UNIVERSIDAD AUTNOMA CHAPINGO

DEPARTAMENTO DE PARASITOLOGA AGRCOLA

MAESTRIA EN PROTECCIN VEGETAL

CONTROL BIOLGICO

PRCTICA

INOCULACIN DE Bacillus thuringiensis

ALUMNOS:

NERI YOANA AGUILAR PANIAGUA SIMN GMEZ NIETO

PRCTICA ENTOMOPATOGENOS INOCULACIN DE Bacillus thuringiensis EN LARVAS DE Pectinophora gosypiella

Los microorganismos procariontes que conforman al grupo de las bacterias estn ampliamente distribuidos en prcticamente en todos los hbitats terrestres. Generalmente se reproducen por fisin binaria con gran profusin, se pueden desarrollar tanto en ambientes anaerbicos y anaerbicos, tanto en condiciones fras o clidas, as como en lugares luminosos y obscuros, hmedos y secos y ocupan nichos que en muchas ocasiones pueden ser saprofitos hasta ser parsitos obligados (Tanada y Kaya, 1993). Las bacterias que causan enfermedades en insectos se conocen como bacterias entomopatgenas, y a la afeccin que causan estas bacterias se le llama bacteriosis. Estas bacterias patgenas normalmente causan algn tipo septicemia en los insectos, invaden el hemocele, con una consecuentemente reproduccin y que causa dao en la homeostasis de individuo que est siendo afectado, cuando solo hay presencia de bacterias en la hemolinfa se le denomina como bacteremia; aunque se ha determinado que no todas las bacteremias son patognicas. Estas bacterias son sistmicas, es decir requieren de ser ingeridas (per os) para causar enfermedad en el insecto hospedante; lo que comienza con la destruccin parcial del intestino medio (mesentern) y dando como consecuencia una septicemia. Estas bacterias se consideran como patgenas extracelulares (con excepcin de las ricketsias) y las consecuencias se reflejan en diarrea, vomito, prdida de apetito, para posteriormente invadir completamente al hospedante, que desencadena en la muerte. El cuerpo se torna a un color caf obscuro por la oxidacin de la hemolinfa, donde tambin se desarrollan gran cantidad de bacterias saprfitas provenientes tanto del mismo tracto digestivo (flora intestinal que va con el alimento) as como bacterias que se encuentran en el medio ambiente. Conforme se descompone el cadver, este va adquiriendo un olor ftido, el integumento exoesqueleto generalmente solo se seca y endurece; algunas de las bacterias producen grandes cantidades de esporas de resistencia que le ayudaran a la persistencia en el medio ambiente (Ibarra, 2001). La gran mayora de las bacterias entomopatgenas son facultativas, pero existen algunas que son obligadas, y otras que son potenciales u oportunistas. Las primeras son las ms conocidas y estudiadas, a pesar de que su patogenicidad normalmente sea baja, pero su virulencia es muy alta (ej. Bacillus thuringiensis). Las patgenas obligadas, por otro lado, presentan alta patogenicidad pero baja virulencia (ej. Paenibacillus. popilliae). Por ltimo, las patgenas potenciales u oportunistas, normalmente no presentan niveles significativos de patogenicidad ni de virulencia, y su actividad patolgica est condicionada a que el hospedero potencial afronte situaciones rigurosas que causen debilitamiento y fragilidad de sus propios mecanismos de defensa. Estas ltimas podran ser habitantes naturales del tracto digestivo del insecto (Tanada y Kaya, 1993).

Los primeros dos tipos de bacterias patgenas estn ampliamente representados por una familia: Bacillaceae. Esta incluye a las especies ms estudiadas y utilizadas como agentes de control. En el tercer grupo se encuentran bacterias pertenecientes a diversas familias, de las cuales destacan Enterobacteriaceae, Pseudomonadaceae y Streptococcaceae. Un caso especial lo presentan las bacterias simbiticas de diversos nemtodos entomopatgenos, las cuales son inoculadas por el nematodo al invadir el hemocele del hospedero (Ibarra et al., 2006). La bacteria entomopatgena B. thuringiensis es muy abundante en la naturaleza y se puede encontrar en casi cualquier medio como suelo, fuentes de agua y aire (esporas). El aislamiento e identificacin de aislamientos silvestres de B. thuringiensis tiene una gran importancia, si se considera que en Mxico hay una gran cantidad de aislamientos nativos que an no han sido evaluados. La tincin de Gram o coloracin Gram es un tipo de tincin diferencial empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color violeta y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa (De Maagd et al., 2003).

Bacillus thuringiensis es una bacteria gram positiva usada como el ingrediente activo para la
agricultura en los insecticidas biolgicos y para el control de vectores de enfermedades. La bacteria forma endosporas y su actividad bioinsecticida radica en una protena parasporal o cuerpo de inclusin (cristal). La protena cristalina es altamente insoluble en condiciones neutras y se solubiliza en condiciones de pH alto (9.5). La activacin ocurre por una discreta proteolisis causada por las enzimas estomacales del insecto. Una vez solubilizado en el tubo digestivo del insecto la protoxina se rompe por una proteasa para producir una toxina activa. Esta toxina se une a las clulas epiteliales del tubo digestivo creando poros en la membrana celular y propicia un desequilibrio de iones resultando en la prdida de iones K+, alterando la presin osmtica. El insecto muere debido a una entrada masiva de agua, el sistema digestivo se paraliza, las clulas epiteliales se lisan y el pH estomacal se baja por compensacin con el pH sanguneo. Esta bajada de pH hace posible que las esporas bacteriales germinen y la bacteria pueda invadir el husped causando una septicemia letal y daos en los tejidos. Generalmente los insectos intoxicados mueren por ayuno y posterior detencin del crecimiento que puede durar algunos das. Las larvas afectadas por las toxinas de B. thuringiensis se vuelven inactivas, y podran devolver la comida o tener diarrea. La cpsula de la cabeza podra aparecer ms larga que el cuerpo (deformada). La larva se vuelve flcida y muere, generalmente en unos das o semanas. El contenido del cuerpo se vuelve marrn-negruzco segn se va descomponiendo. En la figura 1 se puede ver el modo de accin de la toxina en una larva.

Fig.1 Modo de accin de Bacillus thuringensis

INOCULACIN DE B. thuringiensis 1. Se procedi a obtener 30 larvas de Pectinophora gosypiella para ser inoculadas: a las cuales previamente se les dio un tratamiento hidrotrmico para evitar que produzcan ceda con la cual construyen su cocn. Sumergindolas en agua a 55C por un segundo, se secaron y esperamos un momento a que reaccionaran. 2. En una cmara letal de 30 cavidades se coloc papel absorbente (filtro) 3. Luego colocamos las larvas en cada una de las cavidades 4. Despus inoculamos con 200l de la cepa bacteriana: se pesaron 2gr de Bacillus thuringiensis (1gr = 16 mil millones de esporas viables) que fueron diluidas en 10ml de agua, y con una micro-pipeta se inocularon cada larva. 5. Procedimos a la observacin y toma de datos: obteniendo los siguientes resultados.

Figura 1. Larva de Pectinophora gosypiella y hay un cese de la ingesta

Figura 2. Los primeros sntomas que observamos en la larva son vmito y diarrea. Y no muestra indicios de alimentacin

Figura 3. A los tres das de infectada la larva se observa parlisis total lo que indica la accin de

B. thuriengensis

La larva al cuarto da presenta un color negro caracterstico de la infeccin de B.t y muerte de la misma.

Fig. Larvas inoculadas con B. thuringiensis podemos observar que en el cuarto da hubo un 65% de efectividad del producto.

MODO DE APLICACIN DE BT EN CAMPO: Respecto a la aplicacin de la toxina en campo o bosques se realizan suspensiones de esporas cristal en agua con estabilizadores y protectores solares. Se aplica en forma de aerosol que se asperja y se hace o muy temprano o muy tarde para evitar la radiacin solar y cuando no llueve para evitar su lavado.