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1 INTRODUO

As protenas so as molculas orgnicas mais abundantes e importantes nas clulas e perfazem 50% ou mais de seu peso seco. So encontradas em todas as partes de todas as clulas, uma vez que so fundamentais sob todos os aspectos da estrutura e funo celulares. Existem muitas espcies diferentes de protenas, cada especializada para uma funo biolgica diversa. Alm disso, a maior parte da informao gentica expressa pelas protenas. Entretanto, pertencem classe dos peptdeos, pois so formadas por aminocidos ligados entre si por ligaes peptdicas. Uma ligao peptdica a unio do grupo amino (NH 2 ) de um aminocido com o grupo carboxila (-COOH) de outro aminocido, atravs da formao de uma amida.

FIGURA 1 Ligao peptdica Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABspsAH/reacoes-coloracao-precipitacao-proteinas.

So os constituintes bsicos da vida: tanto que seu nome deriva da palavra grega "proteios", que significa "em primeiro lugar". Nos animais, as protenas correspondem a cerca de 80% do peso dos msculos desidratados, cerca de 70% da pele e 90% do sangue seco. Mesmo nos vegetais as protenas esto presentes. Todavia, todas as protenas, independentemente de sua funo ou espcie de origem, so construdas a partir de um conjunto bsico de vinte aminocidos, arranjados em vrias seqncias especficas. 1.1 Reaes de colorao Devido s ligaes peptdicas e a presena de diferentes aminocidos, as protenas reagem com uma variedade de reagentes formando produtos coloridos. Algumas reaes so especficas para aminocidos encontrados na composio de protenas outras so gerais porque caracterizam grupamentos comuns a todas as protenas, ou

seja, grupos amino e ligaes peptdicas. No entanto, essas reaes so importantes tanto na deteco, como na dosagem de aminocidos e protenas.

1.1.2 Reao da ninhidrina A reao da Ninhidrina de extrema importncia na Bioqumica e utilizada na deteco de aminocidos por ter a caracterstica amina primria. Por ser um agente oxidante muito poderoso, a ninhidrina reage com o aminocido da cadeia, dando origem a um composto de cor prpura.

1.1.3 Reao do biureto O reagente de biureto um reagente analtico feito de hidrxido de potssio (KOH) e sulfato de cobre (II) (CuSO4), junto com tartarato de sdio e potssio (KNaC4H4O64H2O). Este reagente de colorao azul torna-se violeta na presena de protenas e muda para rosa quando combinado com polipeptdeos de cadeia curta. O esquema abaixo representa um modelo da formao desse complexo:

FIGURA 2 Estrutura do complexo Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABspsAH/reacoes-coloracao-precipitacao-proteinas.

1.2 Reaes de precipitao A solubilidade de uma protena muito varivel e depende da distribuio e da proporo dos grupos polares (hidroflicos) e apolares (hidrofbicos) na molcula. Contudo, muitas protenas so solveis em gua ou em solues salinas, desde que, uma protena possua vrios grupos carregados positiva ou negativamente provenientes das

cadeias laterais dos aminocidos. Assim, se a interao protena-gua for pequena, esta tender a ser insolvel. Por outro lado, se a interao protena-gua for alta, a protena tender a ser solvel.

1.2.1 Precipitao por reao com os reagentes para alcalides Os nions de alcalides (TCA) so capazes de se combinar com protenas que possuam resduos de aminocidos na forma de ctions, formando complexos insolveis que se precipitam e caracterizam a desnaturao.

1.2.2 Precipitao por sais de metais pesados

Em pH situado ao lado alcalino do seu pI (ponto isoeltrico), algumas protenas combinam-se com ctions de metais pesados formando proteinatos insolveis. 1.3 Efeito da fora inica sobre a solubilidade (salting-in)

Em baixas concentraes de sais (baixa fora inica), a solubilidade em geral aumenta, pois os ons salinos tendem a se associar s protenas contribuindo para uma hidratao e/ou repulso entre as molculas, aumentando a solubilidade (salting in). 1.3.1 Precipitao sem desnaturao (salting-out)

A capacidade dos sais neutros de influenciar a solubilidade das protenas uma funo de sua fora inica, que tanto depende de sua concentrao como da valncia de ctions e nions que formam o sal. Em altas foras inicas, conseguidas pela adio de grandes quantidades de um sal muito solvel (por exemplo, o sulfato de amnio) a uma soluo de protena, pode ocorrer remoo de molculas de gua de hidratao das protenas, o que leva predominncia das interaes protena-protena, resultando em precipitao, fenmeno conhecido como salting-out.

1.4 Precipitao por calor

O calor pode desnaturar a maioria das protenas, pois a agitao trmica afeta as interaes que estabilizam a estrutura tridimensional das protenas, como por exemplo, as pontes de hidrognio.

Fonte: http://www.ebah.com.br/content/ABAAABspsAH/reacoes-coloracao-precipitacao-proteinas

2 OBJETIVOS

Caracterizar a presena de protena em material; Verificar experimentalmente a precipitao de protenas com e sem desnaturao; Relacionar as observaes prticas com a teoria de propriedades gerais. Estrutura e isolamento de protenas.

3 MATERIAIS E REAGENTES

Pipeta graduada de 10 mL; Pipetador automtico; Estante para tubos de ensaio; 11 tubos de ensaio; 4 conta gotas; gua destilada; Soluo de albumina; Suco artificial. Equipamento para banho maria; Soluo de ninhidrina a 0,1%; Leite, NaOH 2,5 M; CuSO4 a 1%; Bico de Bunsen; Pina de madeira; TCA (cido tricloroactico) a 10%; Pb(C2H3O2)2 (acetato de chumbo) a 5%; Basto de vidro; Bquer de 100 mL; Soluo de NaCl 1M; Soluo obtida no experimento (salting-in); Soluo saturada de (NH4)2SO4 (sulfato de amnio): 76,6%.

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4 METODOLOGIA

4. 1 Reao da ninhidrina

Inicialmente, pipetou-se 2 ml da soluo de ninhidrina em 4 tubos de ensaios enumerados de 1 a 4. Posteriormente, foram adicionadas 5 gotas de alimentos em cada tubo de ensaio (um alimento distinto para cada tubo) e em seguida foram homogeneizados e levados em banho-maria por 5 minutos.

Tubo de Ensaio 1 2 3 4

Alimento gua Albumina Suco artificial Leite

Colorao Resultante Incolor Azul-violeta Incolor Azul-violeta

TABELA 1 Resultados da reao com ninhidrina.

4.2 Reao do biureto

Pipetou-se 1 ml de cada alimento em tubos de ensaios distintos e enumerados de 5 a 8, em seguida adicionou-se 5 gotas de NaOH 2,5 N e 3 gotas de CuSO4 a 1%. Homogeneizou-se e observaram-se os resultados.

Tubo de Ensaio 5 6 7 8

Alimento gua Albumina Suco artificial Leite

Colorao Resultante Azul Violeta Azul Violeta

TABELA 2 Resultados da reao com biureto.

4.3 Precipitao pelo calor Em um tubo de ensaio (de numerao 11), pipetou-se 2 ml de soluo de albumina e aqueceu-se diretamente na chama at que comeasse a ferver. Observaram-se a formao de cogulo branco.

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4.4 Precipitao por reagentes para alcalides

Em um tubo de ensaio (de numerao 9), pipetou-se 1 ml de soluo de albumina, usando somente a poro sobrenadante da soluo, e acrescentou-se 1 ml de TCA (cido Tricloroactico) a 10%. Homogeneizou-se e observaram-se a formao do precipitado.

4.5 Precipitao por sais de metais pesados

Em um tubo de ensaio (de numerao 10), pipetou-se 1 ml de soluo de albumina, usando somente a poro sobrenadante da soluo, e acrescentou-se 1 ml de Pb(C2H3O2)2(Acetato de Chumbo) a 5%. Homogeneizou-se e observaram-se a formao do precipitado. 4.6 Solubilizao (salting in)

Pipetou-se 3 ml de soluo de albumina em um bquer e diluiu-se com gua destilada usando-se um basto de vidro, at que houvesse o aparecimento de um precipitado (globulinas). Adicionou-se, em seguida, soluo de NaCl (Cloreto de Sdio), gota a gota, at diluir novamente o precipitado, o que corresponde ao fenmeno denominado de salting-in. 4.7 Precipitao (salting out) Pipetou-se 2 ml da soluo obtida na experincia anterior (salting-in) em um tubo de ensaio. Adicionou-se posteriormente, 2 ml de soluo saturada de (NH4)2SO4(Sulfato de Amnio) e homogeneizou-se com um basto de vidro. Observou-se o aparecimento de um precipitado de protena (globulinas), o que corresponde ao fenmeno de salting-out. Por fim, adicionou-se 4 ml de gua destilada afim de diluir novamente o precipitado.

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5. RESULTADOS E DISCUSSO

5.1 Reaes de colorao

5.1.1 Reao de Ninhidrina

Neste experimento obteve-se uma soluo incolor nos tubos de ensaio 1 e 3 (que continham gua e suco artificial respectivamente), logo no h presena de grupos alfa-amino de aminocidos livres, grupos amino-terminais de peptdeos e protenas, pois no houve o aparecimento de uma colorao azul-violeta. J nos tubos 2 e 4 aps o banho-maria as solues apresentaram resultados positivos, ou seja, a colorao azul-violeta, o que indica a presena de protena nas mesmas. O que era esperado, pois, continham respectivamente albumina (clara de ovo dissolvida em gua destilada) e leite.

FIGURA 3 Reao da ninhidrina Fonte: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradas.htm

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5.1.2 Reao de biureto

Utilizou-se os mesmos alimentos nesta reao, os resultados deram negativos presena de protenas nos tubos 5 e 7 (continham gua e suco artificial respectivamente), pois apresentaram colorao azul , neste caso proveniente da alcalinizao do Sulfato de Cobre II (CuSO4 ). Porm nos tubos 6 e 8 (continham albumina e leite respectivamente), a colorao observada foi violeta, o que confirma a presena de protenas e peptdeos com trs ou mais resduos de aminocidos, pois a reao do biureto devida s ligaes peptdicas.

FIGURA 4 Reao de biureto Fonte: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.htm.

FIGURA 5 Interao biureto Cu2+ Fonte: http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.htm.

5.2 Precipitao por calor

Ao aquecer a soluo de albumina diretamente na chama, formou-se um cogulo branco (parecido com a nata que forma-se na superfcie do leite), o mesmo so as protenas desnaturadas. O calor pode desnaturar a maioria das protenas, pois a agitao trmica afeta as interaes que estabilizam a estrutura tridimensional das protenas.

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5.3 Precipitao por reagentes para alcalides

A formao do precipitado ao adicionarmos o TCA (cido tricloroactico) na soluo de albumina caracterizou a desnaturao. Esta ocorreu por que quando o TCA foi adicionado combinou-se com as protenas que possuam carga positiva, formando um tricloroacetato de protena, que insolvel.

5.4 Precipitao por sais de metais pesados

A formao do precipitado ao adicionarmos o Acetato de Chumbo Pb(C2H3O2)2 a 5%, deu-se pois, em pH situado no lado alcalino do seu pI (ponto isoeltrico), as protenas contidas na soluo de albumina combinaram-se com os ctions do Chumbo. Logo houve a formao de um proteinado insolvel. 5.5 Solubilizao (salting-in)

Ao adicionar gua destilada na soluo de albumina, observou-se a formao de um precipitado entre a poro pura da albumina e a poro pura da gua, como se fosse uma gua turva, isso ocorreu, pois como a gua est destilada no possui ons na mesma, logo a interao protena-protena foi favorecida, formou-se ento o precipitado, contudo a protena no desnaturou. Entretanto, a formao do complexo ocorreu devido a baixa fora inica. Para restabelecermos essa fora inica, adicionou-se uma soluo de Cloreto de Sdio (NaCl) e homogeneizou a soluo (com cuidado, seno as protenas poderiam desnaturar por agitao mecnica). O precipitado dilui-se, pois ao adicionarmos o NaCl, ele ir se ionizar formando ons Na+ e Cl- aumentando a fora inica da soluo, assim a ligao protena-gua mais forte do que a ligao protena-protena. Dessa forma, tal fato comprova que a protena no havia desnaturado. 5.6 Precipitao (salting-out)

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A formao de um precipitado foi observada quando adicionamos a soluo saturada de (NH4)2SO4 (sulfato de amnio) na soluo obtida no "salting-in". Como o sulfato de amnio preparado por reao da amnia com o cido sulfrico pela reao 2 NH3 + H2SO4 (NH4)2SO4, quanto em soluo aquosa, dissocia-se aumentando a fora inica, e diminuindo o pH. Formou-se novamente o precipitado, com caracterstica turva, pois a ligao protena-protena foi favorecida. Aps adicionou-se gua com o intuito de abaixar a fora inica da soluo, pois a mesma ir diluir a soluo de sulfato de amnio, aumentando o pH da soluo, logo as protenas tornaro dissolver-se na soluo, tornando-se homognea.

5.7 Exerccios

1- Em que se fundamenta a reao da ninhidrina e que classes de substncias do positivas com esta reao?

A ninidrina (2,2-diidroxi-hidrindeno-1,3-diona) quando adicionada reage com as aminas primrias da soluo. Se na mesma possui protenas, a ninhidrina ir quebrar as ligaes peptdicas originando aminocidos livres na soluo permitindo assim a reao com a funo amina primria. Essa quebra ocorre devido ao elevado poder oxidante da ninhidrina. Ao reagir com essas aminas livres, uma cor azul escura ou roxa, conhecida como prpura de Ruhemann produzida. As classes que geram resultados positivos so: aminocidos e protenas, pois reage com o grupo amino.

2- Em que se fundamenta a reao do biureto e que grupos nas protenas so responsveis por esta reao?

O biureto (KNaC4H4O64H2O), quando adicionado em uma soluo reagir, tornando-a violeta, se na mesma estiverem contidas protenas e peptdeos com trs ou mais resduos de aminocidos, ou seja para as substncias que contm 2 ou mais grupos carboaminicos (-CONH2) ligados diretamente ou atravs de um nico tomo de carbono ou nitrognio. As protenas ou peptdeos, quando tratados por uma soluo de sulfato de cobre, em meio alcalino, do uma colorao violeta caracterstica.

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As protenas responsveis por esta reao so as que contm 2 ou mais grupos carboaminicos ligados diretamente ou atravs de um nico tomo de carbono ou nitrognio.

3- Qual a importncia da reao de biureto?

Alm da deteco da presena ou no desta classe de protenas e peptdeos, o biureto comumente usado em um ensaio colorimtrico para a determinao de concentrao de protenastal como a espectroscopia UV/visvel no comprimento de onda de 540 nm (para a deteco do on Cu2+).

4- Em que condies de pH as protenas so melhor precipitadas por sais de metais pesados? E por reagentes dos alcalides?

As protenas so mais bem precipitadas por sais de metais pesados em pH do lado alcalino do seu pI (ponto isoeltrico), porqu algumas protenas combinam-se com ctions de metais pesados formando proteinatos insolveis. Na precipitao por reagentes para alcalides, como os reagentes so cidos, o pH ideal acima do pI da protena.

5- Que mudanas podem ocorrer numa protena, quando em contato com o etanol?

Os solventes orgnicos interferem nas pontes de hidrognio e nas pontes salinas. Levando assim a desnaturao das mesmas.

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6 CONSIDERAES FINAIS

Conclui-se que a presena de protenas em um meio pode ser identificada por indicadores como ninhidrina e biureto, e que as protenas sofrem desnaturao atravs de calor, reagentes para alcalides e sais de metais pesados. E ainda, alterando-se o pH e a fora inica do meio podem-se atenuar as interaes protena-protena e protena-substrato (saltingin /salting-out) sem, no entanto, ocorrer desnaturao.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Disponvel em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Ninidrina>. Acesso em: 29 abr. 2013. Disponvel em: <http://pt.wikipedia.org/wiki/Reagente_de_biureto>. Acesso em: 29 abr. 2013. Disponvel em: <http://www.infoescola.com/compostos-quimicos/alcaloides/>. Acesso em: 30 abr. 2013. Disponvel em: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAAAya4AJ/proteinas>. Acesso em: 30 abr. 2013. Disponvel em: <http://www.ebah.com.br/content/ABAAABspsAH/reacoes-coloracaoprecipitacao-proteinas>. Acesso em: 30 abr. 2013. Disponvel em: <http://www.fcfar.unesp.br/alimentos/bioquimica/praticas_proteinas/reacoes_coradasdois3.ht m>. Acesso em: 30 abr. 2013.