Danielle Araujo

UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINRIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS DANIELLE OLIVEIRA DE ARAJO
INFLUNCIA DE TIPOS DE EMBALAGENS SOBRE A QUALIDADE DO SMEN SUNO CRIOPRESERVADO
FORTALEZA-CEAR 2006
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DANIELLE OLIVEIRA DE ARAJO INFLUNCIA DE TIPOS DE EMBALAGENS SOBRE A QUALIDADE DO SMEN SUNO CRIOPRESERVADO
Dissertao
apresentada
ao
Programa de Ps-Graduao em Cincias Veterinrias da Faculdade de Veterinria da Universidade Estadual do Cear, como requisito parcial para a obteno do grau de Mestre em Cincias Veterinrias. rea de concentrao: Reproduo e
Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli
Fortaleza, Cear 2006
A662i
Arajo, Danielle Oliveira
Influncia de tipos de embalagem sobre a qualidade do smen suno criopreservado/ Danielle Oliveira de Arajo Fortaleza, 2006 84p; il. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli Dissertao (Mestrado Acadmico em Cincias Veterinrias) Faculdade de Veterinria, Universidade Estadual do Cear. 1. Smen. 2. Congelao. 3. Suno. I. Universidade Estadual do Cear, Faculdade de Veterinria CDD 636.4
4 DANIELLE OLIVEIRA DE ARAJO
INFLUNCIA DE TIPOS DE EMBALAGENS SOBRE A QUALIDADE DO SMEN SUNO CRIOPRESERVADO
Conceito: Satisfatria Nota: 9,0 (Nove)
Aprovada em 26/ 07 /2006
Banca Examinadora:
______________________________ Prof. Dr. Ricardo Toniolli Orientador
_____________________________ Prof. Dr. Eugnio Pacelli
_______________________________ Prof. Dr. Airton Alencar Arajo
______________________________ Profa. Dra. Lcia Daniel
De tudo ficaram trs coisas: A certeza de que estamos sempre comeando A certeza de que preciso continuar E a certeza de que seremos interrompidos antes de terminar.
Portanto, devemos fazer da interrupo um caminho novo Da queda um passo de dana Do medo uma escada Do sonho uma ponte Da procura um encontro."
Fernando Sabino
A Deus pela companhia e por me fazer acreditar que eu posso!
7 AGRADECIMENTOS
Aos meus pais, Manoel Alves de Arajo e Iraci Oliveira de Arajo pelo amor, apoio, fora e pela confiana em mim depositada.
s meus irmos, Daniel Oliveira de Arajo, Daliane Oliveira de Arajo e Deyse Oliveira de Arajo pela admirao demonstrada e pela fora que me dedicaram.
Salete Alves de Arajo por alm de ser tia tem se apresentado como um anjo em minha vida.
Ao Prof. Dr. Ricardo Toniolli por me aceitar em sua equipe de trabalho.
amiga Ana Beatriz Graa Duarte pela companhia, orientao e pacincia durante todo mestrado.
amiga Ana Cristina Carlos de Albuquerque pelo apoio durante todo o projeto, pelo companheirismo e distrao nas horas fceis e difceis.
amiga Michelle Costa e Silva por nunca me deixar desistir e sempre me socorrer durante todo o mestrado.
A toda equipe do LRSTS, Rocilda Oliveira, Mariana de Souza Pimentel, ngela Silva dos Santos, Darlete Matos, Iara Gonalves, Eveline Lanzillotti Gomes, Valdevnia Arajo, Emanuelle Ribeiro Vasconcelos e aquelas que no esto mais no laboratrio, mas que estiveram presentes no meu trabalho e esto no meu corao, Camilla Oliveira, Roberta Nogueira, Gabriella Queiroga e dila Arajo.
8 equipe da Conceptus, Dr. Marcelo de Pontes Rocha, Dra. Marjorie Luzia Costdio Mota Dias, Dr. Marcelo Borges Cavalcante, Dr. Jos Oswaldo Queiroz Dias, Maura de Oliveira Fernandes, Valdenia Furtado Rodriguez e Roseane de Oliveira Fernandes.
amiga Carolina Sidrim Cavalcante que sem perceber me dava nimo nas horas difceis.
Magda pelo incentivo no perodo mais crtico.
Ao amigo Francisco Atualpa Soares Jnior pela disposio em me ajudar sempre que precisei.
Ao amigo Erivelton Rodrigues que me ajudou num momento de sufoco.
Ao amigo Antnio Srgio Varela Jnior pelas dvidas esclarecidas sempre que lhe recorri.
A todos que de alguma forma me ajudaram e incentivaram na execuo deste trabalho, obrigada.
9 RESUMO
O smen suno criopreservado vem sendo bastante estudado, entretanto, seu uso ainda espordico devido alta sensibilidade desta clula aos protocolos de criopreservao, levando um reduzido nmero de clulas viveis aps a descongelao das amostras criopreservadas. Este reduzido nmero deve-se a vrios fatores que comprometem a clula durante todo protocolo de congelao. Deve-se levar em considerao, a complexidade bioqumica da clula em questo, a interao celular com os componentes do meio crioprotetor, a influncia do resfriamento, congelao e descongelao, e ainda a forma da embalagem a ser escolhida para o armazenamento das clulas sendo necessrio o desenvolvimento de mtodos de congelao mais eficientes. Neste trabalho, foi avaliada a influncia de diferentes tipos de embalagens utilizadas, para o armazenamento de smen suno, sobre a qualidade do espermatozide criopreservado. Foram congeladas 35 amostras de animais em palhetas de 0,5 mL, criotubos de 2,0 mL, macrotubos de 4 e 5 mL, sendo analisadas quanto ao vigor (0 a 5), motilidade (0 a 100%) e morfologia espermticas antes e aps a descongelao em cada embalagem. O smen embalado em palhetas de 0,5 mL apresentou resultados significativamente melhores em todos os parmetros, quando comparados aqueles preservados nas outras embalagens. O vigor e a motilidade foram respectivamente de 2,3 e 45,4% para amostras congeladas em palhetas, 1,4 e 26,5% em criotubos, 1,5 e 26,3% em macrotubos de 4 mL e 1,3 e 29,6% em macrotubos de 5 mL. A morfologia espermtica foi analisada quanto existncia de acrossoma intacto, sendo encontrado 60,4% de espermatozides com acrossoma intacto nas amostras descongeladas em palhetas, 53,6% em criotubos, 54,1% e 52,9% em macrotubos de 4 e 5 mL, respectivamente. Desta forma, os resultados apresentados pelo smen envasado nas palhetas foram aqueles que apresentaram caractersticas psdescongelao condizentes com a possibilidade de serem utilizados nos protocolos de criopreservao de smen suno.
10 ABSTRACT
Cryopreserved swine semen is being quite studied. However, its use is still sporadic due to this cell high sensibility to the cryopreservation protocols, taking a reduced number of viable cells after the thawing of the Cryopreserved samples. This reduced number is due to several factors that commit the cell during every freezing protocol. It should be considered the cell biochemical complexity, the cellular interaction with the components of the cryoprotector way, the influence of the cooling, freezing and unfreezing, and the chosen packing method for the storage of the cells, making necessary the development of more efficient freezing methods. In this work the influence of different types of packaging used for swine semen storage was evaluated, concerning the quality of the cryopreserved spermatozoa. 35 samples of animals were frozen in straws of 0.5 ml, cryotubes of 2.0 ml, maxi-straws of 4 and 5 ml, being analyzed as for the energy (0 to 5), mobility (0 to 100%) and spermatic morphology before and after the thawing in each packaging. The semen frozen in straws of 0,5 ml presented significantly better results in all of the parameters, when compared to those preserved in the other packagings. The energy and the mobility were respectively from 2.3 and 45.4% to frozen samples in straws, 1.4 and 26.5% in cryotubes, 1.5 and 26.3% in maxi-straws of 4 ml and 1.3 and 29.6% in maxi-straws of 5 ml. The spermatic morphology was analyzed as for the existence of intact acrossome, being found 60,4% of spermatozoids with intact acrossome in the unfrozen slats samples, 53,6% in cryotubes, 54.1% and 52.9% in maxi-straws of 4 and 5 ml, respectively. This way, the results presented by the semen in the straws were the ones that presented powder unfreezing characteristics that were more suitable with the possibility to be used in the swine semen cryopreservation protocols.
11 LISTA DE ILUSTRAES
Figura 1 Coleta do ejaculado Figura 2 Retirada da gaze que retm a poro gel do ejaculado
32 33
Figura 3 Representao dos momentos de abaixamento da temperatura 37 Figura 4 Embalagens utilizadas no projeto Figura 5 Freezer para envase das amostras Figura 6 Rampa de congelao Figura 7 Botijes de nitrognio Tabela 1 Comparao entre as caractersticas seminais avaliadas Figura 8 Anlise do vigor espermtico Figura 9 Anlise da Motilidade espermtica Figura 10 Avaliao da Taxa de degradao mdia Figura 11 Anlise da Morfologia espermtica 38 39 39 40 45 46 47 48 49
12 SUMRIO
INTRODUO REVISO DE LITERATURA 1.0. Criobiologia 1.1. Criopreservao 1.2. Integridade da membrana 1.3. Crioinjrias 1.4. Meios crioprotetores 1.5. Diluidores de ressuspenso 2.0. Tipos de embalagem 3.0. Avanos na tcnica da criopreservao 4.0. Criopreservao do espermatozide suno JUSTIFICATIVA HIPTESE CIENTFICA OBJETIVOS Geral Especficos MATERIAL E MTODOS 5.0. Coleta e anlise do smen in natura 5.1. Animais e coleta do smen 5.2. Anlise do smen 5.2.1 Vigor e motilidade 5.2.2. Taxa de degradao mdia da motilidade 5.2.3 Morfologia 6.0. Tcnica de congelao
14 16 16 17 17 20 21 24 25 27 28 29 30 31 31 31 32 32 32 33 33 33 34 34
13 6.1. Tcnica de congelao do smen 6.2. Embalagem do smen 6.3. Congelao das amostras 7.0. Descongelao e ressuspenso 7.1. Descongelao e ressuspenso do smen 8.0. Anlise das amostras 8.1. Vigor e motilidade do espermatozide 8.2. Avaliao morfolgica do espermatozide 8.3. Momento das anlises 9.0. Anlise estatstica RESULTADOS E DISCUSSO CONCLUSES PERSPECTIVAS ARTIGO ANEXO REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ANEXOS 34 38 39 40 40 41 41 41 42 42 43 52 53 54 70 81
14 INTRODUO
A inseminao artificial (I.A.) uma importante ferramenta para a distribuio de gentica superior, tendo sido utilizada em diversas espcies incluindo, bovino, suno, ovelha e bfalo (Sukhato, et al., 2001). A I.A. em sunos, com smen resfriado vem sendo utilizada com sucesso em vrios pases. No Brasil, em 1975, houve a criao das primeiras centrais de I.A. na regio sul com um avano lento da utilizao desta tcnica pelos criadores. Em 1990, apenas cerca de 2% do rebanho nacional era inseminado (Scheid, 1991).
Assim como em outras espcies, bfalo (Sukhato, et al. 2001), bovino (Papa, et al., 2000), cabra (Purdy, 2005), dentre outras, o smen suno criopreservado vem sendo bastante estudado, entretanto, seu uso tem sido limitado a protocolos para melhoramento gentico. Pesquisadores tm procurado melhorar as tcnicas de criopreservao para aumentar sua rea de utilizao (Crdova, et al., 2002). Os primeiros resultados positivos de fertilidade, com a utilizao de smen suno congelado foram obtidos no incio da dcada de 70, inicialmente com I.A. realizada diretamente no oviduto de marrs em estro e depois com I.A. intra-cervical. (Bernardi et al., 2005).
A fertilidade de um rebanho uma resultante de trs fatores: fertilidade da porca, fertilidade do varro e manejo reprodutivo. Na teoria, estes trs componentes influenciam na mesma intensidade. No entanto, de acordo com Flowers (1997) a funo do varro dentro de uma suinocultura, cerca de 15 vezes mais importante que a fertilidade de uma porca isoladamente e representa a metade da influncia do manejo reprodutivo geral. Portanto, aspectos relacionados coleta, avaliao e processamento do smen do varro so de grande importncia para o sucesso da IA (Reis, 1997).
A clula espermtica de mamferos e, em particular, a suna altamente sensvel criopreservao (Watson & Plummer, 1985), sendo de grande importncia o conhecimento acerca dos danos provocados a esta clula, pela agresso trmica durante todo o processo de congelao. Neste processo, deve-se levar em considerao diversos fatores tais como, a complexidade bioqumica do
15 espermatozide, a interao de seus componentes e a influncia do resfriamento, congelao e descongelao (Parks & Graham, 1992). Portanto, torna-se importante a compreenso dos danos causados pelo estresse trmico e as respostas dos espermatozides ao abaixamento da temperatura, sendo necessrio o desenvolvimento de mtodos de congelao mais eficientes (Bwanga, 1991).
A reduo da fertilidade ps-descongelao atribuda alterao estrutural e funcional da membrana celular espermtica durante todo o processo (Papa, et al., 2000). Prope-se que as leses causadas na membrana da clula espermtica durante o resfriamento se devam reorganizao dos lipdios durante este processo e, posteriormente ao reaquecimento, comprometendo assim as associaes lipo-lipdicas e lipo-proteicas interferindo na funo e na integridade da membrana (Parks & Graham, 1992). Na realidade, o maior problema da criopreservao no a habilidade do espermatozide em permanecer vivel 196 C, mas sim, os danos resultantes dos processos de resfriamento e descongelao entre as temperaturas de - 15 C - 60 C (Mazur, 1985).
As pesquisas efetuadas durante os ltimos 30 anos resultaram em avanos originados, sobretudo, dos estudos efetuados para avaliao do efeito de diferentes crioprotetores, embalagens para congelao, diluentes e curvas de congelao e descongelao. No entanto, o emprego de smen congelado ainda est associado reduo de 10 a 20% na taxa de parto e de 1 a 2 leites por leitegada quando comparado ao smen resfriado (Bernardi, et al., 2005).
Para o uso de smen suno congelado em programas de I.A., o mtodo de embalagem do smen tem sido motivo de estudo para alguns autores, j que diferentes resultados na qualidade da amostra descongelada tm sido obtidos de acordo com o tipo de embalagem utilizada, sendo sugerido que o raio da embalagem tem influncia direta na proporo de clulas viveis no processo de criopreservao (Eriksson & Rodriguez-Martinez, 2000; Crdova et al., 2002).
16 REVISO DE LITERATURA
1. 0. Criobiologia
A palavra criobiologia tem origem do termo grego kryos (exprime a idia de frio) e definida como o estudo da vida em temperatura extremamente baixa. Dessa maneira, fica claro que os termos criopreservao e congelao no so sinnimos. O primeiro significa preservar clulas guardando-as a baixas temperaturas, o segundo a mudana do estado da matria de lquido para slido (Cavalcante, 2004). Quando clulas so criopreservadas, elas ficam sujeitas a estresses resultante da soluo de gua e interaes que aparecem atravs da cristalizao do gelo. A exposio celular ao estresse hiperosmtico, e ainda descongelao, provocam retirada intracelular de gua devido concentrao das solues, conseqentemente, a clula desidrata. (Mazur, 1984).
A criobiologia o estudo dos efeitos que as baixas temperaturas provocam nos sistemas biolgicos e as conseqncias que as mudanas de fase da gua provocam, no decorrer do resfriamento e reaquecimento. Desde 1949, Polge et al., demonstraram a sobrevivncia de espermatozides aps serem submetidos temperatura de 196 C. Esta cincia vem se desenvolvendo desde a descoberta do glicerol como crioprotetor. No final dos anos quarenta, comearam a ser investigadas diferentes maneiras de se congelar amostras de smen, tendo como objetivo a manuteno das caractersticas dos espermatozides in natura. Inicialmente, foram testadas as adies de glicerol-albumina aos espermatozides de aves (Polge et al., 1949) e de soluo de glicerol aos espermatozides de touro (Smith e Polge, 1950). Foi observada ento uma melhoria na qualidade dos espermatozides criopreservados, que foi recompensada com o nascimento do primeiro mamfero, fruto de uma inseminao artificial, utilizando smen bovino descongelado (Stewart, 1951).
17 1.1. Criopreservao
A criopreservao tem como principal objetivo manter a integridade estrutural e viabilidade celular aps submeter as clulas baixas temperaturas por um determinado perodo de tempo. Esse processo gera danos celulares conhecidos como crioinjrias, que surgem devido a fatores tais como: a toxicidade dos crioprotetores, o choque osmtico, a formao de cristais de gelo intra e extracelular e os danos de fratura no material gentico da clula (Holt, 2000; Watson, 2000; Kasai et al., 2002).
Ao serem congelados, os espermatozides so expostos a vrios fatores estressantes: transio de fase dos fosfolipdios da membrana, estresse osmtico e txico pela adio e remoo de crioprotetores, desidratao por aumento da concentrao de solutos e a formao e dissoluo de cristais de gelo. Em funo disto, alteraes podem ocorrer, tais como quebra da assimetria da membrana e conseqente alterao da permeabilidade, modificaes no citoesqueleto, na
arquitetura das mitocndrias, na condensao da cromatina, entre outras (Watson, 1995). Estes eventos contribuem para a formao de defeitos na membrana e nas organelas, que acabam por afetar a integridade funcional das clulas (Bwanga et al., 1991; Watson, 2000).
1.2. Integridade de membrana
Os eventos fsico-qumicos da congelao que ocorrem durante a manipulao, criopreservao e estocagem so irreversveis provocando alteraes na estrutura da membrana espermtica, aumenta a sensibilidade ao dano resultante da peroxidao lipdica, alterao na fluidez e instabilidade da membrana,
comprometimento nuclear, perda dos componentes intracelulares e queda da motilidade espermtica (Papa, et al., 2000).
J de conhecimento que a criopreservao afeta a integridade da membrana de modo a comprometer a viabilidade celular aps o processo (Bwanga et al, 1991). Segundo Parques & Lynch (1992), diferenas na composio de cidos
18 graxos e lipdios entre as espcies so fatores importantes durante o processo de abaixamento de temperatura. Buhr (1999) props a ocorrncia de modificaes lipdicas devido ao protocolo de congelao comprometendo a membrana plasmtica da cabea do espermatozide. A descongelao envolve uma reverso destes efeitos, e, conseqentemente, o influxo de gua para o interior poder causar o rompimento da membrana, sendo que estes efeitos podem alongar ainda mais os danos devido a condies hiperosmticas (Mazur et al., 1970).
Acredita-se que, parte das diferenas na sensibilidade dos espermatozides ao choque trmico estejam relacionadas com seu contedo lipdico. No s as diferenas na composio total parecem ser importantes, mas a composio das membranas em diferentes regies da clula espermtica parece assumir papel importante na determinao da sensibilidade s baixas temperaturas (Watson & Plummer, 1985). Foi demonstrada que a criopreservao do espermatozide suno est relacionada a modificaes na composio lipdica (fosfolipdios, cidos graxos, colesterol, triglicerdios) e conseqentes alteraes na fluidez da membrana na poro da cabea do espermatozide (Buhr et al., 1994; Buhr & pettitt, 1996; Cerolini et al., 2001).
A primeira mudana que os espermatozides tm que enfrentar ao serem submetidos ao processo de criopreservao, a transio de fase dos lipdeos de membrana, decorrente da diminuio da temperatura, antes da congelao
propriamente dita. Os aspectos referentes a esta mudana foram revisados e descritos por Watson em 1996.
medida que a temperatura diminui, os fosfolipdios apresentam restrio na sua movimentao lateral. Em dupla camada artificial de lipdeos, os fosfolipdios puros passam de uma fase fluida para uma fase gel a uma determinada temperatura, a chamada temperatura de transio, abaixo da qual os fosfolipdios formam um arranjo regular. Nas membranas naturais, a natureza dos fosfolipdios mista e h grande variedade de possibilidades de composio das cadeias laterais; a temperatura de transio de fase para os lipdios da membrana mais ampla, mas para cada grupo de fosfolipdios, a transio ocorre na faixa de temperatura restrita. Em funo desta variao na temperatura de transio para os diferentes grupos de lipdios, a separao
19 lateral pode acontecer. Como conseqncia, podem ser formados locais ocupados somente por lipdios e as protenas ficam agrupadas e excludas dos arranjos hexagonais dos lipdios gelificados, permanecendo em locais onde h lipdios ainda em estado fluido (Watson, 1996).
A natureza e proporo dos lipdios, juntamente com as protenas, controlam a fluidez da membrana. Muitas funes celulares dependem das protenas da membrana e a fluidez da membrana essencial para estas funes, por manter a mobilidade das protenas (Watson & Plummer, 1985). Pelo fato de estarem em ambiente lipdico no fisiolgico, por ocasio da separao lateral, a funo das protenas de membrana, necessrias para a integridade estrutural ou para o funcionamento das bombas de ons, pode ser afetada (Woelders, 1997).
O colesterol, um dos principais componentes da membrana espermtica, interfere no comportamento dos lipdios, ampliando a sua transio de fase, prevenindo, portanto, mudanas bruscas e minimizando a separao de fases. A membrana plasmtica do espermatozide suno apresenta uma relao
colesterol/fosfolipdios mais baixa de que em outras espcies, sendo para os espermatozides de sunos de 0,12, para os de bovinos 0,38 e para os de ovinos 0,36 (De Leeuw et al., 1990), isto pode ser um dos fatores responsveis por sua maior sensibilidade ao resfriamento (De leeuw et al., 1990; Parks & Lynch, 1992).
Alm do menor contedo de colesterol, Parks & Lynch (1992) observaram ainda que espermatozides sunos apresentam maior relao protena/fosfolipdios na membrana plasmtica numa proporo de 1,26 em relao ao espermatozide de outras espcies menos sensveis ao choque trmico como eqinos (0,86), bovinos (0,80) e galos (0,46). Os mesmos autores salientam que a frao glicolipdica da membrana de espermatozides sunos possui um ponto de fuso relativamente alto e proporo elevada de etanolamina. O conjunto destes aspectos aumentaria a probabilidade de mudanas irreversveis na membrana, advindas da separao lateral de fase e de alteraes na interao lipdios-protenas tornando os espermatozides sunos mais sensveis que os de outras espcies.
20 Do contedo total de lipdios existentes nos espermatozides sunos, aproximadamente 75% so fosfolipdios e 24% colesterol (Celorini et al., 2001). Apesar das diferenas entre espcies, nas classes dos fosfolipdios espermticos (De Leeuw et al., 1991), pouca variao foi observada no pico de temperatura de transio dos fosfolipdios de membrana, a qual foi de 24 C para os espermatozides sunos, e entre 21 e 25 C para os espermatozides de garanhes, perus e touros (Parks & Lynch, 1992). Hammersted et al., (1990) citam que mudanas drsticas ocorrem nas propriedades fsicas da membrana entre 15 e 20 C. Watson (2000), relata que a mudana de fase dos lipdios se concentra na faixa de 5 C a 15 OC, mas a mesma pode no estar completa at 0 C. Isto significa dizer que durante o processo de criopreservao, os espermatozides sunos, ao serem mantidos em equilbrio a 15 e a 5 C, esto sendo submetidos aos efeitos da transio de fase dos lipdios da membrana.
1.3. Crioinjrias
Foi observado que a rpida congelao traz conseqncias deletrias devido formao de cristais de gelo. O rompimento da membrana citoplasmtica por esses cristais pode ser associado ao crescimento destes tambm durante o degelo e recristalizao (Watson, 1990).
A formao de cristais de gelo, intra ou extracelular, durante a criopreservao depende da velocidade de queda da temperatura. O resfriamento lento forma cristais de gelo no meio extracelular levando a uma desidratao da clula, devido sua exposio a um meio hiposmtico por um perodo longo, fenmeno conhecido como efeito soluo (Holt, 2000). No resfriamento rpido se observa a formao de cristais de gelo no interior da clula podendo provocar leses de organelas celulares. Ambas as formas de resfriamento causam danos celulares. Assim, a velocidade de resfriamento ideal deveria ser lenta o suficiente para evitar a formao de cristais de gelo no interior da clula, mas de certa forma rpida para diminuir o efeito soluo (Holt, 2000; Leibo et al., 2002).
21 1.4. Meios Crioprotetores
A presena de solues de altas concentraes e de baixo peso molecular reduz os efeitos dos danos da desidratao no sistema de membranas: elas reduzem a alterao da membrana ocorrida devido elevao da temperatura. Isto pode ser uma razo do porqu de se congelar e desidratar. Freqentemente usa-se sacarose ou outros acares para tais solues (Leopardo, 1986 & Corvo et al., 1988 apud Wolf & Bryan, 2004). A presena de altas concentraes de acares tem a capacidade de reduzir a concentrao de ons que necessria para gerar uma dada presso osmtica, de modo a que a utilizao desses acares, reduz o aumento das concentraes mencionado anteriormente. Essas solues que podem acumular grandes concentraes sem produzir efeitos compatveis (Brown, 1976). txicos denominam-se solues
A gua o principal constituinte dos fluidos biolgicos para o transporte de substncias essenciais. Quando pura, ela congela e forma cristais de gelo a 0 oC, enquanto que contendo ons e outras substncias em soluo, congela a temperaturas mais baixas. Devido a gua em soluo sofrer congelao com formaes de cristais puros, ocorre um aumento na presso osmtica do soluto remanescente, podendo causar danos irreversveis s clulas (Holt, 2000; Oehninger et al., 2000; Kasai et al., 2002;). Durante o processo de congelao, algumas clulas se rompem, sendo que este processo de ruptura da membrana ocorre devido formao dos cristais de gelo (Steponkus et al., 1985).
Vrios fatores so apontados como responsveis por resultados de fertilidade insuficientes com o uso de smen suno congelado. Reconhece-se a sensibilidade do espermatozide suno a baixas temperaturas, manifestada j na faixa de 15 5 C. Para o espermatozide suno, os crioprotetores habituais usados para outros sistemas biolgicos, tm ao reduzida ou inexistente (Wilmut & Polge, 1972; Salamon, 1973).
O resfriamento dos espermatozides a temperaturas acima de 0 C, causa perdas prematuras e irreversveis motilidade espermtica, aumento da
permeabilidade de membrana e perda de molculas e ons intracelulares. Muitas
22 substncias vm sendo utilizadas como aditivos na proteo das clulas antes do abaixamento de temperatura. A adio de protenas como casena e gema de ovo, vm sendo utilizadas para proteo dos espermatozides ao choque trmico (Pursel et al., 1973). Almlid et al. (1989) estudaram o efeito do glicerol a 2 e 4 % sobre parmetros tais como: motilidade, integridade da membrana e capacidade de penetrao em ocitos; encontrando melhores resultados quando utilizaram este crioprotetor na concentrao de 4%. A temperatura de adio do glicerol e o tempo de exposio a este crioprotetor ao smen suno podem reduzir significativamente a qualidade espermtica aps a descongelao, bem como quando utilizado em concentraes acima de 4% (Almlid & Johnson, 1988). Segundo Thilman (1977), a utilizao do glicerol 2% para a congelao do smen em palhetas de 0,5 mL, resultaram na recuperao de maiores percentuais de espermatozides com acrossoma intacto do que com adio de glicerol 5 ou 7%, entretanto, os resultados de motilidade e viabilidade (porcentagem de espermatozides vivos) aps o teste de termorresistncia com o mesmo crioprotetor a 2%, so reduzidos, quando comparados com os resultados utilizando-se maiores concentraes.
Na tentativa de diminuir os danos celulares durante a criopreservao, a adio de substncias crioprotetoras passou a ser utilizada rotineiramente (Polge et al., 1949; Smith & Polge, 1950). Eles podem ser divididos em dois grupos, os permeveis (glicerol, dimetilsulfxido, etanol) e os no permeveis (sacarose, glicose, dextran). Geralmente, so utilizadas composies contendo os dois tipos de crioprotetores (Kasai et al., 2002).
O glicerol at agora o crioprotetor mais utilizado no smen suno em processos de criopreservao (Watson, 1995), embora se reconhea que esta substncia no o crioprotetor ideal para o espermatozide suno. Em concentraes crescentes de glicerol, eleva-se a motilidade espermtica ps-descongelao, porm o percentual de espermatozides com acrossoma intacto diminui (Scheid, 1980). Os crioprotetores exercem uma importante funo na proteo da clula espermtica dos processos de congelao e descongelao.(Gonzalez, 2004)
23 Com o surgimento do glicerol como meio crioprotetor houve uma melhora nos resultados. Porm, encontrar o meio crioprotetor ideal no tarefa fcil. O prprio glicerol utilizado em diferentes concentraes, dependendo da espcie animal, devido a sua agresso txica clula (Critser et al., 1988). A concentrao de glicerol lesiva aos espermatozides do suno se for adicionado a mais de 3%, do bovino a mais de 8% e do rato a mais de 1,7% (Holt, 2000).
No processo de congelao, os espermatozides so submetidos a vrias mudanas de volume celular, s quais devem se ajustar para sobreviver. Estas mudanas resultam em estresse osmtico para a clula (Courtens & Paquignon, 1985; Hammerstedt et al., 1990; Parks & Granam, 1992; Watson, 1995) e ocorrem durante diversas etapas do procedimento: exposio ao crioprotetor; congelao e
descongelao da gua extracelular e sada do crioprotetor.
Foi demonstrado por Gilmore et al. (1998) que os espermatozides sunos so mais sensveis s mudanas osmticas que os de humanos e de camundongos. Estas clulas podem suportar retrao e expanso de apenas 0,97 e 1,02 vezes seu volume isosmtico, respectivamente, de modo a manter motilidade superior a 70%. Estes limites de tolerncia se ampliam um pouco no smen diludo, o que pode ser o resultado da modificao ou estabilizao da membrana plasmtica, devido aos componentes do diluente. A alta sensibilidade dos espermatozides sunos ao choque osmtico indica que a adio e remoo do crioprotetor em passos poderia minimizar o problema e talvez, resultar em maiores ndices de sobrevivncia. No entanto, protocolos do congelao deste tipo poderiam no ser prticos, alm de aumentarem ainda mais o tempo de processamento das doses congeladas.
De acordo com Hammerstedt et al., (1990), provvel que haja ligao entre a morfologia dos espermatozides de vrias espcies e sua habilidade em tolerar as alteraes osmticas de volume. Watson & Plummer (1985) tambm chamavam a ateno para a possvel correlao entre a sensibilidade ao choque trmico e a morfologia da cabea; espermatozides das espcies mais sensveis ao choque trmico seriam os que apresentam cabeas maiores e mais achatadas, enquanto os mais resistentes teriam cabeas menores e menos achatadas, com membranas mais convexas. No entanto, os espermatozides bovinos, ovinos e sunos, os quais
24 apresentam a morfologia da cabea semelhante, diferem na sua sensibilidade a congelao (Holt, 2000).
1.5. Diluidores de ressuspenso
Para ser produzida uma dose inseminante, seja ela resfriada ou congelada, necessrio um meio de ressuspenso que apresente nutrientes necessrios para proteger o espermatozide prolongando sua vida in vitro e ainda aumentar o volume do ejaculado, so os chamados diluidores (Simmet, 1996). Existem basicamente dois grupos de diluidores e estes grupos so determinados pela capacidade de conservao do smen, sendo classificados em diluidores de curta ou longa durao (Reis, 1997). Os diluidores de curta durao apresentam composio de simples, geralmente so compostos apenas por produtos salinos como glicose, citrato de sdio, bicarbonato de sdio e cloreto de potssio. Estes diluidores tm a capacidade de preservar a viabilidade do smen por aproximadamente at quatro dias; J os diluidores classificados como de longa durao apresentam composies mais complexas e, conseqentemente, tm custo superior. Em mdia eles tm a capacidade de preservar as clulas por at 7 dias (Simmet, 1996).
Vrios trabalhos tm sido realizados na tentativa de melhorar a eficcia dos diluidores. Toniolli et al. (1996) demonstraram que o cido 3-indol actico acrescido ao diluidor BTS melhorou as condies de conservao do smen de varro, com um efeito significativamente favorvel sobre a percentagem de espermatozides com acrossoma intacto a uma temperatura entre 15 e 17 C e acondicionados por 13 dias. Na espcie suna, os resultados de fertilidade de fmeas inseminadas com smen congelado tm ficado abaixo das expectativas, fornecendo sempre leitegadas de tamanho menor (Toniolli, 1991). Uma frao rica da gua de coco adicionada ou no ao diluente BTS, foi testada in vivo na diluio de smen suno e os resultados mostraram que a prolificidade (nascimentos vivos por fmea) foi similar nos diferentes grupos, tendo a fertilidade no diminudo quando a gua de cco foi adicionada ao diluente BTS (Toniolli et al, 1995). Desta forma, o BTS tem sido utilizado com resultados bem satisfatrios para a ressuspenso de amostras sejam elas resfriadas ou
descongeladas.
25 2.0. Tipos de embalagens
A criopreservao das clulas espermticas apresenta vrias etapas que devem ser levadas em considerao, porm para ser congelado o smen deve ser processado, resfriado, congelado, armazenado e descongelado, e ainda recuperar o maior nmero de caractersticas fisiolgicas possveis para que ocorra a fecundao. Outro fator que deve ser considerado a variabilidade da fisiologia bioqumica do espermatozide de cada espcie e ainda a variao na anatomia e fisiologia do transporte espermtico no trato genital feminino, onde o nmero de clulas necessrias para se conseguir a fecundao varia de acordo com o trato genital de cada espcie (Holt, 2000).
Tem sido avaliada a possvel influncia da forma da embalagem do smen nos resultados de congelao e descongelao. Aps os primeiros trabalhos de congelao em ampolas ou tubos de vidro, vrios protocolos foram desenvolvidos para congelao do smen suno sob a forma de pellets em meados da dcada de 70. Os pellets so normalmente preparados pela colocao de 20 mL de smen em depresses formadas em blocos de gelo seco, sendo posteriormente armazenados em nitrognio lquido, dentro de tubos de 10 a 15 mL. Devido aos riscos de contaminao, dificuldade de armazenamento e manipulao dos pellets, vrios estudos foram posteriormente efetuados no sentido de encontrar embalagens que fossem adequadas para o congelao, armazenamento e manipulao das doses inseminantes congeladas. Bernardi, et al, 2005).
Vrias embalagens so encontradas atualmente para criopreservao de clulas espermticas tais como: plulas que apresentam uma relao volume-superfcie facilitando uma melhor distribuio da temperatura, porm, seu volume limitado necessita de um nmero considervel de ampolas para reconstituir uma nica dose inseminante: macrotubos apresentando acomodaes para 4 ou 5 mL, ao contrrio das ampolas, com apenas uma ou duas destas embalagens se consegue uma reconstituio de uma dose para inseminao, porm, sua dimenso geomtrica no facilita a transmisso uniforme da temperatura e as zonas perifricas ficam em exposio direta a temperaturas extremas de congelao e descongelao; palhetas, estas podem ser de 0,25 ou 0,5 mL. Apresentam boa transmisso de temperatura do
26 exterior ao meio interior, porm, seu volume dificulta a ressuspenso de uma dose inseminante, pois como as plulas, fazem-se necessrias a descongelao de vrias palhetas; bolsas plsticas apresentando-se em volume de 5,0 mL e uma geometria que facilita uma congelao e descongelao rpida e uniforme, no entanto, h dificuldades para seu armazenamento em tanques de nitrognio lquido (Lpez, 2006).
Existe ainda uma embalagem utilizada para armazenamento de smen humano, os criotubos, pequenos tubos plsticos com capacidade para dois e oito mililitros (Cavalcante, 2004).
Crdova et al. (2002) propuseram que a forma e o volume do recipiente para armazenamento do smen poderiam influenciar na qualidade do smen criopreservado. O choque trmico entre as regies perifricas e centrais do recipiente pode induzir danos ao acrossoma do espermatozide durante o processo de criopreservao. Observou-se que essa influncia da embalagem realmente existe.
Para serem adequadas, as embalagens devem propiciar velocidades de congelao e descongelao que sejam uniformes (Hofmo & Almlid, 1991), sendo sugerido que uma maior relao superfcie/volume deveria contemplar estas caractersticas. Neste sentido, vrios trabalhos resultaram em maior qualidade espermtica aps descongelao, quando foram usados macrotubos achatados (1,7 mL) ou palhetas de 0,5 ou 0,25 mL, em comparao aos macrotubos com volume de 5 mL (Fazano, 1986; Moura, 1988; Stampa, 1989; Bwanga et al., 1990, 1991b e 1991d; Berger & Fischerleitner, 1992; Simmet, 1993). A velocidade de descongelao do centro da dose, mantida em macrotubos, 3,7 vezes menor que a observada na periferia, mas esta variao no ocorre nas doses congeladas em macrotubos achatados (Weitze et al., 1991). Eriksson & Rodrguez-Mannez (2000) tambm atribuem os melhores resultados de motilidade das amostras congeladas em bolsas, em comparao aos macrotubos, maior velocidade de descongelao. Em seu estudo, Rodrigues-Martinez (2000), analisaram amostras ps-descongelao em macrotubos e em sacolas plsticas, ambos com capacidade para armazenar 5mL de ejaculado. Os macrotubos apresentaram uma variao de temperatura entre a periferia e o centro da amostra, sendo a motilidade ps -descongelao melhor nas sacolas.
27 Desta forma props-se que o tipo de embalagem tem uma real influncia sobre a qualidade de espermatozides viveis aps o processo de criopreservao.
3.0. Avanos na tcnica de criopreservao
O estudo dos danos produzidos durante o processo de congelao, abaixamento de temperatura e pelas suas embalagens tem crescido muito. Na medicina humana, a criopreservao j vem sendo praticada rotineiramente, onde clulas sangneas e sexuais so congeladas e descongeladas para posteriormente serem diferentemente utilizadas. No entanto, em muitos casos, as taxas de sobrevivncia celular so muito baixas, levando a cincia a buscar melhorias nas tcnicas de criopreservao celular (Wolf, 2004).
O potencial de fertilizao do espermatozide criopreservado tem sido estudado a mais de 50 anos e at recentemente no se tinha ainda informaes suficientes na literatura que permitissem uma avaliao dos danos causados membrana celular, bem como, ainda no h evidncias conclusivas sobre a capacidade fertilizante dos espermatozides submetidos ao processo de criopreservao (MarcusBraun et al., 2004).
Os processos de resfriamento, congelao e descongelao causam alteraes na estrutura da membrana espermtica. Foi constatado que o smen suno ps-descongelao apresentou uma proporo maior de espermatozides com reao acrossmica que o smen in natura depois de submetido tcnica de swim-up. Conseqentemente, o smen descongelado foi capaz de penetrar imediatamente ocitos sunos em um sistema de fertilizao in vitro, sem a necessidade de um perodo de incubao, para ativar a capacitao do smen in natura (Clarke & Johnson, 1987). Alm disso, concluram que o smen suno congelado aps uma seleo de uma subpopulao mvel de espermatozides mais indicado para fertilizao in vitro, pois as taxas de penetrao so similares as do smen in natura com menor freqncia de polispermia e maior freqncia de formao de proncleo (Zheng, 1992).
28 4.0. Criopreservao do espermatozide suno
Os primeiros trabalhos de congelao do smen de varro comearam na dcada de 1950. Vrios autores (Crabo & Einarsson, 1971; Grahan et al., 1971; Pursel & Johnson, 1971) conseguiram manter um nvel de fertilidade aceitvel com smen suno atravs de inseminaes intracervicais, entretanto o emprego do smen suno congelado ainda espordico e limitado a eventuais importaes para a introduo de material gentico em programas de melhoramento gentico e trabalhos experimentais (Scheid et al., 1982). Embora a tecnologia venha sendo aprimorada, os resultados da aplicao dos mtodos de conservao do smen suno congelado, ainda so insuficientes, apresentando nveis mais baixos de fecundidade em relao monta natural ou inseminao artificial, utilizando smen resfriado.
Durante as ltimas trs dcadas, foram elaborados muitos diluidores, sendo a maioria para protocolos particulares, de forma que geralmente no so transferveis de um mtodo para outro (Osinowo & Salamon, 1976). Segundo Watson (2000), os efeitos da criopreservao podem induzir danos irreversveis e letais ao
espermatozide sendo de grande importncia os estudos aos numerosos danos provocados a esta clula na tentativa de minimizar estes efeitos.
A criopreservao de smen suno pouco utilizada em prtica comercial. As principais razes so a baixa taxa de sobrevivncia do espermatozide e uma necessidade de alta concentrao de clulas espermticas viveis para uma dose inseminante. Armazenar smen suno a 16 18 C o mtodo mais comum para poucos dias e tem sido bem aceito obtendo boas taxas de fertilidade. Ainda assim, a criopreservao uma valiosa tcnica, especialmente, como j citado, para conservao material gentico, ou assegurar um constante abastecimento de smen em casos de um temporrio problema epidemiolgico ou de baixa produo de smen pelos animais, devido a condies adversas (Cerolini et al., 2001).
29 JUSTIFICATIVA
Como citado, a inseminao em sunos com o uso de smen congelado ainda reduzida devido baixa recuperao de clulas espermticas viveis aps a criopreservao. Para uma melhor recuperao celular devem-se levar em
considerao diversos fatores tais como: a complexidade bioqumica da clula em questo, a interao com os meios crioprotetores e o mtodo de embalagem do ejaculado. Neste sentido, a escolha da embalagem pode influenciar diretamente os resultados das amostras ps-descongeladas, influenciando assim na taxa de fertilizao dos protocolos de inseminao artificial suna. (Bernardi, et al, 2005).
Diversos tipos de embalagens de capacidade para 5 mL de smen, visando a criopreservao do smen suno tem sido propostas (Eriksson e Rodriguez-Martinez, 2000). No entanto, devido ao seu grande volume elas apresentam a desvantagem de submeter o smen a diferentes temperaturas, sendo tambm o armazenamento destas embalagens mais trabalhoso.
Palhetas de 0,5 mL so largamente utilizadas para criopreservao em diferentes espcies (Larsson, 1978, Kirk, et al, 2005) e na congelao de smen suno tem apresentado resultados satisfatrios (Bwanga, et al, 1990, Simmet, 1993), no entanto para se obter uma dose inseminante faz-se necessrio em mdia 40 palhetas por animal sendo este nmero considerado trabalhoso. Nos processos de congelao e descongelao de smen humano (Cavalcante, 2004) a utilizao de criotubos tem apresentado resultados significativamente melhores quando comparados a palhetas de 0,25 mL, no entanto esse tipo de embalagem ainda no foi utilizado em protocolos de criopreservao de smen suno.
30 HIPTESE CIENTFICA
O criotubo de 2 mL em relao palheta de 0,5 mL, o tipo de embalagem mais adequado para criopreservao do espermatozide suno.
31 OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL Avaliar a influncia de diferentes tipos de embalagens sobre a qualidade do smen suno criopreservado.
OBJETIVOS ESPECFICOS
a) Comparar a qualidade espermtica aps a congelao e descongelao em diferentes embalagens; b) Avaliar a morfologia espermtica do smen in natura e aps a descongelao das diferentes embalagens; c) Analisar a qualidade espermtica aps o teste de termorresistncia das amostras nas diferentes embalagens; d) Propor a melhor embalagem para seu uso em rotina de criopreservao do smen suno.
32 MATERIAL E MTODOS
5.0. COLETA E ANLISE DO SMEN IN NATURA
5.1. Animais e coleta do smen:
Foram utilizados 5 animais adultos, pertencentes ao Laboratrio de Reproduo Suna e Tecnologia de Smen (LRSTS) da Faculdade de Veterinria da Universidade Estadual do Cear (FAVET/UECE), submetidos rotina de coleta semanal. A coleta foi realizada pela tcnica da mo enluvada, em manequim (figura 1) aps lavagem do prepcio com gua tratada sendo enxugado com toalha de papel descartvel. O smen foi coletado em frasco plstico com capacidade para 500 mL, previamente aquecido a 37 C protegido por copo isotrmico. O ejaculado teve a frao gelatinosa separada por uma gaze especial, sendo posteriormente desprezada (figura 2). A qualidade do ejaculado (in natura) foi estabelecida quanto seu aspecto (branco marmreo), volume (mL), concentrao (x106 sptz/mL), total de clulas (x109 sptz), vigor espermtico (0 a 5) e motilidade espermtica (%). Foi utilizada uma ficha padro para o acompanhamento do ejaculado de cada animal (ANEXOS II e III).
Figura 1 Coleta do ejaculado pela tcnica da mo enluvada. Animal sobre o manequim de acrlico.
33
Figura 2 - Retirada da gaze que retm a poro gel do ejaculado.
5.2. Anlise do smen in natura:
5.2.1. Vigor e Motilidade
Para as anlises do vigor e da motilidade espermtica, foram utilizadas alquotas de 15 L do smen diludo, colocadas entre lmina e lamnula para observao em microscopia ptica a um aumento de 200x. As anlises foram realizadas aps 10 minutos de incubao em banho-maria 37 C. 5.2.2. Taxa de degradao mdia da motilidade (TDM)
O teste utilizado para anlises in vitro que mais se aproxima das condies naturais do smen aps a inseminao o teste de termorresistncia. Este teste consiste na incubao do smen, aps coleta em banho-maria a 37 C, durante 2 horas. Aos resultados aplica-se uma frmula matemtica, no intuito de calcular a taxa de degradao mdia da motilidade (TDM). A TDM consiste em se calcular o vigor espermtico aos 10 minutos de incubao subtrado do valor da mesma caracterstica aps 2 horas de incubao, dividido pelo mesmo valor aos 10 minutos. O resultado desta operao multiplicado por 100, fornecendo ento o
34 resultado final. A TDM expressa em porcentagem (%) e calculada pela seguinte frmula matemtica:
TDM = vigor 10 m - vigor 2 h x 100 vigor 10 m 5.2.3. Morfologia
Para anlise morfolgica dos espermatozides, foi separada uma alquota de 0,5 mL de smen e a esta foi adicionada 0,5 mL de soluo formol-salina (0,99 mL de soro fisiolgico e 0,01 mL de formol) e em seguida colocadas em tubos eppendorffes. Em se tratando da palheta de 0,5 mL, foi descongelada uma segunda amostra para a avaliao desta caracterstica. No caso das outras embalagens, o volume era suficiente para todas as caractersticas serem avaliadas. De cada ejaculado, para cada um dos tratamentos (diferentes embalagens), foi separada uma alquota de 0,5 mL para ser realizada a anlise morfolgica. A morfologia foi analisada segundo qualidade do acrossoma, sendo classificado em duas classes diferentes: espermatozide com acrossoma intacto e espermatozides com acrossoma danificado.
As anlises foram realizadas no smen in natura e aps a descongelao, em cada uma das diferentes embalagens, contando-se 200 clulas por amostra. Os exames foram realizados por meio da microscopia ptica com lente de imerso, a um aumento de 1000x.
6.0. TCNICA DE CONGELAO
6.1. Tcnica de Congelao do smen (Paquignon et al., 1974):
Aps a anlise do smen in natura, este foi refrigerado, congelado e armazenado em diferentes tipos de embalagens (em palhetas de 0,5 mL, criotubos de 2,0 mL e macrotubos de 4,0 e 5,0 mL). O diluidor de resfriamento foi constitudo por 5,67 g de glicose, 22,5 % de gema de ovo, e completados com gua destilada at
35 obteno de um volume final de 100 mL. O diluidor de congelao o mesmo do diluidor de resfriamento adicionado glicerol 4%. A concentrao final de glicerol para a congelao foi estabelecida em 2% (Polge et al., 1970).
O plasma seminal foi eliminado do ejaculado logo aps a sua coleta, atravs de centrifugao (30 C) a 800g (2.600 rpm) por 15 minutos. O volume de plasma seminal separado do precipitado de espermatozides atravs da centrifugao foi retirado por pipetagem, e armazenado em bisnagas plsticas com volume de 90 ml, congelado e conservado 20 C. Aps a centrifugao, foi feita uma 1a diluio atravs da adio do diluidor de resfriamento previamente estabilizado a 30 C: aproximadamente 2,0 ml de precipitado de espermatozides + 9,0 mL do diluidor (mdulos de 2 + 9 mL). Foi separado do ejaculado um total de 10,2 x109 sptz, em volumes variados de acordo com a concentrao inicial do smen.
partir
deste
ponto,
temperatura
do
mdulo
foi
abaixada
progressivamente (em 1 hora) at a temperatura de 17 C e mantida a este nvel durante 5 horas. Foi feita uma 2 diluio (diluio final a 17 C), adicionando-se a cada mdulo mais 9,0 mL do diluidor de congelao (glicose/gema de ovo/glicerol a 4%), este, juntamente com a 1a diluio foi obtida uma concentrao final de glicerol a 2% (Polge et al., 1970), independente do tipo da embalagem a ser testado. A figura 3 representa os momentos em que foram adicionados os diluidores de resfriamento e congelao.
Aps a segunda diluio, ocorreu uma nova etapa de abaixamento de temperatura do mdulo, durante 1 hora. Aps este tempo foi alcanada a temperatura de 4 C. O smen desta forma tratado foi armazenado em diferentes tipos de embalagem (Figura 3) colocadas deitadas lado a lado, em uma rampa de congelao a uma distncia de 5,0 cm da superfcie do nitrognio lquido. Desta forma, cada embalagem permaneceu durante 10 minutos, sendo ento, transferidos diretamente para o nitrognio lquido onde ficaram mantidos por pelo menos 15 dias at ento serem analisados e comparados cada tipo de embalagem ao smen in natura.
35
30
1 Diluio Diluidor Gema de ovo 2 Diluio Dil. Gema de ovo + Glicerol 4%
25
Temperatura
20
15
10
Envaze do smen em "pailletes"
0 0h 1h 2h 3h 4h 5h 6h
Horas
Figura 3 Representao dos momentos de adio dos diluidores em relao ao abaixamento de temperatura.
6.2. Embalagem do smen: Aps o resfriamento do smen at a temperatura de 4 oC, o mesmo proveniente de cada ejaculado foi envasado em diferentes tipos de embalagens (figura 4) com a finalidade de se testar a que se adapta melhor a tcnica, proporcionando melhor qualidade espermtica aps a descongelao. Foram testadas as seguintes embalagens:
01) Palhetas com dimetro de 0,2 cm e volume de 0,5 mL; 02) Criotubos com dimetro de 10 cm e volume de 2,0 mL; 03) Macrotubos com dimetro de 0,5 cm e volume de 4 mL (Mac 4); 04) Macrotubos com dimetro de 0,5 cm de 5,0 ml (Mac 5). A concentrao espermtica foi padronizada com 0,51 x106 sptz/mL em todos os diferentes tipos de recipientes. Tanto as palhetas como os macrotubos foram vedados com esferas de vidro; j o criotubo foi vedado com uma tampa rosqueada adequada.
Mac 5 Mac 4
Palheta
Criotubo
Figura 4 Embalagens utilizadas no projeto (macrotubo de 5 mL, macrotubo de 4 mL, palheta de 0,5 mL e criotubo de 2 mL)
39 6.3. Congelao das amostras:
Aps o envase do smen em cada uma das quatros embalagens (figura 5), estas foram submetidas ao vapor de nitrognio a -120 C (Sukhato et al., 2001) durante 10 minutos em rampa de congelao (figura 6), uma distncia de 5 cm da superfcie do nitrognio lquido. Decorrido o tempo estabelecido, o smen foi depositado em canisteres numerados devidamente identificados e armazenados diretamente no nitrognio lquido a 196 C (figura 7), onde permaneceram por um perodo mnimo de 15 dias, at as anlises.
Figura 5 Freezer utilizado para o envase das amostras. Temperatura interna de 4 C.
Figura 6 - Rampa de congelao.
40
Figura 7 Armazenamento das amostras j congeladas em botijes de nitrognio lquido.
7.0. DESCONGELAO E RESSUSPENSO
7.1. Descongelao e ressuspenso do smen:
Para a descongelao, foram testados diferentes tempos e temperaturas nos diferentes tipos de embalagem utilizados, conforme esquema a seguir: 01) Palhetas: 37 oC por 30 segundos; 02) Macrotubos e Criotubos: 50 oC por 40 segundos;
Imediatamente aps a descongelao, cada amostra foi colocada em tubos plsticos contendo um termmetro para aferio da temperatura. A esta amostra foi adicionado o diluidor de ressuspenso (BTS Betsville) estabilizado a 37 oC para ento serem posteriormente analisadas. Para as anlises in vitro, a diluio do smen descongelado no diluidor de ressuspenso foi feita adicionando-se um volume fixo de cada uma das diferentes embalagens (0,5 mL) a um total de 4,5 mL diluidor BTS.
41 8.0. ANLISE DAS AMOSTRAS
8.1. Vigor e motilidade espermtica:
Aps a descongelao e ressuspenso do smen, cada amostra foi avaliada atravs do vigor espermtico (notas de 0 a 5 Toniolli, 1996 ANEXO I) e da motilidade espermtica (0 a 100%). O smen descongelado foi colocado em banhomaria a 37 oC e as anlises foram realizadas aps 10 minutos de incubao. Para estas caractersticas foi colocado um volume de 15 L do smen, entre lmina e lamnula, para anlise luz a microscopia ptica a um aumento de 200x. 8.2. Avaliao morfolgica do espermatozide:
De cada ejaculado, para cada tratamento, incluindo-se smen in natura, foram separados 0,5 mL de smen e adicionado a 0,5 mL de soluo formol-salina, a fim de se proceder sua anlise morfolgica.
A morfologia foi analisada apenas quanto s caractersticas do acrossoma, sendo classificados como intacto ou danificado. Para se proceder tais anlises, foram colocadas alquotas de 0,15 L colocados entre lmina e lamnula e ento realizada a contagem de 200 clulas. Adio a tubos eppendorffes de um volume de 0,5 mL de smen e 0,5mL de soluo formol-salina (0,99mL de soro fisiolgico e 0,01mL de formol).
a) Identificar a lmina; b) 0,5 mL de smen + 0,5 mL de soluo formol-salina; c) Homogeneizar; c) Analisar. Foram contadas 200 clulas por amostra, com os exames realizados por da microscopia ptica com lente de imerso, a um aumento de 1000x.
42 8.3. Momentos das anlises:
Para as caractersticas vigor e motilidade, o smen foi avaliado nos seguintes momentos do processo: a) Smen in natura; b) Aps a adio do diluidor de resfriamento a 30 C; c) Antes da adio do diluidor de congelao aps o perodo de 5 h 17 oC; d) Antes do envase 4 C; e) Aps 10 minutos da ressuspenso do smen descongelado. f) Aps 2 horas a 37 C
Para o item a, o smen foi analisado logo aps a coleta; nos itens b, c e d, a anlise foi feita aps 10 minutos de incubao do smen a 37 oC em BTS; para o item e a anlise foi realizada aps a descongelao com acrscimo do diluidor de ressuspenso ; e no item f, foi aplicado o teste de termorresistncia. Para as anlises morfolgicas, os esfregaos foram feitos nos seguintes momentos:
a) Smen in natura; b) Imediatamente aps a descongelao.
9.0. Anlise Estatstica
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso. A anlise estatstica foi processada atravs da avaliao das mdias e desvios padres, aos quais foi aplicado o teste de Mann-Withney, e o teste do Qui-quadrado para valores expressos em porcentagem. Todos os testes foram aplicados a um nvel de significncia de 5% (p<0,05). A anlise das diferenas entre mdias foi realizada atravs do teste ANOVA.
43 RESULTADOS E DISCUSSO
Neste trabalho, os resultados de medida da temperatura do smen, logo aps a descongelao, foi de 36 C nas palhetas e de 34 C nas demais embalagens testadas. Provavelmente, esta diferena est relacionada com os diferentes dimetros das embalagens, uma vez que a temperatura utilizada para
descongelao, se distribui de maneira mais uniforme da periferia para o centro da amostra nas embalagens com dimetros menores, quando comparadas quelas com dimetros maiores (Ericksson & Rodrigues-Martinez, 2002). Por outro lado, devem ser avaliadas novas combinaes de tempo e temperatura, para a descongelao do smen envasado em embalagens de maior dimetro (macrotubos e criotubos), de forma a se obter uma temperatura da amostra descongelada mais prxima possvel de 37 oC, uma vez que todo o material que entra em contato com o smen descongelado bem como o diluidor de ressuspenso, encontravam-se esta temperatura. Desta forma, problemas de choque trmico podero ser evitados. Apesar do smen suno ser altamente sensvel, existe citao de anlise espermtica do smen in natura, em lminas e lamnulas aquecidas a 38-39 oC (CBRA, 1998), o que daria uma diferena de at 4 oC uma vez que os ejaculados sunos em nosso clima apresentam temperaturas que variam entre 35 e 37 oC. Baseado nesta indicao da literatura, a diferena de temperatura entre o smen descongelado proveniente dos criotubos e macrotubos, e o diluidor de
ressuspenso, no teria tido influncia sobre os resultados de motilidade, o que indicaria a possibilidade de que a distribuio da temperatura durante a descongelao dentro da coluna de smen da periferia para o centro da embalagem (Ericksson & Rodrigues-Martinez, 2002), teria uma maior influncia na qualidade do smen ps-descongelao, tornando-se assim um fator mais importante a ser considerada para a escolha de embalagens visando a congelao do smen do varro.
Todo o material e diluidor que teve contato com as amostras descongeladas, encontravam-se temperatura de 37 oC; j o smen proveniente das palhetas apresentou uma diferena de apenas 1 oC para o diluidor de ressuspenso, enquanto que nas outras embalagens, esta diferena chegou 3 C, o que pode ter
44 favorecido um choque trmico, que possivelmente justificaria os melhores resultados encontrados no smen armazenado nas palhetas. Por outro lado, resultados obtidos por Bamba & Cran (1985), mostraram que grandes diferenas de temperatura entre o smen suno e o diluidor podem no apresentar influncia imediata sobre a motilidade espermtica, entretanto, quando da incubao do mesmo por at 5 horas, os valores caem significativamente em comparao s amostras onde no ocorreu diferena de temperatura entre o smen e o diluidor, este um fator que deve ser melhor explorado e analisado a fim de se determinar exatamente a sua influncia sobre os resultados de qualidade espermtica aps a descongelao.
Os resultados deste trabalho esto de acordo com alguns achados da literatura, onde Eriksson & Rodrigues-Martinez (2000) medindo a temperatura do smen descongelado 40 oC por 20 segundos, envasado em macrotubos (4 mL) e sacolas de PVC (5 mL), obtiveram melhores resultados de motilidade espermtica nas amostras provenientes das sacolas de PVC. Apesar deste tipo de embalagem apresentar um volume alto (5 mL), quando comparado ao das palhetas de 0,5 mL utilizadas neste trabalho, resta salientar que a forma das sacolas de PVC era achatada, o que proporcionou uma distncia entre as paredes da mesma mais prxima do dimetro das palhetas do que dos criotubos ou macrotubos, explicando desta forma os melhores resultados conseguidos.
A diminuio da qualidade espermtica suna, aps os processos de congelao e descongelao, ainda um problema constante encontrado nos diferentes protocolos utilizados com esta finalidade (Stornelli et al., 2005). Segundo Watson (2000), os efeitos da criopreservao podem induzir danos irreversveis e letais aos espermatozides, sendo de grande importncia o estudo dos numerosos danos provocados, associados aos defeitos na membrana e nas organelas, que acabam por afetar a integridade funcional das clulas (Bwanga et al., 1991; Watson, 2000), reduzindo a capacidade fertilizante dos espermatozides (Pea, et al., 2006). A queda dos valores do vigor, motilidade e morfologia espermtica, so vistos tanto no smen refrigerado, quanto no congelado. Entretanto, nesta ltima forma de conservao da clula espermtica, a influncia da tcnica utilizada sobre os
45 valores destas caractersticas tem sido bem mais contundente (Stornelli et al., 2005).
Esta ao do processo de criopreservao sobre o espermatozide suno, em relao aos seus valores iniciais in natura, pode ser visto na tabela 1. A mdia das caractersticas do semm in natura foi significantemente maior (p<0,05) quando comparado ao smen criopreservado e descongelado (figura 1).
Tabela 1: Comparao entre as caractersticas de vigor, motilidade e morfologia espermtica, avaliadas no smen in natura, em relao s amostras descongeladas, ressuspensas e incubadas por 10 minutos 37 C.
Caracterstica
In natura 4,5 0,3A
Palheta 2,3 0,8B
Criotubo 1,4 0,9C
Mac 4 1,5 0,7C
Mac 5 1,3 0,8C
Vigor (0 5)
Motilidade (%)
89,9 6,4A
45,4 22,7B
26,6 21,4C
26,3 15,4C
26,9 18,3C
Morfologia (%)
89,9 10,4A
60,6 18,5B
53,6 17,9C
54,1 19,4C
52,9 18,2C
A, B, C: Letras diferentes entre colunas apresentam diferena estatisticamente significativa (p0,05).
Analisando-se os resultados do vigor espermtico do smen descongelado (2,3), nas diferentes embalagens testadas, percebeu-se que os maiores valores foram encontrados no smen descongelado proveniente das palhetas. Tais resultados foram significativamente melhores (p<0,05) quando comparados s outras trs embalagens (1,4; 1,5 e 1,3) para criotubo, macrotubo de 4 mL e macrotubo de 5 mL, respectivamente (figura 8). Os espermatozides
criopreservados nos criotubos e nos macrotubos (4 e 5 mL), no apresentaram diferenas significativas entre si quando analisado o vigor espermtico (p>0,05).
46 Os resultados iguais (p>0,05), para esta caracterstica analisada, entre os dois tipos de macrotubos, devem-se provavelmente ao fato deles apresentar em um mesmo dimetro, fato este que possibilitou uma mesma velocidade de resfriamento, congelao e descongelao entre as clulas do bordo da coluna de smen dentro do macrotubo, em relao s clulas de posio mais central.
O dimetro ainda maior do criotubo, no favoreceu a obteno de valores maiores para o vigor espermtico, mas tambm no prejudicou esta caracterstica avaliada em relao aos resultados obtidos nos macrotubos (p>0,05).
Aparentemente os diferentes volumes e altura dos frascos no interferiram nos resultados obtidos.
5,0
4,0
B
Vigor espermtico (0 a 5) 3,0
C
2,0
1,0
0,0 In natura Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5
Figura 8: Anlise do vigor espermtico do smen suno criopreservado em diferentes tipos de embalagens, sob a forma in natura e aps descongelao e incubao 37 C em banho-maria.
Quando comparados os resultados obtidos aps a descongelao em relao ao smen in natura, a queda dos valores do vigor espermtico foi significativamente diferente em todos os tratamentos. Esta queda em amostras de smen que sofrem processos de abaixamento de temperatura (resfriamento e congelao), um fato
47 comprovado por diversos trabalhos uma vez que o processo de criopreservao provoca danos funcionais e estruturais aos espermatozides refletindo numa reduo na qualidade espermtica aps todo processo. (Holt, 2000; Oehninger et al., 2000). Entretanto, quando submetidos aos protocolos de congelao, esta queda avaliada no smen aps descongelao e posterior reaquecimento, maior. Neste trabalho, esta queda foi mais acentuada no smen proveniente das embalagens com maior dimetro (Criotubo, Mac 4 e Mac 5) em relao de menor dimetro (palheta) (p<0,05).
Em relao caracterstica motilidade espermtica, os resultados mostraramse semelhantes queles observados com o vigor espermtico. De acordo com a figura 9 as amostras acondicionadas em palhetas apresentaram maiores percentuais de motilidade espermtica em relao s outras embalagens. Entre os criotubos e macrotubos de 4 e 5 mL no houve diferenas estatisticamente significativas.
A
100
80
B
Motilidade espermtica (%)
60
C C
40
20
0 In natura Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5
Figura 9: Anlise da motilidade espermtica do smen suno criopreservado em diferentes tipos de embalagens, sob a forma in natura e aps descongelao e incubao 37 C em banho-maria.
48 O teste de termorresistncia tem por finalidade avaliar in vitro, a diminuio do vigor espermtico durante um perodo de 2 horas de incubao do smen 37 oC. Segundo este teste, em todas as embalagens utilizadas houve uma reduo nos valores do vigor espermtico aps a incubao, esta reduo tambm foi observada em carneiros (Josh, et al., 2005). Os resultados deste teste podem ser vistos na figura 3, onde houve uma reduo de 56,5% nas palhetas, 71,4% no criotubo, 73,3% no macrotubo de 4 mL e 69,2% no macrotubo de 5 mL. Percebeu-se que o smen envasado e congelado nas palhetas, apresentou o melhor resultado para este tipo de teste, uma vez que o mesmo simula in vitro o que aconteceria com o smen aps ser depositado no genital da fmea. Desta forma, pode-se dizer que a palheta a embalagem que proporciona ao espermatozide suno aps descongelao uma melhor possibilidade de fertilizao, uma vez que o smen nela congelado preserva uma maior quantidade de clulas com boa motilidade.
100
80
71,4%
73,3%
69,2%
Taxa de degradao mdia (%)
60
56,5%
40
20
0 Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5
Figura 10: Avaliao da taxa de degradao mdia (TDM), aps o teste de termorresistncia nos diferentes tipos de embalagem para o smen suno.
Na anlise morfolgica foram avaliados os nmeros de acrossomas intactos e danificados aps a descongelao. A figura 11 representa a freqncia de
49 espermatozides que apresentam acrossoma intacto em cada uma das embalagens testadas. As palhetas apresentaram maior percentagem de espermatozides com acrossomas intactos em comparao com os demais tipos de embalagem (p<0,05).
120
100
A B
80 Acrossoma Intacto (%)
60
40
20
Figura 11: Anlise da morfologia espermtica do smen suno criopreservado em diferentes tipos de embalagens, sob a forma in natura e aps descongelao e incubao 37 C em banho-maria.
Mais uma vez, para a caracterstica morfologia espermtica, as diferenas entre o smen in natura e o criopreservado foram significativas (p<0,05). Entretanto, viu-se uma maior queda do nmero de clulas com acrossoma intacto, no smen proveniente das embalagens com maior dimetro (Criotubo; Mac 4 e Mac 5) (p<0,05).
O tipo de embalagem utilizada na criopreservao do smen suno, parece realmente interferir na qualidade espermtica avaliada aps descongelao, sendo a distncia do raio das mesmas, um detalhe a ser considerado como um dos fatores que pode estar relacionado a esta interferncia. Crdova et al,. (2000) e Izquierdo et al., (2005), propuseram que a forma e o volume do recipiente poderiam influenciar na qualidade do smen congelado. O choque trmico entre as clulas que se
50 encontram nas regies perifricas e centrais da embalagem, pode induzir ao aparecimento de danos no acrossoma dos espermatozides durante o processo de criopreservao. Levando-se em considerao as afirmativas dos autores supra citados, juntamente com os resultados de Eriksson & Rodrigues-Martinez (2000), verificou-se que os resultados deste trabalho apresentaram uma tendncia parcial quando comparados aos destes autores, no que diz respeito ao formato das embalagens testadas.
Com relao ao volume, inicialmente pensou-se na possibilidade de sua influncia sobre a qualidade do smen descongelado, entretanto, levando-se em considerao os resultados obtidos por Eriksson & Rodrigues-Martinez (2000), com o uso das bolsa de PVC (5 mL), percebeu se que esta caracterstica seria de menor relevncia para a compreenso dos fatores que realmente poderiam estar influenciando na qualidade espermtica ps descongelao. Este fato foi confirmado pelos resultados deste trabalho, uma vez que, comparando-se as maiores embalagens com volumes diferentes (criotubo = 2 mL; macrotubos = 4 e 5 mL), no houve diferena significativas (p>0,05) para as caractersitcas avaliadas (vigor, motilidade e morfologia espermtica).
A opo para se utilizar um determinado tipo de embalagem, deve ser vinculada facilidade de manejo, ao custo e aos resultados de
congelao/descongelao. Para serem adequadas, elas devem propiciar velocidades de congelao e descongelao uniformes (Hofmo & Almlid, 1991), sendo sugerido para isto uma maior relao superfcie:volume. Neste sentido, vrios trabalhos resultaram na obteno de uma melhor qualidade espermtica aps descongelao, quando foram usados macrotubos achatados (1,7 ml) ou palhetas de 0,5 ou 0,25 ml, em comparao aos macrotubos tradicionais (5 mL) (Fazano, 1986; Bwanga et al., 1991).
A velocidade de descongelao do centro da dose, mantida em macrotubos 3,7 vezes menor do que a observada na periferia, mas esta variao no ocorre nas doses congeladas em macrotubos achatados (Weitze et al., 1991), o que poderia explicar os melhores resultados com estes ltimos. Eriksson & Rodrguez-Mannez (2000) tambm atribuem os melhores resultados de motilidade das amostras congeladas em bolsas com capacidade para 5 mL, em comparao aos macrotubos, maior velocidade de descongelao. Neste trabalho
51 observou-se que as amostras congeladas em embalagens com dimetros menores colaboram com a teoria de que o dimetro tem influncia direta na qualidade das clulas descongeladas embora no tenha se observado a influncia do dimetro quando comparados os criotubos e os macrotubos de 4 e 5 mL. Este resultado tambm est de acordo com a literatura j que a partir de um determinado dimetro ainda no estabelecido, as amostras contidas em embalagens com tais caractersticas no proporcionam a distribuio homognea da temperatura no apresentando desta forma diferenas significativas.
Na tentativa de se fazer uma projeo dos resultados deste trabalho, correlacionando-os com a possibilidade de fertilizao dos espermatozides sunos criopreservados em diferentes tipos embalagens, faz-se necessrio considerar informaes obtidas na literatura que indicam da mesma forma, melhores resultados de motilidade e morfologia espermtica obtidos em embalagens de menor dimetro (Izquierdo et al., 2005; Eriksson & Rodriguez-Martnez, 2002; Wevar et al., 1997), o que no significa obrigatoriamente maiores porcentagens de fmeas gestantes inseminadas com smen proveniente de congelao em palhetas.
52 CONCLUSES
O dimetro da embalagem influencia na qualidade das clulas espermticas descongeladas; Embalagens que apresentam menor dimetro permitem uma reduo da diferena de temperatura entre as clulas da poro perifrica e central da amostra; A embalagem mais adequada para uma melhor conservao do smen suno aquela que possibilita uma congelao mais uniforme da amostra de smen contida no seu interior, no caso, a palheta de 0,5 mL. A influncia destes resultados in vitro sobre a possibilidade de fertilizao dos espermatozides criopreservados, deve ser confirmado em experimentos in vivo.
53 PERSPECTIVAS
Os resultados obtidos neste trabalho ressaltam a necessidade e a importncia de mais estudos utilizando embalagens diferentes que acomodem um maior volume de clulas e conseqentemente que uma nica embalagem tenha capacidade de armazenar uma dose inseminante alm de recuperar uma quantidade aceitvel de clulas viveis por dose.
A realizao de novas pesquisas sobre diferentes embalagens auxiliaria na implementao da melhoria nas tcnicas para o protocolo de criopreservao de clulas espermticas sunas.
54 ARTIGO ANEXO Submetido ao Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria e Zootecnia Avaliao de diferentes tipos de embalagens sobre a qualidade do smen suno criopreservado
(The diferents packings evaluation on the swine semen freezing quality)
Arajo, D.O.*, Albuquerque, A.C.C., Toniolli, R
Laboratrio de Reproduo Suna e Tecnologia de Smen Universidade Estadual do Cear. Fortaleza Cear. 2. Universidade Federal do cear UFC. * Danielle Oliveira de Arajo, e-mail: danioara@hotmail.com. Rua Maranho, 235 Nepolis. Natal Rio Grande do Norte.
ABSTRACT
Due to the high sensibility of the swine spermatozoid to the cryopreserved process, it becomes important the study concerning the provoked damages the cell, for the thermal aggression caused during the process. The influence of types of used packings was evaluated, for the storage of swine semen, about the quality of the spermatozoid cryopreserved. Hybrid animals of Reproduo Suna's Laboratory and Technology of the semen of University were used of Veterinary of the State University of Cear. The collection was accomplished by the technique of the handglove and soon afterwards they were analyzed the energy (0 to 5), the mobility (0 to 100%) and the morphology espermatozoa. The samples were frozen in straws (0,5 mL), cryotubes (2,0 mL) and maxi-straws (4 and 5 mL). The samples stored in straws, they presented better results with difference significative when compared those stored in the other three types of packings. After the thawed, the samples stored in straws those that presented suitable characteristics with the possibility were of they be used in the artificial insemination protocols with possible fertilization results. It is ended that the packings that allow a temperature change among the cells found in the board and in the center of the same in a more homogeneous way, they favor a better quality of the thawed semen.
RESUMO Devido alta sensibilidade do espermatozide suno ao processo de criopreservao, torna-se importante o estudo acerca dos danos provocados a clula,
55 pela agresso trmica ocasionada durante este processo. Neste trabalho foi avaliada a influncia de diferentes tipos de embalagens utilizadas, para o armazenamento de smen suno, sobre a qualidade do espermatozide criopreservado. Foram utilizados animais hbridos do Laboratrio de Reproduo Suna e Tecnologia do smen (LRSTS) da Faculdade de Veterinria da Universidade Estadual do Cear. A coleta foi feita pela tcnica da mo enluvada. Foram analisados o vigor (0 a 5), a motilidade (0 a 100%) e a morfologia espermtica. O smen foi congelado em palhetas de 0,5 mL, criotubos de 2,0 mL e macrotubos de 4 e 5 mL. As amostras de smen suno congelado em palhetas, apresentaram os melhores resultados com diferena estatisticamente significativas quando comparadas s amostras criopreservadas nos outros trs tipos de embalagens avaliadas. Os resultados ps descongelao indicaram que o smen envasado nas palhetas foi o que apresentou caractersticas condizentes com a possibilidade de serem utilizados nos protocolos de inseminao artificial com possibilidades de bons resultados de fertilidade. Conclui-se que embalagens que permitam uma maior velocidade de trocas de temperatura entre as clulas encontradas no bordo e no centro das mesmas, favorecem a uma melhor qualidade do smen descongelado. I. INTRODUO
Diferentes protocolos de congelao do smen suno vm sendo estudados h vrios anos, na tentativa de se aprimorar a tcnica de criopreservao (Crdova, et al., 2002). Durante este processo, diversos fatores devem ser levados em considerao tais como, a complexidade bioqumica do espermatozide, a interao de seus componentes e a influncia do resfriamento, congelao e descongelao (Parks & Graham, 1992). De acordo com esta problemtica deve-se dar ateno tambm embalagem do smen. Existem vrios tipos de materiais empregados para o armazenamento do smen, tais como: ampolas ou tubos de vidro. A congelao sob a forma de pellets tambm utilizada, entretanto, devido s limitaes de armazenamento e manipulao dos pellets, alm dos riscos de ordem sanitria para a amostra de smen, este mtodo no tem sido empregado. Vrios estudos tm sido efetuados a fim de se encontrar embalagens adequadas para a congelao do smen suno. As embalagens adequadas devem propiciar velocidades de congelao e descongelao uniformes (Hofmo & Almlid, 1991), sendo sugerida as que proporcionem uma maior relao superfcie/volume. Diante do
56 acima exposto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a influncia de diferentes tipos de embalagens sobre a qualidade do smen suno criopreservado.
II. MATERIAL E MTODOS
Foram utilizados 5 reprodutores (2 Dallands, 1 Landrace, 1 Duroc e 1 Sighers) do Laboratrio de Reproduo Suna e Tecnologia do Smen (LRSTS) da Faculdade de Veterinria da Universidade Estadual do Cear, submetidos a uma rotina semanal de coleta de smen. As coletas foram realizadas pela tcnica da mo enluvada em manequim, aps lavagem do prepcio com gua corrente e secagem com papel toalha descartvel. O smen foi coletado em frasco plstico com capacidade para 500 mL, previamente aquecido a 37 C protegido por copo isotrmico. A frao gelatinosa do ejaculado foi separada por gaze especial, sendo posteriormente desprezada.
1.0. Anlise do smen in natura
A qualidade do ejaculado in natura foi estabelecida atravs do volume (mL), da concentrao (x109 sptz/mL), do total de clulas (x109 sptz), do vigor espermtico (escores de 0 a 5; Toniolli, 1996), da motilidade espermtica (0 a 100%) e morfologia espermtica. Para a anlise do vigor e da motilidade, uma amostra do smen foi colocada entre lmina e lamnula e processada a leitura em microscopia ptica com um aumento de 200 vezes. Pelo menos trs campos do microscpio foram analisados para obteno de uma mdia da avaliao. Foram criopreservados somente os ejaculados que apresentaram no mnimo, as seguintes caractersticas: vigor = 3,5 e motilidade = 80%. De cada ejaculado foi retirado um total de 102 x106 sptz para cada tratamento de congelao do smen. 2.0. Congelao e envase do smen
Para a congelao do smen, utilizou-se a tcnica de Paquignon et al. (1974). Sendo selecionadas para o armazenamento do smen, as seguintes embalagens:
57 a) Palhetas com volume de 0,5 mL; b) Criotubos com volume de 2,0 mL; c) Macrotubos de 240 mm com volume de 4 mL (Mac 4); d) Macrotubos de 280 mm com volume de 5,0 mL (Mac 5) A concentrao espermtica foi padronizada em 0,51 x109 sptz/mL em todos os diferentes tipos de embalagens. Tanto as palhetas como os macrotubos foram vedados com esferas de vidro e os criotubos com uma tampa rosqueada apropriada. Aps o envase do smen em cada uma das quatro embalagens, elas foram submetidas aos vapores de nitrognio -120 C (Sukato et al., 2001) durante 10 minutos em rampa de congelao, a uma distncia de 5 cm da superfcie do lquido. Decorrido o tempo estabelecido, as amostras congeladas e devidamente identificadas foram depositadas em canisteres numerados e mergulhadas diretamente no nitrognio lquido dentro do botijo (-196 C), onde permaneceram por um perodo mnimo de 15 dias, para posterior descongelao e anlises. 3.0. Descongelao e ressuspenso do smen
Para descongelao das amostras, foi utilizado um descongelador automtico (Geysir, Minitub GmbH) sendo estabelecidos tempos e temperaturas diferentes para cada tipo de embalagem, conforme esquema a seguir: a) Palhetas: 37 oC por 30 segundos; b) Macrotubos e Criotubos: 50 oC por 60 segundos. Aps a descongelao foi retirada uma alquota de 0,5 mL da amostra de cada embalagem e colocadas em tubos de ensaio previamente aquecidos 37 C adicionando-se 4,5 mL do diluidor de ressuspenso (Diluidor de Beltsville BTS) tambm aquecido a 37 C. Imediatamente aps a descongelao, e antes da ressuspenso, o smen colocado no tubo de ensaio, foi medida a temperatura da amostra, colocando-se um termmetro ao volume do smen descongelado. 4.0. Anlises in vitro
4.1. Vigor e Motilidade Para as anlises do vigor e da motilidade espermtica, foram utilizadas alquotas de 15 L do smen diludo, colocadas entre lmina e lamnula para observao em
58 microscopia ptica a um aumento de 200x. As anlises foram realizadas aps 10 minutos de incubao em banho-maria 37 C. 4.2. Taxa de degradao mdia da motilidade (TDM) Dentre eles, um dos que mais se aproxima das condies naturais do smen aps a inseminao o que trata do teste de termorresistncia. Este teste consiste na incubao do smen, aps coleta em banho-maria 37 C, durante 2 horas. Aos resultados aplica-se uma frmula matemtica, no intuito de calcular a taxa de degradao mdia da motilidade (TDM). A TDM consiste em se calcular o vigor espermtico aos 10 minutos de incubao subtrado do valor da mesma caracterstica aps 2 horas de incubao, dividido pelo mesmo valor aos 10 minutos. O resultado desta operao multiplicado por 100 fornecendo ento o resultado final (TDM) expresso em porcentagem (%). A TDM expressa pela seguinte frmula matemtica:
TDM = vigor 10 m - vigor 2 h x 100 vigor 10 m 4.3. Morfologia Para anlise morfolgica dos espermatozides, foi separada uma alquota de 0,5 mL de smen e a esta foi adicionada 0,5 mL de soluo formol-salina (0,99 mL de soro fisiolgico e 0,01 mL de formol) e em seguida colocadas em tubos eppendorffes. Em se tratando da palheta de 0,5 mL, foi descongelada uma segunda amostra para a avaliao desta caracterstica. No caso das outras embalagens, o volume era suficiente para todas as caractersticas serem avaliadas. De cada ejaculado, para cada um dos tratamentos (diferentes embalagens), foi separada uma alquota de 0,5 mL para ser realizada a anlise morfolgica. A morfologia foi analisada segundo qualidade do acrossoma, sendo classificado em duas classes diferentes: espermatozide com acrossoma intacto e espermatozides com acrossoma danificado. As anlises foram feitas no smen in natura e aps a descongelao, em cada uma das diferentes embalagens, contando-se 200 clulas por amostra. Os exames foram realizados por meio da microscopia ptica com lente de imerso, a um aumento de 1000x.
59 5.0. Anlise Estatstica
O delineamento experimental utilizado foi o de blocos ao acaso. A anlise estatstica foi processada atravs da avaliao das mdias e desvios padres, aos quais foi aplicado o teste de Mann-Witney, e o teste do Qui-quadrado para valores expressos em porcentagem. Todos os testes foram aplicados um nvel de significncia de 5% (p<0,05). A anlise das diferenas entre mdias foi realizada atravs do teste ANOVA.
III. RESULTADOS E DISCUSSES
Neste trabalho, os resultados de medida da temperatura do smen, logo aps a descongelao, foi de 36 C nas palhetas e de 34 C nas demais embalagens testadas. Provavelmente, esta diferena est relacionada com os diferentes dimetros das embalagens, uma vez que a temperatura utilizada para
descongelao, se distribui de maneira mais uniforme da periferia para o centro da amostra nas embalagens com dimetros menores, quando comparadas quelas com dimetros maiores (Ericksson & Rodrigues-Martinez, 2002). Por outro lado, devem ser avaliadas novas combinaes de tempo e temperatura, para a descongelao do smen envasado em embalagens de maior dimetro (macrotubos e criotubos), de forma a se obter uma temperatura da amostra descongelada mais prxima possvel de 37 oC, uma vez que todo o material que entra em contato com o smen descongelado bem como o diluidor de ressuspenso, encontravam-se esta temperatura. Desta forma, problemas de choque trmico podero ser evitados. Apesar do smen suno ser altamente sensvel, existe citao de anlise espermtica do smen in natura, em lminas e lamnulas aquecidas a 38-39 oC (CBRA, 1998), o que daria uma diferena de at 4 oC uma vez que os ejaculados sunos em nosso clima apresentam temperaturas que variam entre 35 e 37 oC. Baseado nesta indicao da literatura, a diferena de temperatura entre o smen descongelado proveniente dos criotubos e macrotubos, e o diluidor de
ressuspenso, no teria tido influncia sobre os resultados de motilidade, o que indicaria a possibilidade de que a distribuio da temperatura durante a descongelao dentro da coluna de smen da periferia para o centro da embalagem
60 (Ericksson & Rodrigues-Martinez, 2002), teria uma maior influncia na qualidade do smen ps-descongelao, tornando-se assim um fator mais importante a ser considerada para a escolha de embalagens visando a congelao do smen do varro.
Todo o material e diluidor que teve contato com as amostras descongeladas, encontravam-se temperatura de 37 oC; j o smen proveniente das palhetas apresentou uma diferena de apenas 1 oC para o diluidor de ressuspenso, enquanto que nas outras embalagens, esta diferena chegou 3 C, o que pode ter favorecido um choque trmico, que possivelmente justificaria os melhores resultados encontrados no smen armazenado nas palhetas. Por outro lado, resultados obtidos por Bamba & Cran (1985), mostraram que grandes diferenas de temperatura entre o smen suno e o diluidor podem no apresentar influncia imediata sobre a motilidade espermtica, entretanto, quando da incubao do mesmo por at 5 horas, os valores caem significativamente em comparao s amostras onde no ocorreu diferena de temperatura entre o smen e o diluidor, este um fator que deve ser melhor explorado e analisado a fim de se determinar exatamente a sua influncia sobre os resultados de qualidade espermtica aps a descongelao.
Os resultados deste trabalho esto de acordo com alguns achados da literatura, onde Eriksson & Rodrigues-Martinez (2000) medindo a temperatura do smen descongelado 40 oC por 20 segundos, envasado em macrotubos (4 mL) e sacolas de PVC (5 mL), obtiveram melhores resultados de motilidade espermtica nas amostras provenientes das sacolas de PVC. Apesar deste tipo de embalagem apresentar um volume alto (5 mL), quando comparado ao das palhetas de 0,5 mL utilizadas neste trabalho, resta salientar que a forma das sacolas de PVC era achatada, o que proporcionou uma distncia entre as paredes da mesma mais prxima do dimetro das palhetas do que dos criotubos ou macrotubos, explicando desta forma os melhores resultados conseguidos.
A diminuio da qualidade espermtica suna, aps os processos de congelao e descongelao, ainda um problema constante encontrado nos diferentes protocolos utilizados com esta finalidade (Stornelli et al., 2005). Segundo
61 Watson (2000), os efeitos da criopreservao podem induzir danos irreversveis e letais aos espermatozides, sendo de grande importncia o estudo dos numerosos danos provocados, associados aos defeitos na membrana e nas organelas, que acabam por afetar a integridade funcional das clulas (Bwanga et al., 1991; Watson, 2000), reduzindo a capacidade fertilizante dos espermatozides (Pea, et al., 2006). A queda dos valores do vigor, motilidade e morfologia espermtica, so vistos tanto no smen refrigerado, quanto no congelado. Entretanto, nesta ltima forma de conservao da clula espermtica, a influncia da tcnica utilizada sobre os valores destas caractersticas tem sido bem mais contundente (Stornelli et al., 2005).
Esta ao do processo de criopreservao sobre o espermatozide suno, em relao aos seus valores iniciais in natura, pode ser visto na tabela 1. A mdia das caractersticas do semm in natura foi significantemente maior (p<0,05) quando comparado ao smen criopreservado e descongelado (figura 1).
Tabela 1: Comparao entre as caractersticas de vigor, motilidade e morfologia espermtica, avaliadas no smen in natura, em relao s amostras descongeladas, ressuspensas e incubadas por 10 minutos 37 C.
Caracterstica Vigor (0 5)
In natura 4,5 0,3
Palheta 2,3 0,8
Criotubo 1,4 0,9
Mac 4 1,5 0,7
Mac 5 1,3 0,8
Motilidade (%)
89,9 6,4
45,4 22,7 26,6 21,4 26,3 15,4
26,9 18,3
Morfologia (%)
89,9 10,4 60,6 18,5 53,6 17,9 54,1 19,4
52,9 18,2
62 Analisando-se os resultados do vigor espermtico do smen descongelado (2,3), nas diferentes embalagens testadas, percebeu-se que os maiores valores foram encontrados no smen descongelado proveniente das palhetas. Tais resultados foram significativamente melhores (p<0,05) quando comparados s outras trs embalagens (1,4; 1,5 e 1,3) para criotubo, macrotubo de 4 mL e macrotubo de 5 mL, respectivamente (figura 1). Os espermatozides
criopreservados nos criotubos e nos macrotubos (4 e 5 mL), no apresentaram diferenas significativas entre si quando analisado o vigor espermtico (p>0,05). Os resultados iguais (p>0,05), para esta caracterstica analisada, entre os dois tipos de macrotubos, devem-se provavelmente ao fato deles apresentar em um mesmo dimetro, fato este que possibilitou uma mesma velocidade de resfriamento, congelao e descongelao entre as clulas do bordo da coluna de smen dentro do macrotubo, em relao s clulas de posio mais central.
O dimetro ainda maior do criotubo, no favoreceu a obteno de valores maiores para o vigor espermtico, mas tambm no prejudicou esta caracterstica avaliada em relao aos resultados obtidos nos macrotubos (p>0,05).
Aparentemente os diferentes volumes e altura dos frascos no interferiram nos resultados obtidos.
5,0
4,0
Vigor espermtico (0 a 5)
B
3,0
C
2,0
1,0
0,0 In natura Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5
Figura 1: Anlise do vigor espermtico do smen suno criopreservado em diferentes tipos de embalagens, sob a forma in natura e aps descongelao e incubao 37 C em banho-maria.
63 Quando comparados os resultados obtidos aps a descongelao em relao ao smen in natura, a queda dos valores do vigor espermtico foi significativamente diferente em todos os tratamentos. Esta queda em amostras de smen que sofrem processos de abaixamento de temperatura (resfriamento e congelao), um fato comprovado por diversos trabalhos uma vez que o processo de criopreservao provoca danos funcionais e estruturais aos espermatozides refletindo numa reduo na qualidade espermtica aps todo processo. (Holt, 2000; Oehninger et al., 2000). Entretanto, quando submetidos aos protocolos de congelao, esta queda avaliada no smen aps descongelao e posterior reaquecimento, maior. Neste trabalho, esta queda foi mais acentuada no smen proveniente das embalagens com maior dimetro (Criotubo, Mac 4 e Mac 5) em relao de menor dimetro (palheta) (p<0,05).
Em relao caracterstica motilidade espermtica, os resultados mostraramse semelhantes queles observados com o vigor espermtico. De acordo com a figura 2 as amostras acondicionadas em palhetas apresentaram maiores percentuais de motilidade espermtica em relao s outras embalagens. Entre os criotubos e macrotubos de 4 e 5 mL no houve diferenas estatisticamente significativas.
100
80
B
Motilidade espermtica (%) 60
C C
40
20
Figura 2: Anlise da motilidade espermtica do smen suno criopreservado em diferentes tipos de embalagens, sob a forma in natura e aps descongelao e incubao 37 C em banho-maria.
64 O teste de termorresistncia tem por finalidade avaliar in vitro, a diminuio do vigor espermtico durante um perodo de 2 horas de incubao do smen 37 oC. Segundo este teste, em todas as embalagens utilizadas houve uma reduo nos valores do vigor espermtico aps a incubao, esta reduo tambm foi observada em carneiros (Josh, et al., 2005). Os resultados deste teste podem ser vistos na figura 3, onde houve uma reduo de 56,5% nas palhetas, 71,4% no criotubo, 73,3% no macrotubo de 4 mL e 69,2% no macrotubo de 5 mL. Percebeu-se que o smen envasado e congelado nas palhetas, apresentou o melhor resultado para este tipo de teste, uma vez que o mesmo simula in vitro o que aconteceria com o smen aps ser depositado no genital da fmea. Desta forma, pode-se dizer que a palheta a embalagem que proporciona ao espermatozide suno aps descongelao uma melhor possibilidade de fertilizao, uma vez que o smen nela congelado preserva uma maior quantidade de clulas com boa motilidade.
100
80
71,4%
Taxa de degradao mdia (%) 60
73,3%
69,2%
56,5%
40
20
0 Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5
Figura 3: Avaliao da taxa de degradao mdia (TDM), aps o teste de termorresistncia nos diferentes tipos de embalagem para o smen suno.
Na anlise morfolgica foram avaliados os nmeros de acrossomas intactos e danificados aps a descongelao. A figura 4 representa a freqncia de espermatozides que apresentam acrossoma intacto em cada uma das embalagens
65 testadas. As palhetas apresentaram maior percentagem de espermatozides com acrossomas intactos em comparao com os demais tipos de embalagem (p<0,05).
120
100
A B
80 Acrossoma Intacto (%)
C C C
60
40
20
Figura 4: Anlise da morfologia espermtica do smen suno criopreservado em diferentes tipos de embalagens, sob a forma in natura e aps descongelao e incubao 37 C em banho-maria.
Mais uma vez, para a caracterstica morfologia espermtica, as diferenas entre o smen in natura e o criopreservado foram significativas (p<0,05). Entretanto, viu-se uma maior queda do nmero de clulas com acrossoma intacto, no smen proveniente das embalagens com maior dimetro (Criotubo; Mac 4 e Mac 5) (p<0,05).
O tipo de embalagem utilizada na criopreservao do smen suno, parece realmente interferir na qualidade espermtica avaliada aps descongelao, sendo a distncia do raio das mesmas, um detalhe a ser considerado como um dos fatores que pode estar relacionado a esta interferncia. Crdova et al,. (2000) e Izquierdo et al., (2005), propuseram que a forma e o volume do recipiente poderiam influenciar na qualidade do smen congelado. O choque trmico entre as clulas que se encontram nas regies perifricas e centrais da embalagem, pode induzir ao
66 aparecimento de danos no acrossoma dos espermatozides durante o processo de criopreservao. Levando-se em considerao as afirmativas dos autores supra citados, juntamente com os resultados de Eriksson & Rodrigues-Martinez (2000), verificou-se que os resultados deste trabalho apresentaram uma tendncia parcial quando comparados aos destes autores, no que diz respeito ao formato das embalagens testadas.
Com relao ao volume, inicialmente pensou-se na possibilidade de sua influncia sobre a qualidade do smen descongelado, entretanto, levando-se em considerao os resultados obtidos por Eriksson & Rodrigues-Martinez (2000), com o uso das bolsa de PVC (5 mL), percebeu se que esta caracterstica seria de menor relevncia para a compreenso dos fatores que realmente poderiam estar influenciando na qualidade espermtica ps descongelao. Este fato foi confirmado pelos resultados deste trabalho, uma vez que, comparando-se as maiores embalagens com volumes diferentes (criotubo = 2 mL; macrotubos = 4 e 5 mL), no houve diferena significativas (p>0,05) para as caractersitcas avaliadas (vigor, motilidade e morfologia espermtica).
A opo para se utilizar um determinado tipo de embalagem, deve ser vinculada facilidade de manejo, ao custo e aos resultados de
congelao/descongelao. Para serem adequadas, elas devem propiciar velocidades de congelao e descongelao uniformes (Hofmo & Almlid, 1991), sendo sugerido para isto uma maior relao superfcie:volume. Neste sentido, vrios trabalhos resultaram na obteno de uma melhor qualidade espermtica aps descongelao, quando foram usados macrotubos achatados (1,7 ml) ou palhetas de 0,5 ou 0,25 ml, em comparao aos macrotubos tradicionais (5 mL) (Fazano, 1986; Bwanga et al., 1991).
A velocidade de descongelao do centro da dose, mantida em macrotubos 3,7 vezes menor do que a observada na periferia, mas esta variao no ocorre nas doses congeladas em macrotubos achatados (Weitze et al., 1991), o que poderia explicar os melhores resultados com estes ltimos. Eriksson & Rodrguez-Mannez (2000) tambm atribuem os melhores resultados de motilidade das amostras congeladas em bolsas com capacidade para 5 mL, em comparao aos macrotubos, maior velocidade de descongelao. Neste trabalho
67 observou-se que as amostras congeladas em embalagens com dimetros menores colaboram com a teoria de que o dimetro tem influncia direta na qualidade das clulas descongeladas.
Na tentativa de se fazer uma projeo dos resultados deste trabalho, correlacionando-os com a possibilidade de fertilizao dos espermatozides sunos criopreservados em diferentes tipos embalagens, faz-se necessrio considerar informaes obtidas na literatura que indicam da mesma forma, melhores resultados de motilidade e morfologia espermtica obtidos em embalagens de menor dimetro (Izquierdo et al., 2005; Eriksson & Rodriguez-Martnez, 2002; Wevar et al., 1997), o que no significa obrigatoriamente maiores porcentagens de fmeas gestantes inseminadas com smen proveniente de congelao em palhetas.
IV. CONCLUSES
Os resultados deste trabalho levam a aceitar a teoria de que o raio da embalagem pode influenciar na qualidade das clulas espermticas descongeladas, proporcionando uma criopreservao da amostra de maneira mais uniforme; fato este que pode ser explicado pelo uso de embalagens de menor dimetro, o que permite uma reduo da diferena de temperatura entre as clulas da poro perifrica e central da amostra. Desta forma, a embalagem mais adequada para uma melhor conservao do smen suno aquela que possibilita uma congelao mais uniforme da amostra de smen contida no seu interior, no caso, a palheta de 0,5 mL. V - REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
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aspekte
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81 11. ANEXOS
11.1 - Anexo I: Escores para a nota de vigor CLASSIFICAO DO VIGOR ESPERMTICO SEGUNDO AS CARACTERSTICAS INDIVIDUAS (ANLISE QUALITATIVA) DOS ESPERMATOZIDES DO VARRO
A anlise do vigor espermtico individual, observando-se em torno de 50 clulas, aleatriamente, para a avaliao das caractersticas. Aps esta anlise individual, uma observao coletiva deve ser feita em todas as clulas do campo do microscpio, a fim de se determinar a proporo das diferentes caractersticas de vigor espermtico, chegando-se ento nota quebrada. Para uma anlise confivel, ao menos trs campos de microscpios devem ser avaliados. Esta classificao corresponde a um grupo de caractersticas para cada nota inteira dentro do intervalo de avaliao. Os valores quebrados so dados pelas caractersticas intermedirias as de notas inteiras consecutivas que a enquadrem, levando-se em considerao a proporo de espermatozides dentro de cada valor inteiro na anlise coletiva de todas as clulas. Nas tabelas seguir, sero colocados os parmetros atravs dos quais so dadas notas de 0 a 5, e onde se v as caractersticas individuais serem consideradas juntamente com a incidncia de cada uma delas demonstrada pelo nmero de cruzes (TONIOLLI, 1996):
82
--------------------------------------------------------------------------------------------------------------NOTA CARACTERISTICAS --------------------------------------------------------------------------------------------------------------0,0 0,5 1,0 Todos os espermatozides esto imveis. Movimentos espordicos, fracos e sem deslocamento. Movimentos circulares contnuos e fracos. Deslocamento muito lento ou sem ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------deslocamento; tremores do sptz e fracas oscilaes do flagelo de eficcia nula. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------1,5 Movimentos circulares fracos c/ deslocamento ( 50%), espermatozides no saem do
campo do microscpio. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------2,0 Movimentos circulares fracos e desorganizados c/ deslocamento sem sair do CM. Tremores c/ alguns sptz se deslocando mais rpido. Oscilaes fracas do flagelo. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------2,5 Movimentos circulares/retilneos, mdios c/ deslocamento, espermatozides saem do campo do microscpio. Oscilaes do flagelo de intensidade mdia. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------3,0 Movimentos retilneos, alguns curvilneos sem tremores e c/ raio bem maior com oscilaes intensas do flagelo; espermatozides saem do C.M. (50 60%). --------------------------------------------------------------------------------------------------------------3,5 Movimentos retilneos fortes e intensos com deslocamento, espermatozides saem do CM (60 70%), com oscilaes fortes do flagelo. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------4,0 Movimentos retilneos, fortes e intensos com deslocamento, espermatozides saem do CM (70 80%); com oscilaes fortes do flagelo. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------4,5 Movimentos retilneos e flechantes, fortes, espermatozides saem do campo do microscpio (80 90%); com oscilaes muito fortes do flagelo. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------5,0 Movimentos retilneos e flechantes muito fortes, sptz saem do CM ( 90%); com oscilaes muito fortes do flagelo. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------Obs: CM = Campo do microscpio
83
(A) Motilid. Deslocam. (B) Vigor No progressivo Rotativo 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 + + ++ ++ +++ +++ ++++ +++++ + + + ++ ++ +++ +++ ++++ ++++ * * * * * * * * * * * * * * Circular Circular MOVIMENTOS (C) Progressivo Retilneo Flechante
A) Deslocamento
Presente (+), ausente (-), presena de um nmero fraco de espermatozides com leve movimento (). A classificao varia de 1 a 5 cruzes, segundo a velocidade de deslocamento.
B) Vigor C) Movimentos
= =
a frequncia de batimentos do flagelo, classificado de 0 (-) a 4 cruzes (+). A presena de um (*), indica o tipo de movimento efetuado pelo espermatozide.
TIPOS DE MOVIMENTOS Rotativos Circulares = = Movimentos de rotao em torno de si mesmo sem deslocamento. Movimentos inscritos dentro de um crculo de raio pequeno (sem deslocamento) ou de raio grande (com deslocamento). Retilneos Flechantes = = Deslocamento em linha reta. Deslocamento em linha reta em grande velocidade.
Fonte: Toniolli, R. (Tese de Doutorado, 91p., 1996).
84
11.2. Anexo II Pr-congelao Planilha de coleta e anlise Animal_____________________
Data
Canister T C
Conc. inicial
Volume
Conc total
Conc
Vigor
Vig 30 C
Vig 17 C
Mot 30 C
Mot 17 C
Morf in natura
centrfuga. In natura
1 1 .3- A n e x oIII P s -c o n g e la o P la n ilh ad ec o le taea n lis e A n im a l_ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ D a ta E m b a la g e m TC V ig1 0m in V ig2h M o t1 0m in M o t2 h M o rf D e s co n g . O b s e rva e s

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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEAR PR-REITORIA DE PS-GRADUAO E PESQUISA FACULDADE DE VETERINRIA PROGRAMA DE PS-GRADUAO EM CINCIAS VETERINRIAS DANIELLE OLIVEIRA DE ARAJO

INFLUNCIA DE TIPOS DE EMBALAGENS SOBRE A QUALIDADE DO SMEN SUNO CRIOPRESERVADO

Sanidade Animal. Orientador: Prof. Dr. Ricardo Toniolli

Fortaleza, Cear 2006

Arajo, Danielle Oliveira

4 DANIELLE OLIVEIRA DE ARAJO

INFLUNCIA DE TIPOS DE EMBALAGENS SOBRE A QUALIDADE DO SMEN SUNO CRIOPRESERVADO

Conceito: Satisfatria Nota: 9,0 (Nove)

Aprovada em 26/ 07 /2006

______________________________ Prof. Dr. Ricardo Toniolli Orientador

_____________________________ Prof. Dr. Eugnio Pacelli

_______________________________ Prof. Dr. Airton Alencar Arajo

______________________________ Profa. Dra. Lcia Daniel

A Deus pela companhia e por me fazer acreditar que eu posso!

Ao Prof. Dr. Ricardo Toniolli por me aceitar em sua equipe de trabalho.

Magda pelo incentivo no perodo mais crtico.

Ao amigo Erivelton Rodrigues que me ajudou num momento de sufoco.

1.2. Integridade de membrana

21 1.4. Meios Crioprotetores

permeabilidade de membrana e perda de molculas e ons intracelulares. Muitas

descongelao da gua extracelular e sada do crioprotetor.

1.5. Diluidores de ressuspenso

25 2.0. Tipos de embalagens

3.0. Avanos na tcnica de criopreservao

28 4.0. Criopreservao do espermatozide suno

5.0. COLETA E ANLISE DO SMEN IN NATURA

5.1. Animais e coleta do smen:

Figura 2 - Retirada da gaze que retm a poro gel do ejaculado.

5.2. Anlise do smen in natura:

5.2.1. Vigor e Motilidade

TDM = vigor 10 m - vigor 2 h x 100 vigor 10 m 5.2.3. Morfologia

6.0. TCNICA DE CONGELAO

6.1. Tcnica de Congelao do smen (Paquignon et al., 1974):

1 Diluio Diluidor Gema de ovo 2 Diluio Dil. Gema de ovo + Glicerol 4%

Envaze do smen em "pailletes"

39 6.3. Congelao das amostras:

Figura 5 Freezer utilizado para o envase das amostras. Temperatura interna de 4 C.

Figura 6 - Rampa de congelao.

Figura 7 Armazenamento das amostras j congeladas em botijes de nitrognio lquido.

7.0. DESCONGELAO E RESSUSPENSO

7.1. Descongelao e ressuspenso do smen:

41 8.0. ANLISE DAS AMOSTRAS

8.1. Vigor e motilidade espermtica:

42 8.3. Momentos das anlises:

a) Smen in natura; b) Imediatamente aps a descongelao.

9.0. Anlise Estatstica

In natura 4,5 0,3A

Palheta 2,3 0,8B

Criotubo 1,4 0,9C

Mac 4 1,5 0,7C

Mac 5 1,3 0,8C

A, B, C: Letras diferentes entre colunas apresentam diferena estatisticamente significativa (p0,05).

0,0 In natura Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5

0 In natura Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5

Taxa de degradao mdia (%)

0 Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5

80 Acrossoma Intacto (%)

0 In natura Palheta Criotubo Tipos de embalagens Mac 4 Mac 5

Arajo, D.O.*, Albuquerque, A.C.C., Toniolli, R

II. MATERIAL E MTODOS

1.0. Anlise do smen in natura

59 5.0. Anlise Estatstica

III. RESULTADOS E DISCUSSES

In natura 4,5 0,3