CENTRO DE CIENCIAS BASICAS DEPARTAMENTO DE QUIMICA ACADEMIA DE BIOQUIMICA

MANUAL DE PRACTICAS DE LABORATORIO DE BIOQUIMICA

LIC. EN MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA 1er. SEMESTRE

ENERO JUNIO 2007

PROFESOR: M en C Gonzalo Muoz Andrade M en C Marco Antonio Zamarripa T. TECNICO: LAQB Ma. Guadalupe Lpez LAQB. Hctor Rangel

REGLAMENTO DE LOS LABORATORIOS DEL DEPARTAMENTO DE QUIMICA

Antes de asistir a la prctica debers leer el texto completo y traer por escrito o en un diagrama el planteamiento del experimento a realizar. Es obligatorio el asistir con bata y lentes de seguridad. Prohibido comer, fumar, beber y masticar chicle. Usar guantes de ltex desechables y cubre boca cuando se trabaje con muestras biolgicas y/o material patolgico. Se debe de informar inmediatamente al profesor o al tcnico cualquier accidente que ocurra durante la prctica. Los remanentes de reactivos utilizados no deben regresarse a los envases originales, y deben manejarse con pipetas y esptulas limpias. La mayora de los disolventes orgnicos son voltiles e inflamables, al trabajar con ellos deber hacerse en lugares ventilados y nunca cerca de la flama. Los recipientes que los contienen deben mantenerse cerrados, en lugares frescos y secos. Nunca debern efectuarse experimentos no descritos en la prctica. Salvo indicaciones precisas, nunca tape un tubo de ensaye con el dedo. Si es necesario inhalar algn gas se provocar una corriente de aire con la mano entre la boca del recipiente y la nariz. No deber verterse nunca agua a los cidos, sino al contrario, teniendo precaucin, asimismo deber tenerse mucho cuidado cuando se vierta amoniaco a un lquido caliente, a un cido concentrado a una base fuerte y viceversa. Al terminar cualquier experimento el profesor o el tcnico indicarn donde se deben de colocar los residuos. Siempre consulte al instructor para aclarar cualquier duda. Al retirarse del laboratorio dejar su lugar de trabajo limpio.

OBJETIVO GENERAL El alumno adquirir los conocimientos, habilidades y actitudes necesarias para un desempeo adecuado en el laboratorio.

METODOLOGIA Al inicio del semestre el alumno recibe el manual de laboratorio. Los alumnos trabajan en equipo; todos debern participar en la realizacin de la prctica. Al finalizar la prctica, se analizarn y discutirn los resultados obtenidos. Una semana despus de concluida la prctica, el alumno entregar un reporte que deber contener: Presentacin 5% Objetivos 5% Introduccin 5% Planteamiento 10% Resultados 10% Discusin de Resultados 25% Cuestionario 10% Conclusiones 25% Bibliografa 5% Para la elaboracin del reporte, el alumno deber consultar al menos dos fuentes de informacin bibliogrfica, y cuando menos una de ellas deber ser un libro.

CRITERIOS DE EVALUACION Los requisitos que debe reunir el alumno para poder aprobar el laboratorio siguientes: Asistencia al 80% de las sesiones Valoracin previa a cada prctica Entrega puntual de reportes Evaluacin final Derecho a calificacin Derecho a entrar a la prctica 75% de la calificacin final 15% de la calificacin final 10% de la calificacin final son los

Participacin y trabajo en el laboratorio -

INDICE

No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13

NOMBRE DE LA PRACTICA Uso del material de laboratorio Preparacin de soluciones Fragilidad osmtica de eritrocitos Medicin de la actividad del in hidrgeno en soluciones acuosas Titulacin cido base y determinacin de acidez en la leche Preparacin de un Buffer y su accin amortiguadora Propiedades qumicas de carbohidratos Preparacin de una curva patrn de glucosa Separacin de aminocidos por cromatografa en papel Examen qumico de orina Determinacin de protenas por el mtodo de Biuret Determinacin cuantitativa de la actividad de amilasa en lquidos biolgicos Anlisis de lpidos

PAG. 4 6 12 14 21 24 27 29 31 33 39 41 43

PRACTICA No. 1 USO DEL MATERIAL DE LABORATORIO OBJETIVO: 1.- Conocer el material ms utilizado en el laboratorio de Bioqumica 2.- Desarrollar las habilidades necesarias para pesar, pipetear y titular con precisin.

INTRODUCCION: Existe gran variedad en lo que a material de laboratorio se refiere debido a la diversidad de necesidades en la practica y experimentos de laboratorio. El material de vidrio esta elaborado con vidrio de borosilicato que resiste las altas y bajas temperaturas (no cambios bruscos de temperatura), es fcil de desinfectar, inerte y principalmente muy frgil. Adems se requiere de material de porcelana, aluminio, plstico, etctera, que sirve para cubrir una amplia gama de usos. El laboratorio es donde se desarrollan las ciencias experimentales, est provisto de instalaciones especiales, materiales, aparatos, recipientes y elementos indispensables, donde se puede llevar a la practica lo visto en teora. El llevar a cabo experimentos en laboratorio permite la comprensin y entendimiento de los fenmenos y los hechos que se dan en la naturaleza. Entre las sustancias delicadas se encuentran los cidos y las bases, que deben de ser manipulados con mucho cuidado, el alumno debe de seguir las indicaciones que el maestro seale, as como tener un comportamiento cuidadoso y de disciplina mientras permanezca en el laboratorio. Si no se tienen los suficientes cuidados se pueden tener accidentes en el laboratorio que pueden manifestarse como lesiones el alumno o dao al material. Para evitar peligros en el laboratorio es necesario evitar: a) b) c) d) e) Incendio o explosin al utilizar solventes inflamables. El uso de reactivos venenosos, corrosivos o custicos. Quemadura y escaldaduras, incluyendo las provocadas por choque elctrico. Laceraciones provocadas por vidriera rota, cuchillas, navajas, etc. Peligros por agentes reactivos, mutagnicos y /o cancergenos.

Es importante que cada estudiante ejecute todos los experimentos por si mismo, es decir que tenga una participacin en la practica. La limpieza es esencial en todo trabajo bioqumico, por lo tanto todas las precauciones que se tomen en un anlisis cualitativo y cuantitativo deber ser tomado en este curso. Frecuentemente, restos de algn compuesto qumico en el material de laboratorio dan resultados errneos en el experimento que se esta realizando, por lo tanto, todo el material de vidrio deber lavarse despus de ser utilizado. Todo material biolgico deber ser desechado de acuerdo a las especificaciones especiales que les sean dadas por el maestro o instructor de laboratorio tan pronto se haya terminado de usar. Adems las mesas debern limpiarse antes y despus de llevar a cavo la practica. En las tarjas no debern ser arrojados papel filtro, vidrio o material parcialmente insoluble. Cuando se tenga duda de cmo desechar un material, se debe de preguntar al maestro de laboratorio o al instructor. Los mecheros deben de apagarse si no se estn utilizando.

MATERIAL: Balanza Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Bureta Soporte Pinzas para bureta Vasos de precipitado Esptula Matraz Erlenmeyer

REACTIVOS: Agua Sacarosa cloruro de sodio

METODO: 1. Pipetear distintos volmenes, utilizando la pipeta adecuada, hasta dominar la tcnica. 2. Pesar distintas sustancias, tomando en consideracin la tara. 3. Titular repetidamente hasta lograr un control de la tcnica. CUESTIONARIO: 1. De la siguiente lista de materiales entregar: Esquema y utilidad de: Material de vidrio. Varilla. Agitador. Pipetas. Tubos de ensaye. Vasos de precipitado. Matraces. Probetas. Refrigerantes. Vidrio de reloj. Otros.

Material de porcelana. Cpsula. Crisol Mortero. Embudo Bucher. Otros.

Otros materiales. Conexiones. Mangueras de hule. Tubos de vidrio. Soporte

Aparatos: Balanza. Centrfuga. Estufa.

PRACTICA No. 2 PREPARACIN DE SOLUCIONES

OBJETIVO: Al finalizar la prctica el alumno sera capaz de: 1.- Definira: molaridad, molalidad, normalidad y porcentualidad. 2.- Preparar los tipos de soluciones ms frecuentemente empleadas en el laboratorio de bioqumica.

INTRODUCCIN: En la naturaleza encontramos dos clases de substancias puras: los elementos y los compuestos; las dems son mezclas. Una mezcla consiste en dos o ms substancias puras, separables por medios fsicos. Su composicin es variable y sus propiedades dependen de sta y de las propiedades de las substancias que forman parte de ella. Las mezclas son de dos tipos: heterogneas y homogneas. Una mezcla heterognea no es completamente uniforme y sus componentes son distinguibles, en ocasiones a simple vista (ejemplo: una mezcla de azcar y arena). Una mezcla homognea tiene apariencia uniforme; las llamadas soluciones son ejemplos de mezclas homogneas. De acuerdo a su estado fsico las soluciones se clasifican en gaseosas, lquidas y slidas. Las soluciones lquidas son las ms comunes y, tal vez, las ms importantes para el qumico. Generalmente se llama disolvente al componente de una solucin que se encuentra en mayor cantidad; los otros componentes se llaman solutos. El agua es la molcula ms abundante en los sistemas vivientes y de ah la importancia de abordar el estudio de las soluciones acuosas en un curso de Bioqumica. Maneras de expresar la concentracin A. El mol. Nos ocuparemos en primer lugar del mol. La razn de su existencia es que los tomos de los diferentes elementos no tienen la misma masa. Para expresar la masa de los tomos se recurre a una unidad que no es el gramo ni el miligramo, sino que es la masa de uno de ellos: el tomo de hidrgeno por ser el ms sencillo. A su masa se le da el valor convencional de 1 (uno). Las masas relativas de los dems elementos son mltiples de este nmero; as, la masa del tomo de sodio es 23 veces la del tomo de hidrgeno; la del cloro, 35.5 veces la del hidrgeno, etc. A estas cifras, por referirse a relaciones de masa entre los tomos, se les denomina masas atmicas. Teniendo presente esta relacin constante entre las masas de los diferentes tomos, se pueden utilizar cualquiera de las habituales unidades de masa ya que siempre que mantengamos dicha proporcin de 1 para el hidrgeno por 39 para el potasio estaremos poniendo en contacto el mismo nmero de tomos. As, 1 kilogramo de hidrgeno tendr el mismo nmero de tomos que 23 kilogramos de sodio o que 39 kilogramos de potasio o que 35.5 kilogramos de cloro. Lo mismo se puede afirmar de 1 gramo de hidrgeno con respecto a 23 gramos de sodio, o de 39 miligramos de potasio con respecto a 35.5 miligramos de cloro. De todas estas unidades, la perteneciente al Sistema Internacional de unidades es el gramo y por ello es la que debe utilizarse. As pues, un tomo-gramo es la masa atmica expresada en gramos. Por ello se tiene que un tomo-gramo de hidrgeno es 1 gramo de hidrgeno; un tomo-gramo de sodio son 23 gramos de sodio; un tomo-gramo de potasio son 39 gramos de potasio; y, un tomo-gramo de cloro son 35.5 gramos de cloro.

Ahora bien, los tomos se unen para formar molculas. Por ejemplo, el carbono, el oxgeno y el hidrgeno se unen para formar, entre otras sustancias, glucosa (frmula: C6H12O6). La masa molecular de la glucosa es la suma de las masas de los tomos constituyentes, a saber:(12x6)+(1x12)+(16x6) = 72+12+96 = 180. Esta masa puede ser expresada en gramos y, si cuando se habla de tomos se le llamaba tomo-gramo, cuando se refiere a molculas, se le denomina molcula-gramo o mol. Por el mismo razonamiento se podra hablar de in-gramo. Todas las molculas-gramo tendrn el mismo nmero de molculas y as se cuenta con una unidad que expresa la proporcin de molculas en una sustancia. En consecuencia, como la masa molecular de la glucosa es 180, un mol de glucosa pesa 180 gramos, 2 moles de glucosa pesan 360 gramos, etc. Se puede establecer la frmula siguiente: MASA EN GRAMOS = MASA MOLECULAR x NMERO DE MOLES y, despejando: NMERO DE MOLES = MASA EN GRAMOS/ MASA MOLECULAR Para usos biolgicos la unidad mol es muy grande y entonces se utiliza el milimol (mmol), unidad mil veces menor. Por lo tanto, un milimol es igual a la masa molecular expresado en miligramos. As, NMERO DE MILIMOLES = MASA EN MILIGRAMOS/ MASA MOLECULAR Comprendidos los conceptos anteriores, se puede pasar a definir qu es una solucin molar. B. Soluciones molares (M). La molaridad de una solucin expresa el nmero de moles de soluto presentes en un litro de solucin final. Esto quiere decir que si se disuelven en agua 1 mol de glucosa (180 gramos) y se aade agua suficiente ("se afora") hasta completar un litro, se obtiene una solucin molar (1.0M) de glucosa. Para ilustrar ms este punto, supongamos que se quieren preparar 500 mililitros de una solucin 0.4 M de cloruro de sodio (NaCl). Cuantos gramos de NaCl deben prepararse, sabiendo que la masa "molecular" de la sal es de 58.5? El problema puede abordarse siguiendo este razonamiento: si 1 litro de solucin 1.0 M contiene 58.5 gramos de NaCl y 1 litro de solucin 0.4 M contiene x gramos de NaCl, entonces x = (0.4)(58.5)/1 = 23.4g de NaCl. Estos 23.4 gramos de NaCl sirven para preparar 1 litro (1000 ml) de solucin; pero solamente se requiere 0.5 litro (500 ml). Entonces, como 1 litro de solucin 0.4M contiene 23.4 gramos de NaCl , 0.5 litro de solucin 0.4 M contiene x gramos de NaCl, esto es, x = (0.5)(23.4)/1 = 11.7 gramos de NaCl. Por lo tanto, se requieren 11.7 gramos de NaCl y disolverlos en agua hasta completar un volumen de 0.5 litro (500 ml). En el ejemplo anterior, como se pudo ver, se multiplic la molaridad del problema (0.4) por la masa "molecular" (peso frmula) del NaCl (58.5) y por el volumen del problema (0.5 litro). Posteriormente se dividi entre 1 litro. Simplificando el procedimiento, se puede aplicar la frmula siguiente: GRAMOS REQUERIDOS DE LA SUSTANCIA = MOLARIDAD X PESO MOLEC. X VOLUMEN (en litros).

C. El equivalente (Eq). Desde el punto de vista electroqumico existen dos clases de substancias: unas, que al estar en solucin permiten el paso de la corriente elctrica, reciben el nombre de electrolitos; las otras, que no lo permiten, son llamadas no electrolitos. Ejemplos de electrolitos son el cloruro de sodio, el fosfato de potasio, etc. La glucosa y la urea son ejemplos de no electrolitos. Se sabe que una propiedad de los tomos es la de poderse combinar. En trminos qumicos esta capacidad de combinacin se denomina valencia. La valencia no guarda relacin con la masa atmica, sino con el nmero de electrones combinables; en otras palabras, existen tomos con gran poder combinatorio cuya masa ("peso atmico") es menor que la de otros tomos con valencia menor. Por ejemplo, el sodio tiene un peso atmico de 23 y una valencia de 1; el oxigeno tiene un peso atmico de 16 y una valencia de 2; el carbono tiene un peso atmico de 12 y una valencia de 4, etc. Se requiere, pues, contar con una unidad que evite la dificultad de que los tomos no tengan la misma masa y que permita comparar "actividades" (cargas) por nmero y no por peso. Por ejemplo, si se tratara de un regimiento de soldados, se hablara del nmero de soldados y no del peso corporal del pelotn. Pero esto no es todo: los soldados pueden estar armados de manera diferente, valer cada uno por dos o tres, y es esta razn del valor diferente, de diferente valencia o actividad qumica la que lleva a la introduccin de una nueva unidad: el equivalente (Eq). Se entiende por equivalente qumico el peso atmico o molecular de una sustancia, expresado en gramos, y dividido entre su valencia: equivalente (Eq) = masa/ valencia Por tratarse de una unidad demasiado grande para usos biolgicos, se utiliza una unidad 1000 veces menor: el miliequivalente (mEq). Otra comparacin que ayuda a ilustrar la importancia de determinar equivalentes en lugar de gramos es la siguiente: si se invita a una fiesta 1000 Kg. de nios y 1000 Kg. de nias, no se puede estar seguro de que se invit a cantidades equivalentes de nios y nias. Pero si se invita a 10 nios y a 10 nias sin tener en cuenta su peso, se puede tener la seguridad de que en la fiesta la cantidad de nios ser equivalente a la de las nias. Si se considera que la actividad fisiolgica y qumica es proporcional a la cantidad de partculas por unidad de volumen (moles o mili moles por litro), y ms directamente al total de cargas elctricas por unidad de volumen (equivalentes o mili equivalentes por litro), con esta ltima unidad se puede tener una mejor idea de la verdadera accin qumica que tienen los iones en el organismo. Por ejemplo, en el suero existen 3.65 g de Cl- por litro y 3,25 g de Na+ por litro, y en + apariencia hay un mayor nmero de iones Cl que de iones Na ; sin embargo, si se toma en cuenta + que la masa de un in Cl es mayor que la de un in Na , se puede sospechar que en el suero existe una menor accin qumica del primero que del segundo. Expresado en mili equivalentes ya + se expresa esta diferencia, puesto que hay 103 mEq de Cl por 142 de Na . Para obtener la actividad qumica se divide la cantidad necesaria de sustancia (en gramos) entre la valencia. Por lo tanto, teniendo en cuenta ambas caractersticas de peso y valencia, se puede generalizar el concepto para todos los elementos, diciendo que las cantidades que representan la masa atmica ("peso atmico") dividido por su valencia, son qumicamente equivalentes. As, 1 gramo de H/1 = 1 g; 23 gramos de Na /1 = 23 g; 39 gramos de K/1 = 39 g; 40 gramos de Ca /2 = 20 g; 16 gramos de O/2 = 8 g; y, 12 gramos de C/4 = 3 g, son equivalentes; en otras palabras, qumicamente valen igual y son capaces de neutralizarse exactamente. De lo expuesto se deduce que es fcil convertir gramos en equivalentes y viceversa. Si se quiere saber cuntos equivalentes son 69 gramos de Na, como el peso atmico de Na = 23 y un equivalente de Na = peso atmico en gramos/ valencia = 23 g/1 = 23 gramos de Na, entonces, 3 equivalentes tienen (3)(23) = 69 gramos de Na. Si se quiere saber cuntos mEq son 69 gramos de Ca, dado que el peso atmico de Ca = 40 y un equivalente de Ca = (peso atmico en gramos)/valencia = 40 g/2 = 20 gramos de Ca, entonces 69 gramos de Ca son x = 69 x 1/20 = 3.45 Eq = 3450 mEq.

Soluciones normales (N). La normalidad de una solucin expresa el nmero de equivalentes de soluto presentes en un litro de solucin final. Por ejemplo, si se disuelve en agua destilada el peso equivalente de una sustancia, a completar 1 litro (1000 ml), se habr preparado un litro de una solucin 1 Normal (1 N). Como se recordar, la frmula utilizada para calcular la cantidad de sustancia necesaria para preparar cualquier volumen de una solucin de molaridad determinada es: VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen se expresa en litros y, VOLUMEN x PESO MOLECULAR x MOLARIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen es expresado en mililitros. Para calcular la cantidad en gramos de una sustancia, necesaria para preparar un volumen determinado de una solucin de cierta normalidad, se pueden usar las frmulas siguientes: VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen se expresa en litros, y VOLUMEN x PESO EQUIVALENTE x NORMALIDAD/1000 = GRAMOS DE LA SUBSTANCIA cuando el volumen ha sido expresado en mililitros. Ejemplo: Preparar 300 ml de una solucin 0.1 N de cloruro de calcio (CaCl2). Volumen = 300 ml Normalidad = 0.1 N Equivalente del CaCl2: Peso atmico de Ca = 40; peso atmico de Cl = 35.5 x 2 (en CaCl2) = 71.0; peso frmula = 40 + 71 = 111. Valencia (capacidad de combinacin) = 2. Peso equivalente = 111 g/2 = 55.5 gramos Substituyendo en la frmula: gramos de CaCl2 = 300 x 55.5 x 0.1/1000 = 1.665 Resultado: Se necesitan 1.665 g de CaCl2 para preparar 300 ml de una solucin 0.1N . D. Soluciones porcentuales (%). En las soluciones, el soluto puede encontrarse a diferentes diluciones en relacin con el solvente. Es por ello que se recurre a una terminologa especial que indica la cantidad de soluto presente en relacin al volumen total de la solucin. Dicha relacin se puede expresar de varias maneras, una de las cuales son las llamadas soluciones porcentuales. Este porcentaje puede ser: de volumen en volumen (v/ v), de peso en peso (p /p) y de peso en volumen (p /v). 1. De volumen en volumen. En general se emplea para soluciones de lquido en lquido. Por ejemplo: soluciones de etanol en agua, ambos son lquidos. Para preparar una solucin porcentual se considera que las substancias "qumicamente puras" estn formadas slo por soluto; es decir, estn al 100%. Para fines prcticos se usan 100 ml como volumen total de solucin; la cantidad de mililitros de soluto empleados en dicha dilucin (v/v), es expresa en forma porcentual. As, si se tiene una solucin de etanol al 96% (v /v), quiere decir que por cada 100 ml de solucin total, 96 ml corresponden al soluto (alcohol qumicamente puro) y el resto, al agua u otro solvente empleado. Ejemplo: se desea preparar una solucin de fenolftaleina al 0.5% (v/ v) en alcohol al 96%. En este caso el soluto es la fenolftaleina, y el solvente el alcohol (etanol) al 96%.

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Si slo se cuenta con alcohol qumicamente puro (al 100%), se debe preparar primero una solucin de alcohol al 96% (v/v). El mtodo a seguir es el siguiente: en una probeta de 100 ml se vierten 96 ml de alcohol absoluto (100%); posteriormente se aade agua destilada suficiente para completar los 100 ml. Es necesario que el procedimiento se haga en el orden mencionado para que sea exacto: primero el alcohol y luego el agua. A primera vista, parecera lo mismo aadir primero 4 ml de agua y a continuacin 96 ml de alcohol absoluto, obteniendo de este modo 4 + 96 = 100 ml de solucin. Sin embargo, hay que considerar que puede haber un margen de error, ya que se trata de dos lquidos cuya densidad es diferente: las molculas de alcohol no mantienen la misma "distancia" entre ellas cuando el alcohol es qumicamente puro que cuando se encuentra mezclado con agua. Esta pequea diferencia puede alterar el volumen final de solucin (100 ml). Una vez preparada la solucin de alcohol al 96%, se procede a preparar la solucin de fenolftalena al 0.5% (v/ v). En una probeta de 100 ml se coloca 0.5 ml de fenolftalena, aadiendo posteriormente la cantidad necesaria de alcohol al 96% para completar el volumen de 100 ml. Es importante insistir que los trminos porcentuales expresan siempre una relacin; es decir, se pueden variar los volmenes siempre y cuando no se pierda dicha relacin. Por ejemplo, si en lugar de 100 ml de la mencionada solucin de fenolftalena al 0.5% (v /v) en alcohol al 96%, slo se deseasen preparar 25 ml, se sigue el planteamiento siguiente: como 100 ml de solucin contienen 0.5 ml de fenolftalena, entonces 25 ml de solucin contienen x ml de fenolftalena, por lo que: x = 25 x 0.5/100 = 0.125 ml de fenolftalena Resultado: se necesita 0.125 ml de fenolftalena, y suficiente alcohol al 96% para completar un volumen de 25 ml. El alcohol etlico comn tiene 96% de pureza (v /v ). Por lo tanto, si no se cuenta con alcohol puro y se quiere preparar una solucin de alcohol al 24%, el planteamiento es como sigue: como 100 ml de solucin contienen 96 ml de alcohol puro y x ml de solucin contienen 24 ml de alcohol puro, entonces: x = 24 x 100/96 = 25 ml de alcohol al 96% (v/ v) Resultado: Se necesitan 25 ml de solucin de alcohol al 96% y completar con agua un volumen de 100 ml. Si tan solo se desean 50 ml de esta nueva solucin: como 100 ml de alcohol al 24% tienen 25 ml de alcohol al 96%, entonces 50 ml de alcohol al 24% tienen x ml de alcohol al 96%, x = 50 x 25/100 = 12.5 ml de alcohol al 96% Resultado: Se requieren 12.5 ml de alcohol al 96% y completar con agua destilada un volumen final de 50 ml. 2. De peso en volumen (p /v). Expresa el nmero de gramos de soluto en 100 ml de la solucin final, independientemente de la naturaleza del solvente. Son las ms comnmente utilizadas en los laboratorios de Bioqumica. 3. De peso en peso (p /p). Expresa el nmero de gramos de soluto en 100 gramos de la solucin final. Generalmente estas soluciones no se preparan en los laboratorios convencionales, pero conviene conocerlas ya que muchos reactivos comerciales son envasados como soluciones porcentuales de peso en peso. Por ejemplo, los cidos clorhdrico, sulfrico, etc. son envasados de esta manera. As, para al cido clorhdrico (HCl) al 37% (p /p) en cada 100 gramos de solucin, 37 gramos son de HCl puro.

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E. Soluciones molales (m). Una solucin molal es la que contiene el peso molecular de una sustancia en 1000 gramos de solvente; es decir, la cantidad de solvente es fija y a ella se agrega la sustancia por disolver. Por ejemplo, una solucin 1 molal (1 m) de glucosa, cuyo peso molecular es de 180, se prepara agregando a 1000 g de agua, 180 g de glucosa. MATERIAL: Balanza Pipetas de 1 ml, 5 ml, 10 ml Vasos de precipitado 50 y 100 ml Esptula Matraces aforados 50 y 100 ml REACTIVOS: Agua Sacarosa Cloruro de sodio Etanol cido clorhdrico cido sulfrico

METODO: Preparacin de soluciones A. Soluciones porcentuales (%). Material: cloruro de sodio (NaCl); sacarosa (C11H22OH10); agua destilada. Procedimientos: a. Preparar 50 ml de solucin de cloruro de sodio al 10% (p /v). b. A partir de la solucin de cloruro de sodio al 10%, preparar 100 ml de una solucin salina al 1%. c. A partir de una solucin de etanol al 96% (v /v), preparar 50 mililitros de una solucin de etanol al 18 % (v/ v) en agua. B. Soluciones molares. Material: cloruro de sodio; agua destilada, cido sulfrico (H2SO4), cido clorhdrico (HCl). Procedimientos: Preparar 100 ml de una solucin de cloruro de sodio 0.5M. a. A partir de la solucin anterior, preparar 100 ml de una solucin 0.1 M de cloruro de sodio. b. Preparar 100 ml de una solucin 0.1 M de cido clorhdrico. c. Preparar 100 ml de una solucin 0.1 M de cido sulfrico. C. Soluciones normales Material: cloruro de sodio; agua destilada, cido sulfrico (H2SO4), cido clorhdrico (HCl). Procedimiento: a. Preparar 50 ml de una solucin de NaCl 0.4 N b. Prepare 50 ml de los reactivos restantes a una concentracin 0.4 N. D. Soluciones molales. Material: sacarosa; agua destilada. Procedimiento: Preparar 100 ml de una solucin de sacarosa 0.5 molal. CUESTIONARIO:

Defina los siguientes trminos: mol, equivalente qumico, normalidad, molaridad, molalidad, solucin porcentual p/ p, solucin porcentual p/ v, solucin porcentual v/ v.

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PRACTICA NO. 3 FRAGILIDAD OSMTICA DE LOS ERITROCITOS

OBJETIVO: El alumno efectuar e interpretar la prueba de fragilidad osmtica de los eritrocitos frente a soluciones salinas hipotnicas.

INTRODUCCIN: La osmolaridad del plasma sanguneo oscila normalmente entre 290 a 310 miliosmolas por litro. Una solucin con esta osmolaridad es isotnica con respecto al plasma y recibe el nombre de solucin fisiolgica. Ejemplo: Una solucin de cloruro de sodio al 0.8 por ciento (p/v) y una solucin de glucosa al 5 por ciento (p/v) son isotnicas con respecto al plasma y, por lo tanto, son soluciones fisiolgicas. Las soluciones que contienen mayor nmero de osmolas por litro que el plasma son hipertnicas, en tanto que las que tienen menor nmero de osmolas son hipotnicas. Cuando se depositan glbulos rojos en una solucin isotnica al plasma, no sufren cambios en su volumen y contenidos; en cambio, si se colocan glbulos rojos en una solucin hipertnica, sale agua del interior celular. Por otra parte, al poner en contacto glbulos rojos con una solucin hipotnica o, en un caso extremo, con agua destilada, el agua penetra al interior de las clulas. Una anemia hemoltica es el resultado de una elevada tendencia a la destruccin de los glbulos rojos; la clasificacin de este tipo de anemias se basa en la identificacin del factor causante de la hemlisis, el cual puede ser de naturaleza hereditaria (factor intracorpuscular) o adquirida (factor extracorpuscular). Se ha estudiado el lmite de tonicidad de los eritrocitos y se ha visto que la fragilidad osmtica est aumentada en la esferocitosis hereditaria, en algunas ocasiones en la enfermedad hemoltica autoinmune, en la enfermedad hemoltica del recin nacido (por anticuerpos anti-A y, con menos frecuencia, por anticuerpos anti-Rh) y en la anemia hemoltica por envenenamiento qumico o por quemaduras graves. Por el otro lado, se ha observado una menor fragilidad osmtica de los eritrocitos en la talasemia, en la anemia de clulas falciformes (drepanocitosis) y en trastornos en los que aparecen eritrocitos de escaso espesor (dianocitos o clulas en blanco de tiro).

MATERIAL: Tubos de ensayo de 5 ml Gradilla Pipetas de 1 y 5 ml Jeringa Torunda Torniquete Guantes desechables Parafilm

REACTIVOS: Tubo con Heprina sdica NaCl 0.5% (p/v) Agua destilada

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METODO: 1.- Obtener por puncin venosa sangre heparinizada (10 ml). 2.- Montar una serie de tubos como se indica en la tabla siguiente: Tubo 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 NaCl 0.5% (ml) 2.5 2.4 2.3 2.2 2.1 2.0 1.9 1.8 1.7 1.6 1.5 1.4 Agua destilada (ml) 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 Sangre completa (ml) 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 0.05 Con (%) 0.50 0.48 0.46 0.44 0.42 0.40 0.38 0.36 0.34 0.32 0.30 0.28

3.- Tapar cada tubo. Agitar suavemente por inversin. 4.- Dejar reposar durante 1 a 2 horas, observando cada 30 minutos. Importante: no mover la gradilla. 5.- Se debe tener cuidado de no agitar los tubos para poder observar si en el sobrenadante hay hemlisis. Anotar en qu tubo se inicia sta y en cul es total

INTERPRETACIN Normal: Inicio de hemlisis........................... 0.44 a 0.38% Hemlisis total................................. 0.34 a 0.30%

CUESTIONARIO: Defina los trminos siguientes: a) osmolaridad b) smosis

c) solucin isotnica d) e) f) solucin hipertnica solucin hipotnica fragilidad osmtica, anemia

g) anemia hemoltica, h) anemia auto inmune, i) j) talasemia, drepanocitosis,

k) dianocito.

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PRACTICA NO. 4 MEDICION DE LA ACTIVIDAD DEL ION HIDROGENO EN SOLUCIONES ACUOSAS

OBJETIVO: 1.-Conocer y aplicar algunos mtodos para la determinacin de pH. 2.- Determinar el pH de varias sustancias problemas. INTRODUCCIN: C O N C E P T O D E pH Para poder comprender qu es pH, es necesario revisar antes algunos conceptos, tales como: cido, base, disociacin, ionizacin y concentracin. Por otra parte, resulta indispensable tener una idea precisa acerca de los logaritmos. Disociacin. La disociacin es el proceso de separacin de uno o ms elementos de una molcula compuesta, que da como resultado fragmentos ms simples: tomos, radicales libres, iones. En los sistemas biolgicos, el agua es el solvente en el que se encuentran disueltos los compuestos disociados. Cuando una molcula se separa dando iones positivos (cationes) e iones negativos (aniones), el proceso de disociacin puede ser tambin llamado ionizacin. cido y base. Se define como cido a una sustancia capaz de ceder protones (H ) en solucin. El grado de acidez depender del nmero de protones o hidrogeniones libres. En general, se consideran dos tipos de cidos: fuertes y dbiles. Un cido fuerte es el que se disocia casi por completo y, por tanto, deja libres a prcticamente todos los hidrogeniones que posee. Un cido dbil es aqul que se disocia parcialmente, de tal manera que la mayora de los protones se encuentran unidos al anin (base conjugada) y slo una pequea proporcin de ellos estn libres. Una base o lcali es una sustancia capaz de aceptar o combinarse con protones y/o capaz de incrementar la concentracin de iones oxhidrilo (OH ) en solucin. Los cidos y las bases se neutralizan mutuamente, molcula a molcula, ya que las bases aceptan los protones de los cidos cuando ambos son mezclados. Como resultado, se establece un equilibrio entre las cargas del cido y las de la base y, por consiguiente, la ausencia de protones libres. Las substancias que pueden actuar indistintamente como cidos o como bases son conocidas como anfotricas. Grado de acidez o alcalinidad. Para poder valorar el grado de acidez o alcalinidad de una sustancia, se ide una escala basada en la concentracin de hidrogeniones libres obtenidos por la disociacin del agua. La cantidad de molculas de agua disociadas puede variar conforme a su pureza y a la temperatura, pero la relacin entre la concentracin de molculas de agua disociadas y la concentracin de molculas de agua no disociadas permanece constante. A esta constante se le denomina constante de disociacin del agua (KD). KD = [H ][ OH ]/[H2O]
+ +

(1)

15

El agua pura, a 25 C, tiene una [H ] = [OH ] = 1.0 x 10 M. La [H2O] = 55.555 M. y, para fines prcticos, se puede considerar que permanece constante ante el evento de disociacin. Por lo tanto, la ecuacin (1) puede rearreglarse definiendo una nueva constante, la KW o constante del producto inico del agua, la cual tiene un valor numrico, a 25 C, de 1.0 x 10-14 (por qu?).
+ -7

[H2O] KD = KW = [H ][ OH ] = 1.0 x 10

-14

(2)

El dans Srensen invent una manera abreviada para referirse a la concentracin de protones libres en solucin, que denomin pH, el cual se define como: pH = log 1/[ H+] = - log [H+] De manera anloga, podra definirse pOH como: pOH = log 1/[ OH ] = - log [OH-]
-

(3)

(4)

Generalizando, pK = log 1/K = - log K

(5)

As pues, el pH del agua pura a 25 C es igual a 7, y el pOH = 7.0 (por qu?). Si se aplican logaritmos negativos a cada uno de los miembros de la ecuacin (2), se obtiene la relacin siguiente: pKw = pH + pOH = 14 (6) En consecuencia, el valor mnimo de pH es 0 y su valor mximo es 14. Asimismo, pOH puede tener un valor mnimo de 0 y un valor mximo de 14. De la ecuacin (6) tambin se deduce que al aumentar el valor de pH, disminuye el valor de pOH y viceversa. Escala de pH. [H ] 1
+

pH 0
-1 -2 -3 -4 -5 -6 -7 -8 -9

pOH 14 13 12 11 10 9 8 Sol. NEUTRA 7 6 5 4 3 2 1 0

[OH ] 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10
-14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7 -6 -5 -4 -3 -2 -1

1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14

1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1 x 10 1

-10 -11 -12 -13 -14

*Concentraciones en molas/litro a 25 C.
+ Se dice que el pH = 7 es neutro, ya que en dicha situacin [ H ] = [OH-]. Un pH menor que 7 es cido, pues predominan los protones sobre los oxhidrilos libres. Finalmente, un pH mayor que 7 es bsico o alcalino, ya que predominan los oxhidrilos sobre los protones libres en solucin.

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INDICADORES DE pH Existen varios colorantes orgnicos, sintticos o de origen natural, que cambian de color cuando vara el pH de la solucin en la que se encuentran disueltos. Ya que la mayora de los cidos y las bases empleados en el laboratorio son incoloros, los indicadores son tiles al hacer posible que los cambios de pH sean observables por las variaciones en la coloracin de las soluciones. Los indicadores de pH son usualmente cidos o bases dbiles. En el caso de un cido, su disociacin puede representarse como sigue: HInd H + Ind
+ -

Cuando se agrega una base a la forma cida del indicador (HInd), aqulla reacciona con l para obtener la forma bsica del indicador (Ind-). Se forma de este modo un sistema amortiguador y, por lo tanto, su pH se puede calcular de la misma forma que en otras soluciones amortiguadoras. En el caso de algunos indicadores, su color es determinado por la disociacin de la sustancia, como sucede con el rojo de metilo. La forma cida (no disociada) es roja; la forma bsica es amarilla. Dependiendo de la proporcin que guarden las concentraciones de ambas formas, se pueden observar todas las tonalidades intermedias entre estos colores extremos. En otros casos, como el de la fenolftaleina, una forma del indicador es incolora y la otra es coloreada. El color final de la solucin depende de la cantidad presente de la forma coloreada. Los indicadores pueden usarse para determinar el pH de alguna solucin, mediante la comparacin entre el color del indicador en una solucin de pH conocido y el color del indicador en la solucin problema.

A LG U N O S I ND I C AD O R E S D E p H D E U SO F RE CU E NT E NO M B R E V U L G A R Azul de timol Anaranjado de metilo Verde de bromocresol Azul de bromofenol Rojo de metilo Rojo de clorofenol Prpura de bromocresol Azul de bromotimol Rojo de fenol Rojo de cresol Azul de timol Fenolftalena Timolftalena Rojo congo Rojo de alizarina Tornasol Rojo neutro pK 1.7 3.5 4.7 4.0 5.1 6.0 6.2 7.0 7.9 8.3 8.9 9.7 9.9 COLOR Y ZONA TIL DE rojo 1.2 amarillo rojo 3.1 amarillo amarillo 3.8 azul amarillo 3.0 azul rojo 4.2 amarillo amarillo 5.1 rojo amarillo 5.4 prpura amarillo 6.0 azul amarillo 6.8 rojo amarillo 7.2 rojo amarillo 8.0 azul incoloro 8.3 rojo amarillo 9.3 azul azul-rojo 3.0 violeta amarillo 3.7 rosa rojo 5.0 azul amarillo 6.8 naranja pH 2.8 4.4 5.5 4.6 6.3 6.7 7.0 7.6 8.4 8.8 9.6 10.0 10.5 5.2 4.2 8.0 8.0

6.85

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preparacion de una escala colorimtrica de pH mediante el uso de buffer estandar e indicadores Este mtodo de estimar el pH se basa en el hecho de que un indicador cido-base, existe en solucin como dos especies de diferente color en un intervalo de pH alrededor de su pKa. Los indicadores son cidos dbiles cuyas formas no disociadas (Hind) y disociada (Ind) tienen color diferente. Por medio de la preparacin de una serie de soluciones amortiguadoras cuyos valores de pH son conocidos y se agrupan alrededor del pKa del cido indicador, y que contienen la misma concentracin del mismo, se obtiene una escala colorida estndar en la que la tonalidad de cada solucin depende de su valor de pH particularmente aadiendo la misma concentracin de indicador que la presente en las soluciones estndar. El color de la solucin problema es entonces comparado visualmente o colorimtricamente con los colores de la serie de los buffers estndar. De esta manera es posible conocer el pH de una solucin con una aproximacin de 0.2 unidades de pH. Este procedimiento esta sujeto a errores. A menudo las soluciones que contienen protenas muestran grandes variaciones de pH debido a que las protenas pueden unirse a una u otra forma del indicador, por lo que ocurre un desplazamiento en el equilibrio de su disociacin. Un segundo error es causado por la presencia de otras sustancias coloridas en la solucin. Este puede cancelarse, si la interferencia no es muy grande, mediante el empleo de un tubo blanco de la sustancia colorida en el que el indicador esta ausente.

Uso del potencimetro: El pH es formalmente definido como el logaritmo negativo de la actividad del in hidrgeno. Algunas aproximaciones a la verdadera actividad del in hidrgeno pueden ser medidas por medio del electrodo de hidrogeno. Este consiste en un electrodo platinado sumergido en la solucin que va a ser probada. Se hace pasar gas hidrogeno a travs de la solucin la media celda as formada consiste de H2 gaseoso en equilibrio con iones H+, generndose un potencial elctrico medible. El potencial medido con un electrodo de hidrgeno, a una atmsfera de presin y en una solucin que contiene la unidad de actividad del in hidrgeno, es considerado igual a cero a todas las temperaturas. Este es el estndar. En ocasiones, el pH determinado con el electrodo de hidrgeno es arbitrario, y se han adoptado algunas conversiones para la relacin entre el pH y el potencial elctrico, de manera que los valores de pH determinados por otros procedimientos y en diferentes laboratorios pueden ser comparados. En todos los casos, la solucin estndar usada para relacionar el pH a la fuerza electromotriz deber especificarse. Como el electrodo de hidrgeno no es adecuado para estimar el pH de soluciones que contienen substancias reductoras, es necesario usar otro mtodo para dichas soluciones. Uno conveniente emplea el electrodo de vidrio. El electrodo de vidrio es una membrana delgada de un vidrio especial. Esta membrana encierra una media celda delgada de plata-cloruro de plata (Ag -AgCl). La otra mitad de la celda es un electrodo de calomel formado por cloruro de mercurio (HgCl2) sobre mercurio slido. En el interior de la celda de vidrio que contiene el electrodo de calomel hay cido clorhdrico 0.1 M, solucin que establece un pH constante y conocido en un lado de la membrana de vidrio. Un puente de KCl conecta la solucin de pH desconocido con la media celda.

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MATERIAL: 15 Tubos de ensayo de Gradilla 2 Pipetas de 10 ml 4 pipetas de 5 ml

REACTIVOS: CH3COOH 0.2 M. CH3COONa 0.2 M. KH3PO4 0.1 M NaOH 0.1 M cido brico-KCl 0.1 M cido brico 0.1 N. INDICADORES: Anaranjado de metilo. Rojo de metilo. Azul de bromotimol . Rojo de cresol. Fenolftalena. Azul de timol. 3 soluciones problema de pH desconocido.

METODO: PREPARACION DE ESCALA COLORIMETRICA DE pH UTILIZANDO INDICADORES 1.- Para realizar la escala de pH en un rango de 3.6 - 10, se dividir el grupo en 3 equipos cada uno de los equipos preparar una serie de pH, en donde tendrn once valores de pH diferentes, a cada equipo corresponde preparar lo siguiente: EQUIPO No. 1 No. DE TUBO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 pH A PREPARAR 3.6 3.8 4.0 4.2 4.4 4.6 4.8 5.0 5.2 5.4 5.6 CH3COOH 0.2 M 9.3 ml 8.8 ml 8.2 ml 7.3 ml 6.3 ml 5.1 ml 4.0 ml 2.9 ml 2.1 ml 1.4 ml 0.9 ml ADICIONAR PRIMERO CH3COONa 0.2 M 0.7 ml 1.2 ml 1.8 ml 2.7 ml 3.7 ml 4.9 ml 6.0 ml 7.1 ml 7.9 ml 8.6 ml 9.1 ml ADICIONAR DESPUES

Despus agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones: A la primera serie de 5 tubos (tubos del 1 al 5) adicionar 5 gotas del indicador anaranjado de metilo y agitar cada tubo. A los tubos 6 al 11 adicionar 5 gotas del indicador rojo de metilo y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos. Ya preparados sus tubos colquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparacin de sus problemas.

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EQUIPO No. 2 No. DE TUBO 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 pH A PREPARAR 6.0 6.2 6.4 6.6 6.8 7.0 7.2 7.4 7.6 7.8 8.0 KH2PO4 0.1 M 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml ADICIONAR EN 1 LUGAR NaOH 0.1 M O.6 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.7 ml 2.3 ml 2.9 m 3.4 ml 3.9 ml 4.2 ml 4.5 ml 4.6 ml ADICIONAR EN 2 LUGAR H2O DEST. 4.4 ml 4.2 ml 3.8 ml 3.3 ml 2.7 ml 2.1 ml 1.6 ml 1.1 ml 0.8 ml 0.5 ml 0.4 ml ADICIONAR EN 3 LUGAR

Despus agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones: A los tubos del 12 al 18 adicionar 5 gotas del indicador azul de bromotimol y del 19 al 22 rojo de cresol, y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos. Ya preparados sus tubos colquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparacin de sus problemas. EQUIPO No. 3 No. DE TUBO 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 pH A PREPARAR 8.2 8.4 8.6 8.8 9.0 9.2 9.4 9.6 9.8 10.0 AC. BORICO-KCl 0.1 M 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml 5 ml ADICIONAR EN 1 LUGAR NaOH 0.1 M 0.6 ml 0.8 ml 1.2 ml 1.6 ml 2.1 ml 2.7 ml 3.2 ml 3.7 ml 4.1 ml 4.4 ml ADICIONAR EN 2 LUGAR H2O DEST. 4.4 ml 4.2 ml 3.8 ml 3.4 ml 2.9 ml 2.3 ml 1.8 ml 1.3 ml 0.9 ml 0.6 ml ADICIONAR EN 3 LUGAR

Despus agregar el indicador a cada tubo, de acuerdo a las siguientes indicaciones: A los tubos del 23 al 26 adicionar 5 gotas del indicador azul de timol y agitar cada tubo. A los tubos del 27 al 32 adicionar 5 gotas del indicador fenolftaleina y agitar los tubos. Observe los distintos tonos que adquiere el indicador en cada uno de los valores de pH obtenidos. Ya preparados sus tubos colquelos en una gradilla y espere a que los dos equipos restantes terminen de preparar sus tubos, para poder realizar la comparacin de sus problemas. 2.- Renanse los 3 equipos con la serie de tubos que prepararon para llevar a cabo la comparacin visual de sus problemas.

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3.- Determinar el pH de las tres soluciones problema por medio de comparacin visual. Para determinar el pH tomar 10 ml de cada solucin, colocarlas en su respectivo tubo de ensaye y agregar 5 gotas del indicador que se le indique. Comparar la coloracin de valor de pH medido con el potencimetro para realizar la comparacin prctica. Reportar los valores de pH obtenidos en la prctica y tericamente en una tabla. SOLUCION DE: PROBLEMA 1 2 3 pH ESCALA COLORIMETRICA pH POTENCIOMETRO

TAREA: TRAER PARA LA PRCTICA SIGUIENTE MUESTRAS DE LECHE BRONCA Y DE DISTINTAS MARCAS DE LECHE PASTEURIZADA Y ULTRAPASTEURIZADA.

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PRACTICA No 5 TITULACIN CIDO - BASE Y DETERMINACIN DE LA ACIDEZ EN LA LECHE OBJETIVOS: Al trmino de la prctica el alumno ser capaz de: 1.- Determinar la normalidad aparente de un cido, titulndolo con una base cuya concentracin es conocida. 2.- Determinara la acidez o alcalinidad de diferentes muestras de leche e indicar si la leche es apta para consumo humano.

INTRODUCCIN.

La titulacin es un tipo de anlisis volumtrico mediante el cual se determina la concentracin de una sustancia en solucin utilizando otra solucin cuya concentracin se conoce. Titulacin cido-bsica: Una solucin conocida de una base puede utilizarse para determinar la concentracin de un cido y viceversa. Como es sabido, los cidos y las bases se neutralizan mutuamente: cido + base = sal + agua. Ejemplo: HCl + NaOH = NaCl + H20. Un mol de base neutraliza exactamente a un mol de cido, de tal manera que, conociendo la concentracin y el volumen de base empleados para neutralizar un volumen conocido de un cido, se puede calcular la concentracin del cido problema. Como no sera posible darse cuenta de cmo ocurre esta reaccin y en cul momento se ha neutralizado por completo la solucin problema (sa cuya concentracin se desconoce), se requiere el empleo de algo que posibilite su observacin; por ejemplo, una sustancia que cambie de color al variar el pH de la solucin que la contiene (indicador de pH). La titulacin cido-bsica puede efectuarse de la manera siguiente: la solucin tipo o estndar (solucin cuya concentracin se conoce) se coloca en una bureta. Al leer la graduacin debe tomarse como referencia el nivel inferior del menisco (parte ms convexa) cuando se emplean lquidos transparentes, y el nivel superior cuando se trata de lquidos opacos. El ojo del observador debe estar al nivel del menisco para evitar errores de paralaje. La solucin problema se coloca en un matraz Erlenmeyer. Se le aaden unas gotas de indicador de pH, el cual le dar un color caracterstico. Por ejemplo, el rojo de fenol es de color amarillo en solucin cida y de color rojo en solucin alcalina. As, si se tiene un cido fuerte cuya concentracin se desconoce, se le agrega rojo de fenol y se aade gota a gota una solucin bsica de concentracin conocida, llegar un momento en el que el color no ser amarillo ni rojo, sino un color intermedio correspondiente a una solucin neutra. La solucin tipo debe dejarse caer gota a gota sobre la solucin problema, al tiempo que se agita el matraz. Es conveniente colocar debajo del matraz que contiene la solucin problema una hoja de papel blanco, para observar el cambio de coloracin (punto de vire). Acidez y pH. Existen dos maneras de expresar la acidez de una solucin. La primera es la + acidez total o titulable. La segunda es la concentracin de iones hidrgeno (H ) libres en solucin. Por ejemplo, una solucin 1 N de cido benzoico tiene la misma acidez total que una de cido clorhdrico 1 N, pero esta ltima tiene una concentracin de iones hidrgeno libres que es cerca de 100 veces ms grande que la primera (por qu?).

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Srensen (1909) adopt el trmino pH como una medida de la concentracin de iones hidrgeno y lo defini como el logaritmo (base 10) negativo de la concentracin de iones + + hidrgeno, expresada en moles por litro: pH = log10 1/[H ] = - log10 [H ]. Clculos estequiomtricos. La unidad prctica usada en los clculos de estequiometra es el miliequivalente (mEq: milsima parte de un equivalente). Un mililitro (ml) de una solucin 1 N contiene un miliequivalente de soluto. Esta es una unidad prctica y conveniente ya que se puede calcular el nmero de mili equivalentes de soluto en una solucin dada, multiplicando simplemente su normalidad (mEq/ ml) por el volumen (en ml). Por ejemplo, 25.0 ml de NaOH 0.080 N contienen 25.0 x 0.080 = 2 mEq de NaOH. Ya que un miliequivalente de cido equivale qumicamente a un miliequivalente de base, la siguiente relacin resulta obvia: Normalidad1 x Volumen1 = mEq = Normalidad2 x Volumen2 y en forma abreviada: N1 x V1 = N2 x V2. La ecuacin anterior puede utilizarse en la resolucin de problemas como el que a continuacin se plantea: 25.0 ml de NaOH 0.080 N fueron neutralizados exactamente con 32.0 ml de una solucin de HCl. Cul es la normalidad de la solucin de cido? Dado que N1 x V1 = N2 x V2, entonces N1 = (N2 x V2)/V1 = (25.0 x 0.080)/32 = 0.0625 N Determinacin de la Acidez de la Leche.

La prueba se basa en la saturacin de las funciones cidas de la leche mediante un lcali, en presencia de un reactivo indicador cuyo color descubre el final de la reaccin. Estequiometra. El nmero de mililitros (ml) gastados de NaOH 0.1 N se puede transformar en partes de cido lctico por volumen de leche multiplicndolo por 0.009, factor que representa la cantidad de cido neutralizada por un ml de sosa 0.1 N. Ejemplo: se gastaron 2.2 ml de NaOH 10 N para titular 10 ml de leche. Entonces, la leche contiene 2.2 x 0.009 = 0.0198 partes de cido Lctico 10 ml, o bien, 0.198 partes en 100 ml, o bien, 1.98 partes en 1,000 ml. El Reglamento de la Secretara de Salud establece que la leche apta para su consumo debe tener, en cuanto a acidez en cido lctico, no menos de 1.4 ni ms de 1.7 por mil.

METODOLOGA. Experimento #1: Titulacin de un cido fuerte con una base fuerte. Materiales. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, matraz Erlenmeyer, vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solucin de cido clorhdrico (problema), solucin de hidrxido de sodio 0.1 N, solucin de azul de bromotimol. Procedimiento. Medir exactamente 10.0 ml de una solucin problema de cido clorhdrico y verterlos a un matraz Erlenmeyer. Aadir tres gotas de azul de bromotimol. Titular con NaOH 0.1 N hasta el punto final. Calcular la normalidad aparente del cido.

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Experimento #2: Titulacin de un cido dbil con una base fuerte. MATERIALES. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, matraz Erlenmeyer, vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solucin de cido actico (problema), solucin de hidrxido de sodio 0.1 N, solucin de fenolftalena. PROCEDIMIENTO. Medir exactamente 10.0 ml de una solucin problema de cido actico y verterlos a un matraz Erlenmeyer. Aadir tres gotas de fenolftalena. Titular con NaOH 0.1 N hasta el punto final. Calcular la normalidad aparente del cido.

Experimento # 3: Determinacin de la Acidez de la Leche. MATERIALES. Soporte universal, bureta, embudo de vidrio, cpsula de porcelana, agitador de vidrio, vasos de precipitado, pipetas de Mohr, solucin de hidrxido de sodio 0.1 N, solucin de fenolftalena al 1% en alcohol, muestra (s) de leche. PROCEDIMIENTO 1. Llenar la bureta con la solucin de NaOH 0.1 N. 2. Mezclar perfectamente la leche que va a ser estudiada (bronca, pasteurizada o ultrapasteurizada. 3. Transferir 10 ml de leche a la cpsula de porcelana. 4. Aadir tres gotas de solucin de fenolftalena a la muestra de leche. Mezclar. 5. Aadir gota a gota a la cpsula de porcelana la solucin de NaOH que contiene la bureta, agitando constantemente. La prueba termina cuando se obtiene un color rosa o salmn en la leche. 6. Repetir el procedimiento con todas las muestras de leche.

RESULTADOS Calcular la acidez en cido lctico (partes por 1,000 ml) de cada una de las muestras. Cumple(n) la(s) leche(s) con el reglamento sanitario?

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PRACTICA NO. 6 PREPARACIN DE UN BUFFER Y SU ACCION AMORTIGUADORA OBJETIVO. Preparar una solucin buffer y observar su accin amortiguadora en material biolgico. INTRODUCCIN. La definicin ms general de una solucin amortiguadora o buffer es que son soluciones que resisten mucho los cambios de pH cuando se les aaden cidos o bases. Casi siempre estn formadas por cidos dbiles y sus sales. Al agregar iones de hidrgeno en forma de un cido fuerte a una solucin amortiguadora, descompone la sal de la mezcla buffer y se forma un cido dbil que se disocia poco a poco y por lo tanto no modifica el pH en forma significativa. Cuando se aade a la misma solucin amortiguadora iones OH en forma de una base fuerte, reacciona con el cido de la mezcla buffer y se forma agua y una sal disociada, que tampoco determina una notable variacin del pH. Ejemplo: Se tiene una solucin amortiguadora formada por un cido dbil, cido actico y su base conjugada (acetato de sodio) en solucin, el cido actico esta dbilmente ionizado y el acetato de sodio esta fuertemente ionizado: CH3COOH CH3COONa
-

H + Na +

CH3COO CH3COO

La mayor parte de los iones CH3COO provienen del acetato de sodio si se le aade un cido fuerte por ejemplo HCl la reaccin que ocurre es la siguiente: Na + CH3COO + H + Cl Na + Cl + CH3COOH Si a ese sistema se le aade una base fuerte por ejemplo NaOH se le da la siguiente ecuacin: H+ + CH3COO- + Na+ + OHCH3COONa + H2O
+ + + -

Por lo anterior se asume que el cambio de pH es mnimo. El pH de cualquier sistema amortiguador puede calcularse con la ecuacin de HendersonHasselbalch. pH = pKa + log (CH3COO-/CH3COOH)

Las sustancias amortiguadoras o buffers tienen un papel importante para la regulacin del pH en los medios biolgicos celulares y extracelulares. Su funcin es reducir al mnimo los cambios en la concentracin de iones hidrgeno y por lo tanto, tambin en la concentracin de iones hidroxilo, cuando se agregan pequeas cantidades de cidos o bases.

Para describir un sistema amortiguador se requieren dos parmetros: 1.- El pH de la solucin amortiguadora: El cual indica la regin de concentracin del in hidrgeno en el cual se realiza el efecto amortiguador (alrededor de +/- una unidad de pH amortiguador).

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2.- La Capacidad Amortiguadora: Es decir, la capacidad de resistir la adicin de cido o base con poco cambio de pH, lo que se relaciona de manera directa con la concentracin de todos los constituyentes del amortiguador. Para que los procesos bioqumicos del cuerpo se produzcan en forma adecuada es necesario que la concentracin de iones hidrgeno se controle con extrema precisin. Por ejemplo, el pH de la sangre se encuentra dentro de los limites de 7.3 - 7.5 siendo regulado por el sistema amortiguador bicarbonato/ cido carbnico. Otro sistema importante son los grupos laterales de la histidina en la hemoglobina. En la saliva el sistema cido Carbnico /Bicarbonato y Fosfato. Algunos amortiguadores y los rangos de pH en que actan son los siguientes:

Fosfato cido de potasio. Acetato de sodio. Ftalato cido de potasio. Fosfato cido de potasio. cido brico. cido brico. Fosfato disdico.

Amortiguador. cido clorhdrico. cido actico. Hidrxido de sodio. Hidrxido de sodio. Borato de sodio. Hidrxido de sodio. Hidrxido de sodio.

PH aproximado. 1.8 3.8 3.6 5.6 4.0 6.0 5.8 7.8 7.5 9.5 8.2 10.2 10.5 12.0

MATERIAL Y REACTIVOS. 4 vasos de precipitado de 100 ml 2 pipetas de 10 ml 4 pipetas de 5 ml 6 tubos de ensaye 1 gradilla 2 pipetas Pasteur con bulbo 1 Vaso de precipitado de 250 ml 1 Potencimetro 100 ml. de KH2PO4 0.15 M. 100 ml. de Na2HPO4 0.15 M. NaOH 0.1 M HCl 0.1 M Albmina de huevo al 2 %, 75 ml Agua destilada

PROCEDIMIENTO. I.- PREPARACIN DE LA SOLUCION BUFFER. En un vaso de precipitado de 250 ml colocar 77 ml de la solucin de KH2PO4 0.15 M. Aadir 49 ml de la solucin de Na2HPO4 0.15 M y medir con el potencimetro hasta obtener un pH de 7.0 (Si es necesario regular utilice cualquiera de las dos soluciones para lograr el pH solicitado. Guarde su solucin buffer para el experimento nmero dos.

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II.- ACCIN AMORTIGUADORA DEL BUFFER PREPARADO Y UN BUFFER BIOLGICO. Poner en una gradilla dos series de tubos numerados del 1 al 6, seguir con las indicaciones dadas por la siguiente tabla: TUBO No. 1 2 3 4 5 6 SOLUCION A COLOCAR 10 ml H2O destilada 10 ml solucin buffer preparada 10 ml albmina de huevo 10 ml H2O destilada 10 ml solucin buffer preparada 10 ml de albmina de huevo PH INICIAL ADICIONAR 4 gotas HCl 0.1 N 4 gotas HCl 0.1 N 4 gotas HCl 0.1 N 4 gotas de NaOH 0.1 N 4 gotas de NaOH 0.1 N 4 gotas de NaOH 0.1 N pH FINAL

1.- Realizar primero la medicin del pH de las soluciones que se indican en el tubo 1 al 6 antes de agregar el HCl y el NaOH. 2.- Despus con el mismo potencimetro determinar la capacidad amortiguadora de cada solucin midiendo el pH final despus de la adicin del cido y la base fuerte.

PRESENTACION DE RESULTADOS. a) Del experimento I, reportar el pH obtenido para la solucin buffer preparada. b) Del experimento II, reportar el pH inicial y final obtenido para cada tubo y explicar sus resultados obtenidos.

CUESTIONARIO. 1.- Por qu el agua destilada observa mayor alteracin de pH?. 2.- Por qu considera que la albmina de huevo debe tener propiedades amortiguadoras?. 3.- Que papel desempean las soluciones buffer dentro de la bioqumica? (En general. 4.- Qu sucede cuando en un sistema amortiguador la concentracin molar de la sal y el cido que integran la solucin son iguales?.

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PRACTICA NO. 7 PROPIEDADES QUMICAS DE CARBOHIDRATOS

OBJETIVO Caracterizar, hasta donde sea posible, un carbohidrato problema mediante algunas pruebas qumicas cualitativas.

INTRODUCCIN. Los azcares se comportan como cidos dbiles y tienen las caractersticas qumicas de aldehdos o cetonas. Por ello, los lcalis aumentan la enolizacin de los azcares. La tautomerizacin es una reaccin tpica de azcares, los cuales contienen un grupo aldehdo libre o un grupo cetnico. En ausencia de lcali existe un equilibrio entre las formas enlicas y cetnicas, predominando estas ltimas. Cuando se les aade lcali, los enoles cidos forman una sal y, por efecto de la accin de masas, se desplaza el equilibrio hacia la derecha. La adicin de cido a una mezcla en equilibrio alcalino, restablece el equilibrio tautomrico hacia la forma cetnica. Otra reaccin importante es la que ocurre entre el grupo carbonilo y un alcohol, formando hemiacetales y acetales. Un monosacrido posee ambos grupos funcionales (carbonilo y alcohol) en su molcula y puede reaccionar con otros azcares. La reaccin puede ocurrir tambin dentro de una misma molcula de azcar, dando paso a la formacin de hemiacetales cclicos. Ahora bien, muchas de las propiedades de los azcares simples slo pueden ser explicadas suponiendo la formacin del anillo, siendo sta la forma ms estable de las molculas. Los lcalis disminuyen la formacin del anillo al favorecer la formacin de la sal enlica.

PARTE EXPERIMENTAL Para el desarrollo de los siguientes experimentos se utilizarn soluciones de glucosa, fructosa, galactosa, sacarosa, maltosa, lactosa y almidn, a una concentracin de 1 % (p/v).

A. PRUEBA DE MOLISH. Objetivo. Detectar la presencia de carbohidratos. Reactivos. Reactivo de Molish (sol. de alfa-naftol en etanol, al 95%) y cido sulfrico concentrado. Fundamento. La reaccin depende de la formacin de furfural y sus derivados por la accin deshidratante del cido sobre un carbohidrato. El furfural se combina con el alfa-naftol para formar un compuesto coloreado. Aunque no es una prueba especfica, un resultado negativo (ausencia de color) sugiere la ausencia de carbohidratos. Procedimiento. A 0.5 mililitro (ml) de cada una de las soluciones que van a ser probadas, aada 1 gota del reactivo de Molish. Agite los tubos. En cada caso, incline el tubo y aada, de manera lenta y cuidadosa, 0.75 ml de cido sulfrico concentrado (15 gotas). Resultado positivo. Aparicin de un color violeta en la unin entre los lquidos.

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B. PRUEBA DE BENEDICT. Objetivo. Deteccin de azcares reductores. Fundamento. Las soluciones alcalinas de cobre son reducidas por azcares que poseen un grupo aldehdo o cetnico libre y se forma xido cuproso insoluble. Reactivo. Solucin de Benedict (contiene sulfato cprico, carbonato de sodio y citrato de sodio). Procedimiento. A 1.25 ml de solucin de Benedict aada exactamente 0.25 ml de cada una de las soluciones que van a ser probadas. Sumerja los tubos en un bao de agua hirviente durante 5 minutos. Posteriormente, permita que se enfren lentamente. Observe el color y si se forma un precipitado. Un cambio en el color de la solucin no indica un resultado positivo. Deber producirse un precipitado de color amarillo, verde o rojo.

C. PRUEBA DE BARFOED. Objetivo. Detectar monosacridos en presencia de disacridos Fundamento. La reaccin de Barfoed difiere de la de Benedict en que la reduccin ocurre en medio cido. IMPORTANTE: Los disacridos tambin respondern a la prueba si la solucin de azcares es hervida durante un tiempo suficiente para producir hidrlisis. Reactivos. Reactivo de Barfoed: Contiene sulfato cprico y cido lctico disueltos en agua. Procedimiento. Coloque en un tubo de ensaye 0.25 ml de la solucin problema y 0.25 ml de la solucin de Barfoed (hacerlo para todas las soluciones que se van a probar). Prepare un tubo control: 0.25 ml de agua ms 0.25 ml de la solucin de Barfoed. Sumerja los tubos en un bao de agua hirviente durante 3 minutos. Permita que se enfren. Aada a cada tubo 0.25 ml del reactivo de cido fosfomolbdico. Agite los tubos. Resultado positivo. Un color azul oscuro es indicativo de la presencia de monosacridos.

D. PRUEBA DE SELIWANOFF. Objetivo. Deteccin de cetosas. Fundamento. Esta prueba depende de la formacin del 4-hidroximetil-furfural y de su reaccin posterior con el 1,3-dihidroxibenceno (resorcinol), de la que resulta un compuesto de color rojo cereza. En general, la prueba es especfica para cetosas; sin embargo, grandes cantidades de glucosa u otros azcares pueden interferir produciendo compuestos de color similar. Reactivo. Reactivo de Seliwanoff: Contiene resorcinol disuelto en cido clorhdrico. Procedimiento. A 0.5 ml del reactivo de Seliwanoff aada 1 gota de cada una de las soluciones que van a ser probadas. Sumerja los tubos en agua hirviente durante 2 minutos. Observe el color que se desarrolla. Si se produce un precipitado, fltrelo y disulvalo en etanol, el cual, en caso de un resultado positivo, debe adquirir color rojo. Resultado positivo. Un color rojo cereza es indicativo de la presencia de cetosas.

RESULTADOS Construya una tabla con los resultados obtenidos con las diferentes soluciones (incluyendo la solucin problema) en las diferentes pruebas.

DISCUSIN Para cada una de las soluciones problema conteste las siguientes preguntas 1. Contiene carbohidratos? 2. Si la respuesta anterior es afirmativa, a. Se trata de un carbohidrato reductor? b. Es un monosacrido? c. Es una cetosa?

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PRACTICA NO. 8 PREPARACION DE UNA CURVA PATRON PARA GLUCOSA

OBJETIVOS Al finalizar esta prctica, el alumno sabr: 1.- Preparar una curva patrn para glucosa. 2.- Determinar la concentracin de glucosa de una solucin problema, interpolando la curva patrn.

INTRODUCCIN Una curva patrn se construye al graficar valores conocidos de concentracin de una sustancia de inters contra las unidades obtenidas al aplicar a dicha sustancia un mtodo qumico cuantitativo. Por ejemplo, en un medio alcalino la glucosa reduce al cobre cprico, para formar oxido cuproso insoluble el cual, a su vez, puede reducir al arsenomolibdato formndose un in colorido. La intensidad del color depende de la cantidad de glucosa presente; la absorbencia de dicha solucin puede determinarse colorimtricamente. Al graficar la absorbencia medida versus concentraciones conocidas de glucosa se construye de una curva patrn. Ahora bien, si se tiene una solucin problema de glucosa se le puede someter al mismo procedimiento que a las soluciones de concentracin conocida. Posteriormente, la absorbencia de la solucin problema puede interpolarse en la curva patrn para determinar su concentracin. Bases qumicas: Al hacer reaccionar glucosa (agente reductor) con hidrxido cprico en medio alcalino, se forma oxido cuproso (color rojo). El xido cuproso es insoluble y se precipita, por lo que no puede valorarse colorimtricamente. Cuando se aade a esta solucin fosfomolibdato, ste se reduce a un in de color azul cuya absorbencia puede medirse con un colormetro. GLUCOSA (agente reductor) + + Reactivo de cobre (Cu ) incubacin e
-

Oxido cuproso + Fosfomolibdato

Compuesto coloreado en proporcin a la concentracin a la concentracin (medible colorimetricamente)

agua destilada

compuesto coloreado con volumen adecuado para medicin calorimtrica.

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MATERIAL Y REACTIVOS: a). Reactivos: b). Aparatos: 1.- Solucin patrn de glucosa (20mg/100 ml) 1.- Espectrofotmetro. 2.- Reactivo de cobre estabilizado en medio 2.- Recipiente con agua a ebullicin. alcalino. 3.- Reactivo de fosfomolibdato. 4.- Solucin de glucosa de concentracin desconocida (problema)

PROCEDIMIENTO 1.- Disponga 6 tubos de ensaye de la manera siguiente: TUBO 1 blanco. Patrn de 0 glucosa (ml) Agua 1.0 destilada (ml) Reactivo de 1.0 cobre (ml) Sol. 0 problema (ml) 2 0.25 0.75 3 0.50 0.50 4 0.75 0.25 5 1.0 0 6 problema. 0 0

1.0 0

1.0 0

1.0 0

1.0 0

1.0 1.0

Agitar e incubar durante 20 minutos a ebullicin, permita que los tubos se enfren. Reactivo de 1.0 fosfomolibda to (ml) Agua 9.5 destilada (ml) 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

9.5

9.5

9.5

9.5

9.5

2.- Agite los tubos. Determine la absorbencia a 540 nm. 3.- Dibuje la curva patrn: grfica de absorbencia vs. concentracin de glucosa (microgramos/ ml). RESULTADOS Interpole la absorbencia de la solucin problema en la curva patrn, para determinar la concentracin de glucosa.

CUESTIONARIO 1.- Que es una curva patrn?. 2.- Que utilidad tiene? 3.- Como se interpola un valor? 4.- Cul es el efecto de la glucosa sobre el reactivo de cobre?.

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PRACTICA NO.9 SEPARACION DE AMINOACIDOS POR CROMATOGRAFIA EN PAPEL

OBJETIVO: Separar una mezcla de compuestos qumicamente semejantes para su identificacin.

INTRODUCCION: En 1903 el botnico ruso M. T. Sweet elabor la primera tcnica para separar distintos componentes coloreados de un extracto vegetal. A esta tcnica se la ha dado el nombre de cromatografa debido a que la separacin de las sustancias dan diferentes colores. Existen diferentes tipos de cromatografa. La cromatografa en papel es una forma sencilla que ha llegado a ser un instrumento analtico extraordinariamente valioso para el qumico orgnico y para el bioqumico. En esta tcnica se emplea papel filtro, una gota de solucin que contiene la muestra y que se coloca en cierto punto sobre el papel de donde hay una migracin como resultado de flujo por una fase mvil. El movimiento de la fase mvil es causado por fuerzas capilares. La gravedad tambin contribuye al movimiento. Puede decirse que la cromatografa en papel es un tipo de cromatografa por particin en el que la fase estacionaria es agua absorbida sobre la superficie hidroflica del papel. Un disolvente orgnico acta como fase mvil. Por tratamiento apropiado del papel, el agua puede ser sustituida por una fase lquida estacionaria no polar; pueden usarse soluciones acuosas como reveladores. En otra variacin, el papel es impregnado con slice anhidra o una resina de intercambio de iones. La trayectoria de una muestra se puede describir en funcin de su factor de retardo o relacin al frente que se define como: Factor de retardo = Rf = Distancia del movimiento del soluto

Distancia del movimiento del solvente Para compensar las variables intercontroladas, la distancia recorrida por un soluto se compara frecuentemente con la de una sustancia estndar en idnticas condiciones. La cromatografa presta valiosa ayuda en el anlisis de sustancias complejas como protenas, tierras raras, etc. MATERIAL Y REACTIVOS:

2 tiras de papel filtro 2 frascos con disolvente y tapa 1 parrilla elctrica

Muestras de aminocido: (leucina y cido asprtico) Solucin disolvente (butanol: cido actico: agua, 4:1:1) Solucin reveladora de ninhidrina

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PROCEDIMIENTO: 1.- En un extremo del papel filtro, hacer dos pequeas marcas con lpiz a un extremo del borde y separarlas entre s una distancia de un centmetro. 2.- Poner una gota en una de las marcas sealadas del aminocido No. 1. 3.- Repetir la operacin con una gota del aminocido No. 2.

4.- En otro papel colocar una gota de una mezcla de los aminocidos. 5.- Introduzca las tiras de papel filtro en un frasco o vaso que contenga la mezcla del solvente (utilice un frasco para cada tira). 6.- Deje avanzar el frente del solvente hasta aproximadamente 1 cm antes de que llegue al borde superior. 7.- Una vez seco el papel, rociar con solucin de ninhidrina (revelador especfico) para aminocido. Dejar secar nuevamente. 8.- Calentar las hojas de papel filtro en una parrilla elctrica (tener cuidado de no quemarlas) hasta la aparicin de manchas coloreadas. Ellas representan el sitio donde se encuentran los aminocidos que reaccionaron con la ninhidrina.

RESULTADOS: 1.- Medir la distancia desde el punto de colocacin de la solucin de los aminocidos al centro de las manchas (d). 2.- Medir la distancia del sitio de colocacin de los aminocidos al sitio donde lleg el solvente (D). 3.- Calcular el Rf para cada aminocido, de acuerdo a la siguiente frmula: Rf = d/ D 4.- El Rf se calcular para cada uno de los aminocidos individuales y para la mezcla. 5.- Identificar cada aminocido. 6.- Cual corri ms y por que?.

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PRACTICA NO.10 DETERMINACION DE PROTEINA POR EL METODO DE BIURET

OBJETIVO: Determinar fotocolorimetricamente la concentracin de protena de una solucin problema, usando una curva estndar. FUNDAMENTO:

ESPECTROFOTOMETRA DE BIOMOLCULAS. t Tomado de: Boyer, R.F.: Modern Experimental Biochemistry, 1s ed., Benjamin/Cummings, Menlo Park, CA, 1986, pp. 145-157. Algunas de las primeras mediciones experimentales sobre las biomolculas incluan un estudio de sus interacciones con la luz. Las observaciones iniciales mostraron que cuando la luz incide sobre una solucin, ocurren por lo menos dos procesos distintos: la dispersin y la absorcin de luz. Ambos fenmenos constituyen ahora la base de algunas tcnicas tiles para analizar y caracterizar biomolculas. En el caso de algunas biomolculas, el proceso de absorcin de luz es seguido por la emisin de luz de una diferente longitud de onda. Este proceso, llamado fluorescencia, depende de la estructura molecular y de factores ambientales y sirve como una valiosa herramienta para la caracterizacin y el anlisis de molculas y procesos dinmicos biolgicamente significativos. Otra tcnica que involucra las molculas y la luz es la polarimetra. En este caso se estudia la interaccin de la luz polarizada en un plano con molculas pticamente activas. A. Principios bsicos de la espectrofotometra de absorcin. El espectro electromagntico est formado por un continuo de ondas con propiedades diferentes. Las regiones de importancia primaria en bioqumica incluyen la luz ultravioleta (UV, 180320 nm) y la luz visible (320-800 nm). La luz en estas regiones del espectro tienen la energa suficiente para excitar los electrones de valencia de las molculas. La longitud de onda de la luz, definida por la ecuacin (1) es la distancia entre las crestas de ondas adyacentes. = c/v donde (1)

= longitud de onda c = velocidad de la luz v = frecuencia, nmero de ondas que pasan por cierto punto por unidad de tiempo. La luz tambin se comporta como si estuviera formada por partculas energticas. La cantidad de energa, E, asociada con estas partculas (o fotones), est dada por la ecuacin E = hv en la que h = constante de Planck Cuando un fotn de cierta energa interacciona con una molcula, puede ocurrir uno de dos procesos. El fotn puede ser desviado (dispersado), o puede transferir su energa a la molcula, produciendo un estado de excitacin de la misma. (2)

La dispersin de la luz es la base fsica de varios mtodos experimentales empleados para caracterizar macromolculas. Antes del desarrollo de la electroforesis, las tcnicas de dispersin

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de la luz eran utilizadas para determinar las masas moleculares ("pesos" moleculares) de macromolculas. Las tcnicas de difraccin de rayos X, microscopa electrnica, dispersin de luz lser, y dispersin de neutrones dependen en alguna medida del proceso de dispersin de la luz. El otro proceso mencionado lneas arriba, la transferencia de la energa de un fotn a una molcula, es la absorcin. Para que un fotn sea absorbido, su energa debe ser igual a la diferencia de energa entre dos niveles energticos de la molcula. Las molculas poseen un conjunto de niveles cuantizados de energa. Aunque son posibles varios estados, para los fines presentes consideraremos slo dos estados electrnicos: un estado basal (B) y el primer estado excitado (S1). Estos dos estados difieren en la distribucin de los electrones de valencia. Cuando los electrones son promovidos de un orbital en estado basal B a un orbital de mayor energa (en S1), se dice que ocurre una transicin electrnica. La energa asociada con la luz ultravioleta y la luz visible es suficiente para promover a las molculas de un estado electrnico a otro, esto es, desplazar electrones de un orbital a otro. En cada nivel energtico electrnico existe un conjunto de niveles vibracionales. Estos representan cambios en el estiramiento y doblamiento de los enlaces covalentes. Las transiciones entre estos niveles son la base de la espectroscopa infrarroja. La transicin electrnica de una molcula de B a S1, tiene una elevada probabilidad de ocurrir si la energa del fotn se corresponde con la energa necesaria para promover un electrn del nivel energtico E1 al nivel energtico E2: E2 - E1 = hc/ (3)

Puede ocurrir una transicin desde cualquier nivel vibracional en B a algn otro estado vibracional en S1. Empero, no todas las transiciones tienen la misma probabilidad. La probabilidad de absorcin es descrita por la mecnica cuntica. Un espectro UV-visible se obtiene midiendo la luz absorbida por una muestra como funcin de la longitud de onda. Como las molculas de la muestra slo pueden absorber "paquetes" discretos de energa (longitudes de onda especficas) tericamente el espectro debe estar formado por lneas discretas. Sin embargo, los numerosos niveles vibracionales de cada nivel energtico electrnico incrementa el nmero de transiciones posibles. Esto da como resultado un espectro de picos amplios. Un espectro de absorcin puede ayudar en la identificacin de una molcula, ya que la longitud de onda de absorcin depende de los grupos funcionales o del arreglo de los tomos en la molcula. A lo largo de un espectro de absorcin pueden encontrarse picos de absorcin mxima o zonas de mnima absorcin. Un segundo parmetro evaluado en la espectroscopa de absorcin es la eficiencia o grado de absorcin a determinadas longitudes de onda. Este parmetro es tradicionalmente llamado coeficiente de extincin. Es definido por la ley de Beer-Lambert: A = EBC (4)

donde A = absorbencia = - log I/I0 I0 = intensidad de luz que irradia a la muestra I = intensidad de luz transmitida a travs de la muestra E = coeficiente de extincin del material absorbente b = recorrido de la luz a travs de la muestra (espesor de la celdilla) c = concentracin del material absorbente en la muestra Como la absorbencia, A, deriva de un cociente (-log I/I0), no tiene unidades; por lo tanto, las unidades de E dependen de las unidades de b y c. E es ms convenientemente utilizado en forma de coeficiente de extincin molar, , definido como la absorbencia de una solucin 1.0 M de

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la sustancia absorbente pura en una celdilla de 1 cm bajo condiciones especficas de longitud de onda y solvente. B. Instrumentacin para medir la absorcin de luz UV-visible El espectrofotmetro es utilizado para medir experimentalmente la absorbencia. Este instrumento produce luz de una longitud de onda preseleccionada, la dirige a travs de la muestra (usualmente disuelta en un solvente y colocada en una cubeta) y mide la intensidad de la luz transmitida por la muestra. Sus componentes principales son: una fuente de luz, un monocromador (que incluye diversos filtros, rejillas y espejos), una cmara para la muestra, un detector y un registrador. Fuente luminosa. Para mediciones de absorcin en la regin UV se usa una lmpara de hidrgeno a alta presin o de deuterio. Estas lmparas producen radiacin en el rango de 200 a 300 nm. La fuente de luz para la regin visible es la lmpara de tungsteno, con un rango de longitudes de onda de 320 a 800 nm. Los instrumentos con ambos tipos de lmpara tienen mayor flexibilidad y pueden ser empleados para estudiar la mayora de las molculas biolgicamente significativas. Monocromador. Las dos lmparas mencionadas producen emisiones continuas de todas las longitudes de onda dentro de su rango. Por tanto, un espectrofotmetro debe poseer un sistema ptico para seleccionar luz monocromtica (luz de una longitud de onda especfica). Los instrumentos modernos utilizan un prisma o, ms a menudo, rejillas de difraccin para producir la longitud de onda deseada. Debe notarse que la luz emitida por el monocromador no es completamente de una sola longitud de onda, sino que es realzada en dicha longitud de onda. Esto es, la mayor parte de la luz es de una sola longitud de onda, pero estn presentes longitudes de onda ms cortas y ms largas. Antes de que la luz monocromtica incida sobre la muestra, pasa a travs de una serie de hendiduras, lentes, filtros y espejos. Este sistema ptico concentra la luz, aumenta la pureza espectral y la enfoca hacia la muestra. El operador de un espectrofotmetro tiene poco control sobre la manipulacin ptica del haz luminoso, excepto en el ajuste de la anchura de la rejilla. La luz que pasa del monocromador a la muestra encuentra una "ventana" o hendidura. En algunos instrumentos sta est ajustada para que pase un haz de luz de cierta anchura. Los instrumentos ms costosos tienen hendiduras variables, lo que permite al operador controlar su anchura. La anchura de la rejilla determina la intensidad de la luz que incide sobre la muestra y su pureza espectral. Al disminuir la anchura de la hendidura, aumenta la pureza espectral de la luz, pero disminuye la cantidad de luz dirigida hacia la muestra. En este caso, el factor limitante es la eficiencia o sensibilidad del detector. Establecer la anchura apropiada de la hendidura requiere un equilibrio entre la pureza espectral y la sensibilidad del detector. Cmara de la muestra. La luz monocromtica procesada es entonces dirigida hacia una cmara de muestra, que puede acomodar una amplia variedad de porta muestras. La mayora de las mediciones UV-visible se hacen en soluciones de las molculas de inters. La muestra es colocada en un tubo o cubeta de vidrio, cuarzo, u otro material transparente. Las cubetas de vidrio son las menos costosas, pero, como absorben luz UV, pueden ser usadas slo a longitudes de onda superiores a 320 nm. El cuarzo o slice fundido debe ser empleado en el rango UV (200-320 nm). La calidad y condiciones de las cubetas son factores crticos en la espectrofotometra. Las cubetas de alta calidad son muy costosas y deben ser objeto de un mantenimiento cuidadoso.

Los espectrofotmetros ms baratos son instrumentos de "un solo haz" que permiten la insercin de una sola cubeta a la vez en el porta cubetas. Este es el caso del Coleman Modelo 6/35, del Bausch & Lomb Modelo 20 o del Seqoia-Turner Modelo 340. Los instrumentos ms sofisticados son de "doble haz" y aceptan dos cubetas a la vez: una que contiene la muestra disuelta en el solvente y otra que contiene solvente puro.

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Con frecuencia los espectrofotmetros son usados para monitorear velocidades de reacciones qumicas. Cuando se efectan estas mediciones la cubeta que contiene la muestra debe tener una temperatura constante. Muchas cmaras de muestra permiten la circulacin de un lquido cuya temperatura es constante, alrededor del porta cubetas. Detector. La intensidad de la luz que pasa a travs de la muestra en estudio depende de la cantidad de luz que es absorbida por la misma. La intensidad es medida por un detector fotosensible, generalmente un tubo foto multiplicador (TFM). El TFM detecta una pequea cantidad de energa luminosa, la amplifica mediante una cascada de electrones acelerados por dnodos, y la convierte en una seal elctrica que puede ser transferida al registrador. Registrador. Los instrumentos menos costosos dan una lectura directa de absorbencia y/o transmitencia en forma anloga o digital. Estos instrumentos son apropiados para mediciones a una sola longitud de onda; sin embargo, si se desea un "barrido" de absorbencia vs. longitud de onda, entonces debe utilizarse un registrador. Algunos espectrofotmetros estn equipados con un registrador de pluma. El rango de absorbencia de la mayora de los registradores es de 0 a 1, pero los instrumentos ms costosos pueden ser utilizados a niveles superiores de absorbencia (1-2) o niveles inferiores, de mayor sensibilidad (0-0.1, 0-0.01, etc.). C. Aplicaciones de la espectrofotometra de absorcin Ahora que estamos familiarizados con la teora y la instrumentacin de las espectrofotometra de absorcin, podremos comprender ms fcilmente el funcionamiento y las aplicaciones tpicas de un espectrofotmetro. Como virtualmente todas las mediciones UV-visible se hacen en muestras disueltas (en solventes adecuados), slo se mencionarn estas aplicaciones. Aunque pueden hacerse muchos tipos diferentes de operaciones con un espectrofotmetro, todas las aplicaciones caen en una de dos categoras: a) medicin de la absorbencia a una longitud de onda fija; y, b) medicin de la absorbencia en funcin de la longitud de onda. Para las mediciones de absorbencia a una longitud de onda fija con un instrumento de "un haz", se coloca una cubeta que contiene el solvente puro y se ajusta la absorbencia a "cero". Una cubeta que contenga solvente ms muestra se coloca entonces en la cmara, y su absorbencia es leda directamente del registrador. El ajuste a cero con el solvente puro ("blanco") permite obtener la lectura directa de la absorbencia de la muestra. Un espectro de absorcin de un compuesto puede obtenerse "barriendo" un rango de longitudes de onda y graficando la absorbencia obtenida a cada longitud de onda. La mayora de los espectrofotmetros de "doble haz" recorren automticamente el rango deseado de longitudes de onda y registran la absorbencia como funcin de la longitud de onda. Si el solvente es colocado en la cmara de referencia y el solvente ms la muestra en la posicin de la muestra, el aparato restar automticamente a absorbencia del solvente de la absorbencia total (solvente ms muestra) a cada longitud de onda; de aqu que la grfica del registrador sea realmente un "espectro diferencial" (absorbencia de la muestra ms solvente menos absorbencia del solvente). Ambos tipos de mediciones (longitud de onda fija y espectro de absorcin) son comunes en la bioqumica, y deberamos ser capaces de interpretar los resultados de ambas.

Medicin de la concentracin de una solucin. De acuerdo con la ley de Beer y Lambert, la absorbencia de un material en solucin depende directamente de la concentracin de dicha sustancia. Comnmente se usan dos mtodos para medir la concentracin. Si se conoce el coeficiente de extincin de la especie absorbente, entonces la concentracin puede calcularse tras la medicin experimental de la absorbencia de la solucin. Sin embargo, esta aplicacin tiene limitaciones. La mayora de los espectrofotmetros son tiles para medir absorbencias con un valor mximo de 1, aunque los aparatos ms sofisticados pueden medir absorbencias tan altas como 2. Asimismo, algunas substancias no obedecen la ley de Beer y Lambert; esto es, la absorbencia no aumenta de manera lineal con la concentracin. Esto puede ocurrir con substancias que se asocian o disocian en solucin. La linearidad es fcilmente verificada preparando una serie de

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concentraciones de la especie absorbente y midiendo la absorbencia correspondiente a cada concentracin. Si la ley de Beer-Lambert es vlida, la grfica de absorbencia vs. concentracin debe ser lineal. Si no se conoce el coeficiente de extincin de una sustancia, su concentracin en solucin puede ser determinada si se conoce la absorbencia de una solucin patrn (estndar) del compuesto. Alternativamente, la concentracin de un especie en solucin puede ser determinada preparando una curva estndar (patrn) de absorbencia vs. concentracin. Identificacin de biomolculas desconocidas. El espectro UV-visible de una biomolcula revela mucho acerca de su estructura molecular. Por lo tanto, una de las primeras mediciones experimentales sobre una biomolcula desconocida debe ser el anlisis espectral. Las molculas naturales a menudo contienen grupos cromforos que tienen espectros caractersticos. El procedimiento para obtener un espectro de absorcin UV-visible comienza con la preparacin de una solucin de la especie en estudio. Una solucin estndar debe prepararse en un solvente adecuado. Se transfiere una alcuota de la solucin a una cubeta, la cual es colocada en la posicin de la muestra en la cmara del espectrofotmetro. Otra cubeta con el solvente puro es colocado en el porta cubetas de referencia. El espectro es recorrido en el intervalo deseado de longitudes de onda y se calcula el coeficiente de extincin para cada longitud de onda en la que la absorbencia es mxima.

Cuando un compuesto que contiene dos o ms grupos carbamilo, unidos directamente o separados por un solo tomo de C o N, es colocado en una solucin alcalina con sales de cobre, se forma un complejo de color violeta. Esta reaccin constituye la base de un mtodo cuantitativo de determinacin de protena. esta determinacin debe hacerse en ausencia del in NH4, el cual produce un color que causa interferencia. REACTIVOS: 1.- Solucin patrn de protena (8 mg de albmina /ml). 2.- Reactivo de Biuret. 3.- Solucin problema. APARATOS: 1.- Espectrofotmetro Baush & Lomb (Spectronic 20). 2.- Bao Mara.

METODO: 1.- Llene 6 tubos de ensayo de la manera siguiente: TUBO Sol. problema (ml) Patrn de protenas (ml) NaCl 0.9 % (ml) Reactivo de Biuret (ml) 1 blanco. 0 2 0 3 0 4 0 5 0 6 problema. 1.0

0.25

0.50

0.75

1.0

3.0 3.0

2.75 3.0

2.50 3.0

2.25 3.0

2.0 3.0

2.0 3.0

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2.- Caliente los tubos en el bao (50 C) durante 10 minutos. 3.- Enfre los tubos en agua corriente. 4.- Determine en el espectrofotmetro la absorbancia a 540 nm; ajuste a cero con el blanco (tubo # 1). 5.- Dibuje la curva patrn (absorbencia vs. concentracin de protena). 6.- Determine la concentracin de protena (mg/ml) de la solucin problema interpolando la curva patrn.

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PRACTICA NO. 11 EXAMEN QUIMICO DE ORINA

OBJETIVOS 1. El alumno comprender la importancia de la valoracin del examen qumico de orina. 2. El alumno ser capaz de entender los fundamentos de las diferentes pruebas con qumica seca para el examen qumico de orina. FUNDAMENTO El rin y su producto de eliminacin, la orina, constituyen el principal sistema en la homeostacia del organismo humano. El rin filtra, retiene o excreta diversos productos presentes en la sangre de acuerdo a la necesidad de conservarlos o eliminarlos. Cada producto presente en la orina tiene un mecanismo individual de eliminacin o de retencin; su identificacin y cuantificacin en la orina nos permite realizar evaluaciones, constituyndose el examen general de orina como un examen de rutina en la practica diaria, ya que la presencia o el aumento de estos compuestos ayudan a l diagnstico o a seguir la evolucin o evalucin de diversos padecimientos. Son numerosos los compuestos que podemos identificar y cuantificar en la orina. El examen general de orina es dividido en un examen qumico y otro microscpico de sedimento. Actualmente el EGO es realizado mediante qumica seca utilizando una tirilla que contiene una serie de parmetros, que son interpretados mediante una carta de colores y concentraciones o bien es evaluada en un urinmetro o reflectometro.

MATERIAL 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Reflectmetro. Escala de colores y concentraciones. Recipiente para colecta de orina. Tubos para anlisis de orina. Tiras reactivas para orina. Gradilla. Papel sanitario. Guantes.

MUESTRA Muestras de orina adecuadamente colectadas.

METODOLOGA Ajustarse a la metodologa del fabricante. Fabricante: Modelo del reflectmetro: Carta de colores y concentraciones.

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RESULTADOS. Identificacin de las muestras: Muestra 1 Muestra 2

Valor de Densidad: Valor de pH: Valor de Leucocitos: Valor de Nitritos: Valor de Protena: Valor de Glucosa: Valor de Cetonas: Valor de Urobilongeno: Valor de Bilirrubina: Valor de Sangre: Valor de Hemoglobina:

Valores normales: Densidad: 1.010 1.020 Leucocitos, nitritos, protena, cetonas, bilirrubinas y sangre: Negativo. pH: 5 6.5 Glucosa y urobilingeno: Negativo

CUESTIONARIO. 1. Cmo influye en el pH, el hecho de que las muestras de orina sean procesadas mucho tiempo despus (aprox. 4 horas) en el resultado? 2. Por qu razn la tira reactiva debe de ser leda en un tiempo especifico? 3. Cul es el fundamento de la prueba para la determinacin de Cetonas, Bilirrubina y Urobilingeno?

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PRACTICA No. 12 DETERMINACION CUANTITATIVA DE LA ACTIVIDAD DE AMILASA EN LIQUIDOS BIOLOGICOS

OBJETIVO Determinar cuantitativamente la actividad de amilasa en lquidos biolgicos mediante el mtodo amiloclstico iodomtrico. INTRODUCCION La amilasa producida en el pncreas excrino y en las glndulas salivales, escinde los enlaces alfa 1-4 glucosdicos de los polisacaridos (almidn y glucgeno). Se encuentra elevada en el suero de pacientes con pancreatitis aguda, alcanzando los valores ms elevados entre las 24 y 30 horas posteriores al ataque, declinando luego para volver a los niveles normales entre las 24 y 48 horas siguientes. Tambin se ve aumentada en este caso la excrecin urinaria de la enzima, persistiendo la hiperamilasuria 3 a 5 das, luego de que la actividad srica ha alcanzado los niveles normales. Tambin es posible encontrar valores aumentados en cualquier caso de abdomen agudo o intervencin quirrgica en regiones prximas al pncreas.

FUNDAMENTO El sustrato, almidn tamponado, se incuba con la muestra, producindose la hidrlisis enzimtica. Esta se detiene por el agregado de reactivo de yodo, que al mismo tiempo produce color con el remanente de almidn no hidrolizado. La disminucin de color respecto de un sustrato color (sin muestra) es la medida de la actividad enzimtica, que se expresa en Unidades Amilolticas (Smith & Roe)/ 100 ml (UA/dl), comparables con las Unidades Sacarognicas (Somogyl)/100 ml.

MATERIALES Y REACTIVOS Bao de agua agua Tubos de ensayo Micropipetas Espectrofotmetro Pipetas serolgicas Suero sanguneo u orina Solucin de almidn 500 mg/l, tamponada a pH 7 con buffer fosfatos 0.1 M en NaCl 0.15 M Reactivo de Yodo (0.01 eq/l de yodo en cido clorhdrico 0.02 M)

PROCEDIMIENTO 1. Marcar un tubo de ensaye como control (c) y otro como desconocido (d). 2. Agregar 1 ml de sustrato a cada tubo. o 3. Dejar 5 min en bao de agua a 37 C 4. Agregar 0.02 ml de la muestra al tubo marcado como desconocido o 5. Incubar a 37 C por 7 minutos y medio 6. Agregar 1 ml del reactivo de yodo a cada uno de los tubos 7. Mezclar y agregar 8 ml de agua destilada a ambos tubos 8. Mezclar por inmersin y leer la absorbancia en el espectrofotometro a 640 nm ajustando a cero con agua destilada. Nota: El color de la reaccin es estable durante 1 hr. o Si la temperatura ambiente es superior a 25 C, la lectura deber efectuarse dentro de los 20 min

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CALCULO DE LOS RESULTADOS

Amilasa (UA/dl)= (c - d)/c x 1000

Unidades: Una unidas Amiloltica (UA) es la cantidad de enzima contenida en 100 ml de muestra, que puede hidrolizar 10 mg de almidn en 30 min, en las condiciones de la reaccin. En esta tcnica se incuban 0.02 ml de muestra con 0.5 mg de almidn contenidos en 1 ml de sustrato durante 7 min y medio, lo que equivale a incubar 100 ml de suero con 10.000 mg de almidn durante 30 min. Si todo el almidn fuera hidrolizado, la actividad amilsica de la muestra sera de 1000 UA/ dl. Para las unidades de actividad amilsica, la fraccin de almidn digerido se multiplica por 1000.

VALORES DE REFERENCIA

Condicin clnica Normal Pancreatitis aguda Pancreatitis crnica Parotiditis Parotiditis c/complicacin pancretica Procesos abdominales agudos (sin pancreatitis)

Suero (UA/dl) <120 300 a 12.000 hasta 200 200 a 350 ms de 350 normal

Orina (UA/hora) <260 Ms de 900 Ms de 300 350 a 750 ms de 750 normal

CUESTIONARIO 1.- Explique la importancia bioqumica de la cuantificacin de la actividad enzimtica 2.- Que factores afectan el comportamiento enzimtico 3.- Mencione tres enzimas de importancia clnica

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PRACTICA NO. 13

ANLISIS DE LPIDOS OBJETIVO: Realizar pruebas generales para identificar algunas propiedades de un lpido.

INTRODUCCIN. Los lpidos son molculas orgnicas que se caracterizan generalmente por ser insolubles en agua y muy solubles en solventes orgnicos. Esta propiedad fsica refleja la naturaleza hidrofbica de su estructura hidrocarbonada. En esta prctica se van a realizar una serie de pruebas cualitativas para poner de manifiesto algunas propiedades de los lpidos como son: solubilidad, deteccin de perxidos y saponificacin.

MATERIALES Y REACTIVOS. 7 Tubos de ensayo 2 Pipetas de 1 ml. 4 Pipetas de 2 ml. Bao Mara. Soporte completo Gradilla

Aceite vegetal. Agua. Etanol. Eter etlico. Tetracloruro de carbono Mezcla de Acido actico y Cloroformo. KI al 5 %. NaOH 2 N o al 10 %.

PROCEDIMIENTO. A) PRUEBA DE SOLUBILIDAD. 1. Enumerar cuatro tubos de ensaye y prepararlos de la siguiente forma: TUBO Aceite Vegetal. Agua Etanol Tetracloruro de carbono. Eter etlico. 1 1 ml. 2 ml. 2 1 ml. 2 ml. 2 ml. 2 ml. 3 1 ml. 4 1 ml.

2.- Observar el grado de solubilidad y anotar los resultados.

B) DETECCIN DE PERXIDOS. 1.- Colocar en un tubo de ensayo 1 ml. de aceite vegetal y 2 ml. de mezcla de ac. Actico l cloroformo. 2.- Agitar fuerte y agregar 2 gotas de KI, agitar nuevamente. 3.- Esperar 10 minutos y observar cambios.

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C) SAPONIFICACIN. 1.- Colocar 2 ml. de aceite vegetal en un tubo. 2.- Agregar 1 ml. de NaOH. 3.- Agitar para formar una emulsin. 4.- Calentar en Bao Mara durante 5 minutos. 5.- Dejar reposar el tubo y observar cambios. CUESTIONARIO. 1.- Da una definicin de lpidos. 2.- Explica con reacciones qumicas en que consiste la saponificacin.

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