
C. Este es el nico atributo de las enzimas de restriccin que
les permite a los ingenieros genticos combinar fragmentos
de ADN de diferentes organismos para producir molculas
de ADN recombinante.
(a)
(b)
Figura 1. (a) molcula de ADN con sitios de restriccin
BamH I y Hind III (en negritas). Las echas
indican los sitios donde las enzimas cortarn
la cadena fosfato-azcar de la molcula de
ADN. (b) La molcula de ADN inferior indica
la ubicacin de los extremos cohesivos
(negritas).
Los plsmidos bacteriales son piezas circulares
relativamente pequeas de ADN que las bacterias pueden
portar adems de su ADN genmico (cromosoma nico).
En la naturaleza, el plsmido de ADN por lo general
lleva de uno a varios genes que ayudan a que la bacteria
sobreviva, tal vez brindndole resistencia a un antibitico.
Las bacterias pueden pasar a lo largo de los plsmidos
durante la conjugacin (apareamiento). Las bacterias
que utilizamos en el laboratorio han sido mutadas, de
manera que no pueden intercambiar plsmidos durante la
reproduccin sexual.
Los plsmidos producidos en forma natural han sido
modicados de modo que realicen funciones especcas:
por lo general, la clonacin y la expresin de genes. En
este laboratorio se examina el pARA-R, un plsmido de
ADN recombinante que ha sido modicado para que
exprese el gen rfp a n producir una protena uorescente
roja mutante (mFP). El plsmido contiene varios elementos
de control que le permiten a una bacteria portar este
Origen Enzima de restriccin
BamH I 5
,
G G A T C C 3
,
3
,
C C T A G G 5
,
Bacillus
amyloliquefaciens
Secuencia de
reconocimiento
EcoR I 5
,
G A A T T C 3
,
3
,
C T T A A G 5
,
Escherichia coli

Hind III 5
,
A A G C T T 3
,
3
,
T T C G A A 5
,
Haemophilus
influenzae
Origen Enzima de restriccin
BamH I 5
,
G G A T C C 3
,
3
,
C C T A G G 5
,
Bacillus
amyloliquefaciens
Secuencia de
reconocimiento
EcoR I 5
,
G A A T T C 3
,
3
,
C T T A A G 5
,
Escherichia coli

Hind III 5
,
A A G C T T 3
,
3
,
T T C G A A 5
,
Haemophilus
influenzae
Laboratorio 1 2a

H;79J?LE
pARA (70 ng/l)
Enzimas de restriccin (Bamh I + Hind III)
Solucin reguladora de restriccin 2.5x
Agua destilada (dH
2
O)

plsmido para expresar un gen extrao. El gen se obtuvo
originalmente del genoma del Discosoma sp., una anmona
de mar encontrada en el ocano Indo-Pacco. En el mapa
de plsmido a continuacin se indican algunas de las
regiones de control ms importantes, araC and P
BAD
, y
la ubicacin del gen rfp. Adems, se indica la ubicacin de
los dos sitios de restriccin: uno para Hind III y otro para
BamH I. Cmo podran proceder en el corte del gen rfp?
Tambin tengan en cuenta que el plsmido posee un gen de
resistencia a los antibiticos: amp
r
. Este gen le permitir a
la bacteria que porta el plsmido vivir en un ambiente que
contenga el antibitico ampicilina.
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Minicentrifugador
Bao Mara a 37 C
Materiales
pARA-R
4720 bp
a
m
p
r
rfp
702 bp
B
a
m
H
I
H
i
n
d

I
I
I

r
f
p
a
r
a
C

P
B
A
D
2a.2
Laboratorio 1 2a
Mtodos
Soliciten a su profesor los siguientes tres tubos de microfuga de 1.5 ml:
pARA-R, mezcla de enzimas y solucin reguladora de restriccin 2.5x.
Coloquen dos tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y utilicen un marcador para rotular
los tubos de la siguiente manera: A+ y A-. Incluyan su nmero de grupo y horario de
clase en cada tubo de manera que puedan ubicarlos en la prxima clase de laboratorio.
La matriz de reaccin resume los reactivos utilizados en la digestin de restriccin. Para
preparar la solucin de digestin, sigan las instrucciones especcas a partir del paso 4.
Utilicen una punta nueva y agreguen 4l de solucin reguladora de restriccin 2.5x para
ambos tubos.
Agreguen 2l de dH
2
O al tubo rotulado A-.
Cul es el objetivo de este paso?
Utilicen una punta nueva y agreguen 4l de pARA-R a los tubos rotulados A+ y A-.
Lleven el tubo A+ a su profesor, quien verter la mezcla de enzimas en el tubo o, si
se les proporcion esta mezcla de enzimas, agreguen con cuidado 2 l de la mezcla
de enzimas directamente en la solucin del tubo A+ que contiene el plsmido y la
solucin reguladora. Luego de agregar las enzimas, cubran el tubo y den golpecitos
suaves en la parte inferior de cada tubo para mezclar los contenidos.
Si hay un minicentrifugador disponible, coloquen los tubos en el rotor, asegurndose de
que los tubos estn en una conguracin equilibrada y centrifuguen los tubos durante
cuatro segundos. Este breve giro combinar todos los reactivos en el fondo de cada tubo.
Coloquen ambos tubos a bao Mara a 37 C e incuben durante por lo menos 60 minutos.
Luego de la incubacin de 60 minutos, su profesor puede colocar los tubos en el
congelador hasta que estn listos para la electroforesis (Laboratorio 4a).
Los plsmidos digeridos se pueden
conservar a -20 C de manera indenida.
'
(
)
*
El objetivo de este laboratorio tiene dos aspectos:
1) analizar el rol de las enzimas de restriccin y su
importancia en la ingeniera gentica; y 2) analizar un
plsmido bacterial y cmo se utiliza en la biotecnologa.
En este protocolo de laboratorio se utilizan las
enzimas de restriccin BamHI y Hind III para digerir
el plsmido recombinante pARA-R. La digestin de
restriccin aislar del pARA el gen rfp de un fragmento
ms grande del plsmido que contiene amp
r
, araC y
P
BAD
. En el protocolo se utiliza un pARA-R de control
no digerido, junto con un marcador de tamao o escala
de ADN que lo ayudar a identicar y conrmar el
tamao de los fragmentos de restriccin.
Preparacin de la digestin de restriccin de pARA-R
+
,
-
.
/
'&
Tubo
A+
A-
4L
4L
2L
4L
4L
2L
10L
10L
Solucin
reguladora 2.5x
Mezcla
de enzimas
Volumen total H
2
O pARA-R
2a.3
Laboratorio 1 2a
5
,
.......................A A G C T T.......................3
,

3
,
.......................T T C G A A.......................5
,
5
,
.......................A 3
,

3
,
.......................T T C G A 5
,
5
,
A G C T T......................3
,

3
,
A .................... 5
,
Extremo cohesivo
Extremo cohesivo
Cules son las secuencias de reconocimiento de Hind III y BamH I?

En una direccin de 5 3, qu secuencia de bases representa los extremos cohesivos?

Analicen el mapa del plsmido pARA-R y completen lo siguiente:
Cuntos fragmentos de restriccin resultarn de la digestin de pARA
con BamH I y Hind III?
Cules sern las longitudes aproximadas, en pares de base, de estos fragmentos de restriccin?

Qu fragmento de restriccin llevar el gen amp
r
?

Qu fragmento de restriccin llevar el gen rfp?

Supongan que su profesor les entrega un cultivo de bacterias. El cultivo puede contener
bacterias que portan el plsmido pARA-R o un cultivo que contenga bacterias sin el
plsmido. Diseen un experimento simple que puedan usar para determinar cul de los
dos cultivos les entreg.
'X
Analicen el mapa de restriccin del plsmido pARA-R. BamH I y Hind III son enzimas de restriccin especcas y
cortarn consistentemente el ADN bicatenario cuando se encuentren con su respectiva secuencia de reconocimiento
de base seis que se muestra en la tabla de la pgina 2a.1. Estas ubicaciones de corte se llaman sitios de restriccin.
La molcula de ADN consta de dos cadenas de componentes bsicos de nucletidos. Estos componentes bsicos
estn orientados en direccin opuesta en cada cadena. Por lo tanto, se dice que las dos cadenas que constituyen la
molcula de ADN son antiparalelas. Por convencin, podemos decir que una cadena est orientada en direccin
de 5 (5 primo) a 3 (tres primo), mientras que la otra cadena est orientada de 3 a 5. Un cuidadoso anlisis de
las secuencias de restriccin BamH I y Hind III revelar que las secuencias de nucletidos son palndromos; es decir,
dicen lo mismo en ambas cadenas cuando se leen en sentido 5 3
Por lo tanto, cuando el Hind III se encuentra con esta secuencia de base seis, cortar la hlice de ADN entre
las bases de adenina adyacentes. Esto deja cuatro bases no apareadas que forman un extremo cohesivo.
Conclusiones
'W
(X
(Y
(W
)
(Z
2a.4
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
Laboratorio 3
3.1
Ligacin de fragmentos de restriccin pARA/pKAN-R que
producen un plsmido recombinante pARA-R
En este laboratorio los fragmentos de restriccin
producidos durante el Laboratorio 2 se ligarn o se unirn,
utilizando ADN ligasa, formando nuevos plsmidos
recombinantes. Estos plsmidos recientemente formados
representarn molculas de ADN recombinante porque los
cuatro fragmentos de restriccin han sido recombinados de
diferentes maneras para producir nuevas construcciones. Por
ejemplo, suponga que los cuatro fragmentos de plsmidos
se representaron con las letras A, A, K y R, en los que A y A
representan los fragmentos pARA, y K y R representan los
dos fragmentos que resultan de la digestin de pKAN-R. Los
plsmidos se pueden representar con cualquier combinacin
de dos letras, como AK o AR, y cualquier combinacin
incluso de fragmentos numerados, como por ejemplo AKAR
o ARAAKK y as sucesivamente. Como pueden ver, hay
muchos tipos de molculas recombinantes que pueden resultar
de mezclar estos fragmentos de restriccin.
Como recordarn, las enzimas de restriccin que estamos
utilizando son BamH I y Hind III. Al cortar los plsmidos en
los sitios de restriccin BamH I y Hind III se dejan extremos
cohesivos. Los extremos cohesivos del ADN cortado pueden
ligarse a cualquier otro fragmento de ADN que tenga un
extremo cohesivo adicional. Analicen el mapa del plsmido
pARA a continuacin para ver las ubicaciones de los sitios
de restriccin de BamH I y Hind III y los extremos cohesivos
que se forman en los extremos de 5 de su fragmento de
restriccin.
Dado que pARA tiene un sitio de restriccin BamH I y otro
Hind III, la digestin dejar dos fragmentos. A continuacin
se representan los fragmentos de restriccin. Es importante
recordar que el fragmento de restriccin ms grande porta el
gen amp
r
, el gen que suministra la resistencia a la ampicilina.
El fragmento ms pequeo no porta ningn gen.
El plsmido pKAN-R tiene un sitio de restriccin BamH I y
otro Hind III que anquea el gen rfp. La digestin de pKAN-R
dejar dos fragmentos, uno ser de 4706 pb y el otro, de 702 pb.
Con la ligacin se unir cualquiera de los dos extremos
cohesivos BamH I con cualquiera de los dos extremos
cohesivos Hind III. Deberan poder observar que son
posibles combinaciones diferentes de fragmentos.
La combinacin que nos interesa es la del fragmento
recombinado de 4018 pb pARA (que contiene el gen
amp
r
) con el fragmento de 702 pb pKAN-R (gen rfp). La
combinacin de estos dos fragmentos proporcionar un
plsmido recombinante que llamaremos pARA-R.
La ligacin del fragmento de 702 pb pKAN-R colocar
al gen rfp del plsmido en un lugar que le permitir a
la bacteria sintetizar (expresar) la protena uorescente
mutante, mFP.
Inicialmente, los fragmentos de restriccin se mantienen
juntos por el enlace de hidrgeno entre las bases de los
5
,
G A T C C A 3
,

3
,
G T T C G A 5
,

4018 pb
5 A G C T T G 3
,
3 A C C T A G 5

40 pb
pARA
4058 pb
a
m
p
r

P
B
A
D
B
a
m
H
I
H
i
n
d

I
I
I

a
r
a
C
5
,
G A T C C A 3
,

3
,
G T T C G A 5
,

4706 pb
5 A G C T T G 3
,
3 A C C T A G 5

702 pb
pKAN-R
5408 pb
K
a
n
r
rfp
702 pb
B
a
m
H
I
H
i
n
d

I
I
I

r
f
p
pARA
4720 pb
a
m
p
r

rfp
702 pb
B
a
m
H
I
H
i
n
d

I
I
I

r
f
p

a
r
a
C

P
B
A
D

Laboratorio 3
3.2
Ligacin de fragmentos de restriccin pARA/pKAN-R que
producen un plsmido recombinante pARA-R
nucletidos que forman los extremos cohesivos. Cabe
recordar que la adenina y la timina comparten dos
enlaces de hidrgeno mientras que la citosina y la guanina
comparten tres. Esto asegura que solamente coincidirn
los extremos cohesivos complementarios.
Los enlaces de hidrgeno son enlaces qumicos dbiles y
no son adecuados para mantener los extremos cohesivos
juntos de manera permanente. La enzima ADN ligasa,
con la energa suministrada por ATP, formar enlaces
covalentes entre el azcar y los grupos de fosfato del
esqueleto del ADN. En el diagrama a continuacin
pueden ver las ubicaciones de estos enlaces en cada lado
de la molcula de ADN. Cuando se forman los enlaces
covalentes, estos completan la unin fosfodister entre
los dos azcares y el grupo de fosfato de cada cadena.
Los enlaces qumicos que resultan constituyen un enlace
relativamente fuerte.
Tomen los tubos A+ y K+ de la gradilla que se encuentra en el
frente de la clase. Coloquen los dos tubos a bao Mara a 70 C
durante 30 minutos. Esta exposicin al calor desnaturalizar
(inactivar) cualquier BamH I y Hind III que pudiera estar activo.
Por qu es importante esto?
Mientras sus tubos se encuentren a bao Mara, solictenle a su
profesor la solucin reguladora 5x y un tubo de ligasa. El tubo de
ligasa contiene 2 l de ADN ligasa. Rotulen este tubo con sus iniciales.
Luego de 30 minutos, duracin del paso de incubacin a
70 C, agreguen 4 l de A+ directamente en la ligasa de ADN en
el fondo del tubo de Ligasa.
Utilizando una punta nueva, agreguen 4 l de K+ a la solucin
en el tubo de Ligasa.
Utilizando una punta nueva, agreguen 3 l de solucin
reguladora de ligacin 5x directamente en la solucin en el fondo
del tubo Ligasa. Desechen el tubo de la solucin reguladora.
Agreguen 2 l de dH2O al tubo de Ligasa, utilizando una punta
limpia. Suave y lentamente muevan el mbolo hacia adentro y
hacia afuera para mezclar los reactivos. Realicen este paso sin
salpicar la solucin en los laterales del tubo de microfuga. En la tabla
a continuacin se resumen los contenidos del tubo de Ligasa.
Si hay gotitas de lquido en los laterales del tubo, centrifuguen
brevemente el tubo para combinar los reactivos.
Coloquen sus tubos de ligasa, A+ y K+ en las gradillas en el frente
de la clase. Su tubo de ligasa permanecer durante la noche a
temperatura ambiente.
'
(
)
Mtodos
*
+
,
-
.
Materiales
H;79J?LE
pARA digerido (A+ del laboratorio 2)
pKAN-R digerido (K+ del laboratorio 2)
Solucin reguladora de ligacin 5x con ATP
ADN ligasa T4 en el tubo rotulado Lig
Agua destilada
A+
4L 4L 3L 2L 2L 15L
K+ dH
2
O Ligasa
Solucin reguladora
de ligacin 5x
Volumen total
5
3
,
3
,
5
G
C
A
T
A
T
T
A
C
G
T
A
ADN ligasa
+ ATP
ADN ligasa
+ ATP
5
3
,
3
,
5
G
C
A
T
A
T
T
A
C
G
T
A
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Bao Mara a 70 C
Gradilla plstica para tubos
de microfuga
Marcador indeleble

Laboratorio 3
Por qu es importante colocar los tubos A+ y K+ a bao Mara a 70 C antes de preparar
la reaccin de ligacin?
Qu creen que podra pasar si se omitiera este paso?
Realicen un diagrama para mostrar cmo se unieron los siguientes extremos cohesivos.
(: = enlace de hidrgeno) Consulten la pgina 3.2 para ver el ejemplo de apareamiento de bases.
Si bien son muchos los plsmidos recombinantes, dibujen tres plsmidos recombinantes
posibles. Incluyan dentro de esos tres, la combinacin en la que estamos ms interesados,
la que combina pARA con el fragmento pKAN-R que porta el gen rfp.
Pueden dos fragmentos rfp unirse y circular en el tubo de ligasa?
En la molcula de ADN, hay dos tipos de enlaces qumicos: enlaces qumicos
covalentes y enlaces de hidrgeno. Describan brevemente cmo dieren estos enlaces
en cuanto a qu tan fuertes son y en qu parte de la molcula de ADN los encontrar.
Durante la ligacin, cules de estos enlaces (hidrgeno o covalente) se forma primero?
Dnde se forman?
Qu enlaces se forman despus y dnde?
Para formar qu enlaces se necesita ADN ligasa?
Conclusiones
'W
'X
(
)
*
+
,W
,X
A
T T C G A
A G C T T
A
. .
. .
. .
. .
3.3
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
...........................................................................................................................................
Laboratorio 3
Laboratorio 14
4.1
Conrmacin de la restriccin y la ligacin
Uso de electroforesis en gel de agarosa
Es importante en esta etapa de nuestro procedimiento
experimental que conrmemos que el BamH I y Hind III
han digerido los plsmidos pKAN-R y pARA originales,
y que los fragmentos de restriccin han sido ligados por
el ADN ligasa. En este laboratorio se demostrar que
tenemos molculas de ADN recombinantes.
La electroforesis en gel es un procedimiento comnmente
utilizado para separar fragmentos de ADN segn su
tamao molecular. Como los colorantes que separaron en
el Laboratorio 1, los fragmentos de ADN migrarn por el
laberinto de la agarosa. El ADN, debido a los grupos de
fosfato, tiene carga negativa y se mover hacia el electrodo
positivo (rojo). Dado que es ms fcil que las molculas
pequeas se muevan por la matriz de agarosa, stas
migrarn ms rpido que los fragmentos ms grandes.
Imagnense un grupo de corredores de campo traviesa
cruzando una espesa selva tropical. Con todos los dems
factores iguales, los corredores de menos altura podrn
circular por la espesura de enredaderas que cuelgan y el
denso follaje ms rpido que los corredores ms altos.
De manera que los fragmentos ms pequeos de ADN se
movern ms rpido por la espesura de las molculas de
agarosa que los fragmentos ms grandes.
Tomaremos todas las muestras de plsmidos: digeridos,
no digeridos y ligados, y utilizaremos la electroforesis para
separar estas piezas. Tal vez predijeron que sus plsmidos
sin cortar produciran solamente una banda de ADN;
no hay motivo para pensar lo contrario. Sin embargo,
es posible que aparezcan dos o tres lneas en las franjas
de plsmidos no digeridos. El motivo de esto es que los
plsmidos aislados de las clulas existen de diversas formas.
Una de las formas del plsmido se llama superenrollada.
Es posible visualizar esta forma pensando en una pieza
circular de tubera plstica retorcida. La torcedura o
enrollamiento tiene como resultado una molcula muy
compacta, que se mover por el gel rpidamente debido
a su tamao.
Una segunda forma de plsmido
es llamada crculo mellado o
crculo abierto. Con frecuencia,
un plsmido experimentar el
rompimiento de uno de los enlaces
covalentes ubicados en la cadena de
fosfato-azcar a lo largo de una de
las dos cadenas de nucletidos. El
congelamiento y descongelamiento
repetido del plsmido u otro tratamiento severo puede
causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensin
acumulada en el plsmido superenrollado se libera a medida
que el plsmido enrollado se desenrolla. Esta forma de
plsmido circular no se mover tan fcilmente por el gel
de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene
el mismo tamao, en trminos de pares de base, estar
ubicado ms cerca del oricio que la forma superenrollada.
La ltima forma del plsmido que podemos ver se
llama multmero.
Cuando las bacterias
duplican los plsmidos,
stos por lo general se
duplican tan rpido
que terminan unidos
como los eslabones de
una cadena. Si los dos
plsmidos se unen, el
multmero ser dos
veces ms grande que un solo plsmido y migrar muy
lentamente por el gel. De hecho, se mover ms lentamente
que el crculo mellado. Sus muestras de pKAN-R y
pARA , luego, pueden tener tres bandas que aparecen
en el gel. Comenzando muy cerca del oricio, pueden
observar que el multmero se desplaza primero, seguido de
una banda con forma circular mellada y nalmente una
banda superenrollada.
Utilizaremos una tcnica de tincin especial que
nos permite ver los fragmentos incrustados en el gel;
luego realizaremos un registro fotogrco del gel para
documentar este importante paso.
Laboratorio 14
4.2

H;79J?LE
Muestras de plsmidos:
K-, K+
A-, A+
Plsmido ligado (tubo LIG)
Colorante de carga 5x
NaB 1x (o TBE 0.5x)
Marcador de tamao del ADN
(25 ng/l)

Conrmacin de la restriccin y la ligacin
Uso de electroforesis en gel de agarosa
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Aparato de electroforesis
Suministro elctrico
Lapicera para marcar
microfuga
Materiales
Renan las cinco muestras de plsmidos y el marcador de ADN que su profesor les
brindar y colquenlos en la gradilla plstica para tubos. Deben tener seis tubos.
Consigan cinco tubos de microfuga de 1.5 ml limpios y rotlenlos de la siguiente manera:
A-, A+, K-, K+, y L. El tubo de microfuga con el marcador ya debe estar rotulado.
En la siguiente tabla se resume la preparacin de la muestra de plsmidos para la
electroforesis.
Vean los Consejos antes de preparar estos tubos.
Consejos:
Por ejemplo, al tubo rotulado con A-, agrguenle 4 l de pARA-, 4 l de dH2O
y 2 l de colorante de carga. El colorante de carga debe ubicarse en la gradilla
plstica para tubos de microfuga al lado del tubo de dH
2
O.
Si estudian esta tabla, vern que pueden agregar agua a los cinco tubos, luego
agregar el colorante de carga a todos los tubos sin cambiar la punta. Luego, viertan
la muestra de plsmido en cada tubo, cambiando la punta cada vez para evitar
la contaminacin.
Guarden el tubo LIG que contiene su plsmido ligado; debe haber alrededor de
10l restante en este tubo.
Importante: regresen el tubo LIG a la gradilla con los tubos, en el frente del
saln, porque lo necesitarn para el prximo laboratorio.
Centrifuguen todas las muestras para combinar los reactivos en el fondo de cada
tubo. Asegrense de que los tubos estn ubicados en una conguracin equilibrada.
Preparen el gel y la cubeta de electroforesis para recibir las muestras de plsmidos.
Asegrense de que los oricios de gel estn orientados hacia el electrodo
negativo (negro).
Viertan la solucin reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) sobre el gel hasta que no haya
hoyuelos que rompan la supercie de la solucin reguladora sobre los oricios. Es
importante que el gel est completamente por debajo de la solucin reguladora de
NaB. No obstante, es recomendable que no utilicen demasiada solucin en la cubeta
para permitir que la corriente elctrica vaya por la solucin reguladora y no por el gel.
Coloquen sus muestras de plsmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas.
)
(
'
Mtodos
*
+
Contina en la pgina siguiente...
Tubo
A+
A
K
K+
L
4L
4L
4L
3L
4L 4L
2L
2L
2L
2L
2L

4L
4L

4L
10L
10L
10L
10L
5L
10L
dH
2
0 K-
Volumen
total
Colorante
de carga
K+ A+ LIG A-
Laboratorio 14
Add comb
Agarose
dissolved in
Well
Agarose gel
Fig. 1.3
Punta para pipeta
''
Compartirn este gel con otro grupo.
A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras con un esquema
diferente, carguen sus muestras como se indica a continuacin. Sigan las
instrucciones de carga que comienzan en el paso siete. Si cargan su muestra en
diferente orden, asegrense de registrarlo en su cuaderno para tomarlo como
referencia ms tarde.
Utilizando un punta limpia, preparen su micropipeta P-20 a 10 l. Aspiren 10 l de su
marcador de tamao de ADN y lentamente virtanlo en el oricio.
A medida que hacen esto, bajen suavemente la punta
de la pipeta por debajo de la supercie de la solucin
reguladora directamente sobre, pero no dentro, del oricio.
Si colocan la punta dentro del mismo pueden daar la pared
del oricio o perforar el fondo del mismo.
Esto no es aconsejable.
Utilicen ambas manos para estabilizar la pipeta. Lentamente viertan la
muestra empujando hasta la primera marca de detencin de la pipeta. Debido
al colorante de carga, la muestra tendr una densidad superior a la solucin
reguladora de electroforesis. Esto le permitir a la muestra hundirse en el
oricio.
Importante: Mientras sostienen el botn en la primera marca, retiren lenta-
mente la punta de la pipeta de la cubeta de gel. Si han cargado su muestra cor-
rectamente, el oricio se llenar de una solucin de color azul.
Realicen este mismo procedimiento con las muestras de plsmidos, siguiendo el orden in-
dicado en la pgina 4.3. Para cada muestra cambien la punta. Si eligen cargar sus muestras
en un orden diferente, asegrense de registrar el orden de las muestras en su cuaderno.
Cierren la tapa de la cubeta de gel con rmeza sobre la cmara de electroforesis.
Conecten los cables elctricos al suministro de energa. Asegrense de que ambos
cables estn conectados al mismo canal (mismo lado), el negativo (negro) con el
negativo (negro) y el positivo (rojo) con el positivo (rojo).
En el suministro elctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.
Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegrense de que el colorante prpura
(azul de bromofenol) se mueva hacia el electrodo positivo. Si se mueve en otra
direccin, hacia el electrodo negativo (negro), veriquen los cables elctricos para ver
que estn conectados al suministro elctrico correctamente.
Asegrense de regresar su tubo LIG al frente de la clase. Este tubo debe contener los
plsmidos recombinantes que utilizarn en el prximo laboratorio.
Su profesor explicar qu hacer con los geles: escuchen con atencin. Si el tiempo
de laboratorio es breve, no les alcanzar para completar la electroforesis. El colorante
amarillo deber llegar justo hasta el nal del gel, en alrededor de 40 50 minutos.
,
Continuacin desde la pgina anterior...
-
.
/
'&
'(
')
marcador K+ K- A+ A- L
4.3
Laboratorio 14
Cmo comparan sus resultados reales con sus predicciones sobre el gel?

Aparecen algunas bandas en la fotografa del gel que no
esperaban?
Cmo pueden explicar el origen de estas bandas inesperadas?
Observan evidencia de las tres formas de plsmidos en las franjas
sin cortes?
Hay pruebas de que hay ms de una forma de multmero?
Por qu los plsmidos ligados estn tan cerca del oricio?
Dos de los fragmentos pKAN-R de 702 pb, los fragmentos del gen
rfp, pueden formar un fragmento circular porque cada extremo de
los fragmentos termina en un extremo cohesivo de BamH I y Hind
III. Hay pruebas de que haya un fragmento circular de 1404 pb en
la franja ligada?
Conclusiones
'
(W
*
+
(X
)W
)X
Respondan a estas preguntas despus de que tengan la
oportunidad de analizar la fotografa del gel.
4.4
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
.............................................................................................................
Laboratorio 1 4a
4a.1
Conrmacion de
la digestin de restriccin de pARA-R
El objetivo de este protocolo es revisar los fragmentos de
restriccin que resultan de la doble digestin de pARA-R
por BamH I y Hind III (Laboratorio 2a). La electroforesis
en gel es un procedimiento comnmente utilizado para
separar fragmentos de ADN segn el tamao molecular
de los fragmentos de restriccin o el nmero de pares de
base. Como los colorantes que separaron en el Laboratorio
1, los fragmentos de ADN migrarn por el laberinto de
la agarosa. El ADN, debido a los grupos de fosfato,
tiene carga negativa y migrar hacia el electrodo positivo
(rojo). Dado que es ms fcil que las molculas pequeas
se muevan por la matriz de agarosa, stas migrarn ms
rpido que los fragmentos ms grandes. Imagnense un
grupo de corredores de campo traviesa cruzando una espesa
selva tropical. Con todos los dems factores iguales, los
corredores de menos altura podran circular por la espesura
de enredaderas que cuelgan y el denso follaje ms rpido
que los corredores ms altos. De manera que los fragmentos
ms pequeos de ADN se movern ms rpido por la
espesura de las molculas de agarosa que los fragmentos
ms grandes.
Tomaremos ambas muestras de plsmido, digerido y
no digerido, y utilizaremos la electroforesis para separar
estos fragmentos de restriccin. Tal vez predijeron que
sus plsmidos sin cortar produciran solamente una sola
banda de ADN: no hay motivo para pensar lo contrario.
Sin embargo, es posible que aparezcan dos o tres lneas
en la franja de plsmidos no digeridos (control). Este
es el motivo: los plsmidos aislados de las clulas tienen
varias formas. Una de las formas del plsmido se llama
superenrollada. Es posible visualizar esta forma
pensando en una pieza circular de tubera plstica torcida.
La torcedura o enrollamiento del plsmido tiene como
resultado una molcula muy compacta, que se mover por el
gel rpidamente debido a su tamao.
Una segunda forma de plsmido
es llamada crculo mellado o
crculo relajado. Con frecuencia,
un plsmido experimentar el
rompimiento de uno de los enlaces
covalentes ubicados en la cadena de
fosfato-azcar a lo largo de una de
las dos cadenas de nucletidos. El
congelamiento y descongelamiento
repetido del plsmido u otro tratamiento severo puede
causar el rompimiento. Cuando esto ocurre, la tensin
acumulada en el plsmido superenrollado se libera a medida
que el plsmido enrollado se desenrolla. Esta forma de
plsmido circular no se mover tan fcilmente por el gel
de agarosa como la forma superenrollada. Si bien tiene
el mismo tamao, en trminos de pares de base, estar
ubicado ms cerca del oricio que la forma superenrollada.
La ltima forma
de plsmido que
pueden observar se
llama multmero.
Cuando las bacterias
duplican plsmidos,
estos por lo general se
duplican tan rpido que
terminan unidos como
los eslabones de una
cadena. Si los dos plsmidos se unen, el multmero ser dos
veces ms grande que un solo plsmido y migrar
muy lentamente por el gel. De hecho, se mover ms
lentamente que el crculo mellado. La muestra de plsmido
no digerido, pARA-R, puede tener tres bandas que aparecen
en el gel. Comenzando muy cerca del oricio, pueden
observar que el multmero se desplaza primero, seguido de
una banda con forma circular mellada y nalmente una
banda superenrollada.
Utilizaremos una tcnica de tincin especial que nos
permite visualizar los fragmentos incrustados en el gel;
luego realizaremos un registro fotogrco del gel para
documentar este importante paso.
Laboratorio 1 4a
4a.2
Conrmacion de
la digestin de restriccin de pARA-R

H;79J?LE
Muestras de plsmidos:
A y A+ (del laboratorio 2a)
Colorante de carga 5x
NaB 1x (o TBE 0.5x)
Marcador de tamao del
ADN (25 ng/l)

;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Aparato de electroforesis
Suministro elctrico
microfuga
Materiales
Renan ambas muestras de plsmidos y el marcador de ADN que su profesor les
brindar y colquenlos en la gradilla plstica para tubos. Deben tener tres tubos.
Agreguen 2 l de colorante de carga a los tubos A+ y A-. Tengan cuidado de no contaminar las
muestras de plsmido. El colorante de carga aumentar la densidad de cada muestra para
que el ADN se hunda en el oricio del gel. El colorante de carga tambin contiene colorantes
visibles para que podamos seguir el progreso de las muestras durante la electroforesis. El
marcador de tamao del ADN ya contiene colorante de carga. Sin hacer burbujas, bombeen
suavemente la pipeta varias veces para mezclar el colorante de carga con las muestras de
plsmido. Asegrense de utilizar una punta nueva por cada muestra de plsmido para
evitar la contaminacin.
Preparen el gel y la cmara de electroforesis para recibir las muestras de plsmidos.
Asegrense de que los oricios de gel estn orientados hacia el electrodo
negativo (negro).
Viertan la solucin reguladora de NaB 1x (o TBE 0.5x) dentro de la cubeta de
electroforesis hasta que no haya hoyuelos que rompan la supercie de la
solucin reguladora sobre los oricios en el gel. Es importante que el gel est
completamente sumergido debajo de la solucin reguladora, pero es recomendable
que no haya demasiada solucin reguladora en la cubeta, dado que la electricidad
corre solamente a travs de la solucin reguladora y no a travs del gel.
Coloquen sus muestras de plsmidos y el marcador al gel, con la pipeta y las puntas.
Pueden compartir este gel con otro grupo.
A menos que su profesor les haya hecho cargar sus muestras con un esquema diferente,
carguen sus muestras como se indica a continuacin. Sigan las instrucciones de carga
que comienzan en el paso seis. Si cargan su muestra en diferente orden, asegrense de
registrarlo en su cuaderno para tomarlo como referencia ms tarde.
)
(
'
Mtodos
marcador A A +
*
+
Laboratorio 1 4a
Utilizando una punta limpia, preparen su micropipeta
P-20 a 10 l.
Aspiren 10 l de su marcador de tamao de ADN y
lentamente virtanlo en el oricio.

A medida que hacen esto, bajen lentamente la punta de la pipeta
por debajo de la solucin reguladora directamente sobre, no dentro,
del oricio. Si colocan la punta dentro del oricio pueden daar la
pared o perforar el fondo del mismo.
Utilicen ambas manos para estabilizar la pipeta. Lentamente
viertan la muestra empujando hasta la primera marca de detencin
de la pipeta. Debido al colorante de carga, la muestra tendr una
densidad superior a la solucin reguladora de NaB o TBE. Esto le
permitir a la muestra hundirse en el oricio.
Importante: mientras sostienen el botn en la primera marca,
retiren lentamente la punta de la pipeta de la cubeta de gel. Si
han cargado su muestra correctamente, el oricio se llenar de
una solucin de color azul que contiene la muestra.
Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 l de la muestra A- en
el prximo oricio.
Cambien la punta de la pipeta y carguen 12 l de la muestra A+ en
el prximo oricio.
Cierren la tapa de la cubeta de gel con rmeza sobre la cmara de
electroforesis. Conecten los cables elctricos al suministro de energa.
Asegrense de que ambos cables estn conectados al mismo canal
(mismo lado), el negativo (negro) con el negativo (negro) y el positivo
(rojo) con el positivo (rojo).
En el suministro elctrico, coloquen el voltaje en 130-135 v.
Luego de dos o tres minutos, observen el gel y asegrense de que el
colorante prpura (azul de bromofenol) se mueva hacia el electrodo
positivo. Si se mueve en otra direccin, hacia el electrodo negativo
(negro), veriquen los cables elctricos para ver que estn conectados al
suministro elctrico correctamente.
Su profesor explicar qu hacer con los geles, escuchen con atencin.
Si el tiempo de laboratorio es corto, no les alcanzar para completar la
electroforesis. El colorante amarillo deber llegar justo hasta el nal del
gel, en alrededor de 30 40 minutos.
Add comb
Agarose
dissolved in
Well
Agarose gel
Fig. 1.3
Punta para pipeta
-
.
/
''
,
'(
'&
Continuacin desde la pgina anterior...
4a.3
Laboratorio 1 4a
Adems de utilizarla para separar fragmentos de ADN, la electroforesis puede utilizarse para
calcular su tamao real. Por ejemplo, podramos estar buscando un gen y sospechamos que tiene
determinado tamao. La electroforesis se puede utilizar para ubicar fragmentos dentro de ese rango
de tamao. Para hacerlo, necesitaramos utilizar un gel con una mezcla de fragmentos de ADN de
tamaos conocidos. La mezcla, llamada marcador o escala, funciona como control o estndar
con el que podemos comparar las ubicaciones de otras bandas de ADN en el mismo gel.
En el diagrama a continuacin, la franja marcador contiene 10 bandas de ADN de
tamaos conocidos. El tamao de los fragmentos se brinda a continuacin. Utilizando esta
informacin y el mapa del plsmido de pARA-R, pronostiquen las ubicaciones de las bandas
de ADN producidas en A- y A+. Es aconsejable revisar las diferentes formas de plsmidos
descritas en la pgina 4a.1 y el mapa del plsmido pARA-R descrito en la pgina 2a.3.

Comparen la fotografa de gel con su prediccin. Ven alguna banda de ADN inesperada?
En relacin con la escala de ADN, entre qu dos bandas est ubicado el gen rfp?
Aqu es dnde predijeron que estara ubicado?
En la franja A-, ven algn indicio de que haya formas de plsmidos diferentes?
Qu forma de conformacin de plsmido migra ms rpido? Cul es la ms lenta?
La franja A+, indica una digestin completa? Expliquen su respuesta.
Qu fragmento de ADN contiene el gen ampr?
Cul es el tamao de este fragmento de restriccin de ADN?
Conclusiones
'
marcador A- A+
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Fragmentos marcadores
10.0 par de kilobase
8.0
6.0
5.0
4.0
3.0 (banda ancha)
2.0
1.5
1.0
0.5
1
2
3
4
5
7
8
9
10
6
(
)
*
+
,
Las preguntas 1 y 2 deben responderse antes o durante la electroforesis.
Preguntas respondidas luego de la documentacin de la electroforesis.
4a.4
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
Laboratorio 15
5.1
Transformacin de Escherichia coli
con un plsmido recombinante
Hasta aqu, han producido plsmidos recombinantes
ligados. Con suerte, algunos de estos ADN recombinantes
tendrn fragmentos de pKAN-R de 702 pb, el gen rfp,
ligados a un fragmento de restriccin pARA ms grande.
A este plsmido se le conoce como pARA-R. Ahora,
queremos que estos plsmidos recombinantes pasen a las
clulas bacteriales para que podamos obtener las clulas
que expresen el gen rfp y generar la protena uorescente
mutante.
El proceso de incluir partes extraas de ADN, como
un plsmido, en una clula bacterial se denomina
transformacin. La transformacin es un proceso que
ocurre en la naturaleza, aunque probablemente es algo
poco frecuente. El mdico britnico Frederick Grifth fue
el primero en estudiar el proceso en 1928. Por lo general,
las bacterias transeren un exceso de material gentico
cromosomtico, como los plsmidos, durante la conjugacin
(sexo bacterial) en lugar de dejarse libradas a su suerte.
Pero incluir plsmidos puede suministrar a las bacterias
determinados genes que coneren una ventaja selectiva, por
ejemplo, la resistencia a los antibiticos. Sin embargo, bajo
condiciones experimentales, es posible preparar clulas de
modo que alrededor de una clula en mil tome un plsmido
del medio circundante.
Existen diversos factores que determinan la eciencia
de la transformacin. Dos factores estn relacionados
directamente con el plsmido utilizado para la
transformacin. Cuanto ms grande sea ste, menos
probabilidades habr de que ingrese a la bacteria. Recuerden
que para que la bacteria tome ADN extrao, el plsmido
debe pasar por la membrana plasmtica y la pared celular
de las bacterias.
Por lo tanto, los plsmidos pequeos tienen ms
posibilidades de pasar por las membranas plasmticas de
la bacteria (E. coli tiene dos) y la pared celular que los
plsmidos grandes.
Los plsmidos pueden tener diferentes formas. La forma
superenrollada entra con mayor facilidad a la clula,
en tanto las formas de crculo mellado o multmero,
es decir, dos o ms plsmidos unidos, tienen mayor
dicultad para hacerlo. El tubo de ligacin que contiene
los plsmidos recombinantes que prepararon, no contiene
ningn plsmido superenrollado. El superenrollado de
un plsmido requiere una enzima que se encuentra en la
clula bacterial; sta no estaba incluida dentro de su tubo
de ligacin. Los plsmidos recombinantes que prepararon
son principalmente de crculo mellado, pero hay una gran
variedad en el tamao.
En la naturaleza, la transformacin es relativamente
poco frecuente. Para aumentar las posibilidades de que
plsmidos recombinantes ingresen a las clulas bacteriales,
utilizaremos clulas competentes. Esto signica que
las clulas estn preparadas para recibir plsmidos. En
su mayor parte, no se encuentran clulas competentes
en la naturaleza; stas deben hacerse competentes en el
laboratorio. Una forma comn de hacerlo es embebiendo las
clulas en cloruro de calcio.
Recuerden que el ADN tiene carga negativa. Recuerdan
por qu? Las membranas plasmticas que rodean la clula
bacterial tambin contienen grupos de fosfato y poseen
carga negativa. El problema que se presenta al intentar
pasar ADN con carga negativa por una membrana con
carga negativa es que las cargas elctricas iguales tienden
a rechazarse. Cuando las clulas se vuelven competentes,
se suspenden en una solucin de cloruro de calcio porque
los iones del calcio (tomos de calcio con carga positiva,
Ca 2+) ayudan a neutralizar las cargas elctricas negativas
de la membrana plasmtica y el plsmido. Neutralizando
las cargas repulsivas mediante iones de calcio, el ADN
plasmdico pasa con mayor facilidad por la membrana
plasmtica de la clula bacterial. Las clulas ya fueron
hechas competentes y su profesor les entregar una alcuota.
No obstante, debern realizar el siguiente paso.
Ahora que hemos neutralizado las cargas negativas del
ADN y de las membranas plasmticas, necesitamos crear
una diferencia de presin entre la parte interna y externa de
la clula bacterial. Esto se logra, en primer lugar, enfriando
las bacterias y luego sumergindolas rpidamente en agua
tibia. Esto se denomina choque trmico y crea una
situacin en la que la presin externa de la clula es apenas
mayor que la presin interna de la misma. Este gradiente
de presin ayudar a trasladar el ADN plasmdico desde
el exterior hasta el interior de la clula bacterial. Luego de
este duro tratamiento, tendremos que alimentar a nuestras
bacterias y dejarlas recuperarse durante algunos minutos
antes de diseminarlas en placas de agar.
Una vez que las clulas se han recuperado, se tomarn
muestras de estas clulas y se dispondrn en una serie
Pared
celular
ADN genmico
Membranas
plasmticas
Plsmido
Plsmidos
Pared celular
ADN genmico
Membranas
plasmticas
Laboratorio 15
5.2
con un plsmido recombinante
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Bao Mara a 42 C
1 paquete de esparcidores de
clulas (compartido)
microfuga
Materiales
H;79J?LEO9KBJ?LE
Tubo LIG (plsmidos recombinantes)
100 l de clulas competentes (LMG)
350 l de caldo de LB (esterilizado)
Hielo molido (en una taza de
poliestireno)
Placas de agar, esterilizadas
1 LB, 1 LB/Amp, 1 Lb/amp/ara
de placas de agar esterilizadas. Una de estas placas contendr
solamente alimentos bacteriales; la placa no contiene
antibiticos. Rotulen esta placa como LB. La segunda, debe
contener LB y ampicilina y deben rotularla como amp. La
tercera placa debe contener LB, ampicilina y un monosacrido
llamado arabinosa, y deben rotularla como ara.
La ampicilina es un antibitico que evita que las bacterias
formen completamente su pared celular. Las clulas que no
resisten la ampicilina no pueden crecer en su presencia, las
clulas nuevas simplemente se rompen o se lisan. Si una clula
recibe un gen resistente a la ampicilina, amp
r
, producir una
protena que destruir qumicamente la ampicilina y, de esa
forma, podr crecer con ampicilina en su medio.
La bacteria necesita arabinosa, un monosacrido, para
expresar el gen rfp. Si una bacteria incluye pARA-R, la arabinosa
ayuda a la enzima ARN polimerasa, necesaria para transcribir
el gen rfp, para que se alinee correctamente en el plsmido. Esta
relacin se tratar en el prximo laboratorio.
Aunque la cepa de E. coli que se utiliza en estos laboratorios
es relativamente benigna, es importante que utilicen tcnicas
adecuadas al momento de manipularlas.
Laboratorio 15
,
*
-
.
Tomen dos tubos de microfuga limpios.
Rotulen uno P+ y el otro P-.

Tomen una taza de poliestireno con
hielo molido y coloquen un tubo que
contenga 100 l de clulas competentes
dentro del hielo. Es impor tante que las
clulas permanezcan a 0 C. Adems, coloquen
los tubos P+ y P- en el hielo.
Tomen los plsmidos ligados de la gradilla para tubos de
microfuga rotulada tubos LIG. Su tubo LIG deber estar
rotulado con su nmero de grupo y horario de clase.
Preparen la pipeta P-200 en 50 l (conf igurada en 0-5-
0) y coloquen una punta limpia en su cilindro. Con mucho
cuidado, vuelvan a suspender las clulas movindolas
suavemente hacia adentro y hacia fuera dos veces.
Sostengan el tubo por el borde superior para evitar
calentar las clulas con los dedos.
Repar tan una alcuota de 50 l de las clulas suspendidas
en los tubos de microfuga P+ y P- previamente enfriados.
Inmediatamente regresen las clulas al refrigerante.
Sostengan los tubos por el borde superior para evitar
calentar las clulas con los dedos.
Utilizando la pipeta P-20, agreguen 10 l del plsmido
ligado al tubo rotulado P+. Mezclen suavemente el
plsmido con la suspensin de clulas bombeando
la suspensin de clulas dos veces. Regresen
inmediatamente el tubo P+ al hielo. No agreguen
plsmido al tubo P. Las clulas de este tubo ser virn
para el control de plsmidos.
Mantengan las clulas en el hielo durante 15 minutos.
Mientras las clulas incuban en el hielo, consigan lo
siguiente:
Cada una de estas placas de agar:
LB, LB/amp (LB + ampicilina)
y
LB/amp/ara (LB + amp + arabinosa)
+
Mtodos
Rotulen las bases de las tres placas que contienen agar con
su nmero de grupo y horario de la clase. Escriban con letra
pequea y en el borde de la placa. Luego tracen dos lneas en
las placas LB y amp por la mitad. Rotulen una de las mitades
de cada placa P+ y la otra mitad P-. Vean el diagrama a
continuacin. No dividan la placa ara.
Luego de la incubacin de 15 minutos en hielo, lleven la taza
de hielo que contiene las clulas a bao Mara a 42 C. Retiren
los tubos del hielo y somtanlos a bao Mara durante 45
segundos. Luego de un choque de calor de 45 segundos,
colquenlos otra vez en el refrigerante de inmediato durante
por lo menos un minuto.
Luego de un minuto, utilicen la pipeta P-200 para agregar 150
l (congurada en 1-5-0) de caldo de LB al tubo P-. Tapen el
tubo y den golpecitos suaves en la parte inferior del tubo dos o
tres veces para mezclar.
Utilicen una nueva punta y transeran 150 l de caldo de LB al tubo
P+. Cierren la tapa y den golpecitos suaves en el tubo para mezclar.
Soliciten a su profesor un paquete de esparcidores de clulas
esterilizados. Trabajarn con el paquete cada dos grupos.
Ahora estn listos para esparcir sus clulas bacteriales
en las placas de agar esterilizadas.
Utilizando una pipeta P200 (congurada
en 0-5-0), muevan suavemente la
pipeta dos o tres veces para volver a
suspender las clulas; luego aspiren 50 l
de clulas del tubo P-. Abran la tapa de la
placa LB como una almeja. Viertan estas
clulas en la mitad de la placa marcada
P-. Cierren la tapa.
Para que este laboratorio funcione sin dicultades, es importante que sepan qu tareas se les asignaron a cada miembro del grupo
antes de comenzar. Un miembro debe preparar el hielo y conseguir las clulas competentes, otro puede recuperar los plsmidos
ligados y otro puede conseguir las placas de agar, el caldo de LB y los tubos de microfuga limpios.
'
(
)
P+ P-
P-
Placa LB
P+ P-
Placa LB/amp
P+
P+
LB/amp/ara
'&
''
'*
/
'(
')
W
5.3
Laboratorio 15
Mango
Superficie
donde se
esparcen
Vuelvan a suspender las clulas bombeando suavemente
con la pipeta, luego aspiren una segunda alcuota de 50
l para la placa LB/amp. Recuerden que deben depositar
las clulas P en la mitad de la placa rotulada P-.
Tapen la placa.
Abran el paquete de esparcidores de clulas esterilizados
en la terminacin ms cercana a los mangos del
esparcidor. Compartirn este paquete con otro
grupo. Retiren slo un esparcidor y mantengan los
dems esterilizados. Sostengan el esparcidor por
el mango y no permitan que la terminacin doblada
toque ninguna supercie, ya que podra contaminar el
esparcidor. Cierren el paquete para evitar que los dems
esparcidores se contaminen.
Abran la tapa de la placa LB
como una almeja y, suavemente,
con un leve desplazamiento,
diseminen las clulas por la
supercie del agar, manteniendo
las clulas en el lado P de la
placa. Intenten esparcirlas de
forma pareja y a los lados de la placa.
Con cuidado, diseminen las clulas P- en la placa LB/
amp utilizando el mismo esparcidor y la misma tcnica.
Coloquen el esparcidor usado en la bolsa para riesgos
biolgicos.
Repitan los pasos 14-a hasta 14-e para sembrar las
placas LB y LB/amp con el cultivo P+. Asegrense de
utilizar la pipeta + y un nuevo esparcidor para evitar
la contaminacin.
Ahora estn listos para sembrar la placa LB/amp/ara.
Utilizando la pipeta P-200
(congurada en 1-0-0), transeran
100 l del cultivo P+ a la supercie
de la placa LB/amp/ara. Coloquen
100 l de clulas en varias reas
de la supercie del agar en vez de
depositarlas en un solo lugar.
Levanten la tapa como una almeja y
diseminen las clulas uniformemente
sobre la supercie de la placa.
Giren suavemente la placa por debajo
del esparcidor P+ de manera que las
clulas se puedan diseminar por toda
la supercie de esta placa. Intenten
diseminar las clulas uniformemente
tambin a lo largo de la pared de la
placa.
Cuando terminen, tapen la placa.
Coloquen las tres placas del lado derecho hacia arriba
durante cinco minutos.
Utilizando una cinta adhesi va de color, aseguren las
placas y colquenlas en la incubadora, con el gel boca
arriba. Asegrense de haber rotulado claramente las
placas con su nmero de grupo y el horario de clase.
Pueden marcar la cinta adhesi va para encontrarlas
rpidamente el prximo laboratorio.
Desechen el desecho celular contaminado: esparcidores,
tubos de clulas y puntas para pipetas, colocndolas en
la bolsa para desechos celulares contaminados que su
profesor les entregar.
X
Y
Z
]
W
X
Y
Z
'+
',
'-
'.
P-
Placa LB
50 L 50 L
P+ P-
Placa LB/amp
P+
P-
[
\
Placa LB/amp/ara
100 L de clulas
P+
P+
5.4
Laboratorio 15
Anticipen el crecimiento, si ocurre, en las siguientes placas. Recuerden que las clulas del
cultivo P+ recibieron los plsmidos recombinantes, mientras que las del cultivo P no. Utilicen
un + si anticipan el crecimiento y un si anticipan que no crecern.
Qu tienen en comn todas las clulas que crecen en las placas LB/amp y LB/amp/ara?

Qu fragmento de restriccin deben tener todas para crecer en las placas con ampicilina?

Esperan que todas las clulas que crezcan en la placa LB/amp/ara se transformen con el
mismo plsmido? Expliquen por qu.

Cmo podran determinar qu clulas de la placa LB/amp/ara contienen pARA-R, el plsmido
recombinante que han creado ligando el gen rfp con el fragmento de restriccin pARA?
Conclusiones
(W
(X
)W
)X
'
P-
Placa LB
P+ P-
Placa LB/amp
P+
P+
LB/amp/ara
Respondan a las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la transformacin.
5.5
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
.................................................................................................................................................
Laboratorio 15
Utilicen la siguiente tabla para comparar el resultado de la transformacin real con los
resultados previstos. Vean los resultados pronosticados en la pgina 5.5.

Si sus resultados reales resultaron diferentes de lo esperado, propongan razones que
expliquen estas diferencias.

Cuntas colonias rojas estuvieron presentes en la placa LB/amp/ara?

Por qu las colonias rojas slo aparecen en esta placa y no en la placa LB/amp?

Esperaban que algunas de las bacterias de la placa LB/amp se transformaran con pARA-R?
Describan brevemente cmo podran probar su respuesta.
*X
+W
+X
+Y
*W
Placa Resultados pronosticados Resultados reales
LB
LB/Amp
LB/Amp/Ara
Respondan a estas preguntas despus de ver los resultados de la transformacin.
5.6
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
....................................................................................................................................................
Laboratorio 1 5a
5a.1
con pARA-R
El proceso de incluir partes extraas de ADN, como
un plsmido, en una clula bacterial se denomina
transformacin. La transformacin es un proceso que
ocurre en la naturaleza, aunque probablemente es algo
poco frecuente. El mdico britnico Frederick Grifth fue
el primero en estudiar el proceso en 1928. Por lo general,
las bacterias transeren un exceso de material gentico
cromosomtico, como plsmidos, durante la conjugacin
(sexo bacterial) en lugar de dejarse libradas a su suerte.
Pero incluir plsmidos puede suministrar a las bacterias
determinados genes que coneren una ventaja selectiva, por
ejemplo, la resistencia a los antibiticos. Sin embargo, bajo
condiciones experimentales, es posible preparar clulas de
modo que alrededor de una clula en mil tome un plsmido
del medio circundante.
Existen diversos factores que determinan la eciencia
de la transformacin. Dos factores estn relacionados
directamente con el plsmido utilizado para la
transformacin. Cuanto ms grande sea ste, menos
probabilidades habr de que ingrese a la bacteria. Recuerden
que para que la bacteria tome ADN extrao, el plsmido
debe pasar por la membrana plasmtica y la pared celular
de las bacterias. Por lo tanto, los plsmidos pequeos tienen
ms posibilidades de pasar por las membranas plasmticas
de la bacteria (E. coli tiene dos) y la pared celular que los
plsmidos grandes.
Los plsmidos pueden tener diferentes formas. La forma
superenrollada entra con mayor facilidad a la clula, en
tanto las formas de crculo mellado o multmero, es decir,
dos o ms plsmidos unidos, tienen mayor dicultad para
hacerlo.
En la naturaleza, la transformacin es relativamente
poco frecuente. Para aumentar las posibilidades de que
plsmidos recombinantes ingresen a las clulas bacteriales,
utilizaremos clulas competentes. Esto signica que
las clulas estn preparadas para recibir plsmidos. En
su mayor parte, no se encuentran clulas competentes
en la naturaleza; stas deben hacerse competentes en el
laboratorio. Una forma comn de hacerlo es embebiendo
las clulas en cloruro de calcio.
Recuerden que el ADN tiene carga negativa. Recuerdan
por qu? Las membranas plasmticas que rodean la clula
bacterial tambin contienen grupos de fosfato y poseen
carga negativa. El problema que se presenta al intentar
pasar ADN con carga negativa por una membrana con
carga negativa es que las cargas elctricas iguales tienden
a rechazarse. Cuando las clulas se vuelven competentes,
se suspenden en una solucin de cloruro de calcio porque
los iones del calcio (tomos de calcio con carga positiva,
Ca 2+) ayudan a neutralizar las cargas elctricas negativas
de la membrana plasmtica y el plsmido. Neutralizando
las cargas repulsivas mediante iones de calcio, el ADN
plasmdico pasa con mayor facilidad por la membrana
plasmtica de la clula bacterial.
Ahora que hemos neutralizado las cargas negativas del
ADN y de las membranas plasmticas, necesitamos crear
una diferencia de presin entre la parte interna y externa de
la clula bacterial. Esto se logra, en primer lugar, enfriando
las bacterias y luego sumergindolas rpidamente en agua
tibia. Esto se denomina choque trmico y crea una
situacin en la que la presin externa de la clula es apenas
mayor que la presin interna de la misma. Este gradiente
de presin ayudar a trasladar el ADN plasmdico desde el
exterior hasta el interior de la clula bacterial.
Una vez que las clulas se han recuperado, se tomarn
muestras de estas clulas y se dispondrn en una serie de
placas de agar esterilizadas. Una de las placas contendr
slo el alimento bacterial. Esta placa no debe contener
antibiticos. Rotulen esta placa como LB. La segunda,
debe contener LB y ampicilina, y deben rotularla como
amp. La tercera placa debe contener LB, ampicilina y
un monosacrido llamado arabinosa, y deben rotularla
como ara.
La ampicilina es un antibitico que evita que las
bacterias formen completamente su pared celular. Las
clulas que no resisten la ampicilina no pueden crecer en su
presencia, las clulas nuevas simplemente se rompen o se
lisan. Si una clula recibe un gen resistente a la ampicilina,
amp
r
, producir una protena que destruir qumicamente
la ampicilina y, de esa forma, podr crecer con ampicilina
en su medio.
La bacteria necesita arabinosa, un monosacrido, para
expresar el gen rfp. Si una bacteria incluye pARA-R, la
arabinosa ayuda a la enzima ARN polimerasa, necesaria
para transcribir el gen rfp, para que se alinee correctamente
en el plsmido. Esta relacin se tratar en el prximo
laboratorio.
Aunque la cepa de E. coli que se utiliza en estos
laboratorios es relativamente benigna, es importante que
utilicen tcnicas adecuadas al momento de manipularlas.
Pared
celular
ADN genmico
Membranas
plasmticas
Plsmido
Plsmidos
Pared celular
ADN genmico
Membranas
plasmticas
Laboratorio 1
5a.2
5a
P-
Placa LB
P+ P-
Placa LB/amp
P+
P+
LB/amp/ara
con pARA-R
La transformacin bacterial exige tcnicas estriles. Es
fundamental que sigan las instrucciones con precisin.
Utilicen el marcador para rotular como P+ uno de los
tubos de microfuga esterilizados de 1.5 ml y el otro tubo
como P-. El ADN plasmdico se agregar slo al tubo P+.
El tubo P- representar un control plasmdico negativo.
Tomen el tubo que contiene CaCl
2
. Utilicen la pipeta P-
200 y una punta limpia para transferir 250 l de CaCl
2
a
los tubos P+ y P-. Indicacin: preparen la pipeta P-200 en
125 l y transeran dos alcuotas a cada tubo rotulado.
La pipeta debe indicar 1-2-5 en la pantalla.
El instructor entregar a la clase un plato Petri con
colonias de clulas de E. coli. Utilicen un asa de siembra
esterilizada para raspar suavemente dos o tres colonias
grandes de bacterias del plato Petri y transferirlas al
tubo P+. Den un golpecito con el asa contra la pared del
tubo para quitar las colonias del asa. Tapen el tubo y
muvanlo enrgicamente por la supercie de la gradilla
para tubos de microfuga para suspender las clulas en
CaCl
2
. Continen haciendo esto hasta que no se vean
aglomeraciones visibles de bacterias. Coloquen este tubo
en el hielo triturado.
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Asa de siembra esterilizada
Esparcidores desechables de clulas (2)
Gradilla para tubos de microfuga
Marcador indeleble
Micropipeta y puntas P-20
Micropipeta y puntas P-200
Vaso de precipitados con desinfectante
Bao Mara a 42 C
Materiales
H;79J?LEO9KBJ?LE
Placa con E. coli (LMG)
Hielo triturado
10 l de pARA-R (10 ng/l)
1 ml 50 mm de CaCl
2
1 placa con LB
1 placa con LB y amp
1 placa con LB y amp y ara
Mtodos
'
Preparacin de clulas competentes para la transformacin.
(
)
*
Repitan este procedimiento usando la misma asa de
siembra, pero transeran la colonia y suspendan las clulas
en el tubo P-. Coloquen este tubo en el hielo triturado.
Coloquen el asa de siembra en desinfectante o en una bolsa
de desechos celulares para su correcta eliminacin.
Transeran 10 l de plsmido (pARA-R) directamente en
la suspensin celular del tubo P+. Agiten brevemente
la mezcla dando golpecitos suaves en la base del tubo de
microfuga con el dedo ndice. Eviten salpicar la mezcla en
la supercie lateral del tubo de transformacin. Regresen
el tubo P+ al hielo triturado.
Incuben ambos tubos en hielo triturado durante
15 minutos. Asegrense de que los tubos estn en
contacto con el hielo. Es importante que las clulas
se enfren bien.
Tomen una de cada una de las siguientes placas: LB,
LB/amp y LB/amp/ara.

Usando el marcador y una regla, dibujen una lnea en el
medio de las placas LB y LB/amp, pero no en la placa
LB/amp/ara. Realicen esta divisin en la base de gel
de ambas placas. Rotulen con una P- y una P+ las
mitades de las bases de las placas LB y LB/amp y con
un + la base de la placa LB/amp/ara.
+
,
-
.
/
Laboratorio 1 5a
Transformacin de E. coli con pARA-R
Despus del enfriamiento en hielo de 15 minutos, realicen un choque trmico en las
clulas de ambos tubos mediante los siguientes procedimientos:
Trasladen el contenedor de hielo con los tubos de transformacin P+ y P- del paso 7
a bao Mara a 42 C. Es importante que las bacterias experimenten un cambio bien
abrupto de temperatura.

Mantengan ambos tubos a bao Mara durante 45 segundos exactamente.

Devuelvan ambos tubos al hielo triturado de forma inmediata durante al menos un minuto.
Despus del enfriamiento de un minuto, vuelvan a colocar los dos tubos en la gradilla de tubos
de ensayo y mantnganlos a temperatura ambiente.
'
)
'
*
''
Esparcimiento de las clulas transformadas en placas de agar
Coloquen las tres placas en el siguiente
orden: LB, LB/amp, LB/amp/ara.
Preparen la pipeta P-200 en 50l. La
pipeta indicar 0-5-0.
Sostengan las clulas P- (control)
entre el dedo pulgar e ndice. Den
golpecitos suaves en la base del
tubo para volver a suspender las
clulas. Depositen 50 l de estas clulas en la mitad - de
las placas LB y LB/amp. No depositen estas clulas en la
placa LB/amp/ara.
Abran el paquete de
esparcidores esterilizados
de clulas en la terminacin
ms cercana a los mangos
del esparcidor. Compartirn
este paquete con otro grupo.
Retiren slo un esparcidor
y mantengan los dems esterilizados. Sostengan el
esparcidor por el mango y no permitan que la terminacin
doblada toque ninguna supercie, ya que podran
contaminar el esparcidor. Cierren el paquete para evitar
que los dems esparcidores se contaminen.
Abran la tapa de la placa LB como una almeja y, con
movimientos suaves y deslizantes, esparzan las clulas por la
supercie del agar, manteniendo las clulas slo en el lado
de la placa. Intenten esparcirlas de forma pareja y a los lados
de la placa.
(
-
.
'&
/
Mango
Superficie
donde se
esparcen
(
Utilizando el mismo esparcidor, repitan el procedimiento de
esparcimiento en la placa LB/amp.
Despus de utilizarlo en la placa LB/amp, desechen el esparcidor
de clulas en desinfectante o en una bolsa de desechos celulares.
Una vez que hayan vuelto a suspender las clulas en el
tubo P+, utilicen una punta nueva y depositen 50 l de
clulas en el lado + de las placas LB y LB/amp; luego
depositen 150 l de las clulas en la placa LB/amp/ara.
Utilizando un esparcidor de clulas nuevo, repitan los pasos
4 y 5 esparciendo las clulas en el lado + de las placas LB y
LB/amp y sobre toda la supercie de la placa LB/amp/ara.
Desechen este esparcidor de clulas en desinfectante o en
una bolsa de desechos celulares.
Utilicen cinta adhesiva para unir las placas. Escriban su
nombre en la cinta para poder reconocer las placas ms
adelante. Coloquen las placas boca abajo en una incubadora
a 37 C.
Incuben las placas entre 24 y 36 horas a 37 C.
,
+
5a.3
Laboratorio 1 5a
Anticipen el crecimiento, si ocurre, en las siguientes placas. Recuerden que las clulas
del cultivo P+ recibieron el plsmido, mientras que las del cultivo P no. Utilicen un
+ si anticipan el crecimiento y un si anticipan que no crecern.

Qu tienen en comn todas las clulas que crecen en las placas LB/amp y
LB/amp/ara?

Qu fragmento del plsmido pARA-R permite que estas clulas crezcan en
estas placas?

Qu tamao tiene este fragmento en bases apareadas?

En qu placa/s anticiparan que las clulas expresarn el gen rfp?

Utilicen la siguiente tabla para comparar el resultado de la transformacin real con
los resultados previstos.

Si sus resultados reales resultaron diferentes de lo esperado, propongan razones que
expliquen estas diferencias.

Cuntas colonias rojas estuvieron presentes en la placa LB/amp/ara?

Por qu las colonias rojas slo aparecen en esta placa y no en la placa LB/amp?
Conclusiones
'
(W
)
*W
P-
Placa LB
P+ P-
Placa LB/amp
P+
P+
LB/amp/ara
Placa Resultados pronosticados Resultados reales
LB
LB/Amp
LB/Amp/Ara
Respondan las preguntas 1 a 3 antes de ver los resultados de la transformacin.
Respondan estas preguntas despus de ver los resultados de la transformacin.
(X
(Y
*X
+W
+X
5a.4
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
Laboratorio 1 6
6.1
Preparacin de
Preparacin de un cultivo overnight de Escherichia coli
El propsito de este laboratorio es iniciar un
cultivo de bacterias que produzca una cantidad suciente
de protena uorescente mutante que les permita aislar y
puricar la protena. El profesor seleccionar una de las
colonias rojas de la placa LB/amp/ara transformadas con
el plsmido pARA-R y la usar para sembrar un cultivo
overnight.
El gen para mFP fue aislado originalmente de una
anmona de mar. La mFP se usa con mucha frecuencia
en investigaciones porque la protena se puede fusionar
con otras protenas y luego se puede hacer un seguimiento
usando un microscopio uorescente. El gen original de la
protena uorescente se mut para producir una molcula
que tiene un brillo uorescente muchas veces mayor. El
plsmido pARA-R fue diseado luego para la expresin del
gen.
En el siguiente diagrama se ilustra la regin de pARA-
R que contiene los principales elementos de control
requeridos para expresar el gen rfp. Es fundamental que
tengan en cuenta que slo una pequea parte del plsmido
pARA-R est representada en este diagrama y que el ADN
est ilustrado como una lnea recta en lugar de un crculo.
El diagrama identica tres regiones importantes: 1) el gen
araC; 2) la regin promotora (P
BAD
); y 3) la ubicacin del
gen rfp en relacin con los dems elementos de control en
el plsmido.
El gen araC representa una protena reguladora conocida
como protena AraC. La protena AraC participa en la
activacin y desactivacin del gen rfp. En el diagrama
anterior se resume la relacin entre el gen AraC, la
transcripcin, el ARN mensajero, el desplazamiento y la
protena araC.
El sitio promotor es la parte de ADN donde ocurre la
regulacin de la expresin del rfp. Cuando no hay arabinosa
en el medio donde se encuentra la bacteria, la protena AraC
se une fsicamente con dos regiones del plsmido, el sitio
promotor y una regin cercana al gen araC. Esto hace que
la molcula de ADN se doble, formando un bucle. Cuando
el ADN se encuentra en esta conguracin, la transcripcin
del ARNm no puede ocurrir porque evita que la ARN
polimerasa se una al sitio promotor. Sin el ARNm, la
bacteria no puede producir mFP.
Cuando la arabinosa est presente en el medio de la
bacteria, la arabinosa se une a la protena AraC, formando
un complejo. Esto evita que se forme el bucle de ADN.
La unin de la arabinosa tambin origina un cambio en
la conformacin de la protena (forma), que resulta en la
formacin de un pequeo bolsillo que ayudar a una tercera
molcula, la ARN polimerasa, a unirse al complejo.
Este complejo de tres molculas se une al sitio promotor,
y la ARN polimerasa se alinea en la molcula de ADN de
manera que pueda transcribir el gen rfp. Esta transcripcin
produce el ARNm, que se traduce como mFP. Por lo tanto,
la protena AraC tiene una funcin doble: puede inhibir la
sntesis de mFP al permitir que el ADN forme un bucle y al
evitar que la ARN polimerasa se una a la regin promotora,
y puede activar la transcripcin del gen rfp y, por lo tanto,
la produccin de mFP, si se une a la arabinosa.
gen
araC
rfp Promotor
Protena AraC
mRNA
Transcripcin
Traduccin
gen
araC
gen
rfp
Promotor
La protena AraC evita la transcripcin
del rfp causando la formacin de un
bucle en la regin del gen rfp
mRNA
mFP
gen
araC
rfp
Promotor
arabinosa Complejo de protena araC
protena araC
arabinosa
ARN polimerasa
Transcripcin
El complejo de protena AraC-arabinosa evita la
formacin de bucles en el ADN y ayuda a alinear
la ARN polimerasa en el sitio promotor
Laboratorio 1 6
6.2
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Agitador
palillo de dientes limpio
Materials
H;79J?LE
Placa LB/amp/ara (del laboratorio 5 5a)
Frasco esterilizado con caldo LB/amp/ara
Dado que trabajar con bacterias, es importante
que lo haga rpido para evitar la contaminacin.
El instructor utilizar un palillo de dientes limpio para trans-
ferir algunas clulas desde una colonia que exprese el mFP
(rojo) a un frasco que contenga caldo LB/amp/ara.
El frasco se ubicar en un agitador y se agitar durante
toda la noche para provocar la divisin de clulas y la expre-
sin del gen rfp.
Mtodos
(
'
'
Conclusiones
Aunque el instructor haya trabajado rpidamente para
transferir una muestra de bacterias que expresan el
gen rfp, hay probabilidad de que tambin se hayan
transferido algunas bacterias que no expresan este gen.
Qu evitara el crecimiento de estas bacterias en el
caldo LB/amp/ara?

El objetivo de este cultivo overnight es clonar las
bacterias que expresan el gen rfp y lograr que stas
produzcan suciente mFP para puricar la protena
de las dems protenas de la clula. Como las clulas
son cultivadas, esperara encontrar el mFP dentro de
las clulas bacteriales o en el caldo de nutrientes que
rodea a las clulas?
(
Cuando la bacteria expresa el gen rfp y produce la
protena uorescente mutante, la clula toma estas
molculas de mFP y las concentra en cuerpos de inclusin.
Los cuerpos de inclusin son grnulos concentrados
de molculas de mFP y no estn unidos mediante una
membrana.
Pared celular
Otras protenas Citoplasma
Molculas de mFP
de los cuerpos
de inclusin
ADN genmico
Membranas
plasmticas
rpARA
Pared celular
Otras protenas
ADN genmico
Membranas
plasmticas
pARA-R
pARA-R
Membranas
plasmticas
Molculas de mFP
de los cuerpos
de inclusin
Pared celular
Molculas de mFP
de los cuerpos
de inclusin
ADN genmico
Otras protenas
Citoplasma
Laboratorio 17
7.1
Puricacin de mFP
a partir de un cultivo overnight
Cuando los cientficos de una compaa
teraputica, como Amgen, identican exitosamente una
protena teraputica promisoria, se presentan dos objetivos:
ubicar y aislar el gen que codica la protena. Una vez
aislado, el gen se inserta en un plsmido para que se pueda
clonar, ya que se necesitarn copias adicionales del gen para
los continuos estudios. El gen rfp se clon en un plsmido
llamado pKAN-R. El pKAN-R es un vector de clonacin,
un plsmido que ha sido diseado para reproducirse en
grandes cantidades dentro de la clula bacterial.
Luego, los genes clonados se insertan en plsmidos que
han sido diseados especcamente para la expresin de la
protena en las bacterias u otros organismos propicios. Estos
plsmidos se conocen como vectores de expresin, como
el pARA-R que porta el gen rfp clonado en una ubicacin
especca del plsmido, lo que permite a la clula bacterial
producir la protena uorescente mutante.
Las clulas transformadas pueden expresar la protena
en un cultivo overnight y luego lisarse (partirse) para
liberar la protena recientemente sintetizada de la clula. La
protena se asla de las dems protenas citoplasmticas, se
purica y se evala su actividad.
Ya han completado gran parte
del trabajo que se asemeja a la
situacin real del descubrimiento
de drogas. Las clulas bacteriales
que se han producido en el
caldo LB/amp/ara han estado
expresando la mFP y ahora
estn listas para ser lisadas
(da uno del Laboratorio 7) y
la mFP puricada (da dos del
Laboratorio 7) usando una
cromatografa en columna.
La protena uorescente
mutante es una molcula cuyo
tamao es de aproximadamente
238 aminocidos. La protena nativa (como existe en
el Discosoma) tiene forma de cilindro con una regin
uorescente, denominada uorforo, ubicada en el centro
del cilindro.
Para puricar una molcula de otras protenas presentes
en la clula, debemos observar cmo dieren los grupos
de molculas entre s y cmo se pueden utilizar estas
diferencias para realizar la separacin.
Una propiedad de la molcula usada comnmente en la
puricacin es la hidrofobicidad de la protena. El trmino
hidrofobicidad se relaciona con el comportamiento de una
molcula en el agua. Si una molcula es hidrfoba, rechaza
el agua; en tanto, si es hidrla, tiene anidad por el agua.
Por ejemplo, los aceites, las ceras y las grasas son hidrfobas
porque no se disuelven en agua. El azcar de mesa y la sal
de mesa son hidrlas y se disuelven rpidamente en agua.
Es comn que las molculas grandes, como las protenas,
tengan regiones hidrfobas y otras regiones hidrlas. Si
estas protenas se colocan en agua, las regiones hidrfobas
tienden a alejarse del agua, mientras que sus regiones
hidrlas intentan acercarse al agua. En gran medida, la
curvatura de la cadena de aminocidos de la protena es
responsable de su conformacin general o forma molecular,
donde las regiones hidrfobas se
esconden en el interior de la
molcula y las regiones que tienen
anidad por el agua se ubican en la
parte externa.
Es importante saber que una clula
bacterial contiene diversos tipos de
protenas. El siguiente diagrama est
muy simplicado dado que indica
slo algunos tipos. Sin embargo,
el problema es cmo separar una
protena simple, como la mFP,
de todas las dems. Una bacteria
tpica contiene ms de 1000 tipos
diferentes de protenas. El uso del
vector de expresin recombinante,
pARA-R, facilitar el aislamiento
de la mFP: las clulas de E. coli que
han cultivado fueron desarrolladas
para producir una concentracin
desproporcionadamente alta de mFP.
Resina hidrfoba
mFP
Llave
Columna
Otras
protenas
Solucin reguladora
Cell wall
Other proteins Cytoplasm
Inclusion body
mFP molecules Genomic DNA
Plasma
membranes
pARA-R
Otras protenas
Citoplasma
Molculas de
mFP de los
cuerpos de inclusin
Pared celular
pARA-R
ADN genmico
Membranas
plasmticas
Laboratorio 1
7
7.2

H;79J?LE
2 ml de Cultivo LB/amp/ara de E. coli (laboratorio 6)
Lisozima (10 mg/ml)
Solucin reguladora de unin, 4 M (NH
4
)
2
SO
4
Solucin reguladora de equilibrio de columna, 2 M
(NH
4
)
2
SO
4
Solucin reguladora de lavado de columna, 1.3 M
(NH
4
)
2
SO
4
Solucin reguladora de extraccin, 10 mM TE
Etanol al 20%
10% de blanqueador u otro desinfectante
TE (igual al amortiguador de extraccin)
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Pipeta y puntas P-200
Pipeta y puntas P-1000
Columna de cromatografa
Gradilla para tubos de microfuga
Marcador indeleble
Tubo de recoleccin de residuos de 6 ml
Bolsa para desechos celulares contaminados
Materiales
La puricacin de protenas puede utilizar la
hidrofobicidad para separar y puricar las molculas
proteicas. Un procedimiento de puricacin comn que
utiliza las diferencias de hidrofobicidad para separar las
protenas se denomina cromatografa en columna. En la
cromatografa en columna se utiliza un cilindro de plstico
o vidrio donde se coloca un medio separador conocido como
resina. El tipo especco de resina utilizado puede variar
dependiendo del tipo de protena que se desea puricar. En
este laboratorio, utilizaremos una cama de resina que consta
de pequeas cuentas hidrfobas. La protena uorescente
mutante es altamente hidrfoba y cuando la mFP se coloca
en una solucin de alta concentracin salina, la molcula de
mFP se distorsiona haciendo que las regiones hidrfobas de
la molcula se adhieran a la resina hidrfoba de la columna
de cromatografa. Las protenas hidrlas originadas por
la clula continan bajando por la columna a travs de la
resina sin adherirse a la cama de resina y luego se eliminan.
Una vez que la mFP queda atrapada en la cama de
resina, la columna se puede lavar con una solucin con
menor concentracin salina para extraer (lavar) las
molculas moderadamente hidrfobas de la columna. Esta
solucin reguladora de lavado para la columna tendr
una concentracin relativamente menor de sal que la
solucin utilizada para unir la mFP con la resina, pero la
salinidad ser lo sucientemente alta para lavar la mFP de
la resina. Finalmente, podemos usar una solucin con una
concentracin muy baja de sal para extraer o liberar la mFP
de las cuentas de resina. Bajo una concentracin salina baja,
las regiones hidrfobas de la molcula de mFP apuntan al
interior de la molcula, liberando de esa forma la mFP de la
resina hidrfoba de la columna.
La puricacin industrial de protenas es mucho ms
compleja que este protocolo de puricacin de la mFP,
pero los principios aplicados por la industria son similares.
La muestra de mFP que obtuvieron de esta puricacin
contiene otras protenas. No obstante, el procedimiento
ha retirado muchas de las dems protenas presentes en el
citoplasma de la bacteria.
Laboratorio 17
Mtodos
Soliciten al profesor 1 ml del cultivo LB/amp/ara.
Analicen este cultivo. De qu color es?
Coloquen este tubo en el centrifugador.
Importante: ustedes o el profesor debern asegurarse de que
los tubos hayan sido colocados en el rotor en una conguracin
equilibrada antes de encender el centrifugador. Centrifuguen los
tubos de microfuga durante 5 minutos.
Una vez que el rotor se haya detenido, retiren con cuidado el tubo para
no daar el sedimento celular.
Determinen la ubicacin de la mFP. Est en el sedimento de la clula
bacterial o en el sobrenadante (el lquido sobre el sedimento celular)?
Una vez que hayan determinado la ubicacin de la mFP, decanten
cuidadosamente (extraigan) el sobrenadante en el vaso de
precipitados con desinfectante. Realicen esto sin daar el sedimento
celular.
Obtengan una segunda medida de 1 ml del cultivo overnight y
repitan los pasos del 3 al 6.
Pidan al profesor un tubo con solucin reguladora de extraccin y
lisozima.
Inviertan el tubo de microfuga que contiene el sedimento celular y,
usando papel secante, intenten eliminar la mayor cantidad de lquido
'
(
+
.
Preparacin del lisado celular a
partir del cultivo overnight lquido
)
que sea posible del tubo de microfuga sin tocar el sedimento
celular. Desechen el papel utilizado en la bolsa para desechos
celulares contaminados.
Usando la pipeta P-1000 (preparada en 0-2-5) y una punta
limpia, transeran 250 l de solucin reguladora de extraccin al
sedimento celular. Cierren y ajusten bien la tapa.
Vuelvan a suspender las clulas moviendo enrgicamente el tubo
de microfuga bien cerrado por la supercie de la gradilla para
tubos de microfuga. Es posible que deban realizar esto varias
veces para volver a suspender las clulas. Examinen el tubo
cuidadosamente para asegurarse de que no haya aglomeraciones
visibles de clulas.
Usando la pipeta P-200 (preparada en 0-4-0), transeran 40 l
de lisozima a las clulas en suspensin. La lisozima es una enzima
que digiere la pared celular bacterial. Esta digestin enzimtica
de la pared celular debilita en gran medida a la clula, y las clulas
comienzan a lisarse (se parten). Agiten o muevan el tubo de
microfuga por la supercie de la gradilla para tubos para mezclar
bien. Si el tiempo lo permite, incuben muestras a 50 C durante
30 a 60 minutos.
Asegrense de haber rotulado este tubo con su nmero de grupo y
el horario de clase. Entreguen el tubo al profesor. Estas clulas se
colocarn en el congelador despus de la incubacin.
Las clulas se pueden conservar congeladas a 20 C,
hasta el siguiente laboratorio.
*
,
-
'&
''
')
/
'(
7.3
Laboratorio 1
7
Ahora la columna de cromatografa est lista para la muestra de mFP.
Mientras esperan la muestra de mFP, asegrense de que el uido
no est drenando desde la columna. Si el tubo de recoleccin de
residuos est lleno, es momento de vaciar el lquido en el fregadero.
Preparacin de la muestra de mFP
Centrifuguen el lisado celular durante cinco minutos para
sedimentar los restos celulares. Ustedes o el profesor debern
asegurarse de que el rotor est equilibrado antes de cerrar la tapa
y centrifugar. Es muy importante equilibrar estos tubos antes
del centrifugado.
Despus del centrifugado, tomen el tubo de microfuga. Examnenlo.
Dnde est la mFP? en el sobrenadante o en el sedimento celular?
Sin daar el sedimento de restos celulares, retiren
cuidadosamente 200 l de sobrenadante usando la pipeta
P-200 (preparada en 2-0-0) y una punta limpia. Realicen esto
sin arrastrar ningn resto celular. Si desplazan el sedimento,
debern centrifugar el tubo nuevamente. Viertan los 200 l de
sobrenadante limpio y sin restos en un tubo de microfuga de 1.5 ml
con el rtulo sobrenadante (uno de los miembros del grupo rotul
este tubo).
Reemplacen la punta de la pipeta P-200 y agreguen 200 l de
solucin reguladora de unin al sobrenadante que vertieron en
el tubo correspondiente. Mezclen la solucin reguladora de unin
con el sobrenadante bombeando suavemente las soluciones hacia
afuera y adentro usando la pipeta.
Usando la pipeta P-1000 (preparada en 0-4-0) y una punta limpia,
agreguen 400 l de esta solucin, sobrenadante de mFP y solucin
reguladora de unin, a la columna preparada usando la misma
pipeta que utilizaron para mezclar las soluciones. Realicen esto sin
daar la supercie de la cama de resina, vertiendo la solucin por el
costado de la columna.
Sin dejar secar la columna, abran la llave de paso y dejen que
la solucin de la columna drene hacia el tubo de recoleccin
de residuos. Dejen aproximadamente 1 2 mm de solucin
reguladora sobre la cama de resina.

Obtencin de materiales

Dividan el grupo para realizar diversas tareas.
Persona A deber vericar que los siguientes reactivos estn
en el lugar de trabajo. Estos reactivos se compartirn con
otro grupo.
Solucin reguladora de unin
Solucin reguladora de equilibrio
Solucin reguladora de lavado
Etanol al 20% (si su grupo es el ltimo en usar
la columna)

Persona B deber pedir al profesor las clulas lisadas;
estas clulas estuvieron congeladas durante la noche.
Esta persona deber llevar las clulas al centrifugador para
sedimentar los restos celulares.
Persona C deber reunir los siguientes suministros:
2 tubos de microfuga de 1.5 ml. Rotulen un tubo como
mFP y
otro como sobrenadante.
1 tubo de recoleccin de residuos de 6 ml (es probable
que ya est en la gradilla plstica para tubos).

Preparacin de la columna
Ubiquen la columna de cromatografa segn las indicaciones del
profesor, tengan cuidado de no desplazar la llave de paso de la
parte inferior del tubo.
Coloquen el tubo de recoleccin de residuos en la gradilla plstica
para tubos de microfuga. Abran cuidadosamente la columna
girando la vlvula de la llave de paso y permitan que el uido
comience a drenar desde la columna. Dejen aproximadamente
1 mm de este lquido sobre la cama de resina para evitar que la
columna se seque.
Usando la pipeta P-1000 (preparada en 1-0-0) y una punta limpia,
agreguen 3000 l (=3 ml) de solucin reguladora de equilibrio
a la columna de cromatografa. Agreguen la solucin reguladora
lentamente por el costado de la columna para que no desestabilice
la supercie de la cama de resina. Dejen que la solucin reguladora
uya lentamente por el costado de la columna.
Permitan que la solucin reguladora de equilibrio drene desde
la columna hacia el tubo de recoleccin de residuos, pero dejen
aproximadamente 1 2 milmetros de solucin reguladora
sobre la cama de resina para evitar que se seque.
'
(
)
*
Puricacin de la protena uorescente
mutante a partir del lisado celular
+
-
.
''
'(
,
/
7.4
'&
Laboratorio 17
Examinen la columna y coloquen la mFP. La mFP est esparcida
por toda la cama de resina o parece haber quedado limitada a una
sola banda?
Usando la pipeta P-1000 (preparada en 1-0-0), agreguen con
cuidado 1000 l (= 1ml) de solucin reguladora de lavado por el
costado de la columna. Sin dejar secar la columna, permitan que la
solucin reguladora drene desde la columna, dejando 1 2 mm de
solucin reguladora sobre la cama de resina.
Examinen la columna y coloquen la mFP. Ha cambiado la
ubicacin de la mFP en la cama de resina? La solucin reguladora
de lavado extraer algunas de las protenas menos hidrfobas de
la columna. La concentracin salina de la solucin reguladora de
lavado es menor que la de la solucin reguladora de unin, pero lo
sucientemente alta para hacer que la mFP se libere de la resina.
Usando la pipeta P-1000 (preparada en 1-0-0) y una punta
limpia, agreguen con cuidado 1000 l dos veces (= 2ml en total)
de solucin reguladora de extraccin por el costado de la columna.
A medida que la mFP comience a gotear desde la punta de la llave
de paso, recojan la protena en el tubo con el rtulo mFP. En este
tubo, recojan slo el eluato rojo. Cuando hayan recogido toda la mFP,
tapen el tubo.
Despus de haber recogido toda la mFP, agreguen 2000 l (= 2 ml)
de solucin reguladora de equilibrio a la columna usando la pipeta
P-1000 y una punta limpia. Esto ayudar a preparar la columna
para la prxima clase. Si es el ltimo grupo en usar las columnas,
agreguen 4000 l (= 4 ml) de etanol al 20% a la columna. Drenen
aproximadamente 2 ml de etanol desde la columna hacia el tubo de
recoleccin de residuos.
Tapen y ajusten bien la columna.

La solucin del tubo de recoleccin de residuos se puede desechar
en el fregadero.
Todos los tubos de microfuga, excepto el que contiene la mFP, se
deben desechar en la bolsa para desechos celulares contaminados.
Comparen su tubo con los tubos con mFP de los dems grupos.
Existe alguna diferencia de intensidad de color entre las muestras?
',
'-
'.
'/
Contina desde la pgina anterior...
(&
('
'+
'*
')
7.5
Laboratorio 1
7
Qu caracterstica de la mFP se utiliza como base para la separacin mediante
la cromatografa en columna?

Despus del centrifugado del lisado celular, la mFP se ubic en el sobrenadante
o en el sedimento de restos celulares?

Cundo se habran extrado las protenas hidrlas de la columna?

El eluato que contiene la mFP parece ms o menos brillante que en el lisado
celular despus del centrifugado?

Si existe una diferencia notable en la intensidad del color rojo, cul sera la
razn de la diferencia?

Cmo se podra ajustar o modicar la columna para aumentar la pureza de la
muestra de mFP?

Aunque este laboratorio trat sobre la expresin de un gen de la anmona de
mar, citen algunos ejemplos de protenas humanas que se podran expresar y
puricar potencialmente usando mtodos similares.
Conclusiones
'
(
)
+
,
*X
*W
7.6
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
Laboratorio 18
8.1
Extraccin de ADN genmico
de clulas epiteliales bucales
El propsito de este laboratorio es recoger una
muestra de ADN de las clulas que recubren la parte
interna de la boca y utilizar esta muestra para explorar
una de las tcnicas ms poderosas de la biologa molecular:
la reaccin en cadena de la polimerasa (RCP). Aunque la
RCP tiene muchas aplicaciones, se utiliza comnmente
para producir numerosas copias de un segmento
seleccionado del gen o locus de ADN. Por ejemplo, en la
ciencia forense criminal, la RCP se utiliza para amplicar
la evidencia de ADN de muestras pequeas que podran
haber quedado en la escena del crimen. Un tcnico experto
hasta puede obtener una muestra de ADN de la saliva que
qued en la parte posterior de una estampilla postal que
se utiliz para enviar una carta. Las muestras de ADN
obtenidas de esta forma se han utilizado para la RCP en
diversos casos criminales de alto perl.
Para obtener la muestra de ADN, debern usar un palillo
de dientes y recoger clulas epiteliales bucales. Las clulas
se transferirn a una solucin con cuentas de Chelex. Las
cuentas de Chelex ligarn los iones de magnesio bivalentes
(Mg2+). Estos iones sirven a menudo como cofactores para
las nucleasas que degradarn la muestra de ADN y podran
interferir con la enzima (polimerasa Taq) utilizada en la
reaccin. Retirando los iones de magnesio, se reduce la
degradacin del ADN genmico que realizan las nucleasas.
Esta mezcla se colocar en agua hirviendo para lisar las
clulas y liberar el ADN.
Luego se centrifugan la mezcla de ADN genmico, los
restos celulares y las cuentas de Chelex para que sedimenten
los restos celulares y el Chelex, mientras se mantiene el
ADN genmico en el sobrenadante. Esta es una forma
rpida y sencilla de separar el ADN genmico de los restos
celulares. Sin embargo, la muestra de ADN no es pura, ya
que contiene protenas y cidos nucleicos de los organismos
que estaban en la boca al momento de tomar la muestra
(mayormente bacterias y alimentos). Por lo general, estos
contaminantes no inhiben la RCP porque el proceso utiliza
cebadores especcos, es decir, segmentos cortos de ADN
de aproximadamente 25 nucletidos de largo que pueden
seleccionar slo el ADN genmico humano. Por lo tanto, si
el sobrenadante porta ADN extrao, no debera interferir en
la seleccin de los cebadores especcamente humanos. Ms
adelante, en este laboratorio se brindar una descripcin
ms detallada de la RCP y de la funcin de los cebadores.
Aunque estamos utilizando epitelio bucal como fuente
de ADN, tambin se pueden usar otros tejidos. Aqu
presentamos la produccin de ADN de otros tejidos
humanos: la sangre produce 40 g/ml; la raz del cabello
aproximadamente 250 ng/ml; el msculo aproximadamente
3 g/ml; y el esperma 3.3 pg/clula.
La segunda parte de este laboratorio trata sobre la RCP
real. Utilizarn la muestra de ADN genmico que han
recogido como objetivo para la reaccin RCP.
Laboratorio 18
8.2
Tomen un tubo con Chelex. Tengan en cuenta que este tubo est identicado con
un nmero y una letra. Registren este nmero y esta letra en sus cuadernos. Slo
ustedes conocern este cdigo annimo.
Para recoger clulas epiteliales bucales, utilicen palillos de dientes esterilizados o
una punta de pipeta amarilla para raspar suavemente la parte interna de ambas
mejillas. Este procedimiento no debe ser invasivo, de manera que no se debe
extraer sangre.
Transeran las clulas que han recogido del palillo de dientes al tubo con Chelex.
Hagan girar enrgicamente el palillo de dientes en la resina Chelex para quitar
las clulas.
Es importante que retiren la mayor cantidad de clulas posible del palillo de
dientes y las coloquen en el tubo con Chelex.

Cierren y ajusten bien el tubo con Chelex. Llvenlo a bao Mara hirviendo o a un
bloque caliente a 100 C. Hiervan o calienten las clulas durante 10 minutos. Este
calentamiento lisar las clulas y ayudar a destruir algunas de las nucleasas que
degradan el ADN.
Utilicen el centrifugador a alta velocidad para centrifugar el Chelex y los
restos celulares.
Usando la pipeta P-20 y una punta de pipeta limpia, retiren cuidadosamente 20
l de sobrenadante y colquenlo en un tubo de microfuga limpio de 1.5 ml. Eviten
aspirar las cuentas de Chelex, ya que aspirarlas inhibira el proceso de RCP de
salida. Rotulen este tubo con su cdigo personal y annimo (nmero).
Si no van a utilizar la muestra inmediatamente, djenla en el frente del saln sobre la
gradilla con el rtulo Muestras de ADN genmico. Estas muestras se colocarn
en el refrigerador durante la noche y las tendrn en el siguiente laboratorio.
Las muestras de ADN genmico se pueden conservar en el refrigerador
a 4 C o en el congelador a 20 C hasta que estn listas para
ejecutar la reaccin RCP.

H;79J?LE
0.5 ml de solucin de Chelex al 10%
Mezclas maestras I y II

Extraccin de ADN genmico
de clulas epiteliales bucales
;GK?FEIOIKC?D?IJHEI
Bao Mara hirviendo
Microcentrifugador
Ciclador trmico
Tubo de microfuga
Marcador indeleble
Palillos de dientes
esterilizados
Materiales
Mtodos
'
(
)
+
Preparacin de la muestra...
*
,
-
Laboratorio 18
8.3
La reaccin en cadena de la polimerasa, RCP, es una
tcnica de la biologa molecular que fue descubierta por
Kary Mullis a comienzos de la dcada de 1980. La tcnica
utiliza una suerte de qumica elegante y un ciclado termal
exacto de reactivos para dirigir y amplicar una ubicacin
especca (locus) a lo largo de la molcula de ADN. Desde
un ADN objetivo nico, la RCP puede producir ms de
mil millones de copias del objetivo en aproximadamente
una hora y media. Se comprob que esta poderosa qumica
es tan importante que Mullis recibi el Premio Nobel de
Qumica en 1993. Hoy en da, la RCP es considerada un
protocolo estndar en la biologa molecular y todos los aos
se publican cientos de documentos cientcos que utilizan
esta tcnica.
El locus que amplicaremos est ubicado en el gen
Activador Plasmingeno del tejido (tPA). Este gen se
encuentra en el cromosoma 8; el gen representa una protena
que participa de la disolucin de cogulos de sangre. El
tPA es una protena administrada a las vctimas de ataques
cardacos para reducir la incidencia de los ataques. No
obstante, la regin que amplicaremos est ubicada en un
intrn (regin no traducida) del gen tPA.
El intrn que seleccionaremos para la amplicacin es
dimorfo, lo que signica que el locus tiene dos formas.
Una de las formas porta un fragmento de ADN de 300 pb
conocido como el elemento Alu y la segunda forma del locus
no porta este fragmento. Por lo tanto, cuando examinamos
el locus, encontramos que puede o no portar un elemento
Alu. En la gura a continuacin se indica el intrn que
seleccionaremos para la RCP.
Los elementos Alu son fragmentos cortos, de alrededor de
300 pb de ADN que se distribuyen a lo largo de nuestro
genoma. Se estima que podemos portar ms de 1,000,000
de copias de este fragmento. Al parecer, el elemento Alu
forma parte de la codicacin de ADN de una molcula
ARN que ayuda a la secrecin de polipptidos recientemente
formados de la clula. A menos que se inserte en un exn o
regin de codicacin, tiene poco o ningn efecto sobre la
funcin de la protena.
La amplicacin de ADN por la RPC depende de los
cebadores que se dirigen a algunos loci especcos. Los dos
cebadores que utilizaremos poseen secuencias de nucletidos
nicas que se complementan con slo un locus en el genoma
humano. Las secuencias de los cebadores son:
Amplicacin del locus tPA utilizando
la reaccin en cadena de la polimerasa
Cromosoma 8
5
,
3
,
3
,
5
,
gen tPA
Alu
+
Alelo
Alu
-
Alelo
300bp
elemento Alu
400bp
100bp
Cebador
Exn
Intrn
Cebador
e i e i e i e
Cebador Cebador
Cebador sentido: 5 G T A A G A G T T C C G T A A C G G A C A G C T 3
Cebador antisentido: 5 C C C C A C C C T A G G A G A A C T T C T C T T 3
Laboratorio 18
8.4
Cdigo
numrico
Amplicacin del locus tPA utilizando
la reaccin en cadena de la polimerasa
Mtodos
Tomen la muestra de ADN genmico con su nmero y el tubo
de RCP rotulado con su cdigo numrico annimo.
El tubo de RCP ya contiene la mezcla
maestra I. sta contiene los dos cebadores
que se dirigirn al locus tPA, los dNTP
(trifosfatos desoxinucletidos: ATP, TTP,
CTP y GTP), la solucin reguladora de la
RCP, el agua de grado molecular (muy pura)
y la polimerasa Taq.
Utilizando una punta de pipeta limpia, agreguen 5 l del ADN
genmico a este tubo de RCP. Aadan con cuidado la muestra
de ADN directamente a la mezcla maestra I de 10l. Realicen
esto sin crear burbujas.
Tapen cuidadosamente el tubo de RCP. ste es un tubo
con paredes muy delgadas, as que eviten romperlo, pero
asegrense de que la tapa est bien colocada sobre la
apertura del tubo.
Coloquen el tubo de RCP en la cubeta con hielo mediante el
ciclador trmico.
Antes de colocar las muestras en el ciclador trmico, el instructor
agregar 10l de la mezcla maestra II que contiene MgCl
2
. La
polimerasa Taq, una enzima de la bacteria Thermus aquaticus,
requiere iones de Mg2+ como cofactores para activarla.
Desechen la muestra de ADN genmico.
El instructor realizar la reaccin RCP en otro momento.
Despus de realizar la RCP, se cargarn 15 l del producto
de la RCP en un gel de agarosa al 2%. El gel se teir y se
documentar mediante fotografas. Estos pasos los realizar
el instructor.
*
)
(
'
+
,
-
.
/
Laboratorio 18
Conclusiones
Cul es su genotipo con respecto al gen tPA?
Cuntos genotipos son posibles con respecto al gen tPA?
Completen la siguiente tabla usando la informacin de la clase.
Comiencen determinando la cantidad de cada genotipo presente en la clase.
Calculen la frecuencia (porcentaje) de cada genotipo presente.
Calculen la frecuencia de cada alelo presente en la clase.
Comparen sus resultados con otras clases.
Existe alguna diferencia en la frecuencia relativa de los genotipos y los alelos?
,
+
*
)
(
'
Genotipos
* El trmino alelos se refiere a las formas de un gen o una secuencia de ADN
Alu
+
Alu
+
Alu
+
Alu
Alu

Alu
Alu
+
alelos* Alu
alelos
Total Alu
+
alelos Total Alu
alelos
Respondan estas preguntas despus de ver los resultados de la RCP.
8.5
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
.....................................................................................................................................
Laboratorio 18
Glosario
Glosario
cido nucleico: molcula grande que consta de
subunidades ligadas al ncleo; polmero de nucletidos.
Ver tambin: ADN, nucletido, polmero, ARN.
Adenina: base que contiene nitrgeno, miembro
del par de bases AT (adenina-timina). La adenina se
encuentra tanto en el ADN como en el ARN.
ADN (cido desoxirribonucleico): molcula que
codica la informacin gentica. El ADN es una
molcula bicatenaria unida mediante enlaces de
hidrgeno entre los pares de bases de los nucletidos.
Es el material hereditario.
Ver tambin: enlaces de hidrgeno, pares de base,
nucletido.
ADN ligasa: enzima que une las cadenas de ADN
formando enlaces qumicos covalentes en la cadena
de azcar-fosfato.
Ver tambin: enlace qumico covalente.
ADN polimerasa: enzima utilizada para reproducir
molculas de ADN. La RCP utiliza la ADN
polimerasa de la bacteria Thermus aquaticus que se
denomina polimerasa Taq.
Ver tambin: reproduccin de ADN, reaccin en
cadena de la polimerasa.
Agarosa: polisacrido altamente puricado
(carbohidrato complejo) que se usa comnmente en
la electroforesis en gel.
Ver tambin: electroforesis.
Alelo: forma alternativa de un locus gentico; se hereda
un alelo simple por cada locus de cada padre (por
ej: en un locus para el color de una or, el resultado
podra ser ptalos prpura o blancos).
Ver tambin: locus.
Alcuota: muestra de una parte de un todo
(Por ej.: una muestra de un plsmido o una muestra
de clulas).
Aminocido: cualquiera de ms de 20 molculas que
se combinan para formar protenas. La secuencia
de aminocidos de una protena y por lo tanto, la
funcin de la misma son determinadas por el cdigo
gentico.
a
Ampicilina: antibitico usado comnmente que
pertenece a la familia de la penicilina. La ampicilina
impide que el material nuevo de la pared celular
se una adecuadamente en la bacteria. Esta pared
celular debilitada impedir el crecimiento de nuevas
bacterias.
Amplicacin: aumento en la cantidad de copias de un
fragmento especco de ADN.
Ver tambin: clonacin, reaccin en cadena de la
polimerasa.
Amp
r
: smbolo utilizado para denominar al gen
resistente a la ampicilina. Este smbolo se ubica en el
plsmido pARA.
Ver tambin: pARA, plsmido.
Antibitico: sustancia que mata o impide la produccin
de clulas.
Ver tambin: ampicilina, kanamicina.
ARN mensajero (ARNm): molcula de cido nucleico
que transporta informacin gentica desde los genes
hacia el resto de la clula para la sntesis de protenas.
Aspirar: extraer o tomar.
Autosoma: cromosoma que aparece en pares homlogos
tanto en machos como hembras y no porta los genes
que determinan el sexo.
-lactamasa: enzima codicada por el gen amp
r
que destruye la ampicilina.
Base: una de las molculas que contienen nitrgeno
que distingue un nucletido de otro. En el ADN,
las bases son la adenina, la guanina, la citosina y la
timina.
Ver tambin: nucletido, par de bases,
secuencia base.
Base que contiene nitrgeno: componente
molecular de los nucletidos del ADN y el ARN. En
el ADN existen cuatro bases que contienen nitrgeno:
A (adenina), G (guanina), T (timina), C (citosina).
Biotecnologa: conjunto de tcnicas biolgicas
desarrolladas a travs de investigaciones bsicas
y aplicadas actualmente en el desarrollo de
investigaciones y productos. Particularmente,
b
Glosario A - B
Glosario
la biotecnologa se reere al uso industrial del
ADN recombinante, la fusin celular y las nuevas
tcnicas de bioprocesamiento.
Cncer: enfermedad en la que clulas anormales se
dividen y crecen sin control.
Cancergeno: causante del cncer que origina cambios
en el ADN de una clula.
Cebador: cadena corta y preexistente de
polinucletidos a la cual se pueden agregar nuevos
nucletidos mediante la ADN polimerasa. Se utilizan
dos cebadores diferentes para dirigir el locus tPA
amplicado mediante la RCP.
Clula: unidad bsica de cualquier organismo viviente
que porta los procesos bioqumicos de la vida.
Clulas somticas: clulas que conforman el cuerpo
y no son clulas sexuales o gametos. Estas clulas
generalmente son diploides y tienen dos conjuntos de
cromosomas.
Ver tambin: gametos
Ciencia forense: ciencia especializada en la aplicacin
de conocimientos cientcos en asuntos legales. El
ADN se utiliza con frecuencia como evidencia en
cuestiones legales.
Citosina: una de las bases que contienen nitrgeno
y se encuentra en el ADN y el ARN. Se
complementa con la guanina.
Ver tambin: par de bases, nucletido.

Clonacin: utilizacin de tecnologa especializada de
ADN para producir varias copias exactas de un solo
gen u otro segmento de ADN. Un segundo tipo de
clonacin utiliza el proceso natural de divisin celular
para realizar muchas copias de una clula entera.
La composicin gentica de estas clulas clonadas,
denominada lnea celular, es idntica a la clula
original. Un tercer tipo de clonacin produce animales
y plantas completa y genticamente idnticos.
Ver tambin: vector de clonacin.
Cdigo gentico: secuencia de nucletidos codicados
en tros (codones) junto con el ARNm, que
determina la secuencia de aminocidos en la sntesis
de protenas.
Ver tambin: codones, ARNm.
Codn: grupo de tres bases de ARNm que codica un
aminocido simple.
Ver tambin: aminocido, ARNm.
Columna de cromatografa: instrumento que se
utiliza para separar una mezcla de molculas.
Competentes: clulas capaces de incluir ADN
de plsmido.
Ver tambin: transformacin.
Cromosoma: en las clulas eucariotas, una cadena
lineal compuesta de ADN y protena, ubicada en
el ncleo de la clula que contiene los genes; en las
clulas procariotas, una cadena circular compuesta
nicamente de ADN. En los humanos, existen 23
pares de cromosomas en las clulas del cuerpo.
Cromosomas homlogos: cromosoma que contiene
la misma secuencia gentica lineal que otra, cada
una derivada de un padre. Aunque la secuencia
gentica es (generalmente) la misma, los alelos
precisos pueden diferir entre cromosomas.
Ver tambin: alelo, cromosoma, gen.
Degradar: disminuir la calidad; convertir en un
componente ms simple; descomponer.
Desnaturalizacin: fundicin del ADN a altas
temperaturas en cadenas de nucletidos simples;
cambiar la forma tridimensional de una molcula
de protena.
Desoxirribosa: tipo de azcar de cinco carbonos
que se encuentra en ADN.
Ver tambin: ADN.
Doble hlice: estructura en la cual dos cadenas de
ADN estn torcidas en espiral alrededor una de la otra.
e
Electroforesis: movimiento de las molculas cargadas
hacia un electrodo de carga opuesta; se utiliza para
separar cidos nucleicos y protenas. Cuando se utiliza
para separar fragmentos de ADN, la electroforesis
d
Glosario C - E
c
Glosario
separa los fragmentos por tamao, ya que los
fragmentos ms pequeos se mueven ms rpido que
los ms grandes.
Elemento Alu: pieza de 300 pares de bases de ADN
que ha sido insertada de forma aleatoria en todo
el genoma. Ya no parece tener ninguna funcin en
el genoma humano. Este fragmento especco de
ADN se denomina elemento Alu porque porta
una secuencia de reconocimiento de la enzima de
restriccin Alu.
Ver tambin: genoma, secuencia de reconocimiento,
enzima de restriccin.
Eluato: solucin que lava (por ej: soluciones
que gotean desde la columna de cromatografa)
Ver tambin: columna de cromatografa.
Enlace de hidrgeno: fuerza dbil que resulta de la
atraccin de un tomo de hidrgeno positivo hacia
las regiones con carga negativa de otros tomos.
sta es la fuerza que mantiene unidas las dos
cadenas de nucletidos en la molcula de ADN.
Los pares de base GC forman tres enlaces de H, en
tanto los pares AT forman dos.
Enlace qumico covalente: una de las fuerzas que
mantiene unidos a los tomos de una molcula. Se
considera un enlace fuerte y se forma al compartir
los electrones entre dos tomos.
Enzima: protena que acta para acelerar las
reacciones qumicas.
Enzima de restriccin: enzima que une y corta
el ADN en una secuencia base especca(por ej:
BamH I y Hind III).
Ver tambin: secuencia de reconocimiento
Escala de kilobase: Conjunto de fragmentos de
ADN estndar con longitudes que dieren en un
kilobase; se utiliza como tamao estndar en la
electroforesis.
Ver tambin: electroforesis.
Esherichia coli: bacteria comn utilizada en
numerosos protocolos de biologa molecular. La
cepa de E. coli utilizada en los protocolos de Amgen
es relativamente inofensiva y no se reproduce con
facilidad fuera del medio del laboratorio.
Estado natural: la produccin original o natural de
un gen o una protena.
Eucariota: organismo que alberga sus genes dentro
de un ncleo y cuenta con numerosos cromosomas
lineales.
Evolucin dirigida: procedimiento experimental
que utiliza la RCP que causa la produccin de
numerosas mutaciones aleatorias. Esas mutaciones
luego se examinan o analizan en cuanto a sus
propiedades.
Expresar: crear una protena.
Ver tambin: vector de expresin
Expresin gnica: proceso mediante el cual la
informacin codicada del gen se convierte en
las estructuras presentes y operativas de la clula.
Los genes expresados incluyen aquellos que se
transcriben en el ARNm y luego se traducen como
protenas.
Ver tambin: ARNm.
Extremos cohesi vos: extremos de una molcula de
ADN cortada con determinadas enzimas de restriccin.
Estos extremos tienen bases no apareadas.
Exn: segmento de un gen que codica las regiones
de una protena.
Ver tambin: intrn.
Fago: virus cuyo husped natural es una clula
bacterial.
Fenotipo: caracterstica que se debe a la expresin
de nuestros genes; generalmente se reere a las
propiedades visibles, pero se puede referir a las
caractersticas reveladas mediante exmenes de
laboratorio.
Fragmento de restriccin: pieza de ADN que se
origina cuando la molcula de ADN se corta con una
enzima de restriccin. Los fragmentos a menudo se
separan en un gel mediante la electroforesis.
Fluorescencia: produccin de luz de una molcula
(por ej: la protena uorescente roja libera luz
roja cuando se expone a la luz ultravioleta). La
protena utilizada en los Laboratorios Amgen se
puede ver con luz ambiente.
Gameto: clula reproductora masculina o femenina
madura.
Gen: unidad fsica y funcional fundamental de la
herencia; secuencia ordenada de nucletidos ubicada
en un locus que codica un producto funcional
especco.
Ver tambin: expresin gnica.
Gentica: estudio de la herencia.
Genoma: todo el material gentico de los cromosomas
f
g
Glosario E - G
Glosario
de un organismo en particular; su tamao se
expresa generalmente mediante su cantidad total de
pares de base.
Genotipo: combinacin de alelos que porta un individuo
para un rasgo especco.
Ver tambin: alelo, fenotipo.
Guanina: una de las bases que contiene nitrgeno
que se encuentra en el ADN y el ARN. Se
complementa con la citosina.
Ver tambin: par de bases, nucletido.
Haploide: conjunto simple de cromosomas presente
en los gametos de las plantas y los animales. El
nmero haploide en los humanos es de 23.
Ver tambin: diploide.
Hetercigo: las dos copias diferentes, o alelos, del
mismo gen.
Ver tambin: alelo, gen, homcigo.
Hidrfilo: que tiene anidad por el agua; se disuelve
en agua; polar.
Algunos ejemplos incluyen el azcar y la sal.
Hidrfobo: que rechaza el agua; no se disuelve en
agua; no polar. Algunos ejemplos incluyen aceite,
cera y protena uorescente mutante.
Homcigo: que tiene dos copias idnticas, o un alelo
del mismo gen.
Ver tambin: alelo, gen, hetercigo.
Ingeniera gentica: alteracin del material gentico
de las clulas u organismos para permitirles crear
sustancias nuevas o desempear nuevas funciones.
Intrn: segmento de un gen que no codica una
protena. Los intrones se transcriben en el ARNm
pero se eliminan antes de ser traducidos como
protenas.
Ver tambin: exones, ARNm, transcripcin,
traduccin.
Kanamicina: antibitico que mata las clulas no
resistentes inhibiendo la sntesis de protenas.
kan
r
: smbolo del gen resistente a la kanamicina que
se encuentra en el pKAN plasmdico; codica una
enzima llamada fosfotransferasa que desactiva la
kanamicina.
Kilobase (kb): unidad de longitud de los fragmentos
de ADN igual a 1000 pares de nucletidos.
Ligasa: enzima requerida para unir covalentemente
dos fragmentos de ADN.
Ligacin: reaccin que une qumicamente dos
fragmentos de ADN dando como resultado una
molcula de ADN recombinante.
Lisis: abrirse.
Locus: lugar o ubicacin en un cromosoma, puede ser
un gen o simplemente cualquier sitio con variaciones
mensurables. (por ej: Alu
+
, Alu
-
en el intrn tPA).
Mapa de restriccin: diagrama de ADN, como un
plsmido, que indica los sitios de restriccin para las
enzimas de restriccin.
Marcador: Ver: escala de kilobase.
Molcula de ADN recombinante: combinacin de
molculas de ADN de diferente origen que se unen
mediante tcnicas de recombinacin de ADN.
Ver tambin: ligacin.
Mutgeno: agente que puede causar mutaciones.
Ver tambin: cancergeno
Nucleasa: familia de enzimas que degradan los cidos
nucleicos.
Ver tambin: degradar, enzima
Nucletido: subunidad o monmero del ADN y el
ARN. Cada nucletido consta de una base con
nitrgeno, un azcar de cinco carbonos y un grupo
de fosfato.
Opern: aglomeracin de genes transcriptos para dar
una sola molcula de ARNm. El opern arabinosa
se utiliza en el vector de expresin pARA para
transcribir el gen rfp.
Pared celular: estructura que brinda a las clulas
apoyo fsico; rodea las clulas bacteriales.
h
k
l
m
l
Glosario H - P
n
o
p
Glosario
Par de bases: dos bases de nitrgeno (adenina y
timina o guanina y citosina) unidas por enlaces
de hidrgeno. Dos cadenas de ADN estn unidas
en forma de doble hlice por los enlaces entre los
pares de base. La suma de los pares de base en una
molcula de ADN se utiliza frecuentemente para
expresar el tamao de la molcula.
Par de bases complementarias: bases que
contienen nitrgeno y que se encuentran enfrentadas
entre s en una molcula de ADN bicatenaria. La
complementariedad es el resultado del tamao
(una base grande debe estar enfrentada a una base
pequea) y la cantidad de enlaces de hidrgeno
entre las bases adyacentes del par (A y T forman
dos enlaces de hidrgeno, G y C forman tres). La
adenina se complementa con la timina y la guanina
se complementa con la citosina.
Plsmido: molcula circular de ADN que se reproduce
independientemente del ADN genmico del husped
(por ej: pKAN, pARA).
Polimerasa Taq: enzima con estabilidad trmica
comnmente utilizada en la RCP; la polimerasa que
se encuentra en la bacteria Thermus aquaticus.
Ver tambin: reaccin en cadena de la polimerasa.
Polmero: molcula grande formada por subunidades
similares o idnticas unidas entre s (por ej: ADN,
ARN, protenas).
Polimorfismo: diferencia en la secuencia de ADN en
un locus gentico particular. Las diferencias pueden
resultar o no en un fenotipo distinto.
Ver tambin: locus, fenotipo.
Polimorsmo gentico: diferencia en la secuencia de
ADN entre individuos, grupos o poblaciones (por ej:
alelos para el locus tPA amplicados por la RCP, o la
altura en las plantas de guisantes, altas o bajas).
Portador: individuo que posee un alelo
no expresado y recesivo.
Procariota: clula u organismo con un solo
cromosoma y sin membrana nuclear; bacterias.
Promotor: regin del ADN al frente de un gen que
une la ARN polimerasa y promueve de esta forma
la expresin gnica; en el opern ara, la regin
de pARA que une el complejo de protena AraC-
arabinosa y la ARN polimerasa antes de la expresin
del gen rfp.
Proteina: polmero grande de aminocidos. Algunos
ejemplos incluyen: enzimas, protena uorescente
mutante y algunas hormonas.
Protena AraC: protena necesaria para la expresin
de la protena uorescente mutante en las clulas
transformadas con pARA-R.
Protena uorescente verde: protena producida por
la medusa marina, Aequoria victoria; protena
codicada por el gen gfp.
Quimera: animal mtico formado por numerosos
animales diferentes. En la biologa molecular, se usa
frecuentemente para describir una molcula de ADN
recombinante.
Reaccin en cadena de la polimerasa (RCP):
procedimiento qumico utilizado para amplicar
una secuencia de ADN mediante ciclos repetidos de
reproduccin y desnaturalizacin.
Reproduccin de ADN: uso del ADN existente como
plantilla para la sntesis de cadenas nuevas de ADN.
Ribosa: azcar de cinco carbonos que se encuentra en
los nucletidos del ARN.
Ribosoma: sitio dentro de la clula que rene los
aminocidos en molculas de protena.
Secuencia base: orden de las bases de nucletidos
en una molcula de ADN; determina la estructura
de las protenas codicadas por dicho ADN.
Secuencia de reconocimiento (sitio de
reconocimiento): secuencia base especca de
nucletidos reconocida por una enzima de restriccin.
La enzima corta el ADN dentro de esta secuencia de
nucletidos.
Solucin reguladora: solucin utilizada para
mantener un ptimo medio sicoqumico para que
se produzca una reaccin qumica. Las soluciones
reguladoras se utilizan en las digestiones de
restriccin, las ligaciones y para la RCP.
Solucin reguladora de NaB: solucin de borato de
sodio utilizada como reguladora en la electroforesis.
Es una solucin que conduce una corriente elctrica
y mantiene un pH relativamente constante.
Ver tambin: TBE
Superenrollada: mayor nivel de contorsin del ADN
que se encuentra a menudo en los plsmidos.
s
Glosario P - T
q
r
Glosario
TBE (cido tris-borato-EDTA): solucin utilizada para
la electroforesis en gel y en la preparacin de geles de
agarosa. La solucin ayuda a conducir la corriente
elctrica mientras que mantiene un pH constante.
Timina: una de las bases que se encuentran en el ADN;
la base que se complementa con la adenina.
Traduccin: proceso qumico que convierte una
secuencia de nucletidos de ARNm en una secuencia
de aminocidos; el sitio de esta reaccin es el
ribosoma.
Transcripcin: proceso qumico que convierte una
secuencia de nucletidos de ADN en una secuencia
de nucletidos de ARNm; proceso que utiliza
ARN polimerasa para convertir una plantilla de
ADN en una cadena de ARNm.
Transformacin: proceso que coloca ADN extrao,
como un plsmido, dentro de una clula.
Vector: Ver: vector de clonacin, vector de expresin.
Vector de clonacin: molcula de ADN que se origina
a partir de un virus, un plsmido o la clula de un
organismo superior, en el que otro fragmento de ADN
de tamao adecuado se puede integrar sin perder la
capacidad del vector de autorreproducirse; los vectores
son diseados para introducir ADN extrao a las
clulas husped, donde el ADN se puede reproducir
en grandes cantidades. En los laboratorios Amgen, se
utiliza el pKAN para clonar varias copias del gen rfp.
Ver tambin: vector de expresin, plsmido.
Vector de expresin: plsmido diseado
genticamente para expresar de forma especca los
genes (por ej: pARA).
Ver tambin: vector de clonacin, plsmido.
t
v
Glosario T - V

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