PRCTICA # 9 STAPHYLOCOCCUS

OBJETIVOS: Determinar el tipo de microorganismo sembrado de diferentes fuentes a travs de su crecimiento en diferentes medios de cultivo y comprobado a travs de diversas pruebas bioqumicas. Describir las caractersticas microscpicas, culturales que permiten efectuar el aislamiento y la diferenciacin entre Staphylococcus aureus y los estafilococos coagulasa negativa (ECN) Seleccionar los medios de cultivo adecuados para llevar a cabo la deteccin de los estafilococos Elegir, leer e interpretar las pruebas que permiten identificar a los estafilococos

INTRODUCCIN STAPHYLOCOCCUS. Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos, segn su forma de divisin y agrupacin, se integran en dos familias (Micrococcaceae y Deicrococcaceae) y otros gneros con personalidad propia como el gnero Streptococcus. La familia Micrococcaceae que tiene inters mdico incluye aquellos que se agrupan de forma irregular o en tetradas, y est constituida por los gneros Staphylococcus, Micrococcus, Planococcus y Stomatococcus. Los cocos gram positivos aerobios y anaerobios facultativos de inters mdico estn en los gneros Staphylococcus y Streptococcus, que a su vez comprende el neumococo (S. pneumoniae). CONCEPTO Y CLASIFICACIN. Concepto Los estafilococos son cocos gram positivos de 0.5-1 m de dimetro, inmviles, aerobios y anaerobios facultativos, caracterizados en que se agrupan de forma irregular en racimos, producen catalasa y descomponen los azcares por fermentacin. Son bacterias poco exigentes, que se cultivan fcilmente en medios comunes y presentan cierta resistencia a los agentes externos, por cuyo motivo se pueden encontrar en la naturaleza, especialmente en el medio ambiente que rodea al hombre, formando parte de la flora normal de la piel y mucosas e interviniendo en procesos patgenos diversos, sobre todo en infecciones supuradas e intoxicaciones alimentarias. Clasificacin Se pueden distinguir las siguientes especies:

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S. aureus, prototipo de los estafilococos patgenos. Es el agente causal de la mayora de las infecciones; se caracteriza por producir coagulasa o fermentar el manitol, elaborar diversas toxinas, en especial la toxina , y sintetizar en su mayora un pigmento amarillo dorado, no difusible, que colorea a las colonias. S. epidermidis y S. saprophyticus, prototipos de los estafilococos oportunistas. Son grmenes comensales de la piel o libres en el medio ambiente, que en ocasiones pueden intervenir en procesos patgenos. Se caracterizan por no producir coagulasa ni toxina , no fermentan el manitol y elaboran en su mayora un pigmento blanco aporcelanado.

La importancia de los estafilococos deriva de su aumento progresivo de resistencia a los antibiticos, sobre todo en el medio hospitalario, que junto con su resistencia a los agentes externos les permite difundir y producir infecciones y brotes epidmicos (infecciones hospitalarias), que plantean serios problemas epidemiolgicos y teraputicos. STAPHYLOCOCCUS AUREUS Estructura antignica y clasificacin en tipos La estructura antignica de S. aureus es compleja y mal conocida. En la pared celular se han demostrado cerca de 30 antgenos, y los ms importantes son:

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El polisacrido A, especfico de especie, constituido por cidos teicoicos, polmeros de fosfato de ribitol, que estn unidos al peptidoglicano por enlaces covalentes. Son antignicos e inducen la aparicin de anticuerpos, y se ha demostrado un aumento de anticuerpos antirrubitol en los casos de endocarditis estafiloccica. En S. epidermidis, los cidos teicoicos son polmeros de fosfato glicerol y en S. saprophyticus, polmeros de fosfato de ribitol. Los bacterifagos se fijan en esta capa.

2.
3. 4.

La protena A, especfica de especie, se encuentra en la pared celular y puede liberarse en el medio. Presenta la propiedad de unirse a la extremidad Fc de las IgG normales y a la extremidad F(ab) 2 de las IgG especficas, as como de activar el complemento. Existen, adems, en la pared celular un nmero indeterminado de protenas responsables de la tipoespecificidad. Tambin se han aislado cierto nmero de cepas mucoides capsuladas, especialmente en los animales, cuya composicin e importancia no se conocen.

La especies S. aureus se caracteriza por la presencia de cidos teicoicos, polmeros de fosfato de ribitol y protena A. Pero, adems por sus antgenos tipoespecficos se ha podido subdividir en tipos siguiendo dos criterios: a) En serotipos, mediante el empleo de sueros tipoespecficos, y se ha clasificado en 18 serotipos. b) En fagotitos o lisotipos, por el estudios de la sensibilidad de la cepa frente a un grupo de fagos seleccionados. Se conocen ms de 100 fagotipos que por necesidades prcticas se han reunido en 4 grupos y un grupo no clasificado. Los serotipos 1, 2 y 3 se corresponden en lneas generales con los fagogrupos I, II y III. Es interesante sealar que en los tres primeros fagogrupos se encuentran la mayora de las cepas patgenas para el hombre: en el grupo II, cepas extrahospitalarias y productoras de toxinas exfoliativa y, en el grupo III, la mayora de cepas multirresistentes a los antibiticos pertenecientes a determinados serotipos o fagotipos. Accin patgena Es debida fundamentalmente a la accin de antgenos de superficie, toxinas y fermentos1 STAPHYLOCOCCUS AUREUS SUBESPECIE AUREUS. Staphylococcus aureus subespecie aureus es sin duda el patgeno humano ms importante entre los estafilococos. Se lo encuentra en el ambiente externo y en las narinas anteriores del 20 al 40% de los adultos. Otros sitios de colonizacin son los pliegues cutneos, el perin, las axilas y la vagina. Aunque este microorganismo suele formar parte de la microflora humana normal, puede producir infecciones oportunistas importantes en las condiciones apropiadas. Los factores que pueden predisponer a un individuo a infecciones graves por S. aureus incluyen los siguientes: Defectos quimiotcticos de los leucocitos, sean congnitos o adquiridos. Defectos en la opsonizacin por anticuerpos. Defectos en la destruccin intracelular de las bacterias despus de la fagocitosis. Lesiones cutneas. Presencia de cuerpos extraos. Infecciones por otros agentes, particularmente virus. Enfermedades crnicas de base, como tumores malignos, alcoholismo, y cardiopatas. Administracin profilctica o teraputica de agentes antimicrobianos. En estas circunstancias S. aureus puede producir una variedad de procesos infecciosos que van desde infecciones cutneas relativamente benignas hasta enfermedades sistmicas potencialmente fatales. Las infecciones cutneas incluyen la foliculitis simple (infeccin superficial que rodea los folculos pilosos) y el imptigo (infeccin superficial de la piel observada frecuentemente en los nios). As como furnculos y carbuncos que afectan el tejido subcutneo y producen sntomas sistmicos como fiebre. S. aureus se asla con frecuencia de heridas quirrgicas infectadas, las que pueden funcionar como focos para el desarrollo de infecciones sistmicas. La bronconeumona estafiloccica adquirida en la comunidad se observa habitualmente en ancianos y se asocia con una neumona viral como factor predisponiente. La neumona nosocomial producida por S. aureus se observa en cuadros clnicos de enfermedad pulmonar obstructiva crnica, con intubacin y aspiracin. Las enfermedades malignas subyacentes se reconocen como factores de riesgo importantes para el desarrollo de una bacteriemia por S. aureus. La bacteriemia tambin puede sembrar localizaciones distantes del organismo y dar origen a una endocarditis, una osteomielitis, una pioartritis y la formacin de abscesos metastticos, particularmente en la piel, los tejidos subcutneos, los pulmones, el hgado, los riones y el cerebro. La meningitis estafiloccica aparece en pacientes con anormalidades del sistema nervioso central relacionadas con traumatismos, ciruga, tumores malignos e hidrocefalia y Staphylococcus aureus es la segunda causa ms frecuente de meningitis asociada con derivaciones ventriculoperitoneales. Tambin es uno de los muchos microorganismos asociados con peritonitis en pacientes sometidos a dilisis peritoneal ambulatoria continua. Las toxinas estafiloccicas tambin son responsables de la necrlisis epidmica txica (sndrome estafiloccico de la piel escaldada) y del sndrome de shock txico. Tambin hay cepas de S. aureus que pueden producir intoxicaciones alimentarias debido a la elaboracin de exotoxinas durante su desarrollo en alimentos contaminados. S. aureus posee varias propiedades que se supone que contribuyen a su capacidad de producir enfermedad. Sin embargo, estos factores de virulencia no se encuentran en todas las cepas de S. aureus y este microorganismo sigue
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A. Fumarola, et al. Microbiologa y parasitologa medica. Segunda edicin. Editorial Masson.

siendo fuente de sorpresas constantes a medida que se descubren propiedades patognicas nuevas y diferentes. Estas propiedades incluyen las siguientes. Formacin de la cpsula Algunas cepas de S. aureus producen un exopolisacrido que puede evitar la fagocitosis del microorganismo por parte de los leucocitos polimorfonucleares. Estos exopolisacridos han sido observados por microscopia electrnica en derivaciones de marcapasos, catteres peritoneales y guas intravenosas infectadas por S. aureus y han sido demostrados inmunolgicamente in Vitro. Este material puede facilitar la adherencia de los microorganismos a las clulas del husped y a los dispositivos protsicos. Los aislamientos clnicos de S. aureus se han clasificado en ocho tipos de acuerdo con la inmunotipificacin del polisacrido capsular y entre el 70 y el 80% de los aislamientos clnicos importantes pertenecen a los serotipos capsulares 5 u 8. Estos dos tipos capsulares, particularmente el tipo 8, tambin estn asociados con otros factores de virulencias de S. aureus, como por ejemplo, la produccin de la toxina del sndrome de shock txico. Adems, una gran cantidad de cepas de S. aureus que son resistentes a la oxacilina, la penicilina antiestafiloccica utilizada con mayor frecuencia, expresan el serotipo 5 de polisacrido capsular. Los tipos capsulares 5 y 8 tambin se han encontrado en aislamientos animales de S. aureus. Protena A La pared celular de S. aureus contiene esta peculiar protena que tiene la capacidad de unirse a la regin Fc de la molcula de inmunoglobulina G (IgG). La protena A se encuentra unida al peptidoglucano de la pared celular y tambin puede ser segregada al medio durante el desarrollo. La protena A funciona como un factor de virulencia al interferir en la opsonizacin y la ingestin de los microorganismos por parte de los leucocitos polimorfonucleares, activan al complemento y estimulan reacciones de hipersensibilidad de tipo inmediato y retardado. La protena A es inmunognica y en los individuos con infecciones graves producidas por S. aureus se encuentran anticuerpos dirigidos contra ella. La presencia de la protena A en S. aureus constituye la base de las pruebas de coaglutinacin que se utilizan muchos laboratorios clnicos para la identificacin de microorganismos y para la deteccin de antgenos bacterianos en lquidos corporales. Constituyentes de la pared celular La pared celular de S. aureus contiene peptidoglucano (polmeros de N-acetilglucosamina y de cido N-acetilmurmico ligados en forma cruzadas), que son similares a los encontrados en otras bacterias gram positivas, y cidos teicoicos, que son polmeros peculiares de ribitol (monosacridos de cinco carbonos) con fosfatos. Los cidos teicoicos participan en la adherencia especfica de las bacterias gram positiva a las superficies mucosas. Adems de conferir rigidez y la elasticidad a la pared celular de los estafilococos los peptidoglucanos y los cidos teicoicos poseen varias propiedades biolgicas que se supone que contribuyen a la virulencia. Estas propiedades incluyen la capacidad de activar el sistema del complemento, de inhibir la quimiotaxis de las clulas inflamatorias y de estimular la produccin de anticuerpos. Las pruebas sexolgicas para la deteccin de anticuerpos contra estas molculas han sido investigadas en lo que respecta a su posible valor diagnstico o pronstico; los resultados han sido desalentadores debido a la considerable superposicin de ttulos de anticuerpos entre individuos infectados y no infectados, el amplio espectro de infecciones y enfermedades producidas por S. aureus y la variabilidad dependiente del husped de la respuesta inmune segn la edad, otras infecciones y la inmunocompetencia general. Enzimas S. aureus produce varias enzimas que pueden contribuir a su virulencia. La produccin de catalasa por parte de estos microorganismos pueden actuar para inactivar el perxido de hidrgeno y los radicales libres txicos formados por el sistema mieloperoxidasa dentro de las clulas fagocticas despus de la ingestin de estos microorganismos. Tanto la coagulasa libre como la unida pueden recubrir las clulas bacterianas con fibrina y tornarlas resistentes a la opsonizacin y la fagocitosis. Las fibrinolisinas pueden degradar cogulos de fibrina y permitir la diseminacin de la infeccin a los tejidos contiguos. En forma similar, la hialuronidasa hidroliza la matriz intercelular de mucopolisacridos en los tejidos y, por lo tanto, pueden actuar diseminando los microorganismos a zonas adyacentes. Las cepas de S. aureus que provocan furunculosis crnica son productoras de potentes lipasas que pueden contribuir a la diseminacin de los microorganismos en los tejidos cutneos y subcutneos. Se ha descrito una fosfolipasa C especfica para el fosfatidilinositol asociada con cepas recuperadas de pacientes con sndrome de distrs respiratorio del adulto y coagulacin intravascular diseminada. Los tejidos afectados por esta enzima se vuelvan ms susceptibles al dao y la destruccin por componentes bioactivos del complemento y los productos de la activacin del complemento. Los estudios inmunolgicos y de especificidad de sustrato indican que S. aureus produce por lo menos tres tipos diferentes de beta-lactamasas. La produccin estas enzimas puede ser inducible o constitutiva y hace que estos microorganismos sean resistentes a la penicilina y a la ampicilina. Los genes que codifican estas enzimas habitualmente residen en plsmidos que tambin poseen genes para la resistencia a diversos antibiticos, como la eritromicina y la tetraciclina. Estos genes de resistencia pueden ser transferidos a otras bacterias por transformacin y tranduccin. Hemolisinas

Las hemolisinas de S. aureus poseen varias actividades biolgicas. La alfa-hemolisina tiene efectos letales sobre una amplia variedad de tipos celulares, entre ellos los leucocitos polimorfonucleares humanos, y lisa eritrocitos de varias especies animales. La toxina es dermonecrtica por inoculacin subcutnea y es letal para los animales cuando se le inyecta por va intravenosa. Tambin es una potente neurotoxina. Esta toxina es responsable del halo de eritrocitos bemolizados que se observa alrededor de las colonias de algunas cepas de S. aureus que se desarrollan en agar sangre de carnero. La beta-hemolisina es una esfingomielinasa que tiene actividad contra una variedad de clulas. Es una hemolisina caliente-fra (es decir, sus propiedades hemolticas son incrementadas por la exposicin posterior de los eritrocitos a bajas temperaturas). La beta-hemolisina, junto con el factor CAMP producido por los estreptococos del grupo B. Toxinas La leucocidina es una exotoxina que ejerce un efecto txico directo sobre la membrana de los leucocitos polimorfonucleares humanos que provoca desgranulacin del citoplasma, edema celular y lisis. La toxina tiene dos componentes que interactan en forma sinrgica para producir una granulocitopenia profunda. La forma de accin de esta toxina involucra la formacin de poros que alteran la permeabilidad celular al potasio y otros cationes. Las exfoliatinas o toxinas epidermolticas son producidas por ciertas cepas de estafilococos y consisten en dos protenas, denominadas ET-A y ET-B, de 24.000 Da de peso molecular relativo de cada una. Las dos molculas son diferentes desde el punto de vista bioqumico e inmunolgico pero tienen actividades biolgicas similares. La ET-A es una protena termoestable cuyo gen estructural es cromosmico, en tanto ET-B es termolbil y de origen plsmido. Estas protenas poseen actividad proteoltica y disuelven la matriz mucopolisacrida de la epidermis, lo que da como resultado la separacin intraepitelial de las uniones celulares del estrado granuloso. Las cepas que producen una de estas toxinas o ambas son responsables del sndrome estafiloccico de la piel escaldada. En este cuadro clnico se observa la formacin de bullas grandes reas del cuerpo, con la posterior formacin de escaras en las capas superficiales de la piel. Esto da como resultado grandes reas de piel denudada y en carne viva. La enfermedad se ve habitualmente en recin nacidos y lactantes. Ambas toxinas son antignicas y los anticuerpos dirigidos contra ellas son protectores. Las enterotoxinas A a E son molculas termoestables, responsables de la caractersticas clnicas de la intoxicacin alimentaria estafiloccica. El mecanismo exacto de accin de estas enterotoxinas se desconoce pero aumentan el peristaltismo intestinal. ESTAFILOCOCOS COAGULASA-NEGATIVOS Antiguamente los estafilococos coagulasa-negativos por lo general se consideraban contaminantes de poca importancia clnica. Sin embargo, en las ltimas dcadas estos microorganismos se han reconocido como agentes importantes de enfermedades humanas. Aunque se han descrito varias especies diferentes de estafilococos coagulasa negativos, relativamente pocos de ellos producen infecciones en los seres humanos. Sin embargo, como una mayor cantidad de laboratorios han intentado identificar estafilococos coagulasa- negativos se estn reconociendo infecciones producidas por otras especies cada vez con mayor frecuencia. Los tipos de infecciones asociadas con los estafilococos coagulasanegativos incluyen las siguientes: Infecciones urinarias, nosocomiales y adquiridas en la comunidad. Infecciones producidas por dispositivos permanentes. Bacteriemia en huspedes comprometidos. Endocarditis de vlvulas cardacas naturales y protsicas. Osteomielitis. Endoftalmitis posquirrgica. ESPECIES DE STAPHYLOCOCCUS DE ORGEN HUMANO, ANIMAL Y AMBIENTAL Estafilococos encontrados en el hombre y en primates no humanos Especie S. haemolyticus S. warneri S. hominis S. simulans Comentarios. Integrante de la flora normal humana de la piel . Se encuentra tambin en primates no humanos. Esta especie, que representa aproximadamente el 1% de los estafilococos encontrados normalmente en la piel humana, en la actualidad es una causa bien reconocida de bacteriemia relacionada con catteres, de endocarditis de vlvulas naturales. Esta especie se encuentra en la piel humana y ha sido aislada como causa de bacteriemia en pacientes cancerosos. Encontrado en la piel y en la uretra de mujeres sanas. Ha sido identificado como causa de septicemia, osteomielitis y artritis sptica posterior a la reduccin a cielo abierto de una fractura de peron. Posee una cpsula que inhibe la fagocitosis in Vitro y contribuye a la virulencia in vivo.

S. lugdunensis

S. capitis

S. schleiferi

S. pasteuri S. auricularis S. cohnii S. xylosus S. saccharolyticus S. caprae S. pulvereri

Se ha relacionado principalmente con endocarditis de vlvulas naturales y protsicas, con celulitis de la piel y del tejido subcutneo, con peritonitis, con prtesis de cadera infectadas y con abscesos mamarios. Integrante de la flora normal humano, se encuentra alrededor de las glndulas sebceas del cuero cabelludo y de la frente. Recientemente la especie se ha dividido en dos subespecies, S. capitis subespecie capitis y S. capitis subespecie urealyticus. Esta ltima subespecie es ureasa-positiva. Ha sido aislada a partir de varias infecciones humanas, entre ellas empiema cerebral, infecciones de heridas, bacteriemia como complicacin de una ostetis vertebral, infeccin de una prtesis de cadera. La especie ha sido dividida en dos subespecies; los aislamientos humanos se denominan S. schleiferi subespecie schleiferi y los aislamientos caninos reciben el nombre de S. schleiferi subespecie coagulans. Especie que se encuentra en muestras clnicas humanas y animales y en alimentos todava no han sido asociada con procesos infecciosos y es fenotpicamente similar a S. warneri. Esta especie se encuentra en el conducto auditivo externo de los seres humanos y rara vez ha sido implicada en infecciones Esta especie se ha subdividido en dos subespecies denominadas S. cohnii subespecie cohnii y S. cohnii subespecie urealytium. Ambos microorganismos pertenecen a la flora normal de la piel. Este microorganismo se encuentra tanto en seres humanos como en primates no humanos y ha sido implicado como causa de infecciones de las vas urinarias superior e inferior. Esta especie anaerobia, se encuentra en las mucosas humanas. Originalmente aislado de cabras, recientemente se lo ha encontrado en la piel humana y en nuestras clnicas humanas. Especie coagulasa-negativa resistente a la novobiocina, se encuentra en seres humanos y en pollos.

Estafilococos encontrados en otros animales. Especie S. intermedius S. hyicus S. choromogenes S. sciuri S. gallinarum S. lentus S. equorum S. delphini S. felis S. muscae S. piscifermentans S. vitulus Comentarios. Hallado como integrante de la flora de los perros, los hurones, los caballos y los gatos, pueden producir infecciones cutneas, urinarias, seas y del sistema nervioso central en varias especies animales Encontrado en cerdos, ganado vacuno y leche de vaca. Produce infecciones cutneas en el ganado vacuno. Se encuentra normalmente en roedores y otros mamferos pequeos, fundamentalmente ardillas. Esta especie se encuentra en aves de corral y no es patgena. Forma parte de la flora normal de las ovejas y las cabras. Una rara especie equina de importancia patgena indeterminada. Especie coagulasa-positiva que produce lesiones cutneas purulentas en delfines. Produce otitis, cistitis, abscesos, heridas y otras infecciones cutneas en gatos. Se encuentra como integrante de la flora transitoria de la superficie corporal de las moscas que viven en establos de vacas pero que no se ha encontrado en moscas que habitan en residencias humanas. Se encuentra en peces, en productos de pescados fermentados y en pur de soja. Se encuentra como parte de flora de los caballos, los ratones campestres y las ballenas piloto.

Otras especies de estafilococos (en su mayora de origen animal).2 Especie S. carnosus S. caseolyticus S. kloosii S. arlettae Comentarios Utilizado como cultivo iniciador en el procesamiento de productos crneos como el salame y salchicha., Especie saprfita encontrada en la leche y otros productos lcteos y como parte de la flora del ganado vacuno y las ballenas. Encontrado en mamferos, es de importancia clnica y ubicacin taxonmica inciertas. Encontrado en mamferos y aves, es de importancia clnica y ubicacin taxonmica inciertas.

INTOXICACIN ALIMENTARIA ESTAFILOCCINA.

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Koneman, et al. Diagnstco Microbiolgico Texto y atlas a color. Quinta edicin. Editorial Medica Panamericana.

La intoxicacin alimentaria ms comn est causada por el coco Gram positivo Staphylococcus aureus. Este organismo produce varia enterotoxinas que secreta al medio circulante o alimento; si se come el alimento que contiene la toxina, en el plazo de 1-6 horas se observan severas reacciones que incluyen nuseas, con vmitos y diarreas. Se han identificado seis tipos de enterotoxinas de S. aureus: A, B, C1, C2, D y E. La enterotoxina A es la ms frecuentemente est asociada a los brotes de intoxicacin alimentaria estafiloccica. El mecanismo de accin de la enterotoxina A es el de un superantgeno e implica la estimulacin sistmica de un gran nmero de clulas T. La enterotoxina A de S. aureus es un pptido pequeo, de peso molecular 30.000 Dalton, codificado por un gen cromosmico. La clonacin y secuenciacin de este gen, el gen entA, y de varios otros genes de enterotoxinas de S. aureus, muestra que esta familia de toxinas estn relacionadas genticamente. Las clases de alimentos ms comnmente implicadas en las intoxicaciones alimentarias son los productos cocidos al horno y rellenos de crema pastelera o de nata, las aves, la carne y los productos crnicos, las salsas, las ensaladas con huevo y carne, los flanes y los alios con nata para ensaladas. Si estos alimentos se mantienen en el frigorfico despus de ser preparados, permanecen relativamente seguros ya que S. aureus es incapaz de crecer a bajas temperaturas. Sin embargo, con frecuencia esta clase de alimentos no se refrigeran y frecuentemente se mantienen en cocinas calientes o al aire libre, durante meriendas campestres. Bajo estas condiciones Staphylococcus, que pueden haber llegado al alimento desde un manipulador de alimentos, durante su preparacin, crece y produce enterotoxina. Muchos de los otros alimentos implicados en intoxicaciones alimentarias no se vuelven a cocinar de nuevo antes de comerlos, pero incluso si se cocinan, la toxina es relativamente termoestable y puede permanecer activa. La intoxicacin alimentaria estafiloccina puede evitarse con cuidados mtodos higinicos o almacenando los alimentos a bajas temperaturas para evitar el crecimiento microbiano, y eliminando todos los alimentos que hayan permanecido durante algunas horas a temperatura superior a 4 grados centgrados.3 CURVA DEL CRECIMIENTO BACTERIANO La curva del crecimiento bacteriano resulta de la representacin grfica de la determinacin peridica del nmero de clulas viables por mililitro que existen en un lquido inoculado con clulas microbianas provenientes de un cultivo que ha crecido previamente hasta la saturacin. Dicha curva se divide en seis fases, mismas que se simbolizan con letras de la A a la F. A continuacin se muestra un cuadro con las caractersticas principales de cada fase y se desarrollan las ms importantes. Parte de la Curva A B C D E F A: Fase de Rezago. Este periodo consiste en la adaptacin de las clulas microbianas a su nuevo ambiente. En esta fase, las clulas microbianas se encuentran empobrecidas en cuanto a metabolitos y enzimas, esto debido a las condiciones desfavorables que representaba el cultivo previo. Por lo anterior, en este lapso de tiempo se forman las enzimas y los metabolitos intermedios hasta alcanzar las concentraciones necesarias para reiniciar el crecimiento. Este periodo se puede prolongar en el caso de que el medio de cultivo previo y las condiciones actuales resulten tan diferentes que las clulas sean genticamente incapaces de sobrevivir, por lo que slo unas cuantas mutantes podrn subsistir, y obviamente se requerir ms tiempo para que stas se multipliquen lo suficiente y sea notorio el aumento de clulas. C: Fase Exponencial. Como el nombre lo indica, en esta fase las clulas se encuentran en un estado de crecimiento sostenido. Se sintetiza nuevo material celular a una tasa constante, pero ste material es en s cataltico y la masa aumenta de manera exponencial. Lo anterior continua hasta que uno o ms nutrimentos se agoten, o hasta que se acumule tal cantidad de metabolitos txicos que se inhiba el crecimiento. El nutrimento limitante para los organismos aerobios suele ser el oxgeno: cuando la concentracin bacteriana es de aproximadamente 1 x 107/ml es necesario incrementar el ingreso de oxgeno mediante agitacin o burbujeo; pero cuando la concentracin alcanza 4 o 5 x 109 bacterias por ml, la tasa de difusin de oxgeno no puede satisfacer las demandas aun en un medio aireado, por lo que el crecimiento disminuye progresivamente.
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Fase Rezago Aceleracin Exponencial De retraso Estacionaria mxima Declinacin

Tasa de Crecimiento Cero Creciente Constante Decreciente Cero Negativa (muerte)

Brock. Biologa de los Microorganismos. Octava edicin. Editorial Prentice Hall.

Durante el crecimiento exponencial, la tasa de crecimiento de las clulas (medida en gramos de biomasa producida por hora), cuando el crecimiento no es limitado por los nutrimentos, se puede obtener multiplicando la constante de la tasa de crecimiento (k) por la concentracin de biomasa. La constante de la tasa de crecimiento es la tasa a la cul las clulas producen ms clulas, y el valor que esta toma se interpreta como los gramos de biomasa producidos por cada gramo de biomasa preexistente creados en una hora. El crecimiento se denomina exponencial porque la biomasa se incrementa exponencialmente con respecto al tiempo. De lo anterior se deriva que, si graficamos el logaritmo de la concentracin de la biomasa (o celular) en funcin del tiempo, como ocurre en la curva del crecimiento, obtendremos una lnea recta como representacin de esta fase. Esta fase puede prolongarse indefinidamente si las clulas se transfieren repetidamente a un medio nuevo (fresco) de composicin idntica al anterior, lo cual se logra de manera automtica mediante dos aparatos: el quimiostato y el turbidostato. E: Fase Estacionaria Mxima. Como se explic en la descripcin de la fase anterior, ante el agotamiento de nutrimentos en el medio o la acumulacin de metabolitos txicos el crecimiento cesa por completo despus de un periodo de decrecimiento en la tasa de crecimiento, lo cual corresponde a la fase D o de retraso. No obstante, por lo general en esta fase se puede observar recambio celular, lo cual se debe a que, aunque existe una prdida lenta de clulas por muerte, dicha prdida se compensa exactamente por la formacin de nuevas clulas a travs de crecimiento y divisn. As, la cifra de clulas viables se mantiene constante, aunque en realidad en el conteo aumente poco a poco el nmero de clulas, si se cuentan tambin las muertas. Para comprender lo anterior debemos considerar que, para una clula microbiana, muerte significa la prdida irreversible de la capacidad para reproducirse (crecer y dividirse), lo cul se comprueba cuando una clula es incapaz de producir una colonia en cualquier medio. De lo anterior se deriva que designar a una clula microbiana como muerta no implica su destruccin fsica. La duracin de esta fase depende de la naturaleza del microorganismo y de las condiciones del medio. F: Fase de Declinacin. Esta fase, tambin conocida como fase de muerte, representa el decremento de clulas debido al aumento progresivo de la tasa de mortalidad, misma que tarde o temprano alcanza un valor sostenido. Por lo general, una vez que la mayora de las clulas ha muerto, la tasa de mortalidad disminuye bruscamente, por lo que un nmero pequeo de sobrevivientes pueden persistir en cultivo por meses o aos. Dicha persistencia puede deberse a que las clulas consiguen crecer gracias a los nutrimientos liberados por las clulas que mueren y se lisan, observndose recambio celular.4 MEDIOS DE CULTIVO Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que en concentraciones adecuadas y en condiciones fsicas ptimas, permiten el crecimiento de los microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiologa por lo que un control en su fabricacin, preparacin, conservacin y uso, asegura la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. Clasificacin de los medios de cultivo En los laboratorios de microbiologa se utilizan diferentes tipos de medios de cultivo que pueden ser preparados en forma lquida o en forma slida. Usualmente para preparar un medio slido se parte de un medio lquido al que se le aade un agente solidificante como el agar, la gelatina o la slicagel. Los medios de cultivo se pueden clasificar de acuerdo a la naturaleza de sus constituyentes en:

Medios naturales o complejos: constituidos por sustancias complejas de origen animal o vegetal, las que son usualmente complementadas por la adicin de minerales y otras sustancias. En ellos no se conocen todos los componentes ni las cantidades exactas presentes de cada uno de ellos. Medios definidos o sintticos: son los medios que tienen una composicin qumica definida cualitativa y cuantitativamente. Generalmente se usan en trabajos de investigacin. (Para bacterias como: Echerichia coli y Leuconostoc citrovorum)
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Brooks, et. al., Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a ed.

De acuerdo al uso del medio de cultivo, stos se clasifican en:

Medios de enriquecimiento: son medios lquidos que favorecen el crecimiento de un tipo de microorganismo en particular. Permiten aumentar el nmero de microorganismos de ese tipo. Usualmente contienen una o ms sustancias inhibidoras del crecimiento de los microorganismos con excepcin de los que se quieren cultivar. Un medio de enriquecimiento se utiliza para aislar un tipo particular de microorganismo a partir de una poblacin mixta de gran tamao. Por ejemplo, las bacterias formadoras de endosporas pueden aislarse hirviendo una muestra de suelo y cultivando los supervivientes. Solamente las endosporas resistirn el tratamiento y podrn crecer. Las bacterias lijadoras de nitrgeno pueden seleccionarse cultivando el inculo de suelo en un medio libre de nitrgeno, donde slo ellas podrn crecer porque obtienen el nitrgeno de la atmsfera. Los eclogos microbianos usan frecuentemente medios de enriquecimiento. Por ejemplo, para encontrar un microorganismo que degrade un determinado compuesto qumico txico, se puede inocular la muestra de suelo en un medio en el cual la nica fuente de carbono sea dicho compuesto. El microorganismo que prospere en l podr ser utilizado en biorremediacin. Medios selectivos: son parecidos a los de enriquecimiento, se diferencian por ser medios slidos y estn diseados para el aislamiento de microorganismos especficos. Un medio selectivo favorece el crecimiento de ciertos microorganismos, mientras suprime el crecimiento de otros. Los medios selectivos se utilizan para aislar especies particulares a partir de una mezcla compleja. Por ejemplo, se utiliza un medio selectivo, para aislar Salmonella typhi, agente causal de la fiebre tifoidea, a partir de heces donde existen cientos de microorganismos diferentes. Algunos medios son selectivos porque contienen un producto qumico, como la azida sdica, el telurito potsico o el cristal violeta, que inhiben el desarrollo de algunos microorganismos pero no de otros. El agar SPS (denominado de esta forma porque contiene sulfadiacina y sulfato de polimixina) se utiliza para identificar Clostridium botulinum, agente causal de una grave intoxicacin alimentara. El medio SPS permite el crecimiento de esta bacteria, pero inhibe el de otras especies de Clostridium. otros medios de cultivo selectivos utilizan un valor extremo de pH o una fuente de carbono poco comn. Medios diferenciales: son medios que contienen indicadores de productos derivados de la actividad microbiana de los microorganismos. No contienen ningn tipo de sustancia con actividad antimicrobiana. Permiten revelar caractersticas fisiolgicas de los microorganismos. Se utiliza un medio diferencial para identificar las colonias de un determinado microorganismo. Por ejemplo, para identificar Streptococcus pyogenes, la bacteria que causa la escarlatina, se utiliza el medio de agar sangre es un agar que contiene hemates. Las colonias de esta bacteria muestran a su alrededor una zona transparente debido a que producen hemlisis (muerte y lisis de los hemates). Escherichia coli y las bacterias relacionadas con ella se identifican en medios con un indicador de pH porque originan productos metablicos cidos, que cambian el color del indicador y por tanto de sus colonias. Medios selectivos-diferenciales: Algunos medios son selectivos y diferenciales al mismo tiempo. El agar MacConkey es un ejemplo de medio selectivo-diferencial, utilizado para detectar cepas de Salmonella y Shigella, bacterias entricas (del intestino) que causan disenteras. Cualquier muestra de heces enviada al laboratorio esta plagada de bacterias pertenecientes a muchas especies. El agente selectivo del MacConkey acta como una especie de tamiz grosero que disminuye el campo de identificacin. El cristal violeta y las sales del medio inhiben el crecimiento de la mayora de las bacterias Gram positivas (Salmonella y Shigella son Gram negativas). A partir de aqu, el componente diferencial del medio, en este caso la lactosa, comienza a ser importante. Salmonella y Shigella no fermentan la lactosa, pero la mayor parte de las enterobacterias s lo hacen. Por tanto, las colonias de estas dos bacterias sern rojas, mientras que las restantes no lo sern.

Por su composicin los medios de cultivo se clasifican en:

Lquidos: conocidos como caldos, estos son especialmente tiles para hacer diluciones, para homogenizar mezclas de microorganismos, para enriquecer cultivos y para rehidratar cepas liofilizadas. Slidos: Para separar microorganismos y favorecer el desarrollo de las colonias aisladas en las que es posible observar las caractersticas tpicas de un solo tipo de microorganismo. Semislidos: Son aquellos medios lquidos a los que se adiciona agar en concentraciones de 0.4 a 0.8%. Estos se emplean para determinar la movilidad de los microorganismos microaeroflicos.

Los medios de cultivo se pueden preparar en el laboratorio a partir de cada uno de sus constituyentes bsicos o por simple rehidratacin de productos asequibles comercialmente (medios de cultivo deshidratados). Generalmente se prefiere el uso de los medios de cultivo deshidratados porque, adems de simplificar el trabajo, con ellos se tiene mayor probabilidad de obtener resultados reproducibles. Para su preparacin se deben tener en cuenta los siguientes aspectos: Prepararlos slo a partir de productos que provengan de fabricantes o proveedores que suministren productos de calidad.

 Utilizar agua destilada o desmineralizada con una calidad microbiolgica y fisicoqumica adecuada.

Utilizar materiales de vidrio bien lavados y enjuagados con agua destilada o desmineralizada.
Controlar el tiempo y la temperatura recomendada durante su esterilizacin. Nunca se deben exceder las condiciones sealadas por el fabricante. Almacenamiento de los medios de cultivo: Los medios de cultivo deshidratados se deben almacenar en envases sellados bajo las condiciones que seale el fabricante. Generalmente se almacenan en un lugar fresco (entre 15 y 25), con poca humedad y protegidos de la luz solar di recta. Nunca se deben almacenar cerca de autoclaves, hornos, ni otra fuente de calor o vapor; Los medios de cultivo deshidratados se deben descartar cuando se hidraten o decoloren. Una vez que el medio de cultivo ha sido preparado y esterilizado se debe almacenar entre 2 y 8C, a menos que el medio requiera alguna condicin diferente. Se deben mantener en recipientes bien cerrados para evitar su deshidratacin. Cuando se usa tapn de algodn se debe colocar por encima una envoltura de papel (Craft).5 MEDIOS DE CULTIVO UTILIZADOS: MAC CONKEY Medio empleado ampliamente para aislar e identificar selectivamente a enterobacterias como Salmonellas, Shigella y coliformes a partir de heces fecales, orinas, aguas negras y diversos alimentos. Formulacin aproximada en gramos por litro: Peptona de gelatina........................................17.0 Mezcla de peptonas..........................................3.0 Lactosa............................................................10.0 Mezcla de sales biliares......................................1.5 Cloruro de sodio................................................5.0 Agar..................................................................13.5 Rojo neutro.......................................................0.03 Cristal violeta....................................................0.001 Preparacin: Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 10 a 15 minutos y calentar a ebullicin agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 C y vaciar en cajas de Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio. Usos: El espcimen puede sembrarse directamente en la placa por estra superficial, o bien inocularlo en medios lquidos d enriquecimiento, tales como caldo tetrationato, caldo selenito cistina o caldo GN. Incubar placas y caldos a 35C de 18 a 24 horas. Hacer resiembras de estas ltimas en placas de Agar de Mac Conkey y volver a incubar. Se recomienda sembrar simultneamente las muestras en otros medios mas selectivos tales como Eosina y Azul de metileno, Agar SS, Agar Tergitol 7, Agar XLD, Agar Entrico Hektoen, Agar Sulfito de Bismuto, Agar Verde Brillante, especial para Salmonellas. Los grmenes Gram positivos son inhibidos por las sales biliares y el cristal violeta. Las enterobacterias fermentadoras de la lactosa bajan el pH del medio que es detectado por el indicador rojo neutro dando colonias rojas o rosadas. Las no fermentadoras de la lactosa dan colonias transparentes, incoloras o ambarinas. En el Agar MacConkey crecen tambin bacilos Gram negativos que no pertenecen a la familia Enterobacteriaceae, como Pseudomonas y Aeromonas. Asimismo, pueden desarrollarse en nmero reducido colonias puntiformes de Streptococcus fecalis de color rojo y de algunos estafilococos cuyas colonias son pequeas, opacas de color rosa plido. Por ltimo, este medio puede usarse en la diferenciacin de especies de Mycobacterium.
CARACTERSTICAS DE LASA COLONIAS MICROORGANISM O

http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/metodesteril.pdf : Mtodo estril y Medios de cultivo por la Prof. Sofa Gutirrez de Gamboa

Puntiformes, escasas MEDIO BASAL O/F (DE HUGH Y LEIFSON)

rosa

plido,

opacas

y Estafilococos

Para identificar bacilos NO fermentadores de importancia mdica y sanitaria, principalmente El medio Hugh y Leifson se emplea extensamente, junto con otros medios de diferenciacin, para identificar al numeroso grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores de carbohidratos, por medio de las reacciones de oxidacin y/o de fermentacin de los mismos. Estos bacilos predominantemente oportunistas que pueden provocar infecciones intrahospitalarias serias, por ejemplo las causadas por Pseudomonas. Sin duda alguna, una de las pruebas ms importantes para el estudio de los bacilos NO fermentadores de carbohidratos, fue introducida en 1953 por Hugh y Leifson cuyo medio permite conocer si el germen en cuestin oxida, fermenta o no al hidrato de carbono agregado al mismo. Se encontr que el al contenido de peptonas (1%) en los medios usuales utilizados en el estudio de las fermentaciones, producan al ser degradadas, la suficiente cantidad de aminas alcalinas para neutralizar y enmascarar a la pequea cantidad de cidos formados por los microorganismo oxidativos. Bajando la concentracin de peptona al 0.2% se podra determinar si el carbohidrato contenido en el medio era o no atacado por las bacterias en estudio. Los azucares que mas se emplean son la glucosa, lactosa, sacarosa, maltosa, manitol y xilosa. Formula aproximada en gramos por litro: Peptona de Casena.................................2.0 Cloruro de sodio........................................5.0 Fosfato Dipotsico.....................................0.30 Agar............................................................2.5 Azul de Bromotimol.....................................0.03 Preparacin: Suspender 9.8g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia hasta disolucin del material. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 10 ml de solucin de glucosa al 10% esterilizada por filtracin por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir aspticamente a razn de 5 ml por tubo. Si prefiere, puede agregarse directamente 1.0 g del carbohidrato a cada 100 ml del medio 1.0g del carbohidrato a cada 100 ml del medio y esterilizar en autoclave a 118C durante 10 minutos, a fin de evitar la degradacin del azcar. El medio tiene un color verde. Usos: Inocular 2 tubos recientemente preparados, por puncin profunda con el germen en estudio. Si el medio ya tiene cierto tiempo de preparacin, fundirlo en bao Mara para eliminar los gases disueltos. Agregarle a un de los tubos una vez inoculado, una cepa de 4 a 5 mm de petrolato, aceite de parafina o vaspar estriles. No es recomendable el uso de aceite mineral. Incubar ambos tubos a 35% durante 48 horas o mas. Se puede observar la produccin de cido por el cambio al color amarillo del medio, la formacin de gas por la presencia de burbujas, y la movilidad o inmovilidad del microorganismo. Los cambios se aprecian mejor comparando los tubos inoculados con uno que no lo hayas sido, que funcionar como control. Para facilitar la identificacin del grupo de bacilos Gram negativos NO fermentadores, utilizar tambin el Agar Diferencial de Sellers y el Medio del indol Nitrito. Resultados: Color amarillo en ambos tubos con o sin formacin de gas: Carbohidrato fermentado. Degradacin fermentativa. Cambio nicamente en el tubo que no contiene aceite: Oxidacin de azcar. Degradacin oxidativa. Sin cambio en ninguno de los tubos: Microorganismos inertes. El carbohidrato no ha sido fermentado ni oxidado. AGAR SAL Y MANITOL Aislamiento de estafilococos

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Es un medio selectivo muy empleado para aislar estafilococos patgenos de materiales clnicos diversos. Tambin se utiliza en la industria alimenticia con los mismos fines, el aislamiento e identificacin de Estafilococos que se encuentran en la leche y productos lcteos, carnes y derivados crnicos incluyendo conservas de pescado. Formula aproximada en gramos por litro: Extracto de carne......................................1.0 Mezcla de peptonas...................................10.0 Cloruro de sodio........................................75.0 D-Manitol...................................................10.0 Agar............................................................15.0 Rojo de fenol...............................................0.025 Preparacin: Suspender 111g. del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y calentar a ebullicin durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Vaciar en cajas de petri. Usos: La degradacin del manitol con produccin de cido cambia el color del medio, de rosado a amarillo. Debido a su alto contenido de cloruro de sodio, puede hacerse una siembra masiva del material en estudio. Generalmente se incuban las placas unas 36 hrs., apareciendo las colonias de estafilococos no patgenos de tamao pequeo y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patgenos fermentadores del manitol, dan colonias ms grandes y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos no patgenos de tamao pequeo y rodeadas de una zona roja; en cambio, las colonias de estafilococos patgenos fermentadores del manitol, dan colonias ms grandes y rodeadas de una zona amarilla. Si agregamos a cada litro del medio, una yema de huevo en condiciones de esterilidad, los estafilococos, que adems de fermentar el manitol producen lipasa, darn un precipitado amarillento de cidos grasos alrededor de la colonia. Este fenmeno concuerda bastante bien con la propiedad de coagular el plasma que presentan los estafilococos patgenos coagulasa positivos. BASE DE AGAR SANGRE Aislamiento, cultivo y actividad hemoltica de grmenes difciles La base de Agar Sangre es adecuada para aislar y cultivar diversos microorganismos de difcil crecimiento. Al aadir sangre es adecuada para aislar bacilos tuberculosis. Preparacin: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Despus de esto enfriar a 4 50C y aadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estriles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. Tambin es posible inocular el fondo de una caja petri estril con un pequeo inculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50C; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra. En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapn de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estriles Usos: Para el aislamiento del Mycobacterium tuberculosis, la base de agar sangre con 0.1% de glicerol, 2.5% de sangre humana de banco de sangre y 100 unidades de penicilina por mililitro ha dado resultados comparables con los del medio de Lowenstein-Jensen. La base de agar Sangre tambin puede usarse para la preparacin de antgenos. BASE DE CALDO ROJO FENOL Fermentacin de carbohidratos; Medio usado para determinar las reacciones de fermentaciones. Formula aproximada en gramos por litro: Peptona de casena.................................10g Cloruro de sodio........................................5g Rojo de fenol.............................................0.018g pH final 7.4+-0.2 Preparacin:

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Disolver 15 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, agregar si se desea de 5 a 10 g de carbohidratos. Se puede agregar de 0.5 a 1.0 g de agar si el medio va a ser destinada al cultivo de organismos anaerobios. Si se desea investigar la formacin de gases, emplear tubos Durham. Colocar los tubos en un recipiente adecuado y esterilizar de 116 a 118C durante 15 minutos. Usos: El base de caldo rojo de fenol puede usarse en los estudios de fermentacin de muchas especies bacterianas. Los tubos de control sin carbohidratos deben inocularse e incubarse en paralelo con las pruebas de fermentacin. Deben examinarse los cultivos frecuentemente ya que los diferentes carbohidratos pueden ser utilizados a velocidades variables. La aparicin de color amarillo es indicio de fermentacin. Para el cultivo de microorganismos anaerobios, el medio debe estar preparado recientemente o calentarse y enfriarse antes de su uso. AGAR MUELLER HINTON Pruebas de sensibilidad a antibiticos y cultivo de Neisseria En un medio muy rico en nutrientes que se recomienda para el aislamiento y desarrollo de gonococos y meningococos. Tambin se emplea, sobre todo, en las pruebas de sensibilidad (antibiogramas) Formula aproximada en gramos por litro: Infusin de carne de res.......................................300.0 Peptona de casena cida....................................17.5 Almidn.................................................................1.5 Agar.......................................................................17 pH final.................................................................. 7.4 +- 0.2 Preparacin: Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121C por un tiempo no mayor de 15 minutos. Enfriar a 40-45C y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar chocolote, previa adiccin de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en bao Mara a 80C 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningn momento. Usos: Es un medio til para el desarrollo de bacterias del genero Neisseria. Se recomienda incubar las cajas a 35C, en atmsfera de CO2. El medio deber mantenerse hmedo en su superficie; esto puede lograrse si dentro de la jarra, envases de hojalata, frasco de vidrio de boca ancha, etc., se coloca una esponja o algodn hmedo y una vela encendida, cerrando luego hermticamente. Para realizar las pruebas de sensibilidad con sulfonamidas, las cajas deben examinarse despus de 12 a 18 horas de incubacin. Despus de este tiempo se tendrn que revisar peridicamente las zonas de inhibicin ya que el microorganismo puede desarrollar cuando la concentracin del agente antimicrobiano comienza a disminuir. Se obtiene mejores resultados para aislar Neisserias patgenas preparando un agar chocolate con el Mueller Hinton adicionndole a cada 100 ml del medio terminado y fluido 1.0 ml de la suspensin VCN, mas 1.0 ml del polienriquecimiento. AGAR TCBS Para cultivar Vibirios selectivamente; Para el aislamiento selectivo de vibrios patgenos a partir de materiales clnicos, aguas y alimentos. Formula aproximada en gramos por litros: Extracto de levadura......................................5.0 Mezcla de peptonas......................................10.0 Citrato de sodio.............................................10.0 Tiosulfato de sodio........................................10.0 Bilis de buey..................................................5.0 Colato de sodio..............................................3.0 Sacarosa........................................................20.0

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Cloruro de sodio............................................10.0 Citrato de hierro.............................................. 1.0 Azul de timol....................................................0.04 Azul de bromotimol........................................0.04 Agar................................................................14.0 Preparacin Suspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Enfriar entre 45-50C y vaciar en cajas de petri. No esterilizar en autoclave. Usos: Se emplea ampliamente para aislar y cultivar diversas especies del gnero Vibrio que pueden provocar clera, diarreas coliformes e intoxicaciones por alimentos contaminados. Las 2 ltimas afecciones provocadas sobre todo, a partir de diversos pescados y mariscos que se ingieren crudos o semicudos y que pueden ser causadas por Vibrio parahemolyticus. El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las Enterobacterias, incluyendo coliformes y proteus. Los Enterococos son tambin inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferacin de los Vibrios, como el antes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus. El agar TCBS, es altamente inhibitorio para las enterobacterias, incluyendo coliformes y Proteus. Los enterococos son tambin inhibidos en gran parte, de tal manera que se favorece grandemente la proliferacin de los vibrios, como el antes mencionado, el V. Cholerae y el V. Alginolyticus. El material sospechoso, se siembra masivamente por estra superficial y se incuba a 35C, de 18 a 24 horas. Casi todos los vibrios fermentan la sacarosa y dan colonias amarillentas por la produccin de acido. Algunas cepas de Proteus fermentadores de la sacarosa pueden formar colonias amarillentas similares a las de los vibrios.6 AGAR Su composicin es en base de polmero de galactosa y acido poligalacturnico; su fuente es algas marinas (Rodfitas), su enzima catablica es agarasa. El agar nutritivo es usado como medio de cultivo para el crecimiento de bacterias y hongos, pero no para virus (aunque los virus bacterifagos crecen frecuentemente en bacterias cultivadas en agar).7 MEDIO DE STUART Est descrito como un medio de transporte eficaz para la recuperacin y viabilidad de microorganismos como Pneumococo, Strep.pyogenes , N. Gonnorrhoeae,Haemophilus sp. Y otros microorganismos lbiles. Se utiliza tambin para el transporte de muestras de secreciones oculares, ticas, heridas y abscesos. Los microorganismos permanecen viables de 6 das a 8 semanas. Se recomienda para la toma de muestras en sitios estriles. MEDIO DE CARY-BLAIR Se utiliza para el transporte de muestras fecales o raspados rctales para Coprocultivo. Se recomienda este medio, ya que permite el desarrollo de Salmonellas y Shigellas an despus de 49 das a 28C, Vibriones y campylobacter permanecen viables hasta por 22 das a 28C.8 PRUEBAS BIOQUMICAS Prueba de Coagulasa: La coagulasa es una protena de composicin qumica desconocida y que resulta relativamente termoestable, ya que resiste temperaturas de hasta 60C durante 30 minutos; es muy sensible a la accin de enzimas proteoliicas y, como posee una actividad similar a la de la protrombina (que la capacita para convertir el fibringeno en fibrina, an cuando en el medio de reaccin se encuentren ciertas sustancias anticoagulantes), permiten que el infectlogo lo detecte mediante reacciones simples.

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Manual Bioxon, p.p 26, 28, 29, 33, 39, 41, 52 www.wikipedia.org
http://www.lablinsan.cl/productos/page8.html

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En cuanto a su funcin in vivo, sta consiste principalmente en interferir la fagocitosis, debido a que genera la produccin de redes de fibrina alrededor de los microorganismos, impidiendo que el fagocito entre en contacto con ellos para englobarlos; sin embargo, al parecer tambin neutralizar la actividad antimicrobiana que el suero normal manifiesta contra los agentes infectantes. Tocante a su mecanismo de accin, existen evidencias de que la coagulasa puede inducir la activacin de un mecanismo alterno de coagulacin, habilitando a un componente del plasma, denominado factor reactivo de la coagulasa o FRC, para convertir el fibringeno en fibrina. De hecho, se sugiere que la coagulasa es una sustancia muy parecida a la protrombina que, al reaccionar con el FRC, forma un compuesto muy parecido a la trombina. Este paso es el decisivo por que, como es sabido, es la trombina la que activa al fibringeno para formar fibrina en el proceso normal de la coagulacin. De acuerdo a lo anterior, la coagulasa origina la coagulacin del plasma en dos pasos: inicialmente se verifica una reaccin entre la enzima producida por el microorganismo y el FRC y posteriormente, las redes de fibrina son producidas por efecto del complejo formado en el paso anterior. Recordando el proceso que se efecta en la ltima etapa de la coagulacin sangunea en el organismo, es posible relacionar el mecanismo asociado a la enzima estafilococcica Otro aspecto importante en la realizacin de la prueba, radica en la eleccin del plasma que se va a emplear; debe considerarse principalmente su origen, ya que se ha encontrado que algunas cepas presentan resultados positivos con el humano y el de conejo, pero negativos con el bovino. La reaccin se considerar positiva si ocurre cualquier grado de coagulacin visible dentro del tubo. Las bacterias coagulasa fuertemente positiva pueden producir el coagulo dentro de las primeras cuatro horas, razn por la que es recomendable leer el resultado en intervalos de 30 minutos, ya que S. aureus tambin produce fibrinolisinas, y la accin de stas puede destruir el cogulo, provocando la obtencin de resultados falsos negativos cuando se toman lapsos mayores. Otras cepas de S.aureus slo son capaces de producir suficiente cantidad de coagulasa hasta que transcurren cerca de 18 h. Por tal motivo, es conveniente revisar nuevamente a las 24 h los cultivos que en los primeros tiempos se observen como coagulasa negativa. Es importante hacer notar que, a mayor virulencia de la cepa analizada, menor ser el tiempo en que la prueba ser positiva. En el laboratorio, la prueba de coagulasa se utiliza ms comnmente para diferenciar al Staphylococcus aureus (coagulasa positivo) de otros Staphylococcus. Principio La coagulasa se halla presente en dos formas, libre y fija, cada una de las cuales posee diferentes propiedades que requieren el uso de tcnicas de determinacin diferentes: Coagulasa fija (prueba en portaobjetos): la coagulasa fija est unida a la pared celular bacteriana. Los hilos de fibrina formados entre las clulas suspendidas en plasma (que contiene fibringeno) provocan su aglutinacin, indicada por la presencia de agregados visibles en el portaobjetos. Coagulasa libre (prueba en tubo): la coagulasa libre es una enzima extracelular que se halla presente en los filtrados de cultivos. Cuando una suspensin de bacterias productoras de coagulasa se mezcla en partes iguales con plasma en un tubo de ensayo, se forma un cogulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade trombina. Medios y reactivos Plasma coagulasa (Difco, o BBL) Cultivo de Staphylococcus de 24 horas en un agar nutriente o caldo nutriente. Procedimiento Prueba en portaobjetos Colocar una gota de agua destilada sobre un portaobjetos Emulsionar suavemente el organismo en estudio en la gota de agua de manera de obtener una suspensin cargada homognea. Agregar una gota de plasma reconstituido junto a la gota de la suspensin del m.o. Mezclar bien con el asa. Inclinar el portaobjetos hacia uno y otro lado, observando la formacin inmediata de un precipitado granular o de grumos blancos. Prueba en tubo Colocar aspticamente 0,5 ml de plasma reconstituido en el fondo de un tubo estril. Aadir 0,5 ml de cultivo de 24 horas (o suspensin en suero fisiolgico de un cultivo en placa).

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Mezclar por rotacin el tubo, evitando remover o agitar el contenido. Colocar en bao de agua a 37C y observar cada hora hasta 4 horas y luego a las 24 horas, la formacin de un cogulo visible.

Interpretacin Prueba en portaobjetos: una reaccin positiva se detecta usualmente en 15 a 20 segundos por la aparicin de un precipitado granular. La prueba se considera negativa si no se observa aglutinacin en 2 a 3 minutos. Esta prueba es solo presuntiva y todos los cultivos que den resultados negativos o positivos tardos deben verificarse mediante la prueba en tubos ya que algunas cepas de Staphylococcus aureus no producen coagulasa fija. Prueba en tubos: 1+: pequeos cogulos no organizados. 2+: pequeos cogulos organizados. 3+: gran cogulo organizado. 4+: todo el contenido aparece coagulado y se mantiene cuando se invierte el tubo. Se consideran positivos los grados 3+ y 4+ Controles

Positivo: S.aureus Negativo: S.epidermidis:

Prueba de catalasa La catalasa es una enzima que descompone al peroxido de hidrgeno (H 2O2) en oxigeno y agua. Qumicamente es una hemoproteina bastante similar a la hemoglobina lo estn en estado reducido (Fe++). Exceptuando a los estreptococos y a gardnerella vaginalis, las bacterias aerobias y facultativas poseen esta enzima, no as la mayora de las anaerobias que, con el objetivo de llevar a cabo la degradacin del mismo sustrato, producen la peroxidasa. Dentro del laboratorio de Bacteriologa, la prueba de la catalasa se utiliza generalmente para diferenciar al gnero Streptococcus (-) del Staphylococcus (+) y, con menor frecuencia, para hacerlo entre las especies de bacilos Gram positivos y entre las micobacterias. Para llevarla acabo es necesario disponer, por un lado, de una solucin de perxido de hidrgeno al 30 % y por otro, de un cultivo puro de 18-24 h del microorganismo por probar, contenido en una caja de Petri o bien en tubos de ensayo exentos de sangre, toda vez que los eritrocitos poseen esta actividad enzimtica. El procedimiento ms sencillo y rpido incluye el uso de un portaobjetos, en el cual se colocan, primeramente, una asada del microorganismo y posteriormente, se vierten sobre sta una o dos gotas de la solucin que est en contacto con las clulas, se empiecen a notar burbujas ocasionadas por el O2 que se desprende. 9 Prueba de oxidasa Esta prueba sirve para determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo (Vibrio fetus), pero los anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. Asimismo, la presencia de oxidasa va ligada a la produccin de catalasa, ya que sta degrada el perxido de hidrgeno que se produce como consecuencia de la reduccin del oxgeno y cuya acumulacin es txica. La prueba de la oxidasa se usa sobre todo para

Identificar todas las especies de Neisseria (+) Diferenciar Pseudomonas de los miembros oxidasa negativos de las enterobacterias.

Manual de practicas Bacteriologa; Q.F.B. R. Garza Velasco; departamento de Biologa; facultad de Qumica, UNAM. p.p 7-21

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El reactivo de la oxidasa ms recomendado es la solucin acuosa al 1% de diclorhidrato de tetrametil- p-fenilendiamina (reactivo de Kovacs). Es menos txico y mucho ms sensible que el correspondiente compuesto dimetilo (reactivo de Gordon y McLeod), pero es ms caro. Este reactivo tie las colonias oxidasa positivas de color lavanda que vira gradualmente a prpura-negruzco intenso. Realizacin de la prueba:

1.

1.

Mtodo en placa directa Agregar directamente 2-3 gotas de reactivo a algunas colonias. No inundar toda la placa y no invertirla. Observar los cambios de color. Con el reactivo de Kovacs la reaccin se produce en unos 10-15 segundos, mientras que con el de Gordon y McLeod es dentro de los 10-30 minutos. Mtodo indirecto sobre papel Colocar un trozo de papel de filtro de 3x3cm aproximadamente en una placa de Petri. Agregar 2-3 gotas del reactivo de Kovacs en el centro del papel. Extender con el asa de siembra una colonia sobre el papel impregnado. La reaccin de color positiva se produce a los 5-10 segundos. 10

TINCIN DE GRAM La tincin de Gram es usada para clasificar bacterias sobre la base de sus formas, tamaos, morfologas celulares y reaccin Gram (color). A nivel del laboratorio es til como test para un rpido diagnstico presuntivo de agentes infecciosos, tanto en muestras como en cultivos en crecimiento, y adicionalmente sirve para valorar la calidad de la muestra clnica. Las bacterias se tien gram positivas (+), gram negativas () o no se tien debido a sus diferencias en la composicin de su pared y arquitectura celular. Las bacterias gram (+) tienen una gruesa capa de pptidoglucano y gran cantidad de cidos teicicos que no son afectados por la decoloracin con alcohol y/o acetona, reteniendo el colorante inicial acomplejado con iodo y visualizndose en distintos grados de tonos desde el violeta al azul claro, dependiendo de si la naturaleza de su pared celular est intacta o daada (por tratamientos antibiticos, edad celular). Las bacterias gram () tienen en su pared celular una delgada capa de peptidoglucano ligada a una membrana externa por molculas de lipopolisacridos. Esta membrana externa es daada por el alcohol y/o acetona de la decoloracin, permitiendo que el primer colorante acomplejado con iodo escape y sea reemplazado por el contracolorante. Clsicamente los reactivos utilizados para la realizacin de la tincin de Gram han sido el cristal violeta como colorante inicial, la solucin de lugol para acomplejar a ste, el alcohol y/o acetona para la decoloracin y la safranina o fucsina bsica como contracolorante. Existen una serie de puntos con respecto a un buen control de calidad de las tinciones de Gram, y que deben ser tenidas en cuenta antes de su realizacin, a saber: Diariamente se debe comprobar que no existen precipitados ni cristales en la solucin de cristal violeta. Si los hay, filtrar antes de su uso. La estabilidad de la solucin de cristal violeta, alcohol y/o acetona, safranina o fucsina bsica es de 1 ao y la de la solucin de lugol de 6 meses, todas ellas conservadas en frascos cerrados (la evaporacin puede alterar su efectividad) a temperatura ambiente. Cada nuevo lote, aunque lo recomendable sera diariamente, preparar tinciones con cepas de coleccin de E.coli, S.aureus o S.epidermidis para comprobar los resultados esperados. Ciertos procedimientos de laboratorio pueden dificultar la interpretacin microscpica de la tincin, como son la preparacin de extensiones demasiado gruesas, uso de portas que no han sido prelavados o desengrasados, sobrecalentamiento en la fijacin y excesivos lavados durante la tincin. Todos los anteriores son causas comunes de pobres resultados en la tincin de Gram. Debe tenerse en cuenta que no todos los microorganismos observados en una tincin pueden ser cultivados, y al contrario, algunos no observados pero presentes consiguen ser recuperados en el cultivo. Supervisin diaria de unas cuantas tinciones elegidas al azar por personal especializado, para confirmacin de coincidencias y posibles discrepancias. Otras consideraciones importantes que deben ser revisadas e inspeccionadas por microscopa tras la realizacin de la tincin son:

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http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/oxidasa.htm

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 Como

regla para evidenciar una buena decoloracin, y teniendo en cuenta la fuente de la muestra, el fondo de la tincin deber ser claro o ligeramente gram (-). Si hay leucocitos se observarn completamente gram (-), y si hay levaduras tipo Candida completamente gram (+). Para una buena interpretacin de la tincin, el grosor de la extensin no debe permitir que aparezcan ms de 2 clulas solapadas unas encima de otras.

Examinar

la tincin en busca de evidencias de inflamacin (clulas polimorfonucleadas, clulas mononucleadas y/o hemates). La presencia de clulas epiteliales, bacterias de la flora, restos alimenticios, segn el producto patolgico que estemos observando, pueden indicar una mala obtencin de ste. signos de inflamacin de pacientes inmunocompetentes, que en aquellas en donde no se observen stos. Si no se detectan se indicar como No se observan microorganismos. Si se observan, se informar su nmero relativo, el tipo de microorganismo y su reaccin gram. Se debe ser cuidadoso al informar si solo se observa 1 muy pocos (especialmente si no existen signos de inflamacin), ya que los recipientes de recogida de muestras, los portas y algunos cultivos pueden contener bacterias no viables ni significativas pero contaminantes que nos aparecern en la tincin.

Inspeccionar distintas reas de la tincin en busca de microorganismos. Prestar ms atencin en aquellas tinciones con

En cuanto a la reaccin gram y caractersticas morfolgicas de los microorganismos visualizados, estas son: Gram:

Positivo: de violeta fuerte a azul claro. Negativo: rosa o rojo (en el caso de carbol-fucsina el rojo ser intenso). Variable: microorganismos parcialmente positivos y negativos. Puede ser debido a una mala extensin, fijacin o tincin, presencia de clulas viejas, dao en la pared celular o por particularidades especiales de la pared celular de ciertos microorganismos. Neutro: no toman ningn color, siendo generalmente el fondo alrededor de ellos de un ligero gram (-). Los microorganismos pueden ser intracelulares. Esta reaccin gram ha sido vista en tinciones de muestras clnicas en donde estn presentes elementos fngicos o algunas especies de micobacterias. Otras caractersticas: a examinar en el gram son si la tincin de los microorganismos es homognea, bipolar, en cuentas o gotas, punteada, en barras o irregular.

Formas:

Totales: cocos, cocoides, cocobacilares, bacilos, filamentosos (ramificados o no) y levaduriformes. Extremos: redondeados, afilados, romos, en forma de palo de tambor o inflado (por vacuolas, esporas, acmulos de cualquier naturaleza) y cncavos. Lados: paralelos, ovoides, cncavos e irregulares. Eje mayor: recto, curvado o en espiral. Pleomorfismos: variacin en la forma de un mismo conjunto de microorganismos. Ocurre en algunas especies de difteromorfos, Bacteroides spp., filamentosos ramificados (Actinomyces spp,), por tratamientos antibiticos.

Tamaos:

teniendo en cuenta que el tamao medio de un hemate es de 7 mm y el de los grnulos citoplasmticos de los leucocitos polimnorfonucleares son de 0,2-0,3 mm: Totales: minsculo (< 0,3 mm), pequeo (0,3-0,5 mm), medio y grande. Longitud: corto (0,5-1 mm), medio, largo y filamentoso (10-30 mm). Anchura: delgado, medio y grueso. Pleomrficos: variacin en el tamao de un mismo conjunto de bacterias.

Caractersticas agrupacionales:
TOMA DE MUESTRA

microorganismos aislados, en pares, en cadenas, ttradas, en grupo o arracimados, en empalizada, en letras chinas, empaquetados, en formas angulares tipo V o L .11

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http://www.a14.san.gva.es/labm/gram.htm

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Consideraciones generales para la toma de muestra: 1. Debemos saber QUE vamos a tomar como muestra (esputo, sangre, etc.) 2. PORQUE vamos a tomar la muestra (con fines de diagnostico, investigacin) 3. COMO vamos a tomar la muestra (puncin, raspado, etc.) 4. DONDE vamos a tomar la muestra (piel, faringe, etc.) 5. CUANDO vamos a tomar la muestra (ayuno, etc.) Caractersticas de una muestra: Ser obtenida del lugar donde asiente la patologa. Generalmente tomada de los bordes de la lesin. Ser cualitativamente optima para su estudio. Alcanzar cuantitativamente un volumen razonable En la mayora de los casos ser de emisin reciente. En algunos casos haber sido obtenida cuando el paciente esta atravesando determinadas instancias evolutivas de su patologa. Obtenida siguiendo criterios anatmicos y funcionales. Perfectamente envasada, evitando recipientes que potencialmente puedan producir contaminaciones accidentales. Enviada inmediatamente al laboratorio para su estudio o si tiene que transcurrir algn tiempo ser enviada en recipientes especiales o en medios de cultivo de transporte. Obtenida con material esterilizado y en condiciones de asepsia.

Procedimiento para la toma de muestras: Instrucciones generales y especficas a seguir para lograr una buena toma de muestras. La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento con antimicrobianos, ya que este interfiere en la observacin directa del germen, as como en posterior aislamiento del mismo en los medios de cultivo. La toma de muestras debe realizarse en los lugares donde sea ms probable es encontrar el microorganismo con la menor contaminacin externa posible. Recoger la muestra en el estadio de la enfermedad ms apropiado. Las muestras deben recoger es cantidades suficientes para permitir un examen completo; deben colocarse en recipientes estriles y remitirse lo ms pronto posible el laboratorio. Es un requisito indispensable que el laboratorio recibe la suficiente o tcnicas adecuas. El personal debe rechazar las muestras que no se han recogido de forma adecuada y los especialistas deben apoyar esta actitud. Recordando: La toma de muestras debe realizarse antes de iniciar el tratamiento antimicrobiano. Es muy importante seguir las normas necesarias para evitar la contaminacin externa. La cantidad debe ser suficiente y es fundamental que se utilice un recipiente.

Clasificacin de la toma de muestras: Se clasifican en:

1. 2. 3. 4.

MUESTRAS SUPERFICIALES MUESTRAS DE CAVIDADES MUESTRAS ESPECIALES. MUESTRAS ESPECFICAS

1) MUESTRA SUPERFICIALES: Aqu consignamos a las muestras de la piel, pelo, uas.

PIEL: Tenemos dos posibilidades de obtener la muestra, ya sea procediendo a alzar a los grmenes con el asa
bacteriologa, por simple raspado ligero o con la ayuda de bistur proceder a raspar algo energticamente los bordes de la lesin, de manera no solo obtendremos los microorganismos sino tambin las capas superficiales de la piel, esto es provechoso en el caso de ciertas determinaciones. Finalmente puede ser que en determinados casos se pretenden ndulos los cuales estn por debajo de la piel, siendo ms palpable que visibles; en este caso procedemos tambin a raspar con el bistur el lugar de la lesin llegando hasta el ndulo de manera que una vez obtenida la pulpa, esta puede ser procesada y as llegar a observar al microbio. PELO: Tambin hay dos posibilidades, la primera cuando los grmenes se hallan localizados en el folculo piloso, en este caso ser suficiente proceder a raspar la regin con el asa bacterol6gca previo de la zona con agua destilada, tambin se podr arrancar el pelo a fin de aislar al germen a partir del folculo piloso.

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La segunda posibilidad se vera cuando el tallo del pelo este atacado (micosis) en esta situacin proceder acortar el pelo para su observacin o posterior procesamiento en cultivo. UAS: Se utilizan dos tcnicas, de acuerdo al sitio atacado. La primera se utiliza cuando la lesin asienta en el lecho ungueal, en esta tcnica desplazamos el asa bacteriolgica, previo lavado de la regin con agua destilada por el lecho ungueal con un solo trazo firme y seguro. Si la ua se halla atacada por microorganismos (hongos) entonces procedemos a cortar ayudados de un bistur a fin de continuar luego con el cultivo y el diagnostico a travs de la microscopia.

1)

MUESTRA DE CAVIDADES: Consignamos las muestras de mucosas, conducto auditivo externo, esputo, orina, heces fecales.

MUCOSAS.- El instrumento que sirve de como denominador en la obtencin de estas muestras es el hisopo, es
decir un aplicada de madera que posee es uno de sus extremos un engrosamiento de algodn y que obviamente debe ser esterilizado. Si vamos describiendo las mucosas de arriba hacia abajo, encontramos lo siguiente: MUCOSAS CONJUNTIVAL.- Usamos un hiposo estril aunque algunas escuelas prefieren utilizar el asa bacteriolgica, luego ubicamos la conjuntiva infectada o aquella que presente mayor exudado si la muestra a nivel del ngulo interno del ojo afectado. El hisopado debe ser cuidadoso y suave para ri producir mayor traumatismo. MUCOSA NASAL.- De igual forma utilizamos un hisopo si la lesin es visible a simple vista procedemos entonces a obtener la muestra, si la lesin es mucho ms interna. Entonces ser necesario que un especialista la obtenga con instrumental que nosotros ya no poseemos. Hay otras oportunidades en que es preciso utilizar un cincel delgado y largo que podemos fabricar a partir de un sujetador de papel (clip) el cual es convertido en alambre rectilneo y posteriormente aplastando uno de los extremos obtendremos un pequeo cincel, con el cual y una vez esterilizado procedemos a raspar lesiones sospechosas. MUCOSA ORAL.- En esta cavidad es sencillo tomar cualquier nuestra pues tenemos gran visibilidad All podemos observar donde se localizan una lesin y posteriormente utilizando el hisopo llevar a cabo la toma de muestra. Por otra parte para fines de investigacin podemos escoger cualquier segmento de la mucosa oral puesto, que esta posee una flora variada de microorganismos. MUCOSA GENITAL FEMENINA.- Aun debemos considerar dos posibilidades ms y son aquellas que se presentan en el caso de una mujer con himen intacto y otra que haya tenido contacto sexual. En la mujer con himen intacto tan solo debemos esperar que las secreciones se viabilicen al exterior para as ser obtenidas. En la mujer desflorada utilizaremos el especulo es decir dos valvas que una vez introducidas en el canal vaginal pueden ser separadas a voluntad, brindndonos de esta forma un campo de accin y observacin ideales luego procederemos a hisopar las regiones escogidas, haciendo hincapi en las vecindades del orificio cervical externo, pues all se acumularan las secreciones.

3) MUESTRAS ESPECIALES.

ESPUTO.- El esputo es la coleccin de secreciones patolgicas provenientes del rbol traqueo-bronquial. La

muestra podemos obtenerla a travs de diferentes tcnicas, entre las cuales citaremos las ms importantes: que pueden entender y aplicar las instrucciones que se les d. Entregamos al paciente un recipiente especial para esta muestra y le indicamos que al despertara proceda a realizar un enjuague bucal con un antisptico, luego debe proceder a expectorar directamente dentro de recipiente, llegando a acumular por lo menos tres esputos (flemas). Posteriormente se sierra hermticamente el envase y deber ser enviado a laboratorio debidamente rotulado (nombre completo, edad y sexo) adems de la numeracin correspondiente y fecha. Lavado gstrico: Esta tcnica se prctica en pacientes que no van ha poder realizar lo anterior, los nios (por que degluten el esputo), ancianos, enfermos mentales finalmente mujeres (por que tambin degluten el esputo. Lavado traqueal: Esta tcnica consiste en instalar suero fisiolgico tibia hacia el rbol traqueo- bronquial de manera que provoquemos el acceso de tos al despertar o excitar ese reflejo, en esa circunstancia debemos estar bien protegidos con barbijo, gorro, mandil y guantes. Forma postural: Este mtodo tambin es til en pacientes que no pueden eliminar en forma espontnea la muestra. Procedemos a colocar al paciente en decbito ventral sobre una camilla (o cualquier superficial que cumpla la misma funcin) con una almohada debajo de ala regin abdominal finalmente la cabeza queda colgado en una de los extremos la camilla al igual que los brazos lateralmente: de esta forma por simple accin de la gravedad la secreciones se viabilizaran al exterior, directamente al recipiente RECOGIDA DE ORINA. - La toma de muestras se realizar en un frasco estril que no deber abrirse antes de la recogida. La recogida de orina puede realizarse de tres formas: Recogida de la porcin media de la miccin: Es aconsejable que la orina recogida sea de la primera hora de la maana. El paciente debe lavarse meticulosamente los genitales externos con agua y jabn enjugndose finalmente con agua limpia. Iniciar la miccin desprecindose la primera parte. A continuacin, y sin detener la miccin, debe

Forma natural de eliminacin del esputo: Esta es la tcnica ms utilizada, se aplica a pacientes

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recogerse la segunda mitad de la misma en un frasco estril de unos 20, 35 m1 evitando tocara el interior o borde de 1 frasco. Sondaje vesical o puncin de sonda: El sondaje vesical debe utilizrselo menos posible ya que con lleva el riesgo de provocar una infeccin por introducir microorganismos del exterior. Se efectuara en condiciones de rigurosa asepsia y por personal cualificado. El enfermo portadores de sonda permanente debe recogerse la muestra a trabes de la sonda y nunca directamente de la bolsa. Puncin suprapvica: Esta tcnica permite extraer la orina directamente de la vejiga mediante una jeringa con aguja asegurando una muestra libre de contaminaciones. Este mtodo puede realizarse con muy poco riesgo en lactantes, nios y adultos con vejiga llena. Dado que la orina es un excelente medio de cultivo para la mayor parte de las bacterias, la muestra debe refrigerarse inmediatamente despus de la extraccin. A 40 C el recuadro de bacterias permanece constante durante 24 horas. Tcnica de recoleccin en 24 horas: Se usa cuando la patologa esta situada en los riones. Consiste en recolectar durante 24 horas toda la orina eliminada de manera que aumentemos las posibilidades de coleccionar el agente etiolgico. Caractersticas del recipiente para recolectar orina. a. La capacidad mnima es de 250 cc. b. Debe poseer boca ancha. c. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema. d. Debe ser estril. e. Debe ser construido de material susceptible de esterilizacin. f. De preferencia ser transparente a fin de observar ciertas caractersticas macroscpicas. g. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, adems de la fecha y el correspondiente nmero de registro.

HECES FECALES.- Tenemos dos posibilidades: heces diarreicas y heces slidas. Heces diarreicas: En este caso obtenemos un volumen similar al de una cuchara sopera lo que ms o menos viene a
ser una cantidad de 10 cc. Estas muestras deben procesarse dentro de un margen de tiempo prudencial pues al acidificarse muchos grmenes patgenos se lisan. Heces slidas: Se toma un volumen similar al de una semilla de durazno. Caractersticas del recipiente para recolectar heces fecales. a. La capacidad mnima es de 30 ml b. Debe poseer sistema de rosca y tapa que asegure con este sistema, o en su defecto un tapn que asegure hermticamente. c. En lo posible debe ser estril, aunque se puede utilizar un envase bien lavado. d. Podr ser construido de material susceptible de esterilizacin, (polipropileno, policarbonato, vidrio) e. No debe ser fabricado de cartn pues deshidrata la muestra. En ltimo caso se podr utilizar recipientes de cartn parafinado. f. Tiene que consignar el nombre, edad, sexo del paciente, adems de la fecha y el correspondiente nmero de registro. 4) MUESTRAS ESPECFICAS EXTRACCIN DE SANGRE PARA CULTIVOS: La tcnica de extraccin consta de una serie de pasos que deben rigurosamente, con objeto de reducir al mximo el riesgo de contaminacin. Colocar una ligadura en el antebrazo. Escoger la vena tocando la piel antes de la desinfeccin. Limpiar la piel con alcohol (70%) sobre el sitio de la venopuntura en un rea se unos 5 cm. frotando vigorosamente. Aplicar yodo-povi dona (2 %) desde el centro hacia afuera, hasta haber saturado todo el crculo. Se dejara que el yodo se seque, durante un minuto como mnimo, Este tiempo es fundamental y se debe cronometrar. Si despus de desinfectada, el flebotomista debe tocar la piel, deber desinfectarse los dedos que va a usar para la palpacin o bien utilizar guantes estriles. Se insertara la aguja en la vena a y se realizara la extraccin. Se cambiaran las agujas antes de inyectar la sangre en las botellas de cultivo. Despus e retirar la aguja, la piel del paciente se desinfectara otra ves con alcohol al 70%, ya que muchos enfermos son sensibles al yodo.

Una

vez inoculadas, las botellas de hemocultivos deben remitirse inmediatamente al laboratorio para iniciar lo ms pronto posible su procesamiento.

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 No es aconsejable extraer sangre a travs de una derivacin 0 catter, ya que estos dispositivos pueden estar colonizados por bacterias que no estn presentes en la sangre el paciente por lo tanto, estos hemocultivos podran dar resultados falsos positivos. Tambin se aconseja realizar la toma por debajo de las tubuladuras intravenosas ya que la sangre tomada por encima e ella estar diluida por el lquido transfundido. Se recomienda 3 muestras en 24 h con un intervalo entre ellas superior a 1 h. Sin embargo se acepta 2 o 3 extracciones separadas 30 min. Cada 24h, para cada hemocultivo, se extraern lO ml de sangre y se inocular a partes iguales en dos frascos (5ml en cada uno) uno para aislamiento de grmenes aerobios y otro para anaerobios. LQUIDO CEFALORRAQUDEO: Esta muestra se obtiene a partir de una puncin lumbar que se practica entre el 3er. Y 4to. Espacio intervertebral lumbar. Esta es una tcnica prctica operatoria y se la debe realizar con todos los cuidados necesarios teniendo en cuenta las contraindicaciones. La cantidad necesaria es de 3 - 5ml. y siempre se debe realizar un estudio microscpico antes de entrar al estudio microbiolgico. La presin ms importante es de procesar el liquido cefalorraqudeo dentro de un margen de tiempo mnimo desde la toma de muestra, pues muchos grmenes se lisan transcurrido cierto tiempo; dndonos de esta manera un resultado negativo. MUESTRA CAPILAR: tcnicas. Realizar la antisepsia del lugar elegido (lbulo de la oreja, pulpejo del dedo anular, planta del pie en lactantes. Funcionar con rapidez y firmeza de tal manera que ingrese toda la punta de la lanceta. Descartar la primera gota. Recoger la sangre que fluye libremente llenando las tres cuartas partes del capilar. Presionar suavemente el lugar de puncin con un algodn empapado en alcohol. La puncin cutnea o capilar se emplea para: Frotis Micro hematocrito Grupo sanguneo Recuento de lbulos blancos

Y otros.12
ANTIBITICO Sustancia qumica producida por ciertos microorganismos, que mata o inhibe el crecimiento de otro. Inhibe el crecimiento o matan a otros microorganismos .Los antibiticos constituyen una clase especial de agentes quimioterapeuticos , que se distinguen de los anlogos de factores de crecimiento por que son productos naturales (productos de la actividad microbiana ) ,son sustancias producidas en los procesos microbianos a gran escala . ANTIBIOGRAMA El medio de cultivo es slido. Este sistema permite probar la eficacia de varios antibiticos al mismo tiempo.; Sobre la superficie de una placa de agar se realiza la siembra de una suspensin bacteriana calibrada y a continuacin se depositan sobre ella discos de papel de filtro impregnados de antimicrobianos (discos para antibiograma disponibles en el comercio). Tan pronto como el disco toma contacto con la superficie hmeda del agar, el agua es absorbida por el papel de filtro y el antibitico difunde hacia el medio circundante creando as concentraciones progresivamente decrecientes. Se observa como a medida que la distancia al disco aumenta hay una reduccin logartmica de la concentracin del antibitico. As, al cabo de 18 horas de incubacin, en aquella zona donde el antibitico es capaz de impedir el crecimiento de la bacteria aparece un halo alrededor del disco: halo de inhibicin. El tamao de la zona de inhibicin depende de ciertas propiedades fisicoqumicas del antibitico que influyen invitro sobre la velocidad de difusin en agar y no estn necesariamente relacionadas con la actividad teraputica (in vivo) del antibitico.; La valoracin de los halos se hacen por patrones obtenidos de forma que se hallan correlacionadas la CIM y la carga antimicrobiana del disco con el dimetro del halo. Para ello es necesario determinar previamente en forma individual la CIM y el halo de inhibicin de un nmero amplio de cepas. Los resultados se representan en un sistema de coordenadas que nos permite establecer una correspondencia para un antibitico determinado. De esta forma midiendo el dimetro del halo de inhibicin de una cepa por el mtodo del disco-placa, trasladamos este valor a la escala anterior
12

www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf

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y podemos conocer su CIM. Pese a las limitaciones, esta tcnica representa un avance ya que provee de resultados estandarizados comparables entre los distintos laboratorios. 13 RESISTENCIA Es la capacidad adquirida por un organismo para resistir los efectos de un antibitico ante el cual es normalmente susceptible ,esta resistencia se adquiere probablemente de los productores antibiticos ,a travs de un proceso de intercambio gentico .Con el fin de protegerse a si mismo de los antibiticos que ellos producen , estos organismos han desarrollado mecanismos para neutralizar o destruir sus propios antibiticos . La existencia de estos genes significa que, bajo las condiciones adecuadas, es posible transferir esta resistencia a otros organismos .Los mecanismos de resistencia a los antibiticos son por: 1) El organismo puede carecer de la estructura diana sobre la que acta un antibitico. 2) El organismo puede ser impermeable al antibitico. 3) El organismo puede ser capaz de alterar en antibitico pasndolo a una forma inactiva. 4) El organismo puede modificar la diana de un antibitico. 5) Por intercambio gentico, puede tener lugar la alteracin de una va metablica que bloque al agente antimicrobiano. 6) El organismo puede ser capaz de bombear hacia fuera el antibitico que va entrando en la clula (eflujo). La resistencia a los antibiticos puede estar codificada genticamente por el microorganismo, bien en el cromosoma o en los plasmados, los llamados plasmados de resistencia, los diferentes tipos especficos de resistencia tiene su base gentica en uno o en otros. SENSIBILIDAD Es la Administracin de un antgeno para inducir una respuesta inmunitaria exposicin a un alergeno que da lugar a una reaccin exagerada La bacterias Gram. + son generalmente mas sensibles a los antibiticos que las bacterias Gram. Se puede medir fcilmente la sensibilidad de un cultivo por un mtodo de difusin en agar o utilizando una tcnica de dilucin en tubo para determinar la concentracin inhibitoria mnima (CIM ) de un agente que inhiba el crecimiento. El mtodo de la CIM para el anlisis de sensibilidad a los antibiticos conlleva un ensayo de dilucin del antibitico ya se en tubos de cultivo o bien en pocillos de una placa de micro titulacin .La prueba CIM ( mtodo de Kirby-Bauer ).14 TABLAS DE IDENTIFICACIN DE BACTERIAS

13

http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp8.pdf
http://es.mimi.hu/medicina/antigeno.html

14

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23

24

MATERIAL

1 esptula
1 agitador de vidrio 30 tubos de ensaye chicos con tapa de rosca 7 matraz erlenmeyer 1L Papel craft Gradilla 1 pipeta 5ml 60 cajas petri estriles Mechero 5 asas 5 portaobjetos 1 probeta 250ml 1 vaso de pp. de 250ml Algodn

Gasa
Papel filtro Torundas con alcohol REACTIVOS Medio Mac Conkey Medio Basal O/F (De Hugh y Leifson) Agar Sal y manitol Base de Agar Sangre Base de Caldo Rojo Fenol Agar Mueller Hinton

Agar

TCBS (Tiosulfato Sales Biliares Sacarosa) Medio Stuart Vancomicina (en discos) Furacilidona (en discos) Perxido de hidrgeno al 30% Manitol Reactivo de kovacs (oxidasa) Aceite mineral Cristal violeta Lugol Alcohol-acetona Safranina Alcohol MATERIAL BIOLGICO Microorganismos desconocidos a identificar EQUIPO Incubadora Autoclave Refrigerador Parrilla elctrica Balanza semi-analtica Microscopio PROCEDIMIENTO Primera sesin 1. Se procede a preparar los medios que se van a utilizar para la identificacin de posibles microorganismos. Como son:

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MacConkey Preparacin: Suspender 50 gramos del medio en un litro de agua destilada o desionizada de buena calidad. Remojar bien entre 10 a 15 minutos y calentar a ebullicin agitando continuamente. Hervir durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50 C y vaciar en cajas de Petri unos 20 ml por placa. Dejar solidificar y luego invertir las cajas para evitar que se deposite un exceso de humedad en la superficie del medio. O/F (De Hugh y Leifson) Preparacin: Suspender 9.8g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia hasta disolucin del material. Esterilizar en autoclave a 15 libras durante 15 minutos. Agregar 10 ml de solucin de glucosa al 10% esterilizada por filtracin por cada 100 ml del medio fluido. Mezclar y distribuir aspticamente a razn de 5 ml por tubo. Si prefiere, puede agregarse directamente 1.0 g del carbohidratos a cada 100 ml del medio 1.0g del carbohidratos a cada 100 ml del medio y esterilizar en autoclave a 118C durante 10 minutos, a fin de evitar la degradacin del azcar. El medio tiene un color verde. Sal y manitol Preparacin: Suspender 111g. del medio deshidratado en un litro de agua destilada y remojar unos 15 minutos. Mezclar bien y calentar a ebullicin durante un minuto. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos. Vaciar en cajas de petri. Base de Agar Sangre Preparacin: Suspender 40 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar entre 5 y 10 minutos. Hervir durante un minuto. Los matraces pueden taparse y colocarse directamente en autoclave. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Despus de esto enfriar a 4 50C y aadir de 5 a 10% de sangre desfibrinada estril, homogenizar y vaciar en cajas de petri estriles. No es recomendable emplear sangre humana. De preferencia utilice sangre de cordero o de conejo. Tambin es posible inocular el fondo de una caja petri estril con un pequeo inculo, y vaciar posteriormente el medio fundido a unos 50C; la caja se hace girar suavemente para homogenizar la muestra. En algunos laboratorios se emplea el medio de cultivo preparado en tubos con tapn de rosca que se pueden inocular y posteriormente vaciar en cajas de petri estriles Base de Caldo Rojo Fenol Preparacin: Disolver 15 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada, agregar si se desea de 5 a 10 g de carbohidratos. Se puede agregar de 0.5 a 1.0 g de agar si el medio va a ser destinada al cultivo de organismos anaerobios. Si se desea investigar la formacin de gases, emplear tubos Durham. Colocar los tubos en un recipiente adecuado y esterilizar de 116 a 118C durante 15 minutos. Agar Mueller Hinton Preparacin: Suspender 38 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Mezclar bien agitando frecuentemente. Hervir durante un minuto, y esterilizar a 121C por un tiempo no mayor de 15 minutos. Enfriar a 40-45C y vaciar en cajas de petri. Si se desea, pueden prepararse placas o tubos de agar chocolote, previa adiccin de sangre de carnero o humana, preferiblemente la primera, calentando en bao maria a 80C 10 minutos. No sobrecalentar el medio en ningn momento. Agar TCBS

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Preparacin Suspender 86 g del polvo en un litro de agua destilada. Remojar de 10 a 15 minutos. Calentar agitando con frecuencia y hervir durante un minuto. Enfriar entre 45-50C y vaciar en cajas de petri. No esterilizar en autoclave. Segunda sesin 2. Toma de muestra:

La toma de muestras que se hicieron para esta prctica fueron: exudados faringeos y nasofaringeos

Faringeos:
Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrs. Se ilumina bien la cavidad orofarngea y con un abatelenguas se empuja la lengua hacia abajo para facilitar el acceso a la parte posterior de la faringe. Con un hisopo de algodn se hace un raspado de las reas hipermicas, purulentas o necrticas, as como de las membranas o manchas de Koplic, si es que las presenta. Nasofaringeos: Toma: Se pide al paciente que se siente y coloque su cabeza hacia atrs. Se introduce un hisopo de alginato de calcio, dacrn o nylon (nunca de algodn en caso de sospechar Bordetella) por las fosas nasales hasta la nasofaringe, sin tocar los cornetes y tratando de producir un acceso de tos. El hisopo se mantiene in situ de 10-15 segundos durante el acceso de tos, despus de lo cual se retira rpidamente.

Cutneo
Toma: Con un hisopo de algodn se toma una porcin del exudado, evitando que sea muy superficial. Inmediatamente se siembra en medios de cultivo adecuados (agar sangre, agar chocolate, PAI, etc) o se inocula en el medio de transporte de Stuart.15 3. 4. Una vez obtenidas las muestras se procede a la inoculacin en medios, por estria cruzada. Incubacin de las placas a 35C, durante 24 a 48 hrs.

Tercera sesin: 5.

6.
7. 8. 9.

Observacin de las caractersticas macroscpicas en cada medio sembrado Realizacin de frotis al Gram de 2 colonias. Observacin a inmersin Siembra de la colonia pura con afinidad a posible estafilococo en caldo rojo de fenol Siembra de esta misma colonia de forma masiva en agar sangre para realizar prueba de sensibilidad-resistencia con antibiticos como son: Furazilidona y Penicilina (antibiograma) Incubacin de estas ultimas a 35C durante 24 horas.

Cuarta sesin 10. Observacin de las caractersticas macroscpicas en el caldo manitol rojo de fenol y en la prueba de sensibilidad. 11. Medir el halo de inhibicin se present) con un regla y determinar posible tratamiento. 12. Realizacin de frotis de Gram del cultivo obtenido. Observacin a inmersin. 13. Realizacin y lectura de la prueba de coagulasa, oxidasa y catalasa. 14. entificacin de microorganismo a partir de los resultados obtenidos. RESULTADOS MICROORGANISMO, PRUEBAS Y MEDIOS DE CULTIVO CARACTERSTICAS IMAGEN

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http://www.salud.gob.mx/indre/mues.htm#M3.%20EXUDADO%20FARINGEO

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Colonias transparentes (en S y M) Colonias amarillas y blancas, Circulares, poco crecimiento, Planos, hemlisis (En GS) BACTERIA PROBLEMA 1 Procedencia: Desconocido Sembrado en Sal y Manitol (con vire a rojo) Resiembra en Gelosa Sangre

Staphylococcus GRAMPOSITIVO

CATALASA OXIDASA -

Colonias blancas Hemlisis

BACTERIA PROBLEMA 2 Procedencia: Desconocido Sembrado en Gelosa Sangre Resembrado en GS

Staphylococcus GRAMPOSITIVO

CATALASA + OXIDASA -

COAGULASA + (Por lo tanto, altamente patgeno)

Resembrado en GS con antibiograma

Halo = 1cm Inhibicin a Penicilina Resistencia a Furacilidona Hemlisis Colonias blancas, redondas y lisas

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Rojo Fenol

Positivo: fermentacin de glucosa (Vire a plido)

Medio basal O/F

Con sello: negativo Sin sello: positivo Vire Azul (por lo tanto microorganismo aerobio)

BACTERIA PROBLEMA 3 Procedencia: Piel de la parte posterior de la oreja Sembrado en Sal y manitol Y gelosa sangre Colonias blancas, circulares, pequeas (S y M) Colonias blancas, circulares, Pequeas con elevacin Concava y ligera hemlisis (GS)

BACTERIA PROBLEMA 4 Procedencia: Exudado Farngeo Siembra en GS

Flora normal Hemlisis Crecimiento abundante Colonias circulares, cncavas, Blanquecinas y puntillosa

BACTERIA 5 S. Aureus

Staphylococcus Gram + Rojo Fenol + Colonias circulares, pequeas, De borde continuo y cremosas. Coagulasa + Anaerobio facultativo Fermentador de glucosa Catalasa + Oxidasa -

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DISCUSIN DE RESULTADOS Identificacin: Bacteria problema 1 Hubo hemlisis gama por que no presento halo, fue un crecimiento abundante de color blanquecino cremoso, fue oxidasa negativo por que no hubo presencia del sistema citocromo oxidasa que activa la oxidacin del citocromo que es reducido por el oxigeno molecular que produce agua y dixido de carbono, en la prueba de catalasa fue negativo, por que no posee esta enzima que descompone al H2O2 en oxigeno molecular y agua por lo que no hubo burbujeo. Se realizo una prueba de sensibilidad en la que con PE fue sensible con halo de inhibicin de 1 cm. lo cual indica que se puede tratar con Penicilina y fue resistente en A indicndonos que el tratamiento con Furazilidona no es recomendable. No se determinaron mas pruebas ya que se encontraron Staphylococcus y Streptococcus GRAM positivo en la tincin por lo que las pruebas nos dieron catalasa negativo y oxidasa negativo. Nota: PE: Penicilina A: Furazilidona Bacteria problema 2 En el cultivo de procedencia hubo hemlisis beta y colonias blancas cremosas. Se determino que era Staphylococcus GRAM positivo coagulasa positivo por lo que es altamente patgenopor que forma el coagulo visible como consecuencia de la utilizacin de los factores de coagulacin del plasma de manera similar a cuando se aade ttrombina, en rojo fenol fue positiva, ya que fermento ligeramente la glucosa del medio, en O/F se observo que con sello fue neutro y sin sello fue acido, por lo que su metabolismo es oxidativo y tambin nos indica que la especie es aerobia o anaerobia facultativa. La prueba de catalasa fue positiva ya que si posee la enzima que descompone al H 2O2 en oxigeno molecular y agua por lo que presento burbujeo y oxidasa negativa. De acuerdo a las pruebas realizadas se puede determinar que cumple con las caractersticas propias de Staphylococcus ya que la prueba de coagulasa es positiva y eso es caracterstico de S. aureus, S. areus subespecie anaerobius y S. simulans pero ya que nos dio hemlisis beta podemos afirmar que es S. aureus. Bacteria problema 3 Exudado de piel (parte posterior de la oreja) No se le realizaron todas la pruebas necesarias para la identificacin, sin embargo por el tipo de muestra y las caractersticas culturales se puede decir que es Staphylococcus de la flora normal que se encuentra en la piel la especie epidermidis. Bacteria problema 4 Exudado faringeo En esta ocasin no se pudieron realizar todas las pruebas necesarias para la identificacin, sin embargo por el tipo de muestra y las caractersticas culturales se puede decir que es Staphylococcus de la flora normal que se encuentra en este tipo de cavidades. Bacteria 5 Fue una bacteria ya identificada como S. aureus a la que se le hicieron las pruebas para la comparacin con nuestras muestras problema.

CONCLUSIONES Se identificaron diferentes tipos de estafilococos en las diferentes muestras tomadas comparndolas con una muestra ya identificada como S. aureus lo cual nos ayudo un poco a la identificacin de este en las otras muestras de exudados. Es importante siempre tomar en cuenta el origen de la muestra ya que de esta se parte para la identificacin y reconocimiento de este tipo de bacteria que forma parte de nuestra flora normal, pero causa dao (patogenicidad) en situaciones extremas como puede ser en heridas con falta de asepsia, higiene de la persona, si se encuentre la persona con su sistema deprimido, etc. Pudiendo producir: Impetigo, Fornculo, Celulitis, ntrax estafiloccico, Pnfigo del recin nacido, en otros aparatos y sistemas puede producir: sinusitis, otitis, faringitis, neumonitis y abscesos pulmonares o pleurales. Los estafilococos Gram positivos, crecen aislados, en parejas, en ttradas o en masas irregularmente agrupadas como racimos de uvas. La especie mas importante, Staphylococcus aureus, generalmente crece dando color amarillo a la naranja, aunque en ocasiones puede ser blanco. En Agar sangre, las colonias son redondas, de 1-3 mm de dimetro, convexas, de color blanco o ligeramente amarillento; generalmente las de tinte ligeramente amarillento se encuentran rodeadas de una zona de hemlisis que corresponde a Staphylococcus aureus. Necesita una fuente nitrogenada

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orgnica y en sus necesidades de oxgeno es facultativo. Muchas de las cepas beta-hemolticas coagulosa positivas son patgenas y algunas producen una enterotoxina que causa intoxicaciones. En esta practica estuvimos estudiando un caso desconocido, donde se le determino todo tipo de pruebas, para poder identificar que tipo de microorganismo es lo que tiene, que al final se concluyo que era posible S. aureus por la prueba de coagulasa positiva que esto indica su alta patogenicidad. Sin embrago fue sensible a la Penicilina con halo de inhibicin de 1 cm lo cual nos indica que este paciente puede ser tratado con penicilina. A diferencia de otros microorganismos esta se identifica por una gran gama de variantes que la caracterizan como son: su cpsula y capa de polisacrido extracelular, peptidoglucano, cidos teicoicos, su protena A, las toxinas estafiloccicas, enzimas estafiloccicas. Algo tambin muy importante es la identificacin de la etapa en que se encuentra de su desarrollo, ya que aqu es donde se determina en que fase se encuentra mas altamente patgena, o viceversa, cuando ya esta muerta o cuando a penas empieza a reconocer el medio o habitad en donde se encuentra y si los nutrientes que existen son los necesario y/o suficientes para poder crear algn nicho infeccioso. Esto nos ayuda a conocer mas sobre su metabolismo y la manera de atacarlo para su aplicacin clinica posterior al paciente que presenta dicha enfermedad a causa de este. REFERENCIAS

http://www.ucv.ve/Farmacia/Micro_web/Catedras02/metodesteril.pdf : Mtodo estril y Medios de cultivo por la Prof. Sofa Gutirrez de Gamboa (Octubre 2001) a partir de la bibliografa:

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Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Garanta de la Calidad de los Laboratorios de Microbiologa Alimentaria. Organizacin Panamericana de la Salud. Harla S.A. Mxico DF. Manual Bioxon, p.p 26, 28, 29, 33, 39, 41, 52 www.wikipedia.org http://www.lablinsan.cl/productos/page8.html Manual de practicas Bacteriologa; Q.F.B. R. Garza Velasco; departamento de Biologa; facultad de Qumica, UNAM. p.p 7-21 http://www.joseacortes.com/microbiologia/pruebasbioq/oxidasa.htm http://www.a14.san.gva.es/labm/gram.htm www.bvsops.org.uy/pdf/laboratorio.pdf http://www.biologia.edu.ar/microgeneral/tp8.pdf http://www.salud.gob.mx/indre/mues.htm#M3.%20EXUDADO%20FARINGEO http://es.mimi.hu/medicina/antigeno.html A. Fumarola, et al. Microbiologa y parasitologa medica. Segunda edicin. Editorial Masson. Koneman, et al. Diagnstco Microbiolgico Texto y atlas a color. Quinta edicin. Editorial Medica Panamericana. Brock. Biologa de los Microorganismos. Octava edicin. Editorial Prentice Hall. Brooks, et. al., Microbiologa Mdica de Jawetz, Melnick y Adelberg, 16a ed.

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