UNIVERSITAT JAUME I Escuela Superior de Tecnologa y Ciencias Experimentales Departamento de Qumica Inorgnica y Orgnica

SNTESIS Y EVALUACIN BIOLGICA DE HBRIDOS DE COLCHICINA CON ANLOGOS SIMPLIFICADOS DE PIRONETINA

Mster en Qumica Aplicada y Farmacolgica

Trabajo Final de Mster Alejandro Gil Escolano Castelln de la Plana 2013

D. Santiago Daz Oltra, Personal Investigador Contratado Doctor de la Universitat Jaume I certifica que:

D. Alejandro Gil Escolano ha realizado bajo su direccin el trabajo que se recoge en esta memoria para optar al grado de Mster en Qumica Aplicada y Farmacolgica.

Asimismo,

autoriza

la

presentacin

del

trabajo ante la Universitat Jaume I de Castell.

Y para que as conste a los efectos legales presenta dicho trabajo y firma este certificado en Castelln de la Plana a de . de dos mil trece.

Santiago Daz Oltra

AGRADECIMIENTOS
Este trabajo ha sido realizado en los laboratorios del Grupo de Sntesis Orgnica del Departamento de Qumica Inorgnica y Orgnica de la Escuela Superior de Tecnologa y Ciencias Experimentales de la Universitat Jaume I de Castelln de la Plana, bajo la direccin y tutela del Dr. D. Santiago Daz Oltra y de Concepcin Vilanova Galln. Gracias a los dos en primer lugar por ensearme todo lo que he aprendido durante estos meses y por estar siempre disponibles para cualquier duda que haya podido surgir. Me gustara tambin reconocer el esfuerzo de Miguel Carda y de Juan Murga, promotores del Mster en Qumica Aplicada y Farmacolgica en el que tanto he aprendido este ao. Siempre han estado disponibles a ayudar cuando fuera necesario. A Eva Falomir le agradezco todo lo que me ha enseado sobre los ensayos biolgicos que hemos realizado con nuestros compuestos obtenidos. Quera dar las gracias tambin a toda la gente del Departamento, en especial a Julin, Mara, Rosa y Steven por mantener un agradable ambiente de trabajo y hacerme sentir muy cmodo cada maana que pasaba en los laboratorios. Ha sido un placer chicos! Finalmente, y no por ello menos importante, quera agradecer el apoyo familiar recibido durante estos meses que me han ayudado a esforzarme todos los das para intentar hacer un buen TFM. Gracias a Elena por estar siempre ah, sabes que juntos hacemos un gran equipo.

ABREVIATURAS
Ac = acetato AcOEt = acetato de etilo ac. = acuoso ADN = cido desoxirribonucleico ARNm = cido ribonucleico mensajero AGF = adicin de grupo funcional (Boc)2O = bicarbonato de di-tert-butilo CDCl3 = cloroformo deuterado CTCs = Circulating Tumor Cells d = doblete DCM = diclorometano DMF = N,N-dimetilformamida DMSO = dimetilsulfxido DMAP = 4-N,N-dimetilaminopiridina EGF = eliminacin de grupo funcional Et3N = trietilamina GTP = Trifosfato de guanosina hept = heptuplete hex = hexano IC50 = concentracin de frmaco a la cual se produce una inhibicin del 50% m = multiplete MAPs = Microtubule Associated Proteins Ph = fenilo q = cuadruplete quint = quintuplete s = singulete sext = sextuplete t = triplete t. a. = temperatura ambiente TFA = cido trifluoroactico TLC = cromatografa en capa fina THF = tetrahidrofurano RMN = resonancia magntica nuclear TOF = time of flight

NDICE DE CONTENIDOS
1. Introduccin 1.1. Cncer: causas y dianas biolgicas 1.1.1. Definicin 1.1.2. Fases de crecimiento tumoral 1.1.3. Factores de riesgo 1.1.4. Dianas biolgicas 1.2. Tubulina y Microtbulos 1.2.1. Descripcin 1.2.2. Inestabilidad dinmica de los microtbulos 1.2.3. Funciones de los microtbulos 1.3. Productos naturales activos frente a microtbulos 1.3.1. Colchicina 1.3.2. Pironetina 1.4. Uso de molculas hbridas en qumica mdica 2. Objetivos 3. Resultados y discusin 3.1. Retrosntesis general de los hbridos de colchicina 3.2. Sntesis de desacetilcolchicina 3.3. Unin de la desacetilcolchicina a los espaciadores 3.3.1. Sntesis de los espaciadores 3.3.2 Unin de los espaciadores a la 1 1 1 3 5 7 9 9 12 15 15 20 23 26 27 29 29 30 32 32

desacetilcolchicina 3.4. Sntesis de los hbridos de colchicina con anlogos simplificados de pironetina 3.5. Ensayos biolgicos 4. Resumen y conclusiones 4.1. Sntesis de los hbridos 3.11a-c y 3.13a-d 4.2. Evaluacin biolgica 5. Parte Experimental 5.1. Tcnicas generales 5.2. Procedimientos experimentales 6. Espectros Seleccionados

33

35 38 41 41 42 45 45 46 57

1. Introduccin

Captulo 1

1. INTRODUCCIN
1.1. Cncer: causas y dianas biolgicas 1.1.1. Definicin El cncer es un grupo de enfermedades caracterizadas por un crecimiento celular descontrolado y posterior distribucin e invasin de otros tejidos por las clulas aberrantes, fenmeno conocido como metstasis.1 Dicho crecimiento descontrolado se debe principalmente a la incapacidad que presentan las clulas cancerosas de reparar el dao celular que impide que se pongan en marcha los mecanismos de apoptosis (muerte celular programada). En la figura 1.1 se esquematizan las diferencias entre la divisin celular en clulas sanas. En la parte de la izquierda de la figura 1.1 se representa el proceso de multiplicacin celular de una clula sana. Si se genera una clula anormal sta entra en apoptosis y muere, evitndose la generacin de una estirpe celular aberrante.

Figura 1.1. Diferencias entre la divisin celular en clulas sanas y en clulas cancerosas.

En la parte de la derecha de la figura 1.1 el proceso de multiplicacin celular produce una clula anormal que evita el mecanismo de apoptosis y

Sarabia, F.; Garca-Castro, M.; Snchez-Ruiz, A. Curr. Bioact. Compd. 2006, 2, 269-299.

Introduccin

genera una lnea celular aberrante que puede conducir a la formacin de un tumor canceroso. Se conocen ms de 200 tipos diferentes de cncer pero los ms frecuentes son los de piel, pulmn, mama y colorrectal. Se estima que el 13% de las muertes en el mundo son provocadas por esta enfermedad y que cada ao 6 millones de personas adquieren algn tipo de cncer.2 La investigacin de nuevas terapias que ayuden a combatir el cncer es un rea de la ciencia de enorme impacto, dadas las muy positivas repercusiones sociales que los logros en este campo provocan. Un tumor es cualquier alteracin de los tejidos que produzca un aumento de volumen. En medicina los tumores cancerosos se denominan neoplasias, trmino que se emplea para definir las nuevas formaciones celulares que desembocan en un tumor. Aunque neoplasia se refiere slo a tumores cancerosos, la denominacin tumor se emplea hoy en da como sinnimo de neoplasia y por esta razn ambos trminos se emplearn indistintamente en esta memoria. Los tumores pueden ser benignos o malignos. Un tumor benigno es una neoplasia que no crece de forma desproporcionada ni agresiva, no invade tejidos adyacentes y no cursa con formacin de metstasis. Las clulas de tumores benignos permanecen juntas y a menudo estn rodeadas por una membrana de contencin o cpsula. Los tumores benignos no constituyen generalmente una amenaza para la vida; se pueden extirpar y, en la mayora de los casos, no reaparecen. Para denominar estos tumores se usa como prefijo el nombre del tejido que lo origina acompaado del sufijo oma, por ejemplo papiloma, tumor benigno que se forma en las papilas de la piel o de las mucosas. Un tumor maligno es una neoplasia caracterizada por un crecimiento rpido y descontrolado seguida de invasin de tejidos y rganos cercanos al

http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/es/

Captulo 1

tumor. La propagacin del tumor, o metstasis, se lleva a cabo a travs del flujo sanguneo o del sistema linftico.

1.1.2. Fases de crecimiento tumoral El desarrollo de la enfermedad cancerosa se puede dividir en cuatro fases:3 Induccin: fase en la que se produce la multiplicacin descontrolada y se dota a las clulas de capacidad de invasin. Puede durar hasta 30 aos. No es diagnosticable ni produce sintomatologa. In situ: se caracteriza por existir ya una lesin microscpica localizada en el tejido donde se ha originado. En adultos suele durar de 5 a 10 aos. No existen sntomas pero el micro-tumor puede ser detectado. Invasin local: la lesin comienza a extenderse e invade tejidos u rganos adyacentes. Suele durar de 1 a 5 aos. Los sntomas comienzan a aparecer y dependen del tipo de cncer, de su crecimiento y de su localizacin. Metstasis: la enfermedad se disemina fuera de su lugar de origen a travs del sistema linftico o del torrente sanguneo apareciendo nuevos tumores a distancia. El proceso de metstasis consta de dos etapas diferenciadas, una primera en la que se produce la translocacin fsica de la/las clulas cancerosas desde el tumor primario hasta otro rgano. La segunda es la colonizacin del nuevo tejido donde va a comenzar a crecer el tumor secundario.

https://www.aecc.es/SobreElCancer/elcancer/Paginas/Fasesdelaenfermedad.aspx.

Introduccin

En la figura 1.2 se representa esquemticamente el proceso de metstasis, que se inicia por un cambio en el contenido gentico de las clulas cancerosas del tumor primario que conduce a un fenotipo invasivo4 (parte A de la figura 1.2). A continuacin, las clulas invaden la zona exterior del tumor y pasan a la circulacin sangunea, o al sistema linftico (parte B de la figura 1.2).

Figura 1.2. Fases de la metstasis.

Las clulas que ya se encuentran en circulacin sangunea se denominan CTCs (Circulating Tumor Cells) (parte C de la figura 1.2). A continuacin, las CTCs salen de la circulacin sangunea e invaden el micro-entorno de un nuevo tejido u rgano (parte D de la figura 1.2). Cuando alcanzan un nuevo rgano o tejido inician la formacin del tumor secundario. All las CTCs deben de ser capaces de evadir la respuesta inmunitaria local y sobrevivir como clulas individuales o pequeos clsteres (parte E de la figura 1.2). Finalmente, la clula se adapta a la zona e inicia la proliferacin (parte F de la figura 1.2).5

4 5

Mareel, MM.; Van Roy, FM.; De Baetselier, P. Cancer Metastasis Rev. 1990, 9, 45-62. Chaffer, C.L.; Weinberg, R.A. Science. 2011, 331, 1559-64.

Captulo 1

1.1.3. Factores de riesgo El cncer es principalmente una enfermedad provocada por factores ambientales ya que el 90-95% de los casos son producidos por esta causa mientras que slo el 5-10% de los casos son debidos a factores genticos.6 Respecto a los casos de cncer producidos por factores ambientales, y por tanto evitables, la dieta (30-35%), el tabaco (25-30%) y las infecciones (1520%) copan el 75% de las posibles causas de cncer (vase la figura 1.3).

Figura 1.3. Reparto porcentual de los factores que provocan el cncer.

Cabe destacar tambin que dentro de los casos de cncer provocados por factores genticos los ms destacados son: el cncer de testculos (8.6%), de tiroides (8.5%) y de laringe (8%). El envejecimiento es tambin un factor de riesgo adicional ya que se van acumulando factores de riesgo, disminuyendo al mismo tiempo la eficiencia de

Anand, P.; Kunnumakkara, AB. Pharm. Res. 2008, 25 (9), 2097116.

Introduccin

los mecanismos de reparacin celular. El onclogo estadounidense Robert A. Weinberg, profesor de Biologa en el Instituto Tecnolgico de Massachussets (MIT) y uno de los pioneros en la identificacin de oncogenes humanos, asegura que s viviramos mucho, tarde o temprano todos acabaramos teniendo cncer debido a los errores acumulados en el DNA y los cambios en el sistema endocrino.7 Los factores de riesgo acaban produciendo defectos genticos de dos tipos en el ADN de las clulas: 8 Activacin de proto-oncogenes: Los proto-oncogenes son genes incluidos en el genoma que regulan el crecimiento y diferenciacin celular. Las protenas que expresan son imprescindibles para la regulacin del ciclo celular. Estos proto-oncogenes pueden convertirse en oncogenes y comenzar a originar protenas alteradas que favorecern el crecimiento tumoral. 9 Como ejemplo se puede citar el proto-oncogen Ras que codifica una GTPasa, denominada protena G, encargada de transmitir la seal de proliferacin celular. Esta protena funciona como un interruptor celular, activando y desactivando la seal de proliferacin. En el 20-30% de los cnceres el gen Ras mutado y la protena G que genera est permanentemente activada, producindose una divisin celular descontrolada. Inactivacin de anti-oncogenes: Los anti-oncogenes son denominados tambin genes supresores de tumores ya que su papel es el de la detencin de la replicacin celular ante cualquier dao o alteracin que sufra el ADN. Un ejemplo de este tipo de genes es el gen TP53, que codifica la protena p53, la cual activa las enzimas

7 8

http://www.nytimes.com/2010/12/28/health/28cancer.html?pagewanted=all&_r=0. Murga, J. Apuntes asignatura Interaccin Frmaco Diana 2012, Tema 5. 9 http://www.biocancer.com/journal/1321/21-proto-oncogenes-y-oncogenes.

Captulo 1

reparadoras de ADN. En el 50% de los cnceres el gen TP53 se encuentra mutado generando una protena que no cumple adecuadamente sus funciones de control.

1.1.4. Dianas biolgicas Una diana teraputica es una molcula que desempea una funcin esencial en una enfermedad. La complejidad del proceso canceroso conlleva la existencia de un gran nmero de dianas teraputicas asociadas a esta enfermedad. Unas de estas dianas son los cidos nucleicos (ARN y ADN) y los microtbulos que forman el huso mittico. En la figura 1.4 se esquematizan estas dianas y los frmacos que actan sobre ellas. Como se puede ver en la figura, la mayora de compuestos antitumorales cuyas dianas son el ARN y el ADN actan bloqueando la sntesis de estas biomolculas, mientras que los denominados antimitticos ejercen su modo de accin bloqueando el proceso de divisin celular (mitosis) mediante interaccin con los microtbulos del huso mittico.10

10

Tesis doctoral de R. Martnez Buey, Universidad Complutense de Madrid, 2005.

Introduccin

Figura 1.4. Posibles dianas en el tratamiento del cncer.

Captulo 1

1.2. Tubulina y Microtbulos 1.2.1. Descripcin La tubulina es el principal constituyente de los microtbulos. Es una protena globular cuya secuencia peptdica se encuentra muy conservada en todos los organismos eucariotas.11 La molcula de tubulina est compuesta por dos monmeros denominados -tubulina y -tubulina. Cada monmero esta formado por cadenas proteicas de aproximadamente 450 aminocidos y 55 kDa que difieren entre s por la presencia de nueve aminocidos extra en el monmero que son los responsables de formar el loop S9-S10.1 Cada monmero posee adems GTP que en la -tubulina no es intercambiable y en la -tubulina se puede hidrolizar a GDP. Ambas subunidades, y , estn formadas por dos lminas beta de 6 y 4 cadenas respectivamente, flanqueadas por 12 hlices alfa.

Figura 1.5. Representacin del dmero de tubulina. En gris se representa la subunidad conteniendo GDP (molcula en color rojo) y en verde se representa la subunidad conteniendo GTP (molcula en color azul).

11

(a) Krauhs, E.; Little, M.; Kempf, T. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981, 78, 4156-4160. (b) Krauhs, E.; Ponstingl, H.; Little, M. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1981, 78, 2757-2761.

10

Introduccin

La estructura de cada monmero se puede dividir en tres dominios: Dominio N-terminal: incluye los 205 primeros residuos y tiene un plegamiento donde se alternan cadenas beta paralelas con hlices alfa (vase la zona azul en la figura 1.6). Dominio Intermedio: comprende los residuos 206-381 y contiene una lamina beta rodeada por cinco hlices (vase la zona roja en la figura 1.6). Dominio C-terminal: formado por dos largas hlices . Este dominio parece estar implicado en la unin de las MAPs (Microtubule Associated Proteins) y las protenas motoras. 12 (vase la zona amarilla en la figura 1.6)

Figura 1.6. Monmero de tubulina.

12

Hirokawa, N. Curr. Opin. Cell Biol. 1994 6, 74-81.

Captulo 1

11

Los microtbulos son polmeros proteicos cilndricos de unos 25 nm de dimetro y longitud variable. Los dmeros de tubulina interaccionan cabezacola formando protofilamentos que se unen paralelamente formando los microtbulos (vase la figura 1.7). Dado que los dmeros de tubulina se asocian en un determinado sentido el microtbulo formado tiene polaridad, es decir, existe un extremo (+) formado por -tubulina, y uno (-) formado por -tubulina. Cada uno de estos extremos tiene propiedades diferentes que son de vital importancia para la funcin de los microtbulos. El extremo (-) est normalmente unido a los centros organizadores de nuevos microtbulos. En cambio, el extremo (+) crece hacia la periferia celular y durante la mitosis se une a los cinetocoros ayudando as a la divisin celular.13

Figura 1.7. Estructura de los microtbulos.

13

Nogales, E.; Alushin, G. Comp. Bioph. 2004, 4, 72-93.

12

Introduccin

1.2.2. Inestabilidad dinmica de los microtbulos El dmero de tubulina existe de forma indivisible en la clula. Tanto la subunidad como la tienen una molcula de GTP unida pero el GTP de la -tubulina no es intercambiable ya que se encuentra en una zona ms interna del monmero. En cambio el GTP de la subunidad es hidrolizable y tiene una gran importancia en la dinmica de los microtbulos. Durante la polimerizacin, los dmeros comienzan a unirse formando el microtbulo y ste crece hasta una longitud concreta acabando siempre en subunidades tipo -GTP. Este final de la cadena es llamado GTP-cap y es esencial en el proceso de inestabilidad dinmica. A la vez que el microtbulo va creciendo, los monmeros intermedios GTP van siendo hidrolizados a -GDP por la actividad GTPasa que ejerce la subunidad vecinal. Esta prdida de fosfato provoca un cambio conformacional en el dmero, el cual, aade inestabilidad al microtbulo y facilita su despolimerizacin.14

Figura 1.8: Dinmica de la polimerizacin de la tubulina.

14

Howard, J.; Hyman A. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2009, 10, 569-574.

Captulo 1

13

La inestabilidad del microtbulo est provocada por un cambio en el ngulo de unin entre los monmeros. Mientras que los contactos entre los dmeros -GTP-GTP presentan un ngulo de 5, los contactos entre los dmeros GTP-GDP son de 12, aumentando la inestabilidad del microtbulo que est formado por esta clase de dmeros (vase la figura 1.9).15

Figura 1.9. Diferencias entre los ngulos de enlace en los dmeros de tubulina.

15

Nogales, E.; Hong-Wei W. Curr. Opin. Struc. Biol. 2006, 16, 221-229.

14

Introduccin

En la figura 1.10 se puede observar cmo en el microtbulo de la derecha, que se est despolimerizando, los protofilamentos se curvan ms rpidamente debido a la inestabilidad provocada por los heterodmeros -GTP-GDP.

Figura 1.10. Intermedios estructurales en la polimerizacin y despolimerizacin. Los dmeros rojo-verde son -GTP-GTP y los verde-azul son -GTP-GDP.

Cuando el microtbulo deja de crecer y se hidroliza el GTP-cap el microtbulo despolimeriza rpidamente liberando al citosol dmeros de GTP-GDP, los cuales vuelven a ser fosforilados a -GTP-GTP y ya estn listos para volver a comenzar el proceso de polimerizacin. El equilibro entre polimerizacin-despolimerizacin es lo que se conoce como inestabilidad dinmica de los microtbulos y es un proceso esencial a nivel celular y en el proceso de mitosis. Es fcil entender que los compuestos que se unan a la tubulina, bien estabilizando los microtbulos bien desestabilizndolos, provocarn una detencin del ciclo de divisin celular y podran ser empleados en terapias antitumorales.

Captulo 1

15

1.2.3. Funciones de los microtbulos Las funciones de los microtbulos son muy importantes a nivel celular y se pueden resumir en las siguientes: Esqueleto celular: mantienen la forma de la clula y la disposicin de los orgnulos. Transporte intracelular: forman unos rales por los cuales se pueden transportar vesculas o macromolculas entre compartimentos celulares. Divisin celular: son imprescindibles, ya que son los

encargados de la formacin del huso mittico. En la prometafase se produce la unin centrosoma-microtbulo-cinetocorocromosoma. En la metafase los cromosomas se alinean sobre el huso mittico y en la anafase los microtbulos se acortan estirando hacia los extremos de la clula los cromosomas.

1.3. Productos naturales activos frente a microtbulos Los compuestos capaces de interaccionar con los microtubulos

representan un arma muy potente en la quimioterapia del cncer. La mayora de estos compuestos actan sobre la -tubulina aunque tambin existen unos pocos que se unen a la -tubulina. Los compuestos que ejercen su accin sobre la -tubulina se suelen dividir en dos grupos:

16

Introduccin

Agentes desestabilizantes de microtbulos: a esta clase pertenecen compuestos vinblastina, bloquean la como la colchicina, colcemida, podofilotoxina, dolastatina, de los vincristina, mitosis maytansina, la rizoxina,

fomopsina y criptoficinas (vase la figura 1.11). Estos compuestos provocando despolimerizacin microtbulos.
Podofilotoxina
Colchicina
O H N O O O O N O O O O O HO O H N O H N O N H N O H N N O O O O N S O O Cl O N O H O O O O O OH H O O O

HO

H N O

Vinblastina

H O

Maytansina

Dolastatina A
O O N

N H

HO

H N O

HO

Cl

OH NH O H N

O O O H O O H

Rhizoxina
N H O

Phomopsina A
O H N N H O OH O O OH O

O N HO O

O O O O

NH H N O O

Criptomicina 175

Cl

O Cl

Figura 1.11. Compuestos desestabilizantes que actan sobre la subunidad .

Captulo 1

17

Agentes estabilizadores de microtbulos: a esta clase pertenecen compuestos como el taxol, epotilonas, discodermolido, sarcodictina A, eleuterobina y laulimalida (vase la figura 1.12). Estos compuestos bloquean el proceso de mitosis al inhibir el proceso de despolimerizacin de los microtbulos.
O O O

OH

Epotilona B
O H O N H OH O O O N

O O O HO

OH O O

Taxol

HO

S O O

O H2N O OH

Discodermlido

O OH HO N O N

Sarcodictina A
OH OH O O

Eleuterobina
H N O OH O O O OH O O H O O H OH

Laulimalida
H

O O

HO

Figura 1.12. Compuestos estabilizantes que actan sobre la subunidad .

Existen muy pocos compuestos que ejerzan su efecto antimittico unindose a la -tubulina. Entre estos se enmarcan las pironetinas, cianoacrilatos, dinitroanilinas y hemiasterlinas (vase la figura 1.13).

18

Introduccin

Pironetina
O OH O

Hemiasterlina
O N O O HN NH N H O OH

OO N O N F

Cianoacrilato

N+

Trifluralina
F F

Pendimetalina
O N+ O-

N+ O-

N H N+
-O

Figura 1.13. Compuestos que actan sobre la .-tubulina.

Los

compuestos

tipo

cobra-1

se

describieron

inicialmente
16

como

compuestos que interaccionaban con la -tubulina pero recientemente se ha demostrado que no interaccionan con los microtbulos. de microtbulos y causan su despolimerizacin a tubulina. Todos los compuestos que interaccionan con la -tubulina son agentes desestabilizantes

16

Carda, M.; Murga, J.; Paos, J.; Angulo-Pachn, C.A.; Garca-Pla, J.; Daz-Oltra, S.; Marco, J.A.; Trigili, C.; Redondo-Marcajo, M.; Daz, J.F.; Barasoain, I. Curr. Med. Chem. 2013, 20, 1173-1182.

Captulo 1

19

Se han identificado cuatro sitios de unin principales en la tubulina: sitio de la colchicina, sitio de los alcaloides de la vinca, sitio del taxol y sitio de la laulimalida (vase la figura 1.14).

Figura 1.14: Diferentes sitios de unin de ligandos antimitticos en el dmero de tubuina. (A) Tubulina unida a colchicina, y vinblastina. (B) Representacin de un trozo de pared del microtbulo con taxol unido. (C) Frmulas qumicas de compuestos que tienen como diana la tubulina.

20

Introduccin

1.3.1. Colchicina La colchicina fue aislada por primera vez en 1820 por los qumicos franceses P.S. Pelletier y J.B. Caventou de plantas del gnero Colchicum y en 1833 P.L Geiger purific el componente activo al cual llamara colchicina.17

Figura 1.15. (a) Flores del gnero Colchium. (b) Molcula de colchicina.

Sin embargo, la colchicina se ha utilizado desde la antigedad para tratar reumatismo e inflamaciones y estos usos aparecen incluso en el Papiro Ebers, un manuscrito dedicado a la medicina de la cultura egipcia (1500 a.C). Actualmente se utiliza para tratar la enfermedad de la gota (aprobada por la FDA en 2009) pero siempre se utiliza en dosis muy bajas ya que es un compuesto muy txico para el ser humano y por lo tanto tiene un ndice teraputico bajo.

17

(a) Pelletier P.; Caventou, J. Ann. Chim. Phys. 1820, 14, 69-81. (b) Geiger, Ph. Ann. Pharm. 1833. 7 (3), 269-280

Captulo 1

21

Debido a la elevada actividad antimittica de la colchicina se est comenzando a investigar como agente antineoplsico, pero su poca especificidad por las clulas cancergenas y su elevada toxicidad hacen que su futura utilizacin como frmaco antitumoral est comprometida. La colchicina acta promoviendo la despolimerizacin de los microtbulos unindose a la -tubulina, en una zona muy cercana a la -tubulina, provocando un cambio conformacional en la tubulina.18 El sitio de unin de la colchicina est enterrado en el dominio intermedio de la -tubulina, cubierto por las cadenas S8 y S9, el loop T7 y las hlices H7 y H8. Adems interacciona con el loop T5 de la subunidad vecinal, lo que concuerda con la observacin de que la colchicina desestabiliza el heterodmero.19 Esta afirmacin viene respaldada por los estudios realizados por Nogales y col. y por Ravelli y col. aparecidos en 2001 y 2004,20 respectivamente. El grupo de Nogales cristaliz y caracteriz la estructura del dmero ,-tubulinaPaclitaxel (PDB ID 1JFF) y en 2004 Ravelli y col. hicieron lo mismo con el dmero ,-tubulina-Colchicina (PDB ID 1SA0). Comparando ambos se observa que el primero tiene un ngulo de enlace entre las subunidades mucho mas cercano a 180 y por lo tanto ms adecuado para la arquitectura cilndrica de los microtbulos. En cambio, el 1SA0 tiene un ngulo de enlace menor y esta es la causa que explica la despolimerizacin de los microtbulos provocada por la colchicina. El anillo trimetoxifenlico de la colchicina se coloca dentro de un bolsillo hidrofbico de la subunidad , rodeado por Cys241, Ala250, Leu252, Leu255, Ala354 y Cys356 (aminocidos en color violeta en la figura 1.17). Existe tambin un enlace de hidrgeno entre el carbonilo C-10 de la colchicina y la Lys352 (aminocido color naranja en la figura 1.17) con una

18 19

Vandecandelaere, A.; Martin, S.R.; Schilstra, M.J. Biochem. 1994, 33, 2792-2801 Chaudhuri, A.R.; Seetharamalu, P.; Schwarz, P.M. J. Mol. Biol. 2000, 5, 679-692 20 (a) Snyder, J.P; Nettles, J.H; Nogales E. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2001, 98, 5312-5316 (b) Ravelli, RBG.; Gigant, B.; Curmi, PA. Nature. 2004, 428, 198-202

22

Introduccin

distancia de enlace N-O de 2.88 . Cabe destacar que la zona de la colchicina donde se encuentra el grupo NH se encuentra orientada hacia la subunidad , ms concretamente al lugar de unin donde est situado el GTP (color azul en la figura 1.17).

Figura 1.16: Lugar de unin de la colchicina en el dmero de tubulina (PDB 1SA0)

Captulo 1

23

1.3.2. Pironetina La pironetina fue aislada y caracterizada por primera vez por Shinichi Kobayashi y col. de una bacteria del gnero Streptomyces sp. en 1994. La primera utilidad biolgica que se observ en la pironetina fue la de inhibicin del crecimiento de las plantas de arroz. 21
O

OMe

OH

Me

Me

Me

Figura 1.17. Molcula de Pironetina.

Actualmente, la pironetina no se utiliza para tratar ninguna enfermedad aunque se estn investigando sus propiedades teraputicas como resultado de su conocida actividad antimittica. La pironetina es un agente desestabilizador de microtbulos provocando la parada celular en mitosis y la subsiguiente muerte celular por apoptosis. En la imagen a de la figura 1.18 se puede observar la red de microtbulos en clulas 3Y1 de ratones y la inexistencia de los mismos en la imagen b (clulas tratadas con colchicina) y en la imagen c (clulas tratadas con pironetina), confirmando as que la colchicina y la pironetina son agentes desestabilizantes de microtbulos.22

21

(a) Kobayashi, S.; Tsuchiya, K.; Harada, T.; Nishide, M. J. Antibiot. 1994, 47, 697702. (b) Kobayashi, S.; Tsuchiya, K.; Kurokawa, T. J.Antibiot. 1994, 47, 703707. 22 (a)Kondoh, M.; Usui, T.; Kobayashi, S.; Tsuchiya, K. Cancer Lett. 1997, 126, 29-32. (b) Kondoh, M.; Usui, T.; Nishikiori, T.; Mayumi, T. Biochem. J. 1999, 340, 411416.

24

Introduccin

Figura 1.18. Inmunofluorescencia de microtbulos en clulas 3Y1 de ratones. (a) Control, (b) Colchicina (1mg/mL), (c) Pironetina (50ng/mL). 6 h.

El anillo de lactona ,-insaturada de la pironetina resulta imprescindible para su actividad ya que la pironetina se une covalentemente a la tubulina mediante una adicin Michael. 23 El sitio de unin de la pironetina se encuentra en la subunidad del dmero de tubulina en la zona de unin con el siguiente dmero, lo cual corresponde a la zona de unin de la vinblastina en la -tubulina. Se ha demostrado que la pironetina se une a la tubulina mediante formacin de un enlace covalente como resultado de la adicin Michael del residuo Lys352. Tambin son importantes los enlaces de hidrgeno con la Asn258. Cuando se emplearon tubulinas modificadas, en las que se sustituyeron los aminocidos Lys352 y Asn258 por Ala, se observ que la eficiencia en la unin pironetina-tubulina disminuy un 75% y un 20% respectivamente (vase la figura 1.19). 24

23 24

Watanabe, H.; Usui, T.; Kondoh, M.; Osada, H. J. Antibiot. 2000. 53, 540545. Watanabe, H.; Usui, T.; Nakayama, H.; Tada, Y. Chem. Biol. 2004, 11, 799-806.

Captulo 1

25

Figura 1.19. La pironetina no se une eficientemente a las tubulinas mutadas N258A y K352A.

La combinacin de los resultados anteriores con modelos computacionales proporcion un modelo de unin de la pironetina a la tubulina que es el que se indica en la figura 1.20.

Figura 1.20. Interacciones presentes en el sitio de unin de la pironetina.

Como resumen destacar que la pironetina es el primer compuesto descrito que se une covalentemente a la subunidad de la tubulina y esto le hace distinto de otros agentes que interaccionan con tubulina. Debido a esto sera interesante crear nuevos frmacos anticancergenos utilizando pironetina como compuesto patrn.

26

Introduccin

1.4. Uso de molculas hbridas en qumica mdica Las molculas hbridas combinan en una nica molcula fragmentos totales o parciales procedentes de las estructuras de dos productos. Estas molculas pueden actuar de tres modos diferentes (vase la figura 1.21).25 A. Misma diana biolgica y mismo sitio de unin. B. Diferentes dianas biolgicas, actuando cada parte de la molcula independientemente con su diana. C. Misma diana biolgica pero diferentes sitios de unin. La intencin de esta doble interaccin es potenciar el efecto que tienen ambos fragmentos por separado e intentar que la nueva molcula sea ms activa que la suma de los dos compuestos (efecto sinrgico).

Figura 1.21. Ejemplos de modo de accin de molculas hbridas.

25

Meunier, B. Acc. Of Chem. Res. 2008, 41, 69-77.

2. Objetivos

Captulo 2

27

2. OBJETIVOS
El objetivo general de este trabajo es intentar comprobar si molculas hbridas de colchicina-anlogos simplificados de pironetina, unidos por cadenas alifticas de longitud variable, son capaces de promover la despolimerizacin de microtbulos ms eficientemente que ambas sustancias por separado. Esto confirmara que la molcula hbrida sintetizada produce un efecto sinrgico. Para conseguir el objetivo general del trabajo se han marcado objetivos ms concretos que se indican a continuacin: El primer objetivo de este trabajo es obtener desacetilcolchicina a partir de la colchicina para despus poder unirla a los espaciadores a travs de una reaccin de amidacin. El segundo objetivo es obtener molculas hbridas con la estructura general indica en la figura 2.1. Estas molculas tendrn una parte de colchicina, un espaciador aliftico intermedio conectado a un anlogo simplificado de pironetina de un solo esterocentro (R o S).

Figura 2.1. Estructura general de los hbridos propuestos.

Finalmente se estudiar la citotoxicidad de dichas molculas hbridas sobre dos lneas celulares cancergenas, mediante ensayos de concentracin inhibitoria 50 (IC50). Por lo tanto se determinarn las

28

Objetivos

concentraciones mnimas a las que nuestros compuestos inhiben el crecimiento celular al 50%. Ms adelante, los hbridos con mejores IC50 se enviarn a Madrid para saber si su diana es la tubulina utilizando otras tcnicas (ciclo celular, inmunofluorescencia y experimentos con tubulina aislada).

3. Resultados y Discusin

Captulo 3

29

3. RESULTADOS Y DISCUSIN
3.1. Retrosntesis general de los hbridos de colchicina En el siguiente esquema se muestra el anlisis retrosntetico general planteado para la sntesis de los hbridos de colchicina con anlogos simplificados de pironetina.

Esquema 3.1. Retrosntesis general de los hbridos de colchicina.

El anlisis retrosinttico comienza con la desconexin del enlace ster. Esta operacin forma el cido I y la lactona II. La desconexin del enlace

30

Resultados y Discusin

amdico en el compuesto I proporciona la desacetilcolchicina III y el derivado de dicido IV. La desacetilcolchicina III se obtendr de la propia colchicina.

3.2. Sntesis de desacetilcolchicina En el esquema 3.2 se muestra la sntesis de desacetilcolchicina a partir de la colchicina natural:

Esquema 3.2. Sntesis de la desacetilcolchicina

Reactivos y Condiciones: (a) (Boc)2O, Et3N, DMAP, THF, 45C, 24h. (94%); (b) MeOH sobre tamices, NaOCH3 2M en MeOH, t.a, 2h. (86%); (c) TFA 98%, t.a, 5 min. (100%).

La desacetilacin de la colchicina no se puede llevar a cabo en un solo paso de reaccin mediante hidrlisis cida debido a la isomerizacin del anillo de tropona. Es por esto que primero se activ el grupo acetilo mediante la adicin del grupo t-butiloxicarbonilo por reaccin de la colchicina con dicarbonato de di-t-butilo en tetrahidrofurano, durante 24 horas a 45C en presencia de trietilamina y de 4-N,N-dimetilaminopiridina. 26 La reaccin

26

Johansson, E.; Dubois, J.; Darbre, T.; Reymond, J.L. Biorg. Med. Chem. 2010, 18, 65896597.

Captulo 3

31

proporcion el compuesto 3.1 con un rendimiento del 94%. El compuesto 3.1 se desacetil por reaccin con metxido sdico en metanol para dar lugar al compuesto 3.2. Este compuesto se convirti en desacetilcochina mediante tratamiento con cido trifluoroactico. El mecanismo de la proteccin de aminas se detalla en el esquema 3.3 y se inicia con la adicin de la 4-N,N-dimetilaminopiridina ii al dicarbonato de dit-butilo i. Esta reaccin forma anhidrido carbnico, anin t-butxido y el carbamato iv. La fuerza impulsora de este proceso es la formacin del anhidrido carbnico que, al ser gaseoso, desplaza el equilibrio de la reaccin hacia la formacin del carbamato iv. Este compuesto es atacado por la amina, simbolizada por RNH2 en el esquema 3.3, y forma el carbamato vii. Se puede apreciar en el mecanismo que no hay consumo neto de 4-N,Ndimetilaminopiridina ii.

Esquema 3.3. Mecanismo de proteccin con Boc.

El mecanismo de la desproteccin del grupo Boc en medio cido se detalla en el esquema 3.4. El proceso se inicia con la protonacin del grupo carbonilo por reaccin del carbamato vii con cido trifluoroactico. La especie

32

Resultados y Discusin

protonada resultante viii experimenta la prdida del relativamente estable carbocatin t-butilo. Este proceso genera el cido carbmico ix que es inestable y se descarboxila espontneamente para dar lugar a la amina RNH2.

Esquema 3.4. Mecanismo de desproteccin con TFA.

3.3. Unin de la desacetilcolchicina a los espaciadores 3.3.1. Sntesis de los espaciadores Los espaciadores se sintetizaron a partir de dicidos con diferentes longitudes de cadena, los cuales se esterificaron en medio cido metanlico. Posteriormente se sometieron a una reaccin de monosaponificacin en medio bsico utilizando como disolvente una mezcla de CH3CN y Et2O, en la que se consiguen mejores rendimientos. Variando la relacin de los disolventes, en funcin de la lipofilia del dister, se consigue aumentar sustancialmente el rendimiento en la formacin del monoster.27 Para el espaciador de n=3 no es necesario ningn tratamiento previo puesto que en este caso se emple en la reaccin de amidacin el anhdrido glutrico.

27

Lodyato, V.; Yurkova, I. Bioorg. Med. Chem, 2004, 14, 4253-4256.

Captulo 3

33

Esquema 3.5: Sntesis de los espaciadores 3.4b-d

Reactivos y Condiciones: (a) H2SO4 (95-97%), MeOH, 65C, 18 h; (b) KOH en MeOH, CH3CN:Et2O (1.2:1) a 0C, 48h; 3.6b (14%, 2 pasos), 3.6c (20%, 2 pasos), 3.6d (77%, 2 pasos)

El mayor problema de la reaccin b es la obtencin del dicido conjuntamente con el monoster. Esto conlleva pasos de purificacin adicionales para conseguir los compuestos 3.6b-d (extraccin lquido-lquido y cromatografa) y rendimientos bajos, como se observa en la sntesis de 3.6b y 3.6c.

3.3.2. Unin de los espaciadores a la desacetilcolchicina Una vez obtenidos los espaciadores 3.6b-d y la desacetilcolchicina 3.3 el siguiente paso de la sntesis se dirigi a la conexin de estos fragmentos. 28 En primer lugar se obtuvo el cido 3.9a por reaccin entre la desacetilcolchicina y el anhidrido glutrico. Este proceso se llev a cabo en DMSO en presencia de 4-metilmorfolina y proporcion el cido 3.9a con un 64% de rendimiento (esquema 3.6).

28

Montalbetti, C.; Falque V. Tetrahedron 2005, 61, 10827-10852.

34

Resultados y Discusin

Esquema 3.6. Sntesis del cido 3.9a

Reactivos y Condiciones: (a) 4-metilmorfolina, DMSO, t.a, 45 min; 3.1a (64%).

Los hibridos restantes se obtuvieron a partir de la desacetilcolchicina en una secuencia en dos pasos, tal y como se indica en el esquema 3.7. As, los acidosteres 3.6 se sometieron a la reaccin de acoplamiento con la desacetilcolchicina 3.3 en presencia de diciclohexilcarbodiimida y 4-N,Ndimetilaminopiridina. Estas reacciones proporcionaron los amidosteres 3.8 que por saponificacin condujeron a los amidocidos 3.9.

Esquema 3.7. Sntesis de los cidos carboxlicos 3.9b-d

Reactivos y Condiciones: (a) DCC, DMAP, t.a, 3h; 3.8b (70%), 3.8c (78%), 3.8d (70%). (b) LiOH en H2O, MeOH, t.a, 6h; 3.9b (64%), 3.9c (51%), 3.9d (62%).

Captulo 3

35

3.4. Sntesis de los hbridos de colchicina con anlogos simplificados de pironetina A continuacin se describe la obtencin de los hbridos finales por reaccin de esterificacin entre los compuestos 3.9a-d y los anlogos simplificados de pironetina 3.10 y 3.12. Para llevar a cabo esta reaccin se eligi la metodologa de Yamaguchi. 29 Dicha reaccin permite preparar steres altamente funcionalizados con muy buenos rendimientos.30 En este trabajo se han llevado a cabo ocho esterificaciones de Yamaguchi lo que ha permitido la obtencin de ocho productos finales, tal y como se muestra en los esquema 3.8 y 3.9.

Esquema 3.8. Sntesis de los hbridos finales colchicina-anlogos simplificados de pironetina

Reactivos y Condiciones:(a) Cloruro de triclorobenzolo, Et3N, CH2Cl2, r.t, 5 h; luego adicin de 3.10 en CH2Cl2, DMAP, r.t, 10 min. 3.11a (33%), 3.11b (50%), 3.11c (45%), 3.11d (57%).

29

Inanaga, J.; Hirata, K.; Saeki, H.; Katsuki, T.; Yamaguchi,M. Bull. Chem. Soc. Jpn. 1979, 52, 1989 - 1993. 30 http://www.organic-chemistry.org/namedreactions/yamaguchi-esterification.shtm

36

Resultados y Discusin

Esquema 3.9. Sntesis de los hbridos finales colchicina-anlogos simplificados de pironetina

Reactivos y Condiciones:(a) Cloruro de triclorobenzolo, Et3N, CH2Cl2, r.t, 5 h; luego adicin de 3.12 en CH2Cl2, DMAP, r.t, 10 min. 3.13a (44%), 3.13b (67%), 3.13d (54%).

Cabe destacar que el compuesto 3.13c no pudo separarse de los productos de partida (concretamente del ster 3.8c de la reaccin anterior) y por lo tanto no aparece el rendimiento de la reaccin de esterificacin. La reaccin de Yamaguchi se lleva a cabo en dos pasos, en el primero se disuelven los compuestos 3.9a-d en diclorometano y bajo atmsfera de N2 se aade Et3N y el reactivo de Yamaguchi hasta la formacin del anhdrido mixto intermedio. Esta etapa es la ms lenta de la reaccin y puede llevar hasta 5 horas. A continuacin se aaden una disolucin del compuesto 3.10 ( 3.12), en CH2Cl2 y DMAP slido. El compuesto final se forma rpidamente debido a la elevada reactividad del anhdrido mixto intermedio. El mecanismo de la reaccin se detalla en el esquema 3.10. El primer paso del mecanismo es la abstraccin del protn del cido carboxlico, simbolizado en el esquema 3.10 como RCOOH, por reaccin con la base Et3N. El carboxilato ix reacciona con el cloruro de 2,4,6triclorobenzoilo x y forma el anhidrido mixto xi.

Captulo 3

37

Esquema 3.10. Mecanismo de reaccin de la esterificacin de Yamaguchi.

Una vez formada la especie xi se aade DMAP, que acta como agente de transferencia de grupo acilo, reaccionando con el grupo carbonilo estricamente menos impedido de xi. En esta reaccin se expulsa el carboxilato del cido 2,4,6-tricolorobenzoico xiii. Cabe destacar que en este paso se pierde la aromaticidad de la DMAP, dato importante para facilitar la reaccin en el siguiente paso de reaccin. El alcohol, representado en el esquema anterior como ROH, ataca al carbonilo de la especie xiv. En este proceso se forma el ster RCOOR y se regenera la DMAP, que recupera su aromaticidad. Conviene mencionar que en esta reaccin no hay consumo neto de DMAP, ya que acta como transferidor de grupos acilo en el paso final de la esterificacin de Yamaguchi.

38

Resultados y Discusin

3.5. Ensayos biolgicos Para determinar la actividad citotxica de los ocho hbridos sintticos se han utilizado ensayos de concentracin inhibitoria 50 (IC50). El IC50 es la concentracin a la cual se inhibe el crecimiento celular del 50% de clulas de un determinado cultivo. Por lo tanto, valores bajos de IC50 implican una elevada actividad citotxica del compuesto en cuestin. Los ensayos se realizaron con las lneas HT-29 (adenocarcinoma de coln) y A2780 (cncer de ovario). Para llevar a cabo el experimento de IC50, se utilizaron placas de 8 pocillos con la misma cantidad de clulas en cada uno de ellos. Se aadieron, utilizando la misma cantidad de DMSO en todos los casos, el siguiente gradiente de concentraciones de compuesto activo: 0 (blanco) - 100 - 50 - 25 12.5 - 6.25 - 3.12 - 1.56 - 0.78 g/mL. Se incubaron las clulas durante 24h y se realiz una primera observacin al microscopio. Cuando un compuesto bloquea las clulas en mitosis stas adquieren una forma redondeada en el pocillo de cultivo. En la figura 3.1 se pueden observar tres fotografas correspondientes al cultivo celular control: parte A, control de DMSO; parte B, clulas tratadas con el hbrido 3.11a; parte C, clulas tratadas con colchicina.

Figura 3.1. Efecto de diferentes compuestos sobre la morfologa de las clulas HT-29 a las 24 h de la adicin. (A) Control, (B) 3.11a 100 g/mL, (C) Colchicina 100 g/mL.

Captulo 3

39

Se puede apreciar la forma redondeada que adquieren en la parte B las clulas tratadas con el hbrido 3.11a, lo que indica que este compuesto es capaz de parar el ciclo celular en la fase de mitosis. Una vez se observaron las clulas, se dejaron incubando hasta las 48h y luego se les adicion MTT (bromuro de metil-tiazolil-difenil-tetrazolio) soluble en DMSO. 31 Si una clula est viva su accin mitocondrial reduce el MTT a formazn, que precipita en el medio intracelular. El precipitado es de color violeta intenso y se podr cuantificar la cantidad de clulas vivas por espectroscopia de UV-visible (vase la figura 3.2).

Figura 3.2. Reduccin de MTT a formazn.

Tres horas despus de la adicin se aade ms DMSO a cada pocillo provocando la lisis celular y la solubilizacin del formazan. A continuacin se mide la absorbancia a 490 nm ( de absorcin mxima del formazn) y a 630 nm ( de absorcin mxima de los componentes intracelulares). La diferencia entre ambas nos da el valor de A. La representacin del valor de A frente a la concentracin, seguida de un ajuste logartmico, proporciona el IC50.

31

Mosmann, T. J. Immun. Methods. 1983, 65, 5563.

40

Resultados y Discusin

En la tabla 3.1 se indican los valores de IC50 de los hbridos sintticos en las lneas celulares HT-29 y A2780.
Tabla 3.1. Valores de IC50 de los hbridos sintticos Compuesto HT-29 Colchicina 3.11a 3.11b 3.11c 3.11d 3.13a 3.13b 3.13d
[a]

IC50 [b] [g/mL] A2780 10 2 62 10 1 0.3 0.1 21 5.1 0.7 51 21 -13 4 13 5 72 -41 9 26 4 28 5

Valores de IC50 para lo hbridos finales obtenidos. Los valores sustituidos por tenan un error demasiado elevado para ser [b] presentados en la tabla. Los valores se dan como la media desviacin estndar de tres experimentos independientes.

El compuesto 3.13c, no se ha incluido en la tabla porque no puedo ser separado del ster progenitor.

4. Resumen y Conclusiones

Captulo 4

41

4. RESUMEN Y CONCLUSIONES
4.1. Sntesis de los hbridos 3.11a-d y 3.13a-d Despus de realizar las ocho sntesis de los hbridos se han extrado las siguientes conclusiones concernientes a los procedimientos utilizados: En primer lugar, hay que destacar los buenos rendimientos obtenidos en la desacetilacin de la colchicina siguiendo el procedimiento descrito en la referencia 25. Prcticamente las tres reacciones de la secuencia sinttica se consiguen llevar a cabo casi de forma cuantitativa y no se produce en ningn caso la isomerizacin del anillo de tropona.

En las reacciones de Yamaguchi es de suma importancia detectar la

presencia del anhdrido mixto intermedio mediante TLC. Si no se consigue detectar se debe dejar ms tiempo la reaccin con el cloruro de triclorobenzolo para obtener rendimientos de reaccin decentes.

En el paso de reaccin descrito en el apartado 3.3.2 (reaccin c) se

debe separar con sumo cuidado el ster que quede sin reaccionar del cido carboxlico formado, ya que de lo contrario se obtendr en el siguiente paso de reaccin (esterificacin de Yamaguchi) el hbrido contaminado con el ster inicial. Este es el problema ocurrido con el hbrido 3.13c, contaminado e imposible de separar del ster progenitor.

42

Resumen y Conclusiones

4.2. Evaluacin biolgica A pesar de carecer de la totalidad de los datos que se podran haber obtenido de las citotoxicidades se pueden comentar varias conclusiones importantes: En general, todos los compuestos son ms activos frente a la lnea celular A2780 que frente a la HT-29. En la lnea celular HT-29 son ms activos los compuestos de configuracin absoluta R (3.11a-d) que los S (3.13a-d). Esto nos indica que el estereocentro del anillo de lactona es importante en la interaccin con los microtbulos. En la lnea celular A2780 todos los compuestos hbridos obtenidos son ligeramente ms activos que la colchicina. Esto nos confirma un posible efecto sinrgico al unir en una misma molcula dos sustancias activas frente a tubulina. En la grfica 4.1 se comparan los valores de IC50 de los hbridos sintticos obtenidos en las lneas celulares A2780 y HT-29. Comparando todos los valores se puede concluir que el compuesto ms activo en ambas lneas celulares el 3.11c.

Captulo 4

43

50 IC50 (g/mL) 40 30 20 10 0 A2780 HT-29

Figura 4.1. Grfica de los valores de IC50 de los hbridos finales.

5. Parte Experimental

Captulo 5

45

5. PARTE EXPERIMENTAL
5.1. Tcnicas generales Los espectros de RMN fueron registrados en espectrmetros Varian Unity de 300 y 500 (frecuencias aproximadas de operacin, 300 y 500 MHz para 1H; 75 y 125 MHz para
13

C). Las asignaciones de las seales se han llevado a

cabo mediante correlaciones heteronucleares bidimensionales (COSY y HMQC/HMBC). Los desplazamientos qumicos estn indicados en (ppm) y se midieron en CDCl3 como disolvente, utilizando las seales de ste ltimo como referencia. En el caso de las multiplicidades en el 1H-RMN se han usado s cuando se trata de un singulete, d para doblete, t para triplete, q para cuadruplete, quint para quintuplete, sext para sextuplete, hept para heptuplete, m para multiplete, br cuando se trata de una seal ancha y app cuando se trate de una seal con una multiplicidad aparente. Los espectros de IR se obtuvieron en un espectrmetro Jasco FT/IR-6200, abarcando la regin 4000-600 cm-1. Los espectros de masas se midieron en un espectrmetro de masas QTOF (Waters, Manchester, UK) con fuente de ionizacin combinada electrospray y APCI con diseo Z-spray; la tensin capilar de 3,5 KV se utiliz en el sentido positivo y la tensin de cono se estableci en 20 V. Para la cromatografa de capa fina se utilizaron cromatofolios de gel de slice de Macherey-Nagel. Los disolventes THF, CH2Cl2, CH3CN y ter se secaron mediante un sistema de purificacin de solventes MBRAUN modelo MB-SPS-800 series. La trietilamina se destil sobre hidrxido potsico. El MeOH y el DMSO se destilaron y se guardaron sobre tamices de 3. Los reactivos disponibles comercialmente se utilizaron sin tratamiento previo, directamente de Aldrich, Fluka o Acros. Los reactivos sensibles al aire se utilizaron bajo atmsfera de nitrgeno evitando en todo momento el contacto con el aire y humedad.

46

Parte Experimental

5.2. Procedimientos experimentales

Sntesis del compuesto 3.1

A una disolucin de colchicina (1.98 g, 5 mmol) en THF anhdro (25 mL) se le aadi secuencialmente, con agitacin y bajo atmsfera de N2, (Boc)2O (5.45 g, 25 mmol, 5 eq), Et3N (0.7 mL, 4.75 mmol, 0.95 eq) y DMAP (0.85 g, 4 mmol, 0.8 eq). La mezcla de reaccin se calent a 45C y se mantuvo a esta temperatura durante 24 h. A continuacin se elimin el disolvente de la reaccin a vaco y el residuo resultante se cromatografo sobre gel de slice utilizando como fase mvil una mezcla Hexano-AcOEt (2:8) obtenindose 2.323 g de 3.6 (94%) como un slido amarillento. Las propiedades fsicas y espectroscpicas obtenidas estn de acuerdo con las descritas previamente en la bibliografa. 32

Sntesis del compuesto 3.2

32

Lagnoux, D.; Darbre, T.; Schmitz, ML. Chem. Eur.. J. 2005, 11, 3497.

Captulo 5

47

A una disolucin de 3.1 (2.32 g, 4.65 mmol) en MeOH anhidro (3.8 mL) se le aadi, bajo atmsfera de N2 y con agitacin magntica, una disolucin de NaOCH3 2M en MeOH (0.47 mL, 0.94 mmol). La mezcla de reaccin se agit durante 2 horas ms. A continuacin se elimin el disolvente en el rotavapor, obtenindose el producto crudo 3.7 como un aceite amarillento (1.82 g, 86%) que se puede utilizar sin purificacin en el siguiente paso de reaccin. Las propiedades fsicas y espectroscpicas obtenidas estn de acuerdo con las descritas previamente en la bibliografa.32

Sntesis del compuesto 3.3

A una disolucin del compuesto 3.2 (1.82 g, 3.98 mmol) se le aadi, bajo corriente de N2 y agitacin, TFA (3.1 mL) y la mezcla se mantuvo a temperatura ambiente durante 2 horas. A continuacin se eliminaron a vaco los productos voltiles y el residuo obtenido se cromatografa sobre gel de slice utilizando como fase mvil una mezcla de Hexano-AcOEt (9:1), obtenindose el producto 3.3 de forma cuantitativa como un slido amarillento. Las propiedades fsicas y espectroscpicas obtenidas estn de acuerdo con las descritas previamente en la bibliografa.32

48

Parte Experimental

Sntesis del compuesto 3.11a

A una disolucin de 3.9a (0.15 g, 0.25 mmol) en CH2Cl2 seco (5 mL) se le aadi, bajo atmsfera de N2 y agitacin, Et3N (0.1 mL, 0.75 mmol, 3 eq) y cloruro de 2,4,6-triclorobenzolo (53 L, 0.5 mmol, 2 eq). La mezcla de reaccin se agit a temperatura ambiente durante 5 horas. (La formacin del anhdrido mixto se monitoriza mediante TLC). A continuacin, se aadi DMAP slido (45 mg, 0.38 mmol, 1.5 eq) y una disolucin de 3.10 (45 mg, 0.25 mmol, 1 eq) en CH2Cl2 (2.5 mL). Se pudo observar la formacin del hbrido por TLC a los 10-15 minutos de la adicin. Luego se verti el crudo de reaccin sobre una disolucin acuosa saturada de NH4Cl y la fase acuosa se extrajo tres veces con CH2Cl2. Las fases orgnicas reunidas se secaron con MgSO4. Luego se filtr y se elimin el disolvente a vaco. El crudo resultante se cromatografi sobre gel de slice utilizando primero como fase mvil una mezcla Hexano-AcOEt (2:8) y finalmente CH2Cl2:MeOH (98:2), lo que proporcion 53 mg de 3.11a (33%) como un aceite amarillento.
[ ]D -123.7 (c 0.788, CHCl3) IR mx 3283 cm , 1728 cm .
1 -1 -1

H NMR (500 MHz, CDCl3) 7.43 (s, 1H), 7.42 (d, J = 6.7 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.88 6.83 (m, J = 9.6, 5.5, 3.0 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.98 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.60 (dt, J = 12.9, 6.7 Hz, 1H), 4.45 4.38 (m, 1H), 4.03

Captulo 5

49

3.97 (m, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.48 (dd, J = 13.4, 6.3 Hz, 1H), 2.39 2.12 (m, 9H), 1.90 1.80 (m, 3H), 1.80 1.68 (m, 1H), 1.68 1.51 (m, 4H), 1.46 1.27 (m, 2H).
13

C NMR (125 MHz, CDCl3) 179.28, 173.01, 171.75, 164.45 (C=O). 163.84, 153.32, 151.58, 151.04, 141.50, 136.36, 134.09, 125.54 (C). 145.09, 135.02, 130.58, 121.17, 112.30, 107.25, 77.71, 52.02 (CH). 64.06, 36.55, 34.84, 34.52, 33.42, 29.78, 29.21, 28.25, 25.59, 24.28, 20.52 (CH2). 61.38, 61.20, 56.20, 55.98 (CH3). HR ESI/MS m/z 638.2969 (M+H+). Calculada para C35H44NO10, 638.2965.

Sntesis del compuesto 3.11b

El compuesto 3.9b (0.111 g, 0.22 mmol) y el alcohol 3.10 (40 mg, 0.22 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de HexanoAcOEt (2:8) y finalmente CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 75 mg (50%) de 3.11b como un aceite amarillento.
[ ]D -136.8 (c 1.3, CHCl3) IR mx 3287 cm , 1725 cm .
1 -1 -1

H NMR (500 MHz,CDCl3) 7.80 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.43 (s, 1H), 7.22 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.77 (m, 1H), 6.78 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 6.45 (s, J = 24.3 Hz, 1H), 5.90 (d, J = 9.8

50

Parte Experimental

Hz, 1H), 4.62 4.46 (m, 1H), 4.39 4.26 (m, 1H), 3.94 (t, J = 6.6 Hz, 1H), 3.90 (s, 2H), 3.83 (s, 3H), 3.80 (s, 3H), 3.56 (s, 3H), 2.53 2.32 (m, 1H), 2.32 2.20 (m, 3H), 2.20 2.02 (m, 5H), 1.80 (m, 1H), 1.69 (m, 1H), 1.61 1.41 (m, 9H), 1.38 1.23 (m, 3H), 1.21 1.07 (m, 5H).
13

C NMR (126 MHz, CDCl3) 179.06, 173.38, 172.54, 164.21 (C=O). 163.63, 153.09, 151.90, 150.8, 141.23, 136.35, 133.98, 125.35 (C). 145.00, 134.88, 130.32, 120.88, 112.27, 107.05, 77.51, 51.90 (CH). 63.66, 36.16, 35.55, 34.34, 33.87, 29.59, 29.00, 28.56, 28.42, 28.13, 25.37, 24.89, 24.40, 24.09 (CH2). 61.19, 60.97, 56.05, 55.77 (CH3). HR ESI/MS m/z 680.3436 (M+H+). Calculada para C38H50NO10, 680.3435.

Sntesis del compuesto 3.11c

El compuesto 3.11c (0.070 g, 0.12 mmol) y el alcohol 3.10 (22 mg, 0.12 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de HexanoAcOEt (2:8) y finalmente CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 40 mg (45%) de 3.11c como un aceite amarillento.
[ ]D -51.9 (c 1.4, CHCl3) IR mx 3279 cm , 2861-2938 cm , 1725 cm .
-1 -1 -1

Captulo 5

51

H NMR (500 MHz, CDCl3) 7.45 (s, 1H), 7.44 (d, J = 8.9 Hz, 1H), 7.26 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 6.84 (ddd, J = 8.1, 4.6, 2.1 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 10.9 Hz, 1H), 6.48 (s, 1H), 5.99 5.95 (m, 1H), 4.64 4.56 (m, 1H), 4.43 4.35 (m, J = 11.9, 8.6, 5.0 Hz, 1H), 4.01 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.89 (s, J = 0.7 Hz, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.61 (s, 3H), 2.46 (dd, J = 13.3, 6.2 Hz, 1H), 2.37 2.26 (m, 3H), 2.19 (ddd, J = 12.3, 10.9, 5.9 Hz, 5H), 1.86 1.71 (m, 2H), 1.65 1.46 (m, 7H), 1.43 1.28 (m, 4H), 1.24 1.13 (m, J = 16.6 Hz, 12H).
13

C NMR (126 MHz, CDCl3) 179.26, 173.71, 172.77, 164.34 (C=O). 163.79, 153.26, 151.84, 151.03, 141.47, 136.43, 134.08, 125.54 (C). 144.97, 134.98, 130.50, 121.17, 112.31, 107.21, 77.65, 51.98 (CH). 63.83, 36.47, 35.97, 34.54, 34.16, 29.77, 29.19, 29.15, 29.08, 28.99, 28.90, 28.33, 25.56, 25.22, 24.80, 24.30 (CH2). 61.39, 61.16, 56.18, 55.95 (CH3). HR ESI/MS m/z 736.4056 (M+H+). Calculada para C42H58NO10, 736.4061.

Sntesis del compuesto 3.11d

El compuesto 3.9d (0.093 g, 0.15 mmol) y el alcohol 3.10 (30 mg, 0.15 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de HexanoAcOEt (2:8) y finalmente CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 68 mg (57%) de 3.11d como un aceite amarillento.
[ ]D -88.7 (c 1.38, CHCl3)

52

Parte Experimental
-1 -1 -1

IR mx 3285 cm , 2853-2926 cm , 1731 cm .
1

H NMR (500 MHz, CDCl3) 7.47 (d, 1H), 7.47 (s, 1H), 7.27 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.84 (ddd, J = 5.2, 4.5, 2.5 Hz, 1H), 6.81 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.97 (d, J = 7.4 Hz, 1H), 4.67 4.54 (m, 1H), 4.45 4.32 (m, 1H), 4.05 3.98 (m, 2H), 3.95 (s, 1H), 3.89 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.61 (s, 1H), 2.52 2.40 (m, 1H), 2.39 2.09 (m, 8H), 1.89 1.69 (m, 2H), 1.68 1.45 (m, 8H), 1.45 1.30 (m, 3H), 1.20 (m, 24H).
13

C NMR (126 MHz, CDCl3) 179.28, 173.73, 172.82, 164.31 (C=O). 163.81, 153.28, 151.89, 151.05, 141.49, 136.49, 134.09, 125.55 (C). 144.91, 135.02, 130.51, 121.20, 112.38, 107.23, 77.64, 52.00 (CH). 63.84, 36.51, 36.01, 34.60, 34.18, 29.79, 29.42, 29.39, 29.26, 29.21, 29.15, 29.06, 28.96, 28.35, 25.57, 25.26, 24.82, 24.32 (CH2). 61.40, 61.17, 56.19, 55.95 (CH3). HR ESI/MS m/z 792.4691 (M+H+). Calculada para C46H66NO10, 792.4687.

Sntesis del compuesto 3.13a

El compuesto 3.9a (0.148 g, 0.32 mmol) y el alcohol 3.12 (60 mg, 0.32 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de HexanoAcOEt (2:8) y finalmente con CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 90 mg (44%) de 3.13a como un aceite amarillento.
[ ]D -54.7 (c 1.244, CHCl3)

Captulo 5

53
-1 -1 -1

IR mx 3286 cm , 2861-2938 cm , 1721 cm .
1

H NMR (500 MHz, CDCl3) 7.67 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.40 (s, 1H), 7.22 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.84 6.80 (m, 1H), 6.78 (d, J = 11.1 Hz, 1H), 6.46 (s, 1H), 5.91 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.58 4.51 (m, 1H), 4.38 4.30 (m, 1H), 3.94 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.85 (s, 3H), 3.81 (s, 3H), 3.57 (s, 3H), 2.43 (dd, J = 13.4, 6.2 Hz, 1H), 2.30 (dd, J = 12.8, 6.9 Hz, 1H), 2.27 2.13 (m, 7H), 1.85 1.76 (m, 1H), 1.76 1.66 (m, 1H), 1.62 1.40 (m, 5H), 1.37 1.23 (m, 4H).
13

C NMR (126 MHz, CDCl3) 179.11, 172.81, 171.68, 164.29 (C=O). 163.68, 153.15, 151.64, 150.85, 141.29, 136.29, 133.99, 125.38 (C). 145.09, 134.92, 130.41, 120.92, 112.25, 107.11, 77.60, 51.91 (CH). 63.87, 36.28, 34.60, 34.36, 33.29, 32.20, 29.62, 29.06, 28.10, 25.42, 24.16 (CH2). 61.20, 61.02, 56.07, 55.82 (CH3). HR ESI/MS m/z 638.2969 (M+H+). Calculada para C35H44NO10, 638.2965.

Sntesis del compuesto 3.13b

El compuesto 3.9b (0.060 g, 0.12 mmol) y el alcohol 3.12 (22 mg, 0.12 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de HexanoAcOEt (2:8) y finalmente con CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 55 mg (67%) de 3.13b como un aceite amarillento.

54

Parte Experimental

[ ]D -69.8 (c 0.8, CHCl3) IR mx 3284 cm , 2860-2936 cm , 1721 cm .
1 -1 -1 -1

H NMR (500 MHz, CDCl3) 7.46 (s, 1H), 7.43 (d, J = 6.5 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.87 6.83 (m, 1H), 6.82 (d, J = 10.8 Hz, 1H), 6.50 (s, 1H), 5.97 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 4.61 (dt, J = 12.9, 6.6 Hz, 1H), 4.42 4.35 (m, 1H), 4.00 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.96 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.51 2.45 (m, 1H), 2.39 2.27 (m, 3H), 2.24 2.12 (m, 6H), 1.88 1.72 (m, 2H), 1.68 1.46 (m, 7H), 1.45 1.29 (m, 3H), 1.26 1.19 (m, 4H).
13

C NMR (126 MHz, CDCl3) 179.28, 173.59, 172.61, 164.37 (C=O). 163.82, 153.30, 151.81, 151.04, 141.49, 136.45, 134.09, 125.54 (C). 145.02, 135.03, 130.52, 121.17, 112.35, 107.23, 77.69, 52.02 (CH). 63.85, 36.51, 35.84, 34.55, 34.06, 29.78, 29.21, 28.74, 28.59, 28.32, 25.56, 25.07, 24.59, 24.30 (CH2). 61.39, 61.18, 56.20, 55.96 (CH3). HR ESI/MS m/z 680.3433 (M+H+). Calculada para C38H50NO10, 680.3435.

Sntesis del compuesto 3.13c

El compuesto 3.9c (0.060 g, 0.12 mmol) y el alcohol 3.12 (22 mg, 0.12 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de Hexano-

Captulo 5

55

AcOEt (2:8) y finalmente con CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 55 mg de 3.11c contaminado con productos de partida.

Sntesis del compuesto 3.13d

El compuesto 3.9d (0.093 g, 0.15 mmol) y el alcohol 3.12 (30 mg, 0.15 mmol, 1 eq) se sometieron a las mismas condiciones de reaccin utilizadas en la sntesis del hbrido 3.11a. Despus del procesado de la reaccin, el residuo resultante se cromatografi sobre gel de slice con una mezcla de HexanoAcOEt (2:8) y finalmente con CH2Cl2-MeOH (98:2), obtenindose 64 mg (54%) de 3.13d como un aceite amarillento.
[ ]D -25.2 (c 1.986, CHCl3) IR mx 3288 cm , 2853-2926 cm , 1731 cm .
1 -1 -1 -1

H NMR (500 MHz, CDCl3) 7.46 (s, 1H), 7.45 (d, J = 6.9 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 10.7 Hz, 1H), 6.88 6.83 (m, 1H), 6.81 (d, J = 11.3 Hz, 1H), 6.49 (s, 1H), 5.98 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 4.66 4.57 (m, 1H), 4.44 4.34 (m, 1H), 4.02 (t, J = 6.6 Hz, 2H), 3.95 (s, 3H), 3.90 (s, 3H), 3.86 (s, 3H), 3.62 (s, 3H), 2.47 (dd, J = 13.3, 6.2 Hz, 1H), 2.40 2.27 (m, 3H), 2.27 2.21 (m, 3H), 2.21 2.11 (m, 1H), 1.88 1.72 (m, 2H), 1.68 1.46 (m, 8H), 1.46 1.30 (m, 4H), 1.30 1.07 (m, J = 34.6 Hz, 20H).
13

C NMR (126 MHz, CDCl3) 179.29, 173.73, 172.80, 164.30 (C=O). 163.82, 153.29, 151.89, 151.06, 141.50, 136.46, 134.09, 125.56 (C). 144.91, 135.00, 130.50, 121.21, 112.34, 107.23, 77.65, 52.00 (CH). 63.85, 36.51, 36.02, 34.57, 34.19, 29.79, 29.43,

56

Parte Experimental

29.39, 29.27, 29.22, 29.16, 29.07, 28.96, 28.36, 25.58, 25.26, 24.83, 24.33 (CH2). 61.42, 61.18, 56.19, 55.96 (CH3). MR ESI/MS m/z 792.4686 (M+H+). Calculada para C46H66NO10, 792.4687.

6. Espectros Seleccionados

Captulo 6

57

58

Espectros Seleccionados

Captulo 6

59

60

Espectros Seleccionados

Captulo 6

61

62

Espectros Seleccionados

Captulo 6

63

64

Espectros Seleccionados

Captulo 6

65