Revista Brasileira de Paleontologia 7(2):169-175, Julho/Agosto 2004 2004 by the Sociedade Brasileira de Paleontologia

NOVO MTODO DE PREPARAO PALINOLGICA PARA AUMENTAR A RECUPERAO DE DINOFLAGELADOS

ANTONIO DONIZETI DE OLIVEIRA, JOO GRACIANO MENDONA FILHO
Lab. de Palinofcies e Fcies Orgnica, DEGEO, IGEO, UFRJ, RJ, Brasil. donnizzetti@yahoo.com.br

MARCELO DE ARAUJO CARVALHO

Museu Nacional, UFRJ, RJ, Brasil.

TASSA RGO MENEZES

GEO, CENPES, PETROBRAS, RJ, Brasil.

CECLIA CUNHA LANA

BPA, CENPES, PETROBRAS, RJ, Brasil.

RESUMO - O mtodo aqui apresentado tem por objetivo melhorar a recuperao de palinomorfos em amostras de sedimentos quaternrios da bacia de Campos. Nas preparaes tradicionais, tanto palinolgicas quanto de palinofcies, a frao mineral eliminada por acidificao, com o objetivo de concentrar o maior nmero possvel de palinomorfos e de matria orgnica nas lminas. Entretanto, ambas utilizam o descarte do sobrenadante aps o ataque com cidos. A principal diferena entre o novo mtodo e as preparaes tradicionais de palinologia e palinofcies o peneiramento do material, ao invs do descarte do sobrenadante, com aproveitamento total do resduo orgnico. Alm disso, acrescentou-se a utilizao de um procedimento simples e artesanal, o bateamento, para eliminar os minerais pesados do resduo que sobram depois do ataque com cido fluordrico. Tambm so empregados, nesse novo mtodo, detergente e ultra-som, para dissociar e eliminar a matria orgnica amorfa. Alm disso, no necessrio o uso de acetlise, diferentemente da preparao palinolgica convencional para amostras do Quaternrio. Uma vantagem adicional da nova metodologia a utilizao de menor quantidade de amostra (cerca de 6 gramas). Para a constatao de sua eficcia foram preparadas duas amostras de um mesmo nvel, para estudos de palinofcies (sem peneiramento) e com a nova metodologia (com peneiramento). Os resultados mostraram-se bastante satisfatrios, revelando que a nova metodologia aumenta significativamente o nmero de dinocistos recuperados. Na amostra preparada para palinofcies foram contados 319 palinomorfos, contra 1017 palinomorfos obtidos na nova preparao. Quanto aos dinoflagelados, na lmina de palinofcies foram contados apenas dois cistos, perfazendo 1% do total de palinomorfos da amostra. No novo mtodo, os dinoflagelados atingiram 78% do total dos palinomorfos contados. Verificou-se que a nova preparao propiciou apenas o aumento da recuperao de dinoflagelados, sem a diminuio dos outros palinomorfos (plens e esporos). Podemos concluir que o novo mtodo possibilita uma maior recuperao de dinoflagelados em menor quantidade de amostra, alm de uma menor quantidade de matria orgnica amorfa na lmina, o que facilita a identificao dos palinomorfos, especialmente dos dinoflagelados. Palavras-chave: dinoflagelados, preparao palinolgica, recuperao de palinomorfos. ABSTRACT - NEW METHOD OF PALYNOLOGICAL PREPARATION FOR INCREASING THE RECOVERY OF DINOFLAGELLATES. This new methodology arises the needs to improve the recovery of marine palynomorphs Quaternary sediments of Campos basin. The objective of the palynological preparation is to eliminate the mineral constituents through acidifications, thus concentrating the palynomorphs on the palynological slides. In this new method, it is add the use of a simple and artisan procedure: of panning to eliminate the heavy minerals in the samples after the use of hydrofluoric acid. Additionally, the amorphous organic matter is dissociated with detergent and ultra-sound. The main difference between the method employed herein and the traditional one palynofacies is that the suspended material (after decantation) is sieved instead of the discard. For this method is not necessary the use of acetolysis, thus the dinoflagellates are better preserved. Another advantage of the method I is the use of lesser amount of sample (6 grams). To confirm the effectiveness

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WOLFRAM WALTER BRENNER
Universitt Kiel, Alemanha.

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of the used method was compared one same sample prepared for method I and method II. The results show that the new method increases the number of dinoflagellates recovery. The sample prepared using the method II, were counted 319 palynomorphs, while in the sample prepared using the method II were counted 017 palynomorphs. This conspicuous difference between the methods is resulted of the high abundance of the recovery dinoflagellates. Using the method II, only two dinoflagellates were found. These two dinoflagellates are 1% of all palynomorphs of the sample. On the other hand, using the method I, the percentage of dinoflagellates reaches 78% of all palynomorphs of the sample. It seems that the increase of the dinoflagellates is not at the expense of other palynomorphs, because in both methods do not have difference in the results of palynomorphs count. According to these results, it is possible to confirm that the method greatly improves the recovery of dinoflagellates. Key words: dinoflagellates, palynological preparation, recovery of palynomorphs.

INTRODUO Este novo procedimento na preparao de lminas palinolgicas surgiu da necessidade de melhorar a recuperao de palinomorfos marinhos em amostras de sedimentos quaternrios da bacia de Campos, preparadas pelo mtodo padro para estudos de palinologia e palinofcies, no Projeto Aplicao da faciologia orgnica na modelagem paleoceanogrfica e microbiofaciolgica do talude continental brasileiro recente da bacia de Campos RJ (CTPetro/ CNPq/UFRJ - no 460492/00-4), o qual visa caracterizar, atravs de estudos taxonmicos e paleoecolgicos dos dinoflagelados do furo Bu91-GL07, os parmetros paleoambientais e paleogeogrficos necessrios modelagem paleoceanogrfica do talude continental. Para tanto, foram utilizados os testemunhos do furo Bu91-GL07, j anteriormente estudados pela PETROBRAS, que investe no detalhamento da seo quaternria do talude continental mdio da bacia de Campos. Os mtodos aqui aplicados seguem os procedimentos descritos por Brenner (1998) para preparao palinolgica e por Tyson (1995), Mendona Filho (1999) e Carvalho (2001) para palinofcies. O estabelecimento de uma metodologia adequada de recuperao de palinomorfos, especialmente dos dinoflagelados, foi fundamental para o desenvolvimento da presente pesquisa. O mtodo de preparao de sedimentos quaternrios e recentes adotado nessa pesquisa indito no pas. Essa preparao seguiu a metodologia proposta por Brenner (1996, 1998), que apresentam resultados bastante eficientes para a concentrao de palinomorfos, notadamente de cistos de dinoflagelados. A amostragem do testemunho estudado e as etapas da preparao palinolgica das amostras so descritas detalhadamente a seguir. METODOLOGIA Amostragem O furo Bu91-GL07 um testemunho contnuo e longo, com 100,20 m de comprimento, coletado a 955 m de lmina dgua, no talude continental da bacia de Campos. Os sedimentos lamosos compreendem cerca de 77% da seo testemunhada e foram classificados de acordo com suas cores - marrom ou oliva - que so funo dos teores de carbonato de clcio e sulfetos disseminados, e de origens pelgicas

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e hemipelgicas, respectivamente (Caddah et al., 1998). As areias foram classificadas de acordo com o contedo de lama, em areias limpas e areias lamosas (Caddah et al., 1998). O material foi classificado de acordo com as seguintes litologias: lama oliva hemipelgica (Loh), areia lamosa (AL), lama oliva carbonosa (Loc), lama cinza esverdeada (Lce), lama cinza escuro esverdeada (Lc), lama preta esverdeada (Lpe), lama preta esverdeada com intercalaes arenosas (Lpei) e lama cinza (Lcc). Para material arenoso ou de colorao clara, o ideal na preparao palinolgica usar entre 50 g e 1 kg de sedimento, para uma boa recuperao de palinomorfos. J para lamas e areias escuras, so suficientes, em mdia, de 5 a 8 g de material. Para o presente estudo, tambm foi levado em considerao a pouca quantidade de material disponvel. Foi usado o peso de mdio de 6,5 g de sedimento por amostra. Processamento palinolgico das amostras Foram testadas duas metodologias para preparao palinolgica de amostras, uma para anlises de palinofcies e o mtodo palinolgico por peneiramento. As lminas preparadas para os estudos de palinofcies e fcies orgnica utilizaram os procedimentos palinolgicos no oxidativos, segundo os padres descritos por Tyson (1995) e Mendona Filho (1999). Esta preparao foi realizada por Menezes (2002), para o estudo de palinofcies e fcies orgnica no poo Bu91GL07. As etapas de isolamento do querognio e preparao de lminas organopalinolgicas foram realizadas no Laboratrio de Petrografia Orgnica do Centro de Excelncia em Geoqumica (GEO/CENPES/ PETROBRAS), onde foi utilizado o Sistema de Neutralizao de Resduo cido desenvolvido por Assis (2000). Foram confeccionadas e observadas ao microscpio biolgico 38 lminas de palinofcies. As lminas de palinofcies no apresentaram bons resultados para estudo de dinoflagelados, pois a recuperao dos cistos foi pequena (Figura 1: A, B). Para o uso da metodologia mais adequada de processamento das amostras, fez-se um primeiro teste de preparao do material, em funo da litologia recuperada pelo testemunho. Foi testada apenas 1 g de material arenoso e lamoso, representativos do poo Bu91-GL07, para verificao de como estas diferentes litologias reagiriam sob diferentes concentraes e tempos de exposio aos reagentes, ao uso ou no

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Figura 1. A, B: lmina preparada pelo Mtodo I (palinofcies), com recuperao de palinomorfos continentais e fitoclastos; C, D: lmina preparada pelo Mtodo II (palinolgico proposto no presente trabalho), com bateamento, apresentando alta recuperao de dinoflagelados; E, F: preparao de lmina pelo Mtodo II, sem bateamento, apresentando abundantes minerais. Figure 1. A, B: Method I (palynofacies), with recovering of continental palynomorphs and phytoclasts; C, D: Method II (palynologic method proposed in this paper), with panning process, presenting high recovered of dinoflagellates; E, F: Method II, without panning, presenting a high percentage of minerals.

de reagentes oxidantes e de detergentes para limpeza das amostras. Este tipo de teste economiza material para estudo, tanto de amostras quanto de reagentes qumicos, e principalmente, tempo de preparao e anlises. Com este teste, foi possvel determinar o processamento a ser adotado para a preparao das 80 amostras coletadas. Neste mesmo teste foi constatado que seria necessria uma separao fsica de minerais pesados, que permaneceram nas amostras arenosas mesmo depois dos ataques com os cidos, o qual foi chamada, aqui, de bateamento.

Depois dos testes, optou-se pela adoo do mtodo palinolgico por peneiramento com o uso de HCl e HF, associado ao detergente, ultra-som e seguido por bateamento. Material Foram utilizados os seguintes materiais para o processamento das amostras: sacos plsticos para armazenar as amostras, geladeira, balana de preciso, recipientes plsticos, peneiras cilndricas com rede de polister com malha de 6 m, papis descartveis, bastes de vidro, bastes de

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REVISTA BRASILEIRA DE PALEONTOLOGIA, 7(2), 2004 do, por peneiramento, o uso de detergente, para dissociar e degradar a matria orgnica amorfa, os pequenos fitoclastos e as cutculas. Foi usado ainda o ultra-som, por trs segundos, para dissociar a matria orgnica mais resistente, como fitoclastos, materiais cuticulares, membranas e matria orgnica amorfa. Etapa de ataques cidos Adotou-se o processamento de dez amostras por vez. A preparao de cada lote de amostras teve a durao de seis dias, da pesagem ao armazenamento do resduo em vidro. Aps a pesagem, coloca-se a amostra em um bequer de vidro de 250 ml. O cido clordrico (HCl a 32 %) acrescentado ao bequer at cobrir a amostra. Deixa-se a amostra em repouso na capela e espera-se o final da reao ou deixa-se o reagente agir por duas horas. O HCl utilizado para eliminar o material carbontico e alguns microorganismos como bactrias, nanofsseis, microforaminferos e ostracodes. Caso este ataque inicial no seja suficiente para dissolver totalmente a frao carbontica, acrescenta-se mais cido clordrico (HCl a 32 %) e espera-se a reao cessar ou duas horas. Aps o trmino da reao, ainda com o material dentro da capela, transfere-se o material do bequer para a peneira sem fazer descarte do lquido, isto , todo o material atacado colocado diretamente na peneira, utilizando-se para isto um pouco de lcool e gua filtrada para limpar a parede do bequer. A tcnica de manejo da peneira inclui uma alternncia de movimentos verticais e horizontais para que o material a ser estudado fique limpo, isto , o material no desejvel se desprenda do microplncton de parede orgnica, principalmente dos cistos que possuem processos, espinhos ou outra ornamentao. Em geral, a matria orgnica amorfa envolve esses microfsseis, o que dificulta a observao e principalmente a identificao dos microorganismos. O peneiramento oferece uma larga vantagem na remoo do material lenhoso, tecidos cuticulares, pequenos fitoclastos e matria orgnica amorfa, isolando e concentrando os palinomorfos. O material que passa pela peneira depositado em um bquer vazio de 550 ml. Esse cido clordrico deve ser devidamente neutralizado e s ento jogado fora. Depois do peneiramento, coloca-se a peneira com o material retido dentro de um bquer vazio de 550 ml, que ser levado at uma pia para ser lavado com gua corrente filtrada, para a neutralizao da soluo cida. Esta lavagem para neutralizao tambm realizada atravs de sucessivos peneiramentos. importante notar que no ocorre descarte em qualquer etapa aps o uso do cido ou em qualquer outra etapa seguinte. A lavagem feita at que a gua se neutralize, ficando com o pH por volta de sete. Na prtica, isto corresponde a repetir a lavagem por dez vezes, at que a gua da lavagem saia limpa da peneira. Na ltima lavagem, uma esponja de espuma colocada debaixo da peneira para que o excesso de gua seja sugado deixando o material da peneira mais seco e para que o material com dimetro abaixo de 6 mm seja eficientemente eliminado. Assim, bactrias, nanofsseis calcrios e esporos de fungos so eliminados mais eficientemente. Com o material ainda dentro da peneira, coloca-se um pouco de detergente (Extran), em quantidade suficiente para cobrir a amostra e espalhar-se por toda a

polipropileno, pipetas de vidro descartvel, bqueres de vidro e polipropileno de 100 ml, 250 ml e 500 ml, garrafas plsticas, cido clordrico 32% (HCl 32 %), cido fluordrico 40% (HF 40%), ultra-som, detergente comum, esponjas, bandejas de vidro, potes de filme fotogrfico, lminas de vidro Menzel SuperFrost Color (76 x 26 mm), lamnulas de vidro (24 x 24mm), corante safranina e gelatina glicerinada. As peneiras so confeccionadas como segue: usa-se uma malha de polister com abertura de 6 m, a qual presa em potes plsticos aquecendo-se ambas com um pedao de ferro quente. O dimetro desses potes varia de acordo com a necessidade do trabalho, conforme a quantidade de material a ser peneirado. Para o presente trabalho foram utilizadas peneiras com 1 cm, 2 cm, 4 cm e 5 cm de dimetro e altura igual ou maior aos respectivos dimetros. Wood et al. (1996), em seu estudo sobre processamento de amostras em laboratrio recomendam ateno no manuseio dos cidos que deve ser realizado em uma capela com o exaustor ligado. necessrio que o preparador utilize corretamente os equipamentos de segurana (avental, luvas de borracha, mscara com filtro para vapores cidos, culos de proteo, calado apropriado etc.) para evitar acidentes. Identificao das amostras Inicialmente, as amostras foram analisadas em lupa para observao da cor, granulometria e forma dos gros, litologia e possvel ocorrncia de carapaas de microfsseis. Aps estes registros, cada amostra foi colocada sobre papel descartvel, para evitar contaminaes, e ento pesada. necessrio colocar a identificao da amostra em todo o material utilizado no processamento (saco plstico, bqueres, peneiras, garrafas plsticas, vidros para armazenamento e lminas).

Metodologias de preparao palinolgica A metodologia aqui descrita refere-se ao mtodo de preparao de amostras para recuperao de microfsseis do tipo microplncton de parede orgnica, como as cianobactrias (Cyanophyceae), clorofceas (Chlorophyceae), prasinfitas (Prasinophyceae), acritarcos (Acritarchs) e dinoflagelados (Dinophyceae), sendo este ltimo o principal objeto de estudo do presente trabalho. Para o estudo de microfsseis orgnicos so geralmente adotados trs mtodos de preparao de amostras: 1. Palinofcies: recupera toda a matria orgnica presente originalmente na amostra; 2. Paleopalinologia: utiliza compostos oxidantes, como hidrxido de potssio (KOH) e cido ntrico (HNO3), para clareamento dos palinomorfos; 3. Palinologia por peneiramento: inclui etapas de acidificao (HCl e HF), uso de detergente e ultra-som, sem descarte de material orgnico flotante. Neste trabalho foi adotado o mtodo utilizado por Brenner (1996, 1998, 2001), o mtodo palinolgico por peneiramento (Figura 1: C, D). O peneiramento favorece a remoo de material lenhoso, tecidos cuticulares, pequenos fitoclastos, concentrando os palinomorfos. Nas 80 amostras preparadas no Laboratrio de Micropaleontologia da UFRJ, foram associados ao mto-

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OLIVEIRA ET AL. NOVO MTODO DE PREPARAO PALINOLGICA peneira. O uso do detergente ajuda na dissociao e degradao da matria orgnica amorfa, dos pequenos fitoclastos e das cutculas. preciso que o detergente atue em toda a amostra para a mesma ser devidamente limpa. Deixa-se a amostra descansar por volta de 15 a 30 minutos em uma bandeja de vidro. Coloca-se um pequeno suporte em baixo da peneira de modo que ela permanea inclinada. Aps a reao com o detergente a amostra lavada com gua filtrada por peneiramento, por vrias vezes, at a gua ficar limpa de toda a espuma feita pelo detergente. Depois dessa etapa, a peneira tem que ser limpa com gua de torneira sob presso forte, esponja e sabo, e ento colocada no ultra-som por dois minutos, para que sua malha seja limpa, evitando a contaminao e entupimento na peneira. A prxima etapa o ataque da amostra com cido fluordrico (HF a 40%). Acrescenta-se uma quantidade de cido fluordrico cerca de trs vezes maior que o volume da amostra, em um recipiente de polipropileno e deixa-se repousar por volta de doze horas ou o tempo suficiente para a slica ser completamente dissolvida. Uma vez terminada a reao, peneira-se o material dentro da capela, pois o HF bastante txico e corrosivo. O material para anlise orgnica lavado e peneirado novamente vrias vezes at que a gua fique neutralizada, seguindo a mesma tcnica de movimentaes verticais e laterais utilizada na lavagem do cido clordrico. Novamente acrescenta-se detergente e deixa-se a amostra reagir entre cinco a quinze minutos. O material novamente lavado e peneirado at a sua total neutralizao. Ainda com o material dentro da peneira, e com um pouco de gua corrente filtrada, observa-se o material ao microscpio ptico.

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Aps os ataques com cidos prprios do processamento usual, utilizar cido ntrico (HNO3 a 600 C) por trs a cinco segundos. Em seguida, peneirar e depois usar o hidrxido de potssio (KOH a 10% a uma temperatura de +/- 800 C) por dez minutos. A matria orgnica amorfa das amostras deste trabalho foi eliminada usando-se detergente e ultra-som, em perodos variando entre um e trs segundos. Eliminao mecnica de minerais Como as amostras aqui estudadas so constitudas predominantemente por areias lamosas, verificou-se a presena de uma grande quantidade de minerais aps os ataques cidos, como micas, nas lminas testadas. Esta frao mineral prejudica as anlises organopalinolgicas, palinolgicas e paleopalinolgicas. Matsuoka (2000) sugere, para eliminar o excesso de minerais pesados do resduo, um mtodo mecnico artesanal que foi adotado neste trabalho por seu timo resultado. Depois dos ataques com os cidos, caso reste alguma frao mineral (micas, silicatos e fluoretos), esta frao separada atravs de um bateamento (Figura 1: E, F). Coloca-se o resduo, j neutralizado e com um pouco de gua, num vidro de relgio de 15 cm de dimetro e balana-se o vidro em movimentos circulares, como os que so feitos com uma bateia para concentrar o ouro de aluvio. preciso ter cuidado para no derramar a gua, pois os palinomorfos esto suspensos na lmina dgua. Depois de alguns giros circulares no vidro, o resduo orgnico leve (palinomorfos) flutua e vai juntando-se no centro, na coluna da gua. A frao mineral, mais pesada, concentra-se tambm, mas afunda mais rapidamente e fica no fundo do vidro, na parte central. Cuidadosamente, antes que todo o material decante, verte-se a gua com o material flutuante para um recipiente ou pipetase a gua com o material orgnico para outra peneira de 6 mm. Os minerais pesados ficam no fundo do vidro de relgio. Assim, separa-se o material orgnico da frao mineral, de uma forma fsica e no qumica. O procedimento feito com amostras muito arenosas ou que contenham muito mineral micceo, onde o ataque com HF pode no ser muito eficaz. Testa-se a qualidade da amostra, colocando-se um pouco do material em uma lmina com um pouco de gua destilada. Colorao dos dinocistos Em geral, os dinoflagelados autotrficos do Quaternrio so de difcil identificao em microscpio com luz branca por apresentarem-se praticamente transparentes, enquanto que, em microscpio com luz fluorescente, estes aparecem com brilho fluorescente. Ocorre o contrrio com os dinoflagelados heterotrficos, que so identificados sem problema sob luz branca, por apresentarem uma cor marrom ou castanha. Uma possibilidade para a identificao de dinoflagelados autotrficos em microscpio com luz branca o uso de produtos qumicos de tingimento, os corantes Safranin (Safranina, corante vermelho) ou Fucsin (Fucsina, corante marrom). Esse tingimento foi utilizado, a princpio, como teste em 20 amostras desse trabalho. Como os resultados foram satisfatrios adotou-se o tingimento para todos os resduos orgnicos. A soluo para corar o resduo a de 0,01 g de Safranina

Eliminao da matria orgnica amorfa Logo nos primeiros testes das amostras, verificou-se que seria necessrio o uso do ultra-som para dissociar a matria orgnica amorfa mais resistente. Brenner (1996, 1998) recomenda o uso de alguns produtos oxidantes, como o hidrxido de potssio (KOH) e o cido ntrico (HNO3), que eliminariam parte da matria orgnica amorfa, alm de clarear os palinomorfos. No material mais antigo, onde a matria orgnica sofreu carbonizao em altas profundidades, esses reagentes so usados para clarear as amostras e facilitar a identificao e classificao dos palinomorfos (Uesugui, 1979). Entretanto, no material do Quaternrio, os dinocistos so muito claros e muito mais frgeis do que os dinocistos de sedimentos mais antigos, e por isso o uso de oxidantes deve ser evitado. Nesta fase do processamento, caso ainda permanea na amostra muita matria orgnica amorfa, pode-se recorrer s tcnicas descritas a seguir. Usar detergente puro (sem gua) na amostra, por 30 minutos, agitando o material de vez em quando. Com a matria orgnica devidamente limpa e peneirada, transferir o material para um bequer de vidro com um pouco de gua destilada e acrescentar KOH a 10%, at que a cor da gua fique castanho claro. Em seguida, acrescenta-se a mesma quantidade de fosfato de sdio (Na3PO4) ou outro fosfato, coloca-se na chapa aquecedora a uma temperatura de +/- 80C por dez minutos. A seguir deve-se lavar e peneirar o material at neutraliz-lo (se for necessrio, pode-se usar o ultra-som por dois segundos).

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REVISTA BRASILEIRA DE PALEONTOLOGIA, 7(2), 2004 estabilizao da curva quanto ao aparecimento de novos gneros. Optamos pela contagem de 300 palinomorfos (inclusive os cistos de dinoflagelados) e em seguida contamos mais 300 espcimes de cistos de dinoflagelados por lmina. A contagem dos 300 palinomorfos reflete a composio original do material orgnico palinomrfico na lmina que composto por gros de plen, esporos, microplncton de gua doce (Botryococcus, Pediastrum), esporos de fungos, microplncton marinho de parede orgnica (Prasinophyta, acritarcas e dinoflagelados), ciliatas (tintindeos), cianobactrias, microforaminferos (paliniforaminferos), ovos de vermes, ovos de coppodas, etc.. Paralelamente a essa contagem, tambm foram analisadas 38 lminas organopalinolgicas que nos forneceram o resultado da matria orgnica total (Menezes, 2002). As espcies de dinoflagelados que ocorrem nas lminas confeccionadas por peneiramento e a anlise da matria orgnica total (lminas para estudos de palinofcies) possibilitaram dados mais precisos, principalmente, a respeito do paleoambiente. RESULTADOS E CONCLUSES

(sem fenol) para cada 1.000 ml de gua destilada, sugerindose, ainda, mistura de 50 ml de gua destilada e 50 ml de lcool. Do resduo final, pipeta-se trs gotas em uma peneira com malha de 6 mm, que fica perfeitamente encaixada em um vidro com tampa plstica (conjunto peneira/vidro para colorao). Nesse vidro colocada a Safranina. A soluo deve invadir a peneira o suficiente para cobrir toda matria orgnica. Tampa-se o vidro e agita-se o sistema vidro/peneira para homogeneizar a mistura e efetivar o tingimento da amostra. O ideal deixar o material ser tingido de um dia para o outro. Depois, peneira-se o material com gua corrente filtrada, deixando apenas a matria orgnica com um pouco de gua. No dia seguinte, faz-se um teste para verificar se o material est efetivamente corado. Caso contrrio, deixa-se soluo agir por mais tempo ou aumenta-se a concentrao de corante. Novamente, pipeta-se o material para um vidro usando gua destilada e adiciona-se trs gotas de fenol no vidro com o material, que ficar armazenado. Confeco das lminas palinolgicas Para a confeco das lminas utilizamos pipetas de vidro descartveis para retirar o resduo palinolgico do recipiente onde a amostra foi armazenada. A lmina aquecida em chapa quente na temperatura de 60 C e, sobre ela, coloca-se 3 mm3 de gelatina glicerinada. Aguarda-se o derretimento da gelatina, sobre a qual so colocadas duas gotas do resduo. Com um palito, mistura-se o resduo e a gelatina glicerinada at a sua homogeneizao. A gua dessa soluo deve evaporar completamente, e isso verificado colocando-se a lamnula prxima da soluo. Enquanto a soluo contiver gua, a lamnula ficar embaada pelo vapor dgua. Isso ruim, pois poder ocorrer formao de bolhas. Aps a evaporao, retira-se a lmina da chapa quente, colocando-a sobre uma bancada clara, se possvel, para observar se apresenta boa quantidade de material. Nem pouco, nem em excesso. Em seguida, coloca-se a lamnula sobre a lmina, de forma a no deixar bolhas no material. Para vedar a lmina, torna-se a coloc-la na chapa quente, com um pedao de parafina de cerca de 4 mm3, que deve ficar encostado entre a lmina e a lamnula. Aguarda-se a parafina derreter e penetrar completamente entre a lmina e a lamnula. Retira-se a lmina da chapa quente e aps a secagem da mesma, o excesso de parafina das bordas retirado com estilete. Por fim, limpa-se a lmina com algodo e lcool. Procedimento de contagem Foram analisadas quatro amostras (amostras 1, 7, 12 e 13) para se adotar a metodologia de contagem. As anlises quantitativa e qualitativa de palinomorfos do Quaternrio foram adotadas na contagem dos diferentes palinomorfos e gneros de dinoflagelados. Foi confeccionado um grfico para cada amostra em funo do gnero de dinoflagelados versus sua variao a cada 50 formas contadas, num total de 300, para se conhecer a freqncia de variao dos gneros de dinoflagelados. Os gneros tiveram uma variao maior entre 180 e 250 cistos de dinoflagelados contados. Aps 250 partculas ocorre uma

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Os resultados mostraram-se bastante satisfatrios, revelando que este mtodo aumenta significativamente o nmero de dinoflagelados recuperados. Na amostra preparada para palinofcies (Mtodo I) foram contadas, primeiramente, 300 partculas da matria orgnica total. Os resultados por componente, em percentual em relao matria orgnica total, podem ser observados abaixo. Mtodo I (palinofcies): matria orgnica total. Contagem: 300 partculas. Resultado em percentual do total de matria orgnica (100%): fitoclastos: 45% matria orgnica amorfa: 25% esporos: 20% gros de plen: 2% microplncton de gua doce: 6% dinoflagelados: 1% componentes indeterminados: 1%

Ainda na lmina referente amostra preparada para palinofcies (Mtodo I), foi realizada uma segunda contagem, somente de palinomorfos, de lmina inteira, obtendo-se como resultado: Mtodo I (palinofcies): somente palinomorfos. Contagem: Contagem de lmina inteira. Resultado: no partculas contadas / percentual em relao aos palinomorfos (100%): esporos: 194 gros / 62% gros de plen: 37 gros / 12% microplncton de gua doce: 59 elementos / 20% dinoflagelados: 2 dinocistos / < 1% microforaminferos (palinoforaminferos): 0 outros: 18 elementos / 5% Total de elementos contados: 310.

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OLIVEIRA ET AL. NOVO MTODO DE PREPARAO PALINOLGICA O mesmo sistema de contagem utilizado anteriormente (somente palinomorfos em lmina inteira) foi aplicado para a amostra preparada pelo novo mtodo palinolgico proposto (Mtodo II), obtendo-se como resultado: Mtodo II (palinolgico aqui proposto): somente palinomorfos. Contagem: Contagem de lmina inteira. Resultado: no partculas contadas / em percentual em relao aos palinomorfos (100%): esporos: 92 gros / 9% gros de plen: 38 gros / 4% microplncton de gua doce: 59 elementos / 6% dinoflagelados: 796 dinocistos / 79% microforaminferos (palinoforaminferos): 15 / 1,5% outros: 5 elementos / 0,5% Total de elementos contados: 1.005 Comparando-se os mtodos utilizados constata-se que no sistema de contagem efetuado somente para palinomorfos, usando a contagem em lmina inteira, foram contados 310 palinomorfos na amostra preparada para palinofcies (Mtodo I Figura 1: A, B), enquanto na amostra preparada pelo mtodo aqui apresentado (Mtodo II Figura 1: C, D), foram contados 1.005 palinomorfos. Essa grande diferena entre um mtodo e outro devido ao grande nmero de dinoflagelados recuperados. No mtodo de palinofcies foram contados apenas dois dinocistos que perfazem percentuais inferiores a 1% do total de palinomorfos dessa amostra. No mtodo aqui apresentado o percentual dos dinoflagelados chega a 79% do total dos palinomorfos contados. Esse mtodo propiciou um aumento (concentrao) de dinoflagelados podendo, entretanto, ocorrer a diminuio de outros palinomorfos, notadamente de esporos. O sistema de contagem utilizado para a matria orgnica total s tem resultado no mtodo de preparao para palinofcies (Mtodo I), uma vez que a elevada concentrao dos cistos de dinoflagelados, observada no Mtodo II, se d em detrimento de outros componentes orgnicos da matria orgnica total. Pode ser concludo que o mtodo aqui apresentado possibilita uma maior recuperao de dinoflagelados em menor quantidade de amostra, alm de uma amostra mais limpa devido ao peneiramento e ao uso do detergente que dissocia a matria orgnica amorfa facilitando, assim, a melhor identificao dos palinomorfos, especialmente dos dinoflagelados. A preparao palinolgica por peneiramento, alm de eliminar os constituintes mineralgicos por acidificao, mostra timos resultados quando se utiliza detergente e ultrasom para eliminar pequenos fitoclastos e dissociar a matria orgnica amorfa. A utilizao da peneira faz com que ocorra uma maior concentrao dos palinomorfos. A no utilizao de etapas de descarte um dos principais responsveis pela recuperao dos dinoflagelados do Quaternrio, obtendo assim, o maior nmero possvel de palinomorfos na lmina palinolgica. AGRADECIMENTOS

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Os autores agradecem ao CNPq/CTPETRO (projeto n 460-492/000-04) pelo apoio financeiro, e ao Laboratorio de Geologia/Unidade de Negcio de Explorao e Produo da Bacia de Campos/PETROBRAS pela liberao das amostras. Pelo apoio logstico e financeiro agradecem o Laboratrio de Micropaleontologia/IGEO/CCMN/UFRJ, o Laboratrio de Palinofcies e Fcies Orgnica/IGEO/CCMN/UFRJ e a Gerncia de Bio-Estratigrafia e Paleoecologia (CENPES/ PETROBRAS). Gerncia de Geoqumica do CENPES/ PETROBRAS, pelo apoio analtico. REFERNCIAS
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