UNIVERSIDADE FEDERAL DE MINAS GERAIS INSTITUTO DE CICNCIAS BOLGICAS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA GERAL PROGRAMA DE PS GRADUAO EM GENTICA

DISSERTAO DE MESTRADO

RELAES FILOGENTICAS DO GRUPO PANARTHROPODA AVALIADAS ATRAVS DE SEQUNCIAS DO GENE rDNA 18s

ORIENTADO: Jonatas Francisco de Souza ORIENTADOR: Profa Dra Cleusa Graa da Fonseca

BELO HORIZONTE JUNHO-2011

Jonatas Francisco de Souza

RELAES FILOGENTICAS DO GRUPO PANARTHROPODA AVALIADAS ATRAVS DE SEQUNCIAS DO GENE rDNA 18s

Dissertao apresentada ao Programa de Ps-Graduao em Gentica do Departamento de Biologia Geral do Instituto de Cincias Biolgicas da Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito parcial obteno do ttulo de mestre em Gentica. Orientadora: Prof Dr Cleusa Graa da Fonseca

BELO HORIZONTE JUNHO 2011

AGRADECIMENTOS

Agradeo primeiramente a minha orientadora Profa Dra Cleusa Graa da Fonseca pelo exemplo e referncia como intelectual, profissional e como pessoa. Agradeo instituio UFMG e especialmente a todos os Professores da Gentica que contriburam para minha formao. Agradecimento especial ao Doutor Gustavo Augusto Lacorte que foi meu companheiro de Laboratrio e que me ensinou muito sobre os procedimentos laboratoriais e sobre o Filo Onychophora. Agradeo aos meus companheiros de laboratrio Pilar, Leonardo e Luciene que alm de me ajudarem em diversos momentos de dificuldade, faziam do laboratrio um local de trabalho saudvel e agradabilssimo. Agradecimento especial ao meu pai, Lourival, e minha me, Celina, que sempre me ensinaram valores sobre o amor, trabalho e famlia e tambm aos meus irmos Geovane, Juliana e Bruno (irmo de corao) que cresceram junto comigo e partilharam inmeros momentos de felicidade.

SUMRIO
LISTA DE FIGURAS .................................................................................................... 6 LISTA DE TABELAS E QUADROS........................................................................... 7 RESUMO......................................................................................................................... 8 ABSTRACT.................................................................................................................... 9 1.INTRODUO......................................................................................................... 10 1.1 A filogenia dos metazorios......................................................................................10 1.1.2. O grupo Ecdyzosoa............................................................................................ 10 1.1.3. O grupo Euarthropoda....................................................................................... 13 1.1.4. O grupo Panarthropoda...................................................................................... 14 1.1.4.1. Aspectos gerais dos organismos do clado Panarthropoda ............................... 15 1.1.4.1.1. Onychophora................................................................................................ 15 1.1.4.1.2. Hexapoda..................................................................................................... 16 1.1.4.1.3. Chelicerata.................................................................................................... 16 1.1.4.1.4. Crustacea...................................................................................................... 16 1.1.4.1.5. Myriapoda.................................................................................................... 17 1.1.4.1.6. Tardigrada.................................................................................................... 18 1.2. Evoluo dos genes nucleares de RNA ribossmico (rDNA).............................. 18 1.2.1 Mutaes gnicas................................................................................................ 18 1.2.2. Homologias......................................................................................................... 19 1.2.3. Os genes de RNA ribossmico como marcadores moleculares......................... 20 1.3. Filogenia................................................................................................................ 21 1.3.1 rvores filogenticas.......................................................................................... 21 1.3.2. Algoritmos para filogentica.............................................................................. 22 1.3.3. Reconstrues filogenticas............................................................................... 22 1.3.4. Mxima parcimnia........................................................................................... 23 1.3.5. Mtodo da mxima verossimilhana (ML)........................................................ 24 1.3.6. Inferncia bayesiana........................................................................................... 24 1.4. Banco de dados...................................................................................................... 25 1.5. Busca de sequncias em banco de dados............................................................... 25 1.6. Alinhamento.......................................................................................................... 26 1.7. Justificativa............................................................................................................ 26 1.8. Objetivos................................................................................................................ 27 1.8.1 Objetivo geral..................................................................................................... 27 1.8.2. Objetivos especficos.......................................................................................... 27 1.9. Hiptese................................................................................................................. 27 2. METODOLOGIA.............................................................................................. 27 2.1. Sequncias............................................................................................................. 27 2.2. Edio das sequncias........................................................................................... 29 2.3. Anlise das sequncias.......................................................................................... 30
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3.

RESULTADOS.................................................................................................... 30

3.1 Modelo evolutivo e proporo de stios invariveis ................................................ 30 3.2 rvores filogenticas................................................................................................ 31 4. 5. 6. DISCUSSO....................................................................................................... 34 CONCLUSO...................................................................................................... 41 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.............................................................. 42

LISTA DE FIGURAS
Figura 1: A controvrsia entre dados moleculares e dados morfolgicos...................... 12 Figura 2: Provvel filogenia do Ecdysozoa.................................................................... 13 Figura 3: Gene de rDNA................................................................................................ 21 Figura 4: Resultado da filogenia do Panarthropoda com sequncias do gene rDNA 18s utilizando a mxima verossimilhana (rvore compactada)........................................... 32 Figura 5: Resultado da filogenia do Panarthropoda com sequncias do gene rDNA 18S utilizando a anlise bayesiana..........................................................................................33 Figura 6: Resultado da filogenia do Panarthropoda com sequncias do gene rDNA 18S utilizando mxima parcimnia....................................................................................... 34 Figura 7: Trs possibilidades para a filogenia do Panarthropoda.................................. 36 Figura 8: Regio da topologia analisada com anlise bayesiana incluindo o Tardigrada juntamente com o Crustacea........................................................................................... 37 Figura 9: Regio da topologia de mxima verossimilhana mostrando o Pancrustacea. Os nmeros representam o valor de bootstrap. A classe de Crustacea denominada Malacostraca se apresentou como grupo irmo de Hexapoda mais outra classe de Custacea, a Branchiopoda............................................................................................... 38 Figura 10: Regio da topologia de mxima verossimilhana demonstrando o grupo Myriochelata. Os nmeros nos ns representam os valores de bootstrap........................ 39

LISTA DE TABELAS E QUADROS QUADROS: Quadro 1: Sequncias dos clados dos Panarthropoda baixadas no genbank.......................................................................................................................... 28

TABELAS Tabela 1: Resultado do teste modelo utilizando o programa Modeltest3.7folder para dados das sequncias de rDNA 18S............................................................................... 31 Tabela 2: Lista de artigos utilizados na discusso organizados de acordo com o tipo de estudo e resultado........................................................................................................... 40

RESUMO

O grupo Ecdysozoa composto por invertebrados que fazem troca de cutcula ou ecdise. Esse grupo foi proposto por Aguinaldo et al, 1997 em sua anlise molecular com subunidade ribossomal 18S e contrasta com a hiptese morfolgica do grupo Articulata. Dentro do Ecdysozoa, h um grupo de animais com caractersticas em comum denominado Panarthropoda. Este composto por Onychophora, Tardigrada e o Euarhtropoda. Muito se tem discutido sobre o grupo basal do Panarthropoda e tambm sobre as relaes filogenticas dos integrantes deste grupo. O marcador molecular 18S um gene ortlogo e tem sido utilizado em muitos trabalhos de filogenia com boa eficincia para a resoluo das relaes entre os clados. O presente trabalho teve como objetivo resolver a posio filogentica do Filo Onychophora dentro do grupo Panarthropoda utilizando como marcador sequncias do gene 18S. Para esta anlise, foram utilizados os mtodos de mxima parcimnia, mxima verossimilhana e anlise bayesiana. Embora se tenha encontrado suporte estatstico para a relao entre alguns grupos do Panarthropoda, no houve suporte estatstico suficiente para resolver a posio do Filo Onychophora.

ABSTRACT

The group Ecdysozoa is compounded by invertebrates that make cuticle exchange or ecdise. This group was proposed by Aguinaldo et al.1997 in his molecular analysis with the 18S ribosomal subunit and it contrasts with the morphological hypothesis of the Articulata group. In the Ecdysozoa, there is a group of animals with similar characteristics called Panarthropoda. This group is compounded by Onychophora, Tardigrada and Euarhtropoda. It has been discussed a lot about basal group of Panarthropoda and also about the phylogenetic relationships among members of this group. The 18S is a molecular orthologue marker gene and it has been used in many studies of phylogeny with good acceptance for the resolution of the relationships between clades. This study aimed to solve the phylogenetic position of the phylum Onychophora within the group using Panarthropoda as sequence markers of the 18S gene. For this analysis it was used the methods of maximum parsimony, maximum likelihood and Bayesian analysis. Although it has been found statistical support for the relationship between some groups of Panarthropoda, there was no sufficient statistical support to solve the position of the phylum Onychophora.

1. INTRODUO 1.1 A filogenia dos metazorios A anlise filogentica dos metazorios um desafio para os pesquisadores. Os metazorios constituem, do ponto de vista evolutivo, um grupo muito complexo, mas de interesse central na Biologia. Existe uma grande discusso sobre o posicionamento dos clados, que se intensificou com o surgimento da Sitemtica Filogentica, em meados do sculo XX, com o trabalho de Hennig (Matioli, 2001). O avano dos mtodos e das tcnicas de pesquisa filogentica tem proporcionado meios de enfrentar muitas dificuldades, mas frequentemente aponta novos problemas a serem resolvidos (Adoutte et al. 2000) A morfologia h muito tempo usada para o entendimento da evoluo biolgica e para as anlises filogenticas. Entretanto, a escassez de dados fsseis dificultava a reconstruo de filogenias com este tipo de dado. O problema com a falta de dados era devido s linhagens evolurem rapidamente, o que deixa uma ausncia de sinal filogentico, ou perda dos dados devido extino de grupos ancestrais que no deixaram fsseis ou tambm devido evoluo convergente e hibridizao introgressiva (Jenner & Littlewood, 2007). Atualmente a anlise molecular vem sendo utilizada em muitos estudos filogenticos. O uso de marcadores genticos trouxe uma nova interpretao da evoluo dos metazorios e altera principalmente vrias posies filogenticas dentro do grupo dos invertebrados. Uma das filogenias mais discutidas dos invertebrados a dos protostmios, principalmente a do grupo Panarthropoda. A anlise de sequncias do gene de rDNA 18S trouxe uma nova idia da filogenia destes grupos que so cruciais para o entendimento da evoluo dos bilaterais.

1.1.2. O grupo Ecdysozoa A filogenia dos bilaterais por muito tempo foi baseada em caractersticas morfolgicas e embriolgicas e propunha um aumento gradual da complexidade: teriam surgido primeiro os organismos mais simples, depois os acelomados seguidos pelos pseudcelomados e posteriormente os celomados (Hyman, 1940).

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Uma das filogenias mais discutidas a dos invertebrados, particularmente entre os Arthropoda e seus grupos prximos. Os Arthropoda eram relacionados

filogeneticamente mais prximos dos Annelida e Onychophora (Snodgrass, 1938) que estavam includos no clado dos celomados (Hyman, 1940). Entretanto, esta idia vem sendo alterada aps a anlise das sequncias da pequena subunidade ribossomal de um grupo de animais (Aguinaldo et al. 1997). Segundo esta anlise, h uma nova filogenia em que so agrupados alguns pseudocelomados, mais prximos dos Nematoda do que dos celomados (Arthropoda e Tardigrada) num grupo denominado Ecdysozoa (figura 1 e 2). Outros pseudcelomados (como os Rotifera) foram agrupados com acelomados e protostmios celomados (Annelida) no grupo Lophotrocozoa. Este e Ecdysozoa so monofilticos e formam o clado dos protostmios (Aguinaldo et al. 1997) Os grupos que compem o clado Ecdysozoa so os Euarthropoda (Hexapoda, Crustacea, Myriapoda, Chelicerata), os grupos prximos dos Arthropoda (Onychophora e Tardigrada) e mais cinco filos: Nematoda, Nematomorpha, Priapulida, Kinorhyncha e Locyfera. O Ecdysozoa o clado com maior nmero de espcies e de diversidade de nichos, sendo estimados 4,5 milhes de espcies vivas. Sua cutcula resistente significa que esse grupo pode estar representado por vrios fsseis o que aumentaria mais ainda o nmero de espcies (Chapman, 2005). O plano corporal basal dos Ecdysozoa bastante conservado. Os organismos relacionados aos Hexapoda possuem corpo segmentado e apndices unidos e os grupos relacionados aos Onychophora possuem um nervo ao redor do esfago e uma boca terminal que encontrada em alguns indivduos. Todos os grupos perderam a larva primria e apresentam troca de cutcula com concomitante perda da locomoo. Esta troca de cutcula ou ecdise a principal caracterstica que nomeia o grupo (Telford et al. 2008).

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Dados morfolgicos (Nielsen, 2002)

Dados moleculares (Aguinaldo et al. 1997)

Figura 1: A controvrsia entre dados moleculares e dados morfolgicos (Nielsen, 2002).

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Figura 2: Provvel filogenia do Ecdysozoa de acordo com dados moleculares da unidade ribossomal 18S (Aguinaldo et al. 1997; Telford et al. 2008) 1.1.3. O grupo Euarthropoda O grupo Euarthropoda formado pelos clados Chelicerata, Crustacea, Myriapoda e Hexapoda. As relaes filogenticas entre esses grupos tm sido debatida atravs da morfologia e dados moleculares. Algumas anlises moleculares tm suportado a monofilia dos Euarthropoda e uma nica origem de seu corpo cuticularizado com apndices unidos (Telford et al. 2008). Estudos morfolgicos propuseram que Myriapoda e Hexapoda formavam um grupo denominado Atelocerata (que significa chifres mal formados e refere-se perda do segundo segmento da antena) definido por apndices no ramificados, tbulos de malphighi e traquias respiratrias. Alguns autores agrupam o Aterocerata com Onychophora num clado denominado Uniramia (Telford & Thomas, 1995).

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Entretanto, o mais claro resultado na filogenia dos Arthropoda mostra que os Hexapoda so mais relacionados aos Crustacea que aos Myriapoda (Boore et al. 1995). O grupo formado pelos Crustacea mais Hexapoda seria o Pancrustacea ou Tetraconata devido aos cones cristalinos dos omatdeos (Dohle, 1997; Harzsch, 2004).

1.1.4. O grupo Panarthropoda H mais de 60 anos foi proposta uma relao entre Annelida, Arthropoda e Onychophora (Snodgrass, 1938) que muito parecida com a recente hiptese Articulata (Nielsen, 1997). Os estudos morfolgicos posteriores foram contra essa proposio devido grande variao da articulao e da musculatura das pernas dos Arthropoda e foi sugerido que este grupo no teria surgido de um ancestral comum (Anderson, 1973; Manton, 1977; Tiegs & Manton, 1958). Os Arthropoda foram ento considerados um clado superior a filo e foram divididos em dois grupos: os que tinham um ancestral comum do grupo Annelida e aqueles que no se originavam de um ancestral Annelida (Tiegs & Manton, 1958). O grupo que possua os Annelida como ancestral comum foi denominado Uniramia e era composto por Onychophora, Myriapoda e Insecta. O outro grupo era composto por Crustacea, Trilobita e Chelicerata (Manton, 1972). A hiptese do Uniramia foi corroborada por estudos morfolgicos (Anderson, 1973) e, desta maneira, a evoluo dos membros articulados (artropodizao) foi considerada ter surgido mais de uma vez dentro do grupo (Fryer, 1992). Os estudos de morfologia que propunham os Arthropoda como polifilticos no levavam em considerao a alfa quitina. Esta estrutura est presente nos Arthropoda e Onychophora e sugere que estes sejam monofilticos. Caractersticas como apndices com garras e mixoceloma com metanefrdeos destes grupos tambm so compartilhadas com alguns indivduos dos Tardigrada. Arthropoda, Tardigrada e Onychophora formam o grupo Panarthropoda (Nielsen, 1997). Os Tardigrada j foram relacionados filogeneticamente mais prximos com o Nematoda que com os Euarthropoda (Lartillot & Philippe, 2008). Entretanto, caso se assuma que o pequeno tamanho dos Tardigrada seja derivado e se considere a ausncia de celoma, corao e nefrdeos (Schmidt-Rhaesa, 2001), caractersticas que so encontradas em Onychophora e Euarthropoda, pode-se sugerir que as similaridades de
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cutculas, cordo nervoso ventral e apncides em Tardigrada e Euarthropoda podem indicar uma relao de grupos irmos (Telford et al. 2008).

1.1.4.1. Aspectos gerais dos organismos do clado Panarthropoda 1.1.4.1.1 Onychophora Onychophora um grupo de invertebrados terrestres que so

predominantemente encontrados no solo, serrapileira ou tronco de rvores e mostram uma disjuno datada de Gondwana (Monge-Najera 1995; Reid, 1996). Este txon muito importante para o entendimento do grupo Panartropoda (grupo com Euartrhopoda, Tardigrada e Onychophora) (Monge-Najera, 1995; Telford et al. 2008) porque estes animais so relacionados com Arthropoda (Chelicerata, Myriapoda, Crustacea, e Hexapoda) (Mayer et al. 2004), ou alternativamente com Chelicerata (Strausfeld et al. 2006), ou unindo Tardigrata e Nematoda (Park et al. 2006) e tambm porque o corpo destes animais um mosaico de caracteres anatmicos encontrados em Arthropoda e alguns vermes ancestrais (Nielsen, 1997). At algum tempo atrs, foi assumido que estes vermes ancestrais estavam relacionados aos Annelida e, ento, os animais do grupo Onychophora foram interpretados como derivados da forma do corpo dos Annelida (Anderson 1973; Scholtz, 2002; Scholtz & Edgecombe, 2005; Wgele et al. 1999; Wgele & Misof, 2001). Dados moleculares no corroboram essa idia e mostram que nem Arthropoda nem Onychophora so relacionados com Annelida. Eles so membros do grupo Ecdysozoa, que inclui um nmero de animais no segmentados assim como Tardigrada, Onychophora e Arthropoda, mas no Annelida. Apesar desta classificao ainda no ser muito clara, h fortes indcios moleculares (Eriksson et al. 2009; Telford et al. 2008). As espcies de Onychophora esto divididas em duas famlias: Peripatopsidae e Peripatidae (Monge-Najera, 1995) que se distinguem pela posio de suas aberturas genitais. As espcies de Peripatidae so encontradas em reas intertropicais (leste da frica, Sul do Mxico, Amrica Central e do Sul, Antilhas e sudeste da sia) e espcies da Peripatopsidae apresentam distribuio no hemisfrio sul com clima temperado (frica do Sul, Oceania e Chile) (Monje-Njera, 1995).

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1.1.4.1.2 Hexapoda Este grupo contm aproximadamente 1.200.000 espcies descritas sendo o maior txon dos animais. A diversidade desse grupo se deve sua adaptao ao meio terrestre, ao vo e coevoluo com as plantas com flores. Esses animais conseguiram invadir uma grande diversidade de habitats, inclusive o aqutico de gua doce e gua salgada. O sucesso adaptativo est diretamente ligado ao plano corpreo dos Arthropoda, resistncia dessecao, ao vo e ao desenvolvimento holometbolo (indireto). Como os adultos necessitam de recursos diferentes das larvas, no h competio entre eles (Barnes et al. 2005). A cutcula encouraada dos Arthropoda oferece proteo contra predadores, patgenos, dessecao alm de oferecer ancoragem para musculatura esqueltica e adaptaes para reteno de gua. Entre as caractersticas que distinguem os Hexapoda dos demais traqueados, pode-se citar o tronco dividido em trax e abdome, trs pares de patas e pernas e asas sempre no trax (Brusca & Brusca, 2007). Atualmente os entomlogos dividem os Hexapoda em dois grupos irmos: Entognatha e Insecta, este ltimo com mais de 30 ordens (Barnes et al. 2005). 1.1.4.1.3 Chelicerata Os Chelicerata so compostos pelos Arachnida terrestres (aranhas, caros, escorpies e outros), os extintos Eurypterida e os Xyphosura marinhos. O corpo destes animais formado por dois tagmas: cefalotrax e abdome. O cefalotrax formado pela fuso no embrio da cabea e do trax. Os apndices do primeiro segmento do cefalotrax foram perdidos. O primeiro apndice do cefalotrax dos Chelicerata um par de quelceras prensil (caracterstica que nomeia o grupo). O segundo apndice um pedipalpo e os apndices restantes so pernas locomotoras (quatro pares). O abdome constitudo de 12 segmentos ou menos e dividido em pr abdome (7 segmentos) e ps abdome (5 segmentos). Apndices abdominais quando presentes possuem funo respiratria (Barnes et al. 2005; Brusca & Brusca, 2007). 1.1.4.1.4 Crustacea Os Crustacea so um txon com cerca de 42.000 espcies descritas. Dentre estas, destacam-se carangueijos, tatuzinhos de jardim, lagostas, camares entre outros. Estes
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animais possuem uma enorme heterogeneidade morfolgica e ecolgica. H desde animais com menos de 1 milmetro de comprimento a animais com mais de 3 metros (Barnes et al. 2005). Uma caracterstica especfica desse grupo so os quatro pares de antenas e os trs ou quatro ocelos simples em forma de taa pigmentada. Poucos so os caracteres que podem ser generalizados entre os seres desse grupo (Brusca & Brusca, 2007). Os organismos desse txon possuem mandbula, assim como os Hexapoda e os Myriapoda. O clado formado por estes seres foi denominado Mandibulata, devido presena da mandbula e outras similaridades entre estes indivduos (Barnes et al. 2005). Vrias anlises moleculares (Delsuc et al. 2003; Friedrich & Tautz, 1995; Hwang et al. 2001; Nardi et al. 2003; Regier et al. 2005) sugeriram que os Crustacea estariam relacionados com os Hexapoda num clado denominado Pancrustacea. Alguns aspectos morfolgicos so compartilhados por estes dois grupos como neuroblastos, dois pares de neurnios serotonrgicos por hemineurnios, um nmero fixo de motoneurnios excitatrios por msculo e aspectos da ultra estrutura lateral do olho (Brusca & Brusca, 2007)

1.1.4.1.5 Myriapoda O Subfilo Myriapoda possui quatro grupos ou classes: Chilopoda, Diplopoda, Symphyla e Pauropoda. So seres traqueados que apresentam um corpo constitudo por cabea e um tronco alongado que contm muitos segmentos portadores de pernas. Na cabea existe um par de antenas. Os ocelos medianos esto ausentes nos Myriapoda, entretanto, os olhos laterais simples, talvez derivados dos olhos compostos, esto presentes nos Chilopoda e Diplopoda. Os Pauropoda e Symphyla no possuem olhos (Barnes et al. 2005). A maioria dos Myriapoda necessita de um ambiente mido porque sua epicutcula relativamente permevel e no apresenta as mesmas caractersticas qumicas dos Chelicerata e Hexapoda. Os Myriapoda so amplamente distribudos e vivem sob pedras e madeira, dentro do solo e no hmus das regies temperadas e tropicais (Barnes, 2005; Brusca & Brusca, 2007).
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1.1.4.1.6 Tardigrada Tardigrada, tambm chamados de ursos dgua, podem ser encontrados em gua ou em ambientes midos. A primeira espcie deste grupo foi descoberta em 1773 e desde ento mais de 960 espcies tm sido escritas (Guidetti & Bertolani, 2005). O filo Tardigrada possui trs classes: Heterotardigrada, Mesotardigrada e Eutardigrada (Ramazzotti & Maucci, 1983). Enquanto Heterotardigrada primariamente marinho, os indivduos da classe Eutardigrada podem ser encontrados em gua doce ou em ambientes terrestres e s existe uma espcie da classe Mesotardigrada que foi descrita num manancial quente no Japo por Rahm (1937) e nunca mais foi encontrada (Ryu et al. 2007). A posio filogentica dos Tardigrada no grupo dos metazorios incerta. Os estudos mais recentes de morfologia e de DNA e protenas consideram os Tardigrada como um filo separado pertencente ao Panarthropoda, que inclui os Arthropoda e seus grupos relacionados (Brusca & Brusca, 2003; Garey et al. 1996; Giribet et al. 1996; Mallatt et al. 2004; Nielsen, 2001; Regier & Shultz, 2001).

1.2 Evoluo dos genes nucleares de RNA ribossmico (rDNA)

1.2.1 Mutaes gnicas Mutaes gnicas so modificaes que ocorrem nas sequncias de DNA dentro de genes especficos. Se considerarmos apenas as mudanas nas sequncias, elas podem ser classificadas como transies, transverses, inseres ou delees. Na transio uma base trocada por outra que possui caracterstica qumica mais semelhante (purina por purina ou pirimidina por pirimidina). Em contrapartida, na transverso a base substituda por outra com caracterstica qumica diferente (purina por pirimidina). As transies so mais frequentes que as transverses porque modificam menos a estrutura do DNA (Page & Holmes, 1998). A insero uma mutao que adiciona uma ou mais bases na fita de DNA e a deleo remove bases da fita (Griffths et al. 2008; Page & Holmes, 1998). H uma relao entre o nmero de substituies e o tempo de divergncia entre duas sequncias. O nmero de diferenas entre duas sequncias com o aumento do tempo se torna uma medida cada vez menos acurada em relao ao verdadeiro nmero
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de substituies que ocorreram desde a divergncia das sequncias do ancestral comum. medida que aumenta a divergncia entre duas espcies, o nmero de transies em relao ao de transverses decresce (Schneider, 2003; Yang, 2006). A relao entre a diferena da sequncia e o tempo decorrido desde a divergncia no linear e sim, hiperblica, devido ocorrncia de mltiplas mudanas no mesmo stio. Com o acmulo das substituies entre as duas sequncias, pode ocorrer saturao dos dados, ou seja, os stios observados mudaram tanto que retornaram ao estado ancestral. (Page & Holmes, 1998). Ento, ao se trabalhar com um conjunto de sequncias para o estudo de relaes filogenticas, deve-se fazer a anlise de saturao dos dados. Dar continuao a uma anlise filogentica quando se evidencia saturao de substituio nas sequncias pode levar a subestimar os eventos evolutivos importantes que possam ter ocorrido durante o tempo, desde a divergncia inicial. A saturao de substituies, no entanto, difcil de ser estimada de acordo com o tempo de divergncia, pois na maioria das vezes se trabalha com txons de existncia atual. Uma maneira de contornar este problema relacionar o nmero de substituies com a distncia matemtica entre as sequncias, j que a distncia entre estas proporcional ao tempo de divergncia (Matioli, 2001; Page & Holmes, 1998) 1.2.2 Homologias possvel distinguir entre estados de carter ancestrais (primitivos) e derivados. Se uma sequncia tem a mesma base em comum com o ancestral de todas as sequncias estudadas, ela considerada primitiva ou plesiomrfica. Caso contrrio ele ser considerado apomrfica. Um nico carter derivado considerado autapomorfia e um carter derivado compartilhado considerado sinapomorfia (Futuyma, 2005). Dado dois estados de carter que so idnticos (o mesmo nucleotdeo) e a similaridade entre eles foi herdada diretamente de um ancestral (que tambm o possua), isto denominado homologia. Homoplasia seria a similaridade compartilhada que no foi herdada de um ancestral (Futuyma, 2005; Matioli, 2001; Page & Holmes, 1998). Os genes homlogos podem ser considerados parlogos quando sofrem duplicao ou ortlogos quando seu ancestral mais recente no sofreu duplicao e eles passam a ter histrias evolutivas diferentes (Matioli, 2001).
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Na reconstruo de filogenias a preocupao primordial deve ser a busca por homologias, isto , a comparao de caracteres homlogos entre as sequncias. Para cada tipo de trabalho deve haver a escolha certa do tipo de gene e as sequncias a serem trabalhadas. Para fenmenos de duplicao, devem ser escolhidos genes parlogos; para reconstrues filogenticas devem ser escolhidos genes ortlogos (Matioli, 2001; Page & Holmes, 1998). Apesar disto, eventos antigos de duplicao podem ser teis para reconstrues filogenticas quando empregados como grupos externos recprocos. Um exemplo desta prtica foi a utilizao de cpias parlogas para enraizar a rvore da vida e determinar as relaes filogenticas entre os trs domnios: Bacteria, Archaea e Eukarya (Woese et al. 1990). Um exemplo de genes com cpias mltiplas frequentemente utilizados em filogenias so os rDNA (genes de rRNA). H inmeras cpias deste gene no genoma dos vertebrados, o que torna provvel que houve a duplicao antes da divergncia entre os vertebrados. As cpias deste gene num indivduo so virtualmente idnticas mas diferem entre espcies (Matioli, 2001) 1.2.3 Os genes de RNA ribossmico como marcadores moleculares As sequncias que codificam o rRNA so reiteradas, ocorrendo em nmero varivel nos diversos grupos de organismos. Nos eucariontes essas cpias esto organizadas em tandem e agrupadas em uma ou mais regies cromossmicas. Os rRNA so classificados conforme seu coeficiente de sedimentao sob campo centrfugo, que depende tanto do tamanho quanto da unidade da molcula nas unidades Svedberg (S). Cada unidade de repetio do rDNA possui uma organizao conservada, constituda de: um espaador externo (ETS, do ingls external transcribed spacer), transcrito numa sequncia que contm a extremidade 5 da molcula precursora do rRNA, esta com alto coeficiente de sedimentao (at 45S); uma regio que codifica para rRNA 18S; um espaador interno que transcrito (ITS, do ingls internal transcribed spacer) e que possui uma regio que codifica para rRNA 5,8S; e uma regio que codifica para rRNA 25-28S e um espaador externo que no transcrito (NTS, do ingls non transcribed spacer) (Figura 3). (Griffths et al. 2008; Lewin, 2004; Matioli, 2001).

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Figura 3: Gene de rDNA (Matioli, 2001) Os ribossomos so formados por grandes complexos proticos juntamente com cidos nuclicos, formando subunidades. Nas clulas eucariontes so observadas duas subunidades, a primeira chamada de subunidade pequena (small subunit SSU) que formada pelos RNAs 18S e 5S e mais um total de 32 protenas formando a subunidade 30S. A segunda subunidade denominada de subunidade grande (large subunit LSU) formada pelos rRNAs 26S, rRNA 5,8S e 50 protenas formando a subunidade 50S. A funo do rRNA est relacionada com a formao de protenas (Lewin, 2004). O gene que codifica a subunidade pequena do rRNA (SSU, do ingls small subunit) tem baixa taxa de mutao, resistente transferncia lateral de genes, funcionalmente conservado e amplamente distribudo ente os organismos. Estas caractersticas so fundamentais para sua utilizao como marcador molecular (Brocchieri, 2001). Os genes de rRNA so essenciais para o organismo e por isso evoluem de forma mais lenta. Ento, modificaes pontuais em stios especficos podem determinar a inativao da funo da subunidade comprometendo a sntese protica. O gene rDNA 18S possui uma taxa de mutao menor que o gene rDNA 28S e mais utilizado para as reconstrues filogenticas (Bargues & Mas-Coma, 1997). 1.3 Filogenia 1.3.1 rvores filogenticas

O conceito de filogenia surgiu com Darwin, junto com o prprio conceito de ancestralidade comum entre espcies e seu nico diagrama publicado de filogenia representa, por meio de uma rvore, relaes filogenticas. Assim as filogenias nada mais so que a indicao das relaes de ancestralidade supostas para um conjunto de espcies (Matioli, 2001).

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Uma rvore uma representao de uma hiptese utilizada como modelo da mais provvel histria evolutiva de um grupo de sequncias ou de organismos. Uma rvore consiste de ns conectados por braos. Ns terminais representam sequncias ou organismos que esto sendo estudados (tambm denominados unidades taxonmicas operacionais OTU). Ns internos representam os hipotticos ancestrais. O ancestral de todas as sequncias da rvore a raiz desta (Page & Holmes, 1998; Yang, 2006). A reconstruo filogentica consiste em estimar as relaes de ancestralidade para um determinado nmero de organismos (txons). Uma rvore filogentica representa graficamente a histria evolutiva dos organismos representados nela (Matioli, 2001). 1.3.2 Algoritmos para filogentica

Para a obteno de uma rvore filogentica, faz-se necessria a escolha de algoritmos. H dois grupos bsicos de algoritmos neste caso: no primeiro grupo, o princpio do mtodo est embutido no algoritmo que resulta em uma rvore final; o segundo grupo, o princpio do mtodo o critrio usado para a escolha da melhor rvore dentre um conjunto delas (Matioli, 2001). No caso do segundo grupo, os algoritmos faro a busca de rvores de acordo com o mtodo de otimizao de caracteres escolhido. O conjunto de rvores pode conter todas as rvores possveis (algoritmos exatos), caso em que o mtodo necessariamente encontrar a rvore (ou as rvores) que satisfaam o critrio de otimizao. Entretanto, isto pode ser invivel por causa do tempo computacional requerido. Uma soluo possvel para este problema procurar uma rvore dentro de um subconjunto de rvores (algoritmos heursticos), gastando menos tempo computacional para a estimativa da rvore. Entretanto, a rvore estimada pode no ser a tima para o critrio escolhido (Matioli, 2001).

1.3.3 Reconstrues filogenticas

A tarefa da filogentica molecular converter as informaes contidas nas sequncias numa rvore evolutiva. Um grande nmero de mtodos tem sido descritos para fazer isto. Os mtodos de distncia so baseados na idia de que se conhece a real distncia evolutiva entre todos os membros de um grupo de sequncias. As distncias evolutivas, na prtica, so raramente as melhores rvores mtricas, e por isso uma classe
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de mtodos de qualidade de ajuste busca a rvore mtrica que melhor representa as distncias observadas. A segunda classe de mtodo procura a rvore cuja soma dos comprimentos dos braos o mnimo (Page & Holmes, 1998). J os mtodos discretos atuam de uma maneira mais direta nas sequncias ou nas funes derivadas delas do que nos pares de matrizes. Estes mtodos tentam impedir a perda de informao que ocorre quando sequncias so convertidas em distncias. Os dois mtodos discretos mais utilizados so a Mxima Parcimnia (MP) e a Mxima Verossimilhana (ML do ingls: Maximum Likelihood) (Matioli, 2001; Page & Holmes, 1998; Yang, 2006).

1.3.4 Mxima parcimnia (MP)

O mtodo de mxima parcimnia baseado na suposio de que a rvore mais provvel a que requer o menor nmero de mudanas para explicar toda a variao observada em uma matriz de caracteres ou de alinhamentos de sequncias. O mtodo se baseia no princpio de homologias, ou seja, se dois txons compartilham uma caracterstica porque esta foi herdada do ltimo ancestral comum a ambos (Schneider, 2003). Nesse mtodo, nem toda variabilidade das sequncias til porque aquelas que apresentarem variao numa nica sequncia adicionaro um passo para qualquer uma das rvores consideradas, ou seja, aquela que tiver o menor nmero de mudanas. Em seguida, para cada uma das rvores possveis, o nmero de substituies de cada stio informativo inferido e o total, para cada uma das rvores possveis calculado. A rvore com menor comprimento selecionada como mais parcimoniosa. Pode haver mais de uma rvore parcimoniosa e todas devem ser consideradas (Matioli, 2001). O mtodo da parcimnia apresenta como vantagem a fcil interpretao dos dados, uma vez que escolhe o caminho mais simples. A desvantagem ocorre quando os marcadores usados apresentam grande nmero de homoplasias relativamente quantidade de stios informativos. As sequncias com muitas substituies apresentaro ramos longos comparativamente aquelas com menores nmeros de substituies. Estas ento sero agrupadas erroneamente pelo mtodo da parcimnia. Este problema denominado atrao de ramo longo. Ele pode ser contornado com o uso de marcadores com menores taxas de evoluo (Page & Holmes, 1998; Yang, 2006).

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1.3.5 Mtodo da mxima verossimilhana (ML)

O princpio bsico do mtodo da verossimilhana consiste em estimar a probabilidade, com base em um determinado modelo, de um conjunto de dados estar representado num processo que realmente ocorreu. Tratando-se de sequncias de DNA, o mtodo ir calcular a probabilidade de que aquelas sequncias em estudo tenham sido geradas seguindo as premissas do modelo evolutivo escolhido. Nesse caso, a topologia e o comprimento dos ramos de uma rvore so os parmetros a serem estimados, dadas as sequncias finais nas extremidades dos ramos. Difere um pouco da probabilidade porque esta pode ir de zero a um enquanto na mxima verossimilhana nunca ser zero (Page & Holmes, 1998; Schneider, 2003). A probabilidade deve ser calculada para todas as topologias possveis, variando o tamanho dos ramos para um grupo de unidades taxonmicas operacionais e a rvore que demonstrar a maior verossimilhana considerada a melhor estimativa da filogenia. A vantagem deste mtodo que ele apresenta menor varincia que a parcimnia porque menos afetado por erro de amostragem mesmo com sequncias curtas. Entretanto ele pode ser mais demorado, especialmente quando se envolve um grande nmero de OTUs (Matioli, 2001).

1.3.6 Inferncia bayesiana Um dos fundamentos da anlise bayesiana prope que no h distino lgica entre parmetros do modelo e dados. Ambos so variveis aleatrias com uma distribuio de probabilidades conjuntas que so especificadas por um modelo probabilstico. Desta maneira, os dados so variveis observadas e os parmetros so variveis no observadas. A distribuio a priori engloba informao sobre os valores de um parmetro antes de examinar os dados na forma de uma distribuio de probabilidade. A verossimilhana a distribuio condicional que especifica a probabilidade de dados observados, dado um particular valor para os parmetros. Essas duas funes juntas combinam todas as informaes sobre os parmetros. O principal objetivo da inferncia bayesiana calcular a distribuio posterior dos parmetros que a distribuio condicional dos parmetros dado os dados (Beamount & Ranala, 2004).

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Os fundamentos do mtodo bayesiano consistem em descrever todos os erros que podem existir em torno de um parmetro, usando como medida do erro a probabilidade de que o parmetro tome determinados valores (Faria et al. 2007) A anlise bayesiana um pouco semelhante mxima verossimilhana mas difere na noo de probabilidades a posteriori: probabilidades que so estimadas, baseadas em algum modelo (expectativas a priori) aps se ter algum conhecimento sobre os dados (Schneider, 2003).

1.4 Banco de dados

Com o desenvolvimento da tecnologia, os seqenciamentos esto cada vez mais rpidos, com mais qualidade e com menores custos. Desta forma, a quantidade de sequncias de cidos nuclicos e de protenas produzidas cresceu e houve a necessidade da criao de um banco para servir de repositrios destas sequncias (Meidanis & Setbal, 1994). Com este intuito foi criado o Genbank, um dos bancos de dados mais acessados na atualidade. O Genbank parte da colaborao internacional de base de dados de sequncias nucleotdicas (International Nucleotide Sequence database collaboration) que composto pelo banco de dados de DNA do Japo (DNA Databank of Japan - DDBJ), o Laboratrio de Biologia Molecular Europeu (European Molecular Biology Laboratory - EMBL) e o Genbank no National Center for Biotechnology Information (NCBI). Estas trs organizaes trocam informaes entre si e o Genbank que atualizado a cada dois meses (NCBI-Genbnak, 2010).

1.5 Busca de sequncias em banco de dados Para que se busquem as sequncias em bancos de dados, necessrio utilizar uma ferramenta que reconhea as sequncias mais similares para facilitar a comparao e o alinhamento entre elas (Matioli, 2001; Schneider, 2003). O programa BLAST (Basic Local Alignemnt Search Tool) procura regies de similaridade local entre as sequncias. O programa compara sequncias de nucleotdeos ou protenas no banco de dados e calcula a significncia estatstica da diferena entre elas. O BLAST pode ser utilizado para inferir relaes evolutivas e funcionais e tambm identificar membros de famlias gnicas (NCBI-BLAST, 2010).

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1.6 Alinhamento O alinhamento de seqncias possui uma diversidade de aplicaes na bioinformtica, sendo considerada uma das operaes mais importantes desta rea. Este mtodo de comparao procura determinar o grau de similaridade entre duas ou mais seqncias, ou a similaridade entre fragmentos destas seqncias. No caso de mais de duas seqncias o processo denominado alinhamento mltiplo (Page & Holmes, 1998). O alinhamento pode ser classificado em global ou local. No alinhamento do tipo global as sequncias so alinhadas de um extremo ao outro. Em contrapartida, no alinhamento local, alinha-se apenas as sequncias mais conservadas, independente da localizao destas. Enquanto o alinhamento global utilizado para determinar sequncias conservadas, o local utilizado na busca por homologias. O algoritmo utilizado pelo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) realiza este tipo de alinhamento (Prodoscimi et al. 2002).

1.7 Justificativa

Dentre as razes para se propor um estudo filogentico com dados moleculares do grupo Panarthropoda, pode-se destacar: No se sabe quem o grupo basal dos Panarthropoda A posio dos subgrupos do grupo Panarthropoda ainda incerta; Ainda no h suporte molecular suficiente para o Ecdysozoa e

consequentemente para os Panarthropoda;

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1.8 Objetivos 1.8.1 Objetivo geral Investigar as relaes filogenticas do grupo Panarthropoda atravs de sequncias do gene rDNA 18S.

1.8.2

Objetivos especficos Resolver as relaes dos Onychophora com os grupos do Panarthropoda Resolver as relaes filogenticas entre os grupos do Panarthropoda.

1.9 Hiptese Hiptese: O grupo Panarthropoda monofiltico e o grupo Onychophora o grupo basal.

METODOLOGIA

2.1 Sequncias As sequncias foram obtidas no banco de dados do Genbank no site do NCBI. Foi feito o download de cinqenta e uma sequncias do gene ribossmico 18S de invertebrados do grupo Panarthropoda e duas sequncias de indivduos do grupo Annelida para serem utilizadas como grupo externo (quadro 1). As sequncias foram baixadas no formato Fasta e armazenadas em blocos de notas.

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Quadro 1 - Sequncias dos clados dos Panarthropoda baixadas no genbank

Indivduo Grupo Chelicerata Chelicerata Chelicerata Chelicerata Chelicerata Chelicerata Chelicerata Chelicerata Onychophora Onychophora Onychophora Onychophora Onychophora Onychophora Onychophora Myriapoda Myriapoda Myriapoda Myriapoda Myriapoda Myriapoda Myriapoda Myriapoda Myriapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Hexapoda Custacea Custacea Custacea Custacea Acesso no genbank

Colossendeis sp Achelia hispida Pallenopsis sp Pallenopsis macneilli Sericosura venticola Callipallene sp Achelia hoekii Ammothella appendiculata Ooperipatellus viridimaculatus Peripatopsis moseleyi Opisthopatus cinctipes Euperipatoides leuckarti Peripatoides novaezealandiae Metaperipatus inae Peripatopsis sedgwicki Scolopendra mutilans Theatops posticus Alipes crotalus Tuoba sydneyensis Schendylops pampeanus Pectiniunguis argentinensis Cormocephalus monteithi Ethmostigmus rubripes Scolopocryptops nigridus Anthocomus rufus Lepicerus inaequalis Canthidium guanacaste Attalus analis Attalus varitarsis Charopus flavipes Ebaeus humilis Haplomalachius hispanus Axinotarsus ruficollis Cyrtosus semimarginatus Pseudosquillopsis marmorata Triops australiensis Lepidurus apus Lepidurus packardi

FJ862859.1 FJ862857.1 FJ862856.1 DQ389931.1 DQ389925.1 DQ389899.1 AY210808.1 DQ389888.1 GQ911190.1 GQ911189.1 GQ911188.1 GQ911187.1 AF342794.1 GQ911184.1 ELU49910 DQ666178.1 AY288695.1 AY288691.1 AF173260.1 AF173257.1 AF173256.1 AF173253.1 AF173249.1 AF173250.1 AY748136.1 GU591994.1 DQ012276.1 EF209726.1 EF209723.1 EF209718.1 EF209722.1 EF209715.1 EF209717.1 EF209729.1 HM138889.1 EF189637.1 EF189623.1 AF144212.1

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Quadro 1 - Sequncias dos clados dos Panarthropoda baixadas no genbank (Continuao)

Indivduo Grupo Custacea Custacea Custacea Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Tardigrada Annelida Annelida Acesso no genbank

Triops longicaudatus Triops cancriformis Austinogebia narutensis Echiniscus canadensis Testechiniscus spitzbergensis Pseudechiniscus sp Cornechiniscus lobatus Bryodelphax sp. Echiniscoides sigismundi Minibiotus sp Hebesuncus ryani Hebesuncus sp. Ramazzottius oberhaeuseri Syllis westheidei Syllis ferrani

AF144219.1 EF585454.1 EF189638.1 FJ435714.1 EU266967.1 EU266965.1 EU038079.1 EU266963.1 GQ849021.1 FJ435728.1 EU266933.1 EU266958.1 EU266956.1 EF123877.1 EF123874.1

O programa BLAST, disponvel na pgina do NCBI, foi utilizado para o download das sequncias. A sequncia inicial utilizada foi de um Onychophora da espcie Euperipatoides leuckarti. Para a busca de sequncias de outros indivduos foi selecionado o cone com mais baixa similaridade. As amostras com mais de setenta e cinco por cento de similaridade, com mais de mil pares de bases (pb) e menos de dois mil pb de todos os grupos do Panarthropoda foram selecionadas.

2.2 Edio das sequncias Para fazer o alinhamento foi utilizado o programa Mega4 (Tamura et al. 2007). As sequncias salvas em blocos de notas foram importadas para o programa Mega4 que fez o alinhamento. As sequncias foram editadas manualmente. O incio e o final de algumas sequncias foram desprezados para que toda a amostra ficasse do mesmo tamanho. Os espaos (gaps) foram deletados e todas as sequncias ficaram do mesmo tamanho e com mil e noventa e dois nucleotdeos.

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2.3 Anlise das sequncias Aps o alinhamento mltiplo, as sequncias foram submetidas anlise de modelo evolutivo com o programa Modeltest3.7folder (Posada & Crandal, 1998). Este programa atua em conjunto com o PAUP*4.0 Beta version (Phylogenetic Analysis Usisng Parsimony) (Swoford, 2002) selecionando o melhor modelo de substituio nucleotdica para as sequncias alinhadas dentro aqueles existentes no programa (Swoford, 2002). A anlise de mxima verossimilhana foi feita pelo programa PHYML (Guindon et al. 2010) aps descobrir o melhor modelo evolutivo e a proporo de stios invariveis para as sequncias feito pelo Modeltest3.7folder. A anlise de mxima parcimnia foi feita pelo programa PAUP*4.0 Beta version (Swoford, 2002) e a anlise Bayesiana foi feita com o programa Mrbayes (Huelsenbeck & Ronquist, 2001). As anlises de bootstrap para testar a confiana nas topologias obtidas foram realizadas para a parcimnia e para a verossimilhana com mil repeties. Para facilitar a visualizao, as rvores foram compactadas para serem exibidas nos resultados. Na discusso sero mostradas regies das rvores com as espcies.

3. RESULTADOS 3.1 Modelo evolutivo, proporo de stios invariveis e parmetro de distribuio

O programa Modeltest3.7folder apresentou como melhor modelo evolutivo para as sequncias o Modelo Geral de Reverso ao Longo do Tempo (GTR, do ingls General Time Reversible). Este modelo leva em considerao a taxa de substituio de um nucleotdeo para cada um dos demais, levando-se em conta a sua freqncia e taxa de substituio (Matioli, 2001; Page & Holmes, 1998). Os stios possuem baixa variao ou so prximas de invariveis. Entretanto, h alguns stios que so alvos de muitas variaes (hotspots, pontos quentes de mutao) (Yang, 2006). Os resultados apresentados pelo Modeltest3.7folder esto representados na tabela abaixo:

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Tabela 1- Resultado do teste modelo programa Modeltest3.7folder para sequncias de rDNA 18S Modelo selecionado: (Logaritmo da verossimilhana)-InL Frequncia de bases: Freq. de A Freq. de C Freq. de G Freq. de T Variao entre stios: Proporo de stios invariveis (I) sobre stios variveis (G)

utilizando o dados das GTR+I+G 84.203.262 0.2617 0.2313 0.2761 0.2308 0.3454

3.2 rvores filogenicas As rvores de mxima verossimilhana e anlise bayesiana apresentam os comprimentos dos ramos de tamanhos proporcionais ao nmero de substituies. A rvore enraizada por um grupo externo, formado pelos Annelida, que distante filogeneticamente dos clados analisados. Os nmeros contidos nos ns da topologia de mxima verossimilhana so do teste de confiana (bootstrap) e representam a frequncia que os grupos foram amostrados da forma apresentada nos ramos. J os nmeros mostrados na anlise bayesiana representam a probabilidade posterior. Acima de 70, esses dados so confiveis. A rvore de mxima parcimnia no possui seus ramos proporcionais ao nmero de substituies. Os nmeros nos ns tambm representam o bootstrap. Os Onychophora foram basais em todas as topologias. Quando se utilizou a mxima verossimilhana, o grupo Tardigrada se apresentou como grupo irmo dos Euarthropoda. O grupo Euarthropoda se mostrou monofiltico e foi dividido em dois grupos: O grupo Myriochelata (formado pelo Chelicerata e Myriapoda) e Pancrustacea (Hexapoda e Crustacea) (figura 4).

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Figura 4: Resultado da filogenia do Panarthropoda com sequncias do gene 18s utilizando a mxima verossimilhana (rvore compactada). Os nmeros nos ns indicam o valor de bootstrap.

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Quando foi utilizada a anlise bayesiana, os Tardigrada foi posicionado juntamente com os Euarthropoda. Todo o grupo Euarthropoda foi monofiltico e tambm foi observado o grupo Myriochelata e o grupo Pancrustacea (figura5).

Figura 5: Resultado da filogenia do Panarthropoda com sequncias do gene 18S utilizando a anlise bayesiana. Os nmeros nos ns indicam probabilidade posterior.

Quando foi utilizada a mxima parcimnia, os Euarthropoda no foram monofilticos. Os Tardigrada foram posicionados juntamente com o Hexapoda e alguns membros dos Crustacea foram grupos irmos dos Euarthropoda mais Tardigrada. Dentro do Euarthropoda h o grupo Myriochelata (figura 6).

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72
55 55

100

Figura 6: Resultado da filogenia dos Panarthropoda com sequncias do gene 18S utilizando mxima parcimnia. Os nmeros nos ns indicam os valores de bootstrap.

4. DISCUSSO

A maioria dos estudos de filogenia dos Arthropoda inclui apenas os grupos Chelicerata, Crustacea, Myriapoda e Hexapoda considerados como membros do grupo Euarthropoda. Dois grupos, os Onychophora e os Tardigrada, so comumente utilizados como grupos externos para a compreenso da filogenia dos Euarthropoda. Entretanto, esses dois grupos so cruciais para a compreenso da evoluo tanto dos Euarthropoda quanto do grupo Panarthropoda (Aguinaldo et al. 1997) porque eles podem ser considerados como basais deste grupo (Ryu et al. 2007). Estudo molecular com a famlia da protena hemocianina de Onychophora revelou que este grupo possui um tipo de protena diferente daquele encontrado nos Euarthropoda. Este resultado sugere que os Onychophora seriam posicionados como grupo irmo dos Euarthropoda (Kusche et al. 2002). Ainda no se tem certeza da real posio filogentica dos Onychophora. Alguns estudos morfolgicos os relacionam com os Chelicerata (Strausfeld et al. 2006) ou como sendo os basais do grupo Panarthropoda (Kusche et al. 2002) e estudos moleculares colocam os Onychophora como sendo grupo irmo do Euarthropoda (RotaStabelli et al. 2010). Os dados analisados deste trabalho resultaram na posio filogentica dos Onychophora sendo basal dentro dos Panarthropoda na anlise bayesiana, mxima
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parcimnia e mxima verossimilhana (Figuras 4, 5, e 6). Estudos moleculares com gene rDNA 18S (Aguinaldo et al. 1997), genes de histonas (Colgan et al. 1998) e Hox genes (Eriksson et al. 2009; Grenier et al. 1997) ratificam esse resultado. A posio do grupo Tardigrada tem sido bastante discutida e ainda permanece incerta. Alguns estudos moleculares consideram esse grupo um filo separado do Panarthropoda (Mallatt et al. 2004; Regier & Shultz, 2001), e alguns estudos morfolgicos os posicionam mais relacionados com os Nematoda devido a sua faringe com estilete (Dewel & Clark, 1973; Kinchin, 1992). Entretanto, o posicionamento mais prximo dos Tardigrada aos Nematoda pode ser efeito da atrao do ramo longo. Estudos com genoma mitocondrial e anlises multignicas resultaram nesse posicionamento. O resultado foi testado em outros modelos evolutivos e com genes com nmero de substituies moderadas. Desta maneira os Tardigrada foram posicionados juntamente com os Euarthropoda (Philippe et al. 2005; Rota-Stabelli, 2009). H trs possibilidades de posicionamento dos grupos Onychophora e Tardigrada dentro do Panarthropoda: os Onychophora como grupo basal e Tardigrada mais Euarthropoda como grupos irmos, Onychophora mais Euarthropoda como grupos irmos e Tardigrada como grupo basal ou Onychophora mais Tardigrada como grupos irmos (Figura 7). Morfologicamente, Euarthropoda e Tardigrada como grupos irmos suportado por trs caractersticas: esclerotizao das placas dorsal e ventral, desintegrao das fibras musculares abaixo da epiderme e colorao do complexo de golgi por bismuto (Schmidit-Rhaesa, 2001). Estudos da filogenia dos Arthropoda com DNA mitocondrial, micro RNAs e protenas encontrou suporte para Tardigrada mais Onychophora como grupos irmos e a monofilia dos Panarthropoda (Rota-Stabelli et al, 2009). Os resultados da mxima verossimilhana do presente trabalho demonstraram os Tardigrada e Euarthropoda como grupos irmos apenas na anlise de mxima verossimilhana, entretanto, com baixo valor de bootstrap (44) (figura 4).

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Figura 7 (Schmidit-Rhaesa, 2001): Trs possibilidades para a filogenia do Panarthropoda. E= Euarthropoda; O= Onychophora e T= Tardigrada. Nas topologias de anlise bayesiana e parcimnia, encontra-se um alto valor de probabilidade posterior e de bootstrap para os Tardigrada sendo grupo irmo de Malacostraca (Crustacea) (Figura 5 e 6). Esta relao possivelmente pode ser ter sido efeito de atrao do ramo longo (Matioli, 2001). Estudos filogenticos do Panarthropoda com DNA mitocondrial tambm tiveram problemas com atrao do ramo longo e tiveram como resultado os Tardigrada como grupo irmo dos Chelicerata, com altos valores de probabilidade posterior e bootstrap (Rota-Stabelli et al. 2010) (figura 8).

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Figura 8: Regio da topologia analisada com anlise bayesiana incluindo o Tardigrada juntamente com o Crustacea. Possvel atrao do brao longo. Os nmeros representam probabilidade posterior.

As amostras de Crustacea deste trabalho so de duas classes: Malacostraca (Pseudosquillopsis marmorata e Austinogebia narutensis) e Branchiopoda. Em estudos de filogenia do grupo Pancrustacea (Hexapoda mais Crustacea) (Aguinaldo et al. 1997; Giribet et al. 2007; Telford et al. 2008) estas duas classes tiveram relao mais prximas com os Hexapoda (Insecta) que com outros membros dos Crustacea, corroborando a hiptese que nem Hexapoda e nem Crustacea so grupos monofilticos (Regier et al. 2005; Capelli et al. 2007). Cook et al. 2005 em seu estudo com protenas, demonstrou que o Malacostraca e Branchiopoda so grupos irmos de Hexapoda e que o grupo dos Crustacea no monofiltico. Neste trabalho no houve suporte estatstico para a separao de Hexapoda e Crustacea como grupos irmos formando o Pancrustacea. Entretanto, na anlise de mxima verossimilhana, os indivduos da classe Malacostraca foram separados com
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bom suporte estatstico do grupo que contm Hexapoda e Branchiopoda (83 de bootstrap), ratificando a hiptese que os Malacostraca seriam grupo irmo de Hexapoda e este no seria monofiltico (figura 9). Na anlise bayesiana e na mxima parcimnia os valores de bootstrap e probabilidade posterior foram baixos (Figura 5 e 6). Dados morfolgicos da anatomia do crebro suportam esta teoria (Harzsch, 2002) (figura 7).

Figura 9: Regio da topologia de mxima verossimilhana mostrando o Pancrustacea. Os nmeros representam o valor de bootstrap. A classe de Crustacea denominada Malacostraca se apresentou como grupo irmo de Hexapoda mais outra classe de Custacea, a Branchiopoda. A posio do grupo Myriapoda ainda incerta e tem sido bastante debatida. Eles j foram considerados grupo irmo do Hexapoda que juntos formavam o grupo denominado Aterocerata. Unindo os Aterocerata com Onychophora formavam o grupo Uniramia (Telford et al. 2008). O presente trabalho resultou num suporte molecular para a hiptese do Myriochelata ou Paradoxopoda (Janssen et al. 2011; Mayer & Whintington, 2009) pois os Myriapoda foram posicionados como grupo irmo dos Chelicerata com um valor alto de boostrap para a anlise de mxima verossimilhana (81) (figura 10). A anlise de

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parcimnia resultou num valor no significativo e a anlise bayesiana resultou num moderado valor de probabilidade posterior (57) (Figura 5 e 6).

Figura 10: Regio da topologia de mxima verossimilhana demonstrando o grupo Myriochelata. Os nmeros nos ns representam os valores de bootstrap. O grupo Myriochelata tambm foi encontrado com suporte estatstico em estudos com DNA mitocondrial (Podsiadlowski et al. 2008), no trabalho com Hox genes (Cook et al. 2005) e vai contra a teoria do grupo Mandibulata, onde seriam irmos os grupos Hexapoda, Crustacea e Myriapoda (Aguinaldo et al. 1997; Telford et al. 2008; Eriksson et al. 2009). Isto pode ser um indcio que a mandbula estava presente no ancestral e foi perdida no grupo dos Chelicerata ou ento houve evoluo convergente da mandbula nos Myriapoda e no grupo Pancrustacea (Cook et al. 2005). Em seu trabalho com genoma mitocondrial, Rota-Stabelli, 2009 encontrou suporte molecular para o Myriochelata. Entretanto, quando se alterava o modelo evolutivo e se retirava as amostras com maior taxa de evoluo, o suporte para o Myriochelata diminua e aumentava o suporte para o Mandibulata, o que o levou a concluso que a hiptese do Myriochelata poderia ser causada pela atrao do ramo longo e que a posio do Myriapoda modelo dependente. A tabela abaixo contm os artigos presentes na discusso com os marcadores utilizados e seus respectivos resultados.

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Tabela 2 Lista artigos utilizados na discusso organizados de acordo com o tipo de estudo e resultado. Autor Aguinaldo et al, 1997 Capelli et al. 2007 Colgan et al. 1998 Cook et al. 2005 Dewel & Clark, 1973 Eriksson et al. 2009 Grenier et al. 1997 Harzsch, 2002 Janssen et al. 2011 Kinchin, 1992 Kusche et al, 2002 Mallat et al. 2004 Mayer & Whintington, 2009 Nielsen, 2001 Philippe et al. 2005 Podsiadlowski et al. 2008 Regier et al. 2005 Tipo de estudo Molecular - Gene de rRNA Molecular - genes de protenas mitocondriais Molecular - Genes de Histonas Molecular - Hox genes Morfolgico - Anatomia da faringe Molecular - Hox genes Molecular - Hox genes Morfolgico - anatomia do crebro Molecular - expresso do gene collier Morfolgico - Anatomia da faringe Molecular - Hemocianina Molecular - Gene de rRNA Morfolgico - caracteres embrionrios Morfolgico - Segmentao Molecular - Anlise multignica Molecular - DNA mitocondrial Molecular - gene de protenas nucleares Molecular - Gene de fator de elongao Resultado Onychophora como basal dos Panarthropoda Malcostraca e Branchiopoda mais relacionados com Hexapoda Onychophora como basal dos Panarthropoda Myriapoda como grupo irmo de Chelicerata Tardigrada relacionados com Nematoda Onychophora como basal dos Panarthropoda Onychophora como basal dos Panarthropoda Malcostraca e Branchiopoda mais relacionados com Hexapoda Myriapoda como grupo irmo de Chelicerata Tardigrada relacionados com Nematoda Onychophora como basal dos Euarthropoda Tardigrada como um filo separado Panarthropoda Myriapoda como grupo irmo de Chelicerata Viso tradicional Tardigrada relacionados com Euarthropoda Myriapoda como grupo irmo de Chelicerata Malcostraca e Branchiopoda mais relacionados com Hexapoda Tardigrada como um filo separado dos Panarthropoda

dos

Regier & Shultz, 2001 Rota-Stabelli et al. 2009 Molecular - Genoma mitocondrial Tardigrada Relacionados com Euarthropoda Rota-Stabelli et al. 2010 Molecular - Genoma mitocondrial Onychophora como grupo irmo dos Euarthropoda Onychophora e Tardigrada como basais do Ryu et al. 2007 Molecular - Genoma mitocondrial Panarthropoda Schmidit-Rhaesa, 2001 Morfolgico -Fibras musculares Tardigrada como grupo irmo de Euarthropoda Strausfeld et al. 2006 Morfolgico - anatomia cerebral Onychophora como grupo irmo de Chelicerata Malcostraca e Branchiopoda mais relacionados com Telford et al. 2008 Molecular e morfolgico Hexapoda

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5. CONCLUSO Os resultados do presente trabalho foram similares aos de outros trabalhos sobre o mesmo tema. Entretanto, no apresentaram suporte estatstico para a resoluo da posio filogentica do Filo Onychophora. Dentro do grupo dos Euarthropoda, o grupo Myriochelata apresentou bom suporte estatstico e foi de acordo com os trabalhos consultados. Para um melhor entendimento da filogenia do Filo Onychophora so necessrios mais estudos envolvendo concomitantemente vrios genes e tambm caracteres morfolgicos para dar maior suporte estatstico anlise. Estes estudos filogenticos devem envolver todos os subgrupos do grupo Panarthropoda.

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