CHRISTIAN DE ALENCAR SIEBRA

ATIVIDADES BIOLGICAS DE Annona glabra Linn., ANNONACEAE

CURITIBA 2007

CHRISTIAN DE ALENCAR SIEBRA

ATIVIDADES BIOLGICAS DE Annona glabra Linn., ANNONACEAE

Dissertao apresentada como requisito parcial obteno do grau de Mestre em Cincias Farmacuticas, Programa de Psgraduao em Cincias Farmacuticas rea de Anlises Clnicas, Setor de Cincias da Sade, Universidade Federal do Paran.

Orientadora: Prof.a Dr.a Almeriane Maria Weffort-Santos

CURITIBA 2007 ii

NOTA BIOGRFICA

O autor Farmacutico Bioqumico graduado pela Universidade Federal do Paran em 2001. Durante a graduao, de janeiro a dezembro de 1998, foi voluntrio em iniciao cientfica no Laboratrio de Equilbrio Qumico e Quimiomtrico do Departamento de Qumica da UFPR, sob orientao da Profa Dra Ana Lucia Ramalho Merc Maia, participando do projeto de pesquisa Estudo quantitativo, qualitativo, estrutural e complexomtrico da

arabinogalactana extrada de Pereskia aculeata. De agosto a dezembro de 2000, foi monitor na disciplina de Citologia Clnica A, do Departamento de Patologia Mdica da UFPR, perodo que participou do projeto Educao para preveno do cncer e de doenas sexualmente transmissveis, sob orientao da Profa Dra Maria Suely Soares Leonart. Iniciou sua carreira profissional como farmacutico responsvel pelo Metrolab Laboratrio de Anlises Clnicas, no municpio de Colombo-PR, entre setembro de 2001 e maro de 2005, e no Laboratrio de Anlises Clnicas do Hospital e Maternidade Victor Ferreira do Amaral, de maro de 2002 a setembro de 2004. Atualmente farmacutico bioqumico no laboratrio do Hospital Nossa Senhora das Graas. Em 2005, ingressou no Programa de Ps-graduao em Cincias Farmacuticas, rea de concentrao Anlises Clnicas, onde desenvolveu projeto sobre as atividades biolgicas do extrato de

Annona glabra Linn., cujos resultados esto apresentados nesta dissertao de mestrado.

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DEDICATRIA

minha querida esposa Ligia, aos meus pais e irmos. iv

AGRADECIMENTOS

Primeiramente, agradeo ao meu bom Deus, pelas bnos concedidas, graas alcanadas e por fazer de mim instrumento de Sua vontade. A minha esposa, Ligia Maria Claro, pelo companheirismo e amor. Aos meus pais, Francisco Amrico Siebra de Brito e Mrcia Maria de Alencar Siebra, pelo dom da vida e por me ensinarem a viver com humildade e honestidade. Aos meus irmos, pelo carinho e apoio incondicionais. A Profa Almeriane Maria Weffort-Santos, por contribuir definitivamente com minha formao pessoal e profissional, com dedicao, entusiasmo, conhecimento e amizade. Ao Prof. Brs Heleno Oliveira, pela gentileza de fornecer o extrato de A. glabra, o cido caurenico e o esteviol, alm da sua disponibilidade e apoio. Ao Prof. Marco Antnio Ferreira Randi, pelos ensinamentos e orientaes nos ensaios com clulas HEp-2. Ao Prof. Jos Domingos Fontana, pela ateno e disponibilidade nos ensaios com Artemia salina. Ao Prof. Aguinaldo Jos do Nascimento, por me ajudar pacientemente com as anlises estatsticas. A Profa Maria Suely Soares Leonart, por ser uma grande incentivadora e amiga. A todos os professores da UFPR, pelas colaboraes que tornaram este trabalho possvel. A Irene e Geni, pela amizade, carinho e ajuda no dia-a-dia do nosso trabalho. Aos amigos ngela, Jeanine, Julio, Melissa, Fabiana, Fernanda, Luciana, Tatiana e colegas da Ps-graduao, especialmente, Gabriel, Larissa, Michele, Jaqueline e Janana, pelas contribuies e amizade. Ao Altair, Adlia e Indianara, pela inestimvel ajuda em meus experimentos. Aos meus grandes amigos e irmos que se formaram comigo nesta escola, pela valiosssima amizade e unio. A todas as pessoas que, de forma direta ou indireta, deram sua contribuio para que este trabalho, como fruto de um grande esforo, fosse concretizado, o meu sincero agradecimento. v

EPGRAFE

Quando a prxima tarefa uma montanha a sua frente, ela pode parecer muito difcil de se escalar. Mas, voc no precisa escal-la de uma s vez... d um pequeno passo... e d mais um pequeno passo... e, mais um... e ento, outro... E voc descobrir que a tarefa, que era uma montanha sua frente, apenas uma montanha que voc j escalou!

Ashley Rice vi

SUMRIO

NOTA BIOGRFICA..................................................................................... iii DEDICATRIA.............................................................................................. iv AGRADECIMENTOS..................................................................................... v EPGRAFE..................................................................................................... vi LISTA DE FIGURAS...................................................................................... x LISTA DE TABELAS..................................................................................... xi RESUMO........................................................................................................ xii ABSTRACT.................................................................................................... xiii 1. INTRODUO........................................................................................... 1 1.1. FAMLIA ANNONACEAE E Annona glabra.................................... 2 1.2. CONSTITUINTES QUMICOS E PROPRIEDADES FARMACOLGICAS..................................................................... 6 1.3. MECANISMOS DE DEFESA.......................................................... 8 1.3.1. INFLAMAO E RESPOSTA INFLAMATRIA.................. 8 1.3.1.1. Adeso celular.......................................................... 11 1.3.1.2. Quimiotaxia............................................................... 13 1.3.2. O SISTEMA IMUNITRIO................................................... 15 1.3.2.1. Clulas do sistema imunitrio adaptativo................. 15 1.3.2.2. Interao de linfcitos e antgenos........................... 18 1.3.2.3. Ativao e proliferao de linfcitos......................... 18 1.3.2.4. Resposta de linfcitos a mitgenos.......................... 20 1.4. PLANTAS MEDICINAIS COMO AGENTES PROMOTORES DA SADE........................................................................................... 22 1.5. PLANTAS MEDICINAIS COMO AGENTES ANTIINFLAMATRIOS, IMUNOMODULADORES E ANTI-TUMORAIS........................................................................... 23 2. OBJETIVOS............................................................................................... 26 2.1. OBJETIVO GERAL......................................................................... 26 2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS........................................................... 26 3. MATERIAL E MTODOS.......................................................................... 27 3.1. SOLUES.................................................................................... 27 3.2. MATERIAL BOTNICO.................................................................. 29 vii

3.3. OBTENO DE LEUCCITOS HUMANOS.................................. 29 3.3.1. Separao das populaes de leuccitos humanos............ 30 3.4. VIABILIDADE E CITOTOXICIDADE SOBRE LEUCCITOS HUMANOS..................................................................................... 30 3.5. PREPARO DE CITOCENTRIFUGADOS........................................ 31 3.6. COLORAO DE MAY-GRNWALD-GIEMSA............................. 31 3.7. ENSAIO DE QUIMIOTAXIA DE GRANULCITOS........................ 31 3.8. ENSAIO DE IMUNOMODULAO................................................ 32 1.1 3.8.1. Ativao e proliferao de linfcitos avaliada por citometria de fluxo............................................................... 32 1.1.1.1 3.8.2. Ativao de linfcitos avaliada morfologicamente............... 33 3.9. TESTE DE LETALIDADE PARA NUPLIOS DE Artemia salina.... 33 3.9.1. Ecloso dos cistos de Artemia salina.................................. 33 3.9.2. Ensaio de letalidade dos nuplios....................................... 34 1.2 3.9.3. Concentrao letal em 50% dos nuplios (CL50)................. 34 3.10.1. Manuteno de clulas HEp-2........................................... 34 3.10.2. Viabilidade e citotoxicidade................................................ 34 3.10.3. Ensaio de adeso.............................................................. 35 3.10.4. Expresso de molculas de adeso.................................. 37 3.11. ESTUDOS ESTATSTICOS.......................................................... 37 3.12. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS FORMATAO................ 37 4. RESULTADOS E DISCUSSO................................................................. 38 4.1. ENSAIOS DE SOLUBILIZAO..................................................... 38 4.2. ENSAIOS COM LEUCCITOS HUMANOS................................... 38 4.2.1. Toxicidade............................................................................ 38 4.2.2. Quimiotaxia.......................................................................... 43 4.2.3. Imunomodulao................................................................. 50 4.3. TESTE DE LETALIDADE PARA NUPLIOS DE Artemia salina.... 56 4.4. ENSAIOS COM CLULAS HEp-2.................................................. 58 4.4.1. Toxicidade............................................................................ 60 4.4.2. Adeso celular..................................................................... 62 4.4.3. Expresso de molculas de adeso.................................... 65 4.5. CIDO CAURENICO E ESTEVIOL: ESTRUTURA QUMICA x ATIVIDADES BIOLGICAS................ 66 viii

3.10. ENSAIO COM CLULAS HEp-2................................................... 34

5. CONCLUSES.......................................................................................... 70 REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.............................................................. 71 ANEXOS........................................................................................................ 81

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LISTA DE FIGURAS

Figura 1 Annona glabra Linn. ..................................................................... 3 Figura 2 Flores de Annona glabra Linn. ..................................................... 4 Figura 3 Fruto de Annona glabra Linn. ...................................................... 5 Figura 4 Eventos leucocitrios na inflamao............................................ 9 Figura 5 Aplicao do Programa UTHSCSA ImageToll for Windows, verso 3.00, para o estudo dos efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a adeso de clulas HEp-2........................................................................................... 36 Figura 6 Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de granulcitos humanos............ 40 Figura 7 Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de leuccitos mononucleares humanos........ 42 Figura 8 Avaliao dos efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a quimiotaxia de granulcitos humanos...................................................................................... 45 Figura 9 Representao grfica em pontos para anlise da atividade imunomodulatria de linfcitos por citometria de fluxo................ 51 Figura 10 Efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a transformao blstica e a proliferao de linfcitos humanos............................................ 53 Figura 11 Efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a transformao blstica e a proliferao de linfcitos humanos estimulados por fitohemaglutinina............ 54 Figura 12 Artemia salina, suas formas de vida e ensaio de letalidade....... 57 Figura 13 Cultura de clulas HEp-2........................................................ 59 Figura 14 Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de clulas HEp-2......................... 60 Figura 15 Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a adeso de clulas HEp-2 base dos frascos de cultura.................................................................... 63 Figura 16 Expresso de molculas de adeso em clulas HEp-2.............. 66

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 Mitgenos: caractersticas e clulas alvo.................................... 21 Tabela 2 Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de nuplios de Artemia salina......... 56 Tabela 3 - Atividades biolgicas do cido caurenico e do esteviol............. 67

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RESUMO A Annona glabra Linn. (Annonaceae), conhecida no Brasil como Araticum-do-brejo ou Araticum-bravo, uma rvore de pequeno porte encontrada em todo territrio brasileiro, principalmente nas reas costeiras. Na medicina popular, tem sido utilizada principalmente como vermfuga e antireumtica. Diferentes mtodos in vitro tm sido empregados para a investigao de atividades biolgicas de plantas usadas na medicina popular. Este trabalho teve como objetivos investigar as atividades biolgicas in vitro do extrato de A. glabra e do cido caurenico dele purificado, enfatizando sua toxicidade sobre leuccitos humanos, sobre nuplios de Artemia salina e sobre clulas HEp-2. Ainda, observou-se seus efeitos sobre a quimiotaxia de granulcitos e seu potencial imunomodulatrio sobre clulas mononucleares. Observou-se sua influncia sobre a adeso de clulas HEp-2 e a expresso de molculas de adeso. Por ter uma estrutura qumica muito parecida com o cido caurenico, diferindo deste pela presena de uma hidroxila no carbono 13 do anel terpnico, em paralelo, avaliou-se os efeitos do esteviol. Os resultados obtidos demonstraram que somente o cido caurenico apresentouse txico sobre leuccitos humanos mononucleares em concentraes iguais ou superiores a 100 M, e sobre nuplios de Artemia salina, com CL50 de 54,4 M. Os ensaios de quimiotaxia revelaram que o extrato inibe, de forma dose dependente, a migrao natural de granulcitos, sugerindo uma atividade antiinflamatria, enquanto o cido caurenico, a 0,001 a 0,01 M, e o esteviol a 0,1 M, demonstraram estimul-la. Em contraste, nenhum efeito foi observado com relao imunomodulao. De particular interesse, ambos, extrato e cido caurenico, interferiram, de forma significativa e dependente da dose, na adeso natural de clulas HEp-2, efeito este no promovido pelas integrinas 41 e 51. Alguns dos efeitos apresentados ainda no foram descritos e, dessa forma, complementam a lista de atividades biolgicas j conhecidas, no s para o extrato de A. glabra, mas tambm para o cido caurenico.

Palavras-chaves: Annona glabra, cido caurenico, esteviol, citotoxicidade, HEp-2, Artemia salina, quimiotaxia, adeso celular. xii

ABSTRACT Annona glabra Linn. (Annonaceae), known in Brazil as Araticum-do-brejo or Araticum-bravo, is a small tree that grows over the Brazilian coast and have been used in the folk medicine as a vermifuge and anti-rheumatic. Different in vitro methods have been used for investigating biological activities of medicinal plants. The aims of this study were to evaluate the in vitro biological potential of the extract of A. glabra and its purified kaurenoic acid, focusing their toxicity upon human leukocytes, Artemia salina nauplii, and HEp-2 cell line. Their effects upon the human granulocyte chemotaxis, and upon mononuclear cells immunomodulation were also investigated, as well as their influence upon the natural adhesion of HEp-2 cells and the expression of cell adhesion molecules were studied. As steviol is similar to kaurenoic acid in their chemical structure, differing from it in a hydroxyl group linked to the carbon 13 of the terpenic ring, its effects were also evaluated. The results herein described showed that only the kaurenoic acid, at 100 M and over, was toxic to mononuclear cells, and upon A. salina nauplii, with a DL50 of 54,4 M. In the chemotactic assay, inhibition dose-dependent of the granulocyte migration could be observed for the extract, suggesting an anti-inflammatory activity, in contrast with the stimulation observed for the kaurenoic acid, at 0,001 and 0,01 M, and for steviol, at 0,1 M. When focusing immunomodulation properties, no activity could be drawn. Of interest were the findings that both, extract and kaurenoic acid, were able to significantly increase, in a dose-dependent fashion, the adhesion of HEp-2 cells to the plastic surface, which were not mediated by 41 and 51 integrins. Some of the effects presented in this work are reported for the first time and will improve the list of biological activities already described not only for the A. glabra extract but also for the kaurenoic acid.

Keywords: Annona glabra, kaurenoic acid, citotoxicity, HEp-2, Artemia salina, chemotaxis, cellular adhesion. xiii

1. INTRODUO

De acordo com a Organizao Mundial de Sade (OMS), uma planta para ser considerada medicinal deve aliviar, prevenir ou curar uma doena ou alterar um processo fisiolgico ou patolgico ou, ainda, ser empregada como fonte de uma droga ou seus precursores (WHO, 2002a). Uma preparao fitofarmacutica ou medicinal caracteriza-se como qualquer medicamento manufaturado obtido exclusivamente das partes areas e no areas de plantas medicinais, alm de resinas, leos e sucos, usadas em seu estado bruto ou em uma formulao farmacutica (Calixto, 2000). A utilizao de plantas como drogas para o tratamento de uma variedade de doenas tem sido realizada desde a atinguidade. As plantas medicinais desempenham papel chave na sade humana, mesmo com os avanos observados na medicina moderna. Isto porque, segundo a OMS, devido pobreza e a dificuldade de acesso a medicina moderna, aproximadamente 65 a 80% da populao mundial que mora em pases em desenvolvimento dependem essencialmente de plantas medicinais para o tratamento primrio de doenas (WHO, 2002b). Medicina tradicional (MT) um termo amplo e refere-se a sistemas de tratamento como as medicinas tradicionais chinesa, indiana, arbica ou a medicina indgena. A MT pode se utilizar de terapias medicamentosas se envolvem o uso de plantas medicinais, partes animais ou minerais e no medicamentosas se no utilizam medicamentos no tratamento primrio, como observado na acupuntura, nas terapias manuais e espirituais. Em pases onde o sistema nacional de sade baseado principalmente na medicina aloptica, ou quando a MT no est incorporada nos sistemas de sade, este termo tambm pode ser conhecido como medicina complementar, alternativa ou no-convencional (WHO, 2002b). Grande parte da populao mundial faz uso da medicina complementar para cuidar de sua sade e uma parte significativa dessa terapia tradicional envolve plantas, utilizadas particularmente sob a forma de chs e extratos. No Brasil, este costume no diferente e a incorporao de plantas medicinais ao aparato teraputico utilizado nas mais variadas doenas tm conquistado espao cada vez maior.

A diversidade de climas e regies geogrficas no Brasil favorece o desenvolvimento de uma flora diversificada. Neste contexto, observa-se o uso de plantas medicinais como terapia alternativa e/ou como suporte s terapias convencionais. No entanto, a idia de que as drogas preparadas de plantas so seguras e isentas de efeitos adversos falsa. As plantas contm centenas de constituintes e alguns deles so muito txicos como, por exemplo, as drogas citotxicas derivadas de plantas com atividade anti-cncer. Mesmo assim, estudos clnicos apontam que os efeitos adversos de agentes fitoterpicos so menos freqentes se comparados com os de drogas sintticas (Calixto, 2000). Alm disso, o Brasil gasta cerca de dois a trs bilhes de dlares por ano na importao de matrias-primas utilizadas no preparo de medicamentos. O panorama, nessa rea, mostra que 84% dos frmacos consumidos no Brasil so importados e que 78 a 80% da produo feita por indstrias multinacionais (Varanda, 2006), o que justifica a busca de alternativas para superar a dependncia externa por parte da indstria qumico-farmacutica brasileira. Os produtos extrados de plantas medicinais continuam, assim, a representar uma diversidade qumica nica, a qual continuar a ser uma fonte importante de compostos-modelos para programas de investigao clnica, iniciados a partir da observao das espcies de plantas regionais popularmente utilizadas. 1.1. FAMLIA ANNONACEAE E Annona glabra A famlia Annonaceae, de distribuio pantropical, caracterizada por rvores e arbustos, tem cerca de 110 gneros e aproximadamente 2.150 espcies identificadas (Mabberley, 1997). No Brasil, foram registrados 29 gneros, compreendendo cerca de 260 espcies (Barroso et al., 1978). Dentre essas, situa-se a Annona glabra Linn., comumente conhecida no Brasil como Araticum-do-brejo ou Araticum-bravo (Figura 1A). uma rvore de pequeno porte, semidecdua, encontrada em todo o territrio brasileiro, principalmente nas reas costeiras, e alcana

aproximadamente 12 a 15 metros de altura. Um espcime possui normalmente tronco nico, porm as sementes germinam em grupo (Figura 1, B e C), dando aparncia de moitas com vrios caules (Protection, 2004). Necessita de solo

mido para crescimento e beneficia-se de inundaes regulares, porm no permanentes.

Figura 1. Annona glabra Linn. rvore de pequeno porte, encontrada principalmente em regies alagadias, salobras ou no, onde muitas sementes podem germinar juntas, dando o aspecto de moitas. Fonte: (A e B) Weed Management Guide, Pond Apple, Annona glabra, 2003. (C) Facts, Pond Apple, Annona glabra, 2004.

Crescendo naturalmente tambm nas Amricas do Norte, do Sul e Central, alm do oeste Africano, em regies alagadas, salobras ou no, seu crescimento ocorre em habitats que esto, periodicamente ou

permanentemente, inundados (Croat, 1978), ou seja, ao longo de rios, margens de lagos e em regies salobras prximas ao litoral. A adaptao a esses ambientes se deve s vrias caractersticas estruturais da planta, como intumescimento da base de seu tronco, razes adventcias, aernquima nas razes, tronco pequeno, frutos que biam e disperso das sementes na gua (Zotz et al., 1997). Consegue sobreviver em perodos de seca, porm seu crescimento torna-se severamente comprometido. Os frutos flutuam e podem sobreviver por perodos prolongados quando imersos em gua, salobra ou no (Protection, 2004). As flores, ilustradas na Figura 2, so raramente observadas, porm muito atrativas, geralmente com 2 a 3 cm de dimetro, variando de amarelo plido a creme, com trs ptalas maiores externas encouraadas e trs ptalas pequenas internas (Protection, 2004).

Figura 2. Flores de Annona glabra Linn. De cor amarelo plido a creme, possuem externamente trs ptalas maiores (a), encouraadas e trs ptalas pequenas (b) internamente. Fonte: (A) Atlas de Plantas Vascularizadas da Flrida, Universidade do Sul da Flrida EUA; (B) Albion College, 1983, Michigan EUA.

As folhas possuem de 7 a 12 cm de comprimento, pecolo cilndrico, lmina oblonga, cartcea, base obtusa, pice acuminado, margem plana, com 9 a 13 pares de nervuras secundrias. A maturidade reprodutiva atingida aps aproximadamente dois anos, quando se inicia a florao e a produo de frutos. O fruto esfrico, com cerca de 5 a 15 cm de dimetro, naturalmente verde (Figura 3), o qual, aps a queda, torna-se amarelado, escurecendo em seguida. Contm pouco mais de 100 sementes, de aspecto semelhante aos da abbora, com aproximadamente 1 cm de comprimento. No Brasil, os frutos caem entre os meses de maro e abril, permanecendo viveis por alguns meses em gua doce ou salobra. Para que ocorra a germinao, a semente necessita de ambiente alagadio ou mido. Uma vez estabelecida a germinao, a planta pode sobreviver em altos nveis de salinidade, possuindo, na fase adulta, considervel tolerncia a ambientes salinos (Protection, 2004).

Figura 3. Fruto de Annona glabra Linn. Naturalmente verde, aps a queda, torna-se amarelado e, em seguida, escurece. Fonte: Albion College, 1983, Michigan EUA.

1.2. CONSTITUINTES QUMICOS E PROPRIEDADES FARMACOLGICAS A famlia Annonaceae quimicamente uma das famlias de plantas tropicais menos estudadas. Entretanto, investigaes fitoqumicas e, em menor extenso, farmacolgicas sobre membros desta famlia vm se intensificando nos ltimos anos. Vrios estudos tm demonstrado grande quantidade de compostos de natureza qumica diversificada nas mais variadas partes da planta. Os principais grupos de compostos qumicos presentes em extratos preparados de cascas (Chen et al., 2000), folhas e frutos (Chang et al., 1998) so os alcalides, as acetogeninas e os diterpenos (Chen et al., 2004; Oliveira et al., 2002). Na China, por exemplo, a A. glabra amplamente cultivada e utilizada como inseticida e parasiticida (Chen et al., 2004). Nesse contexto, as acetogeninas anonceas j demonstraram atividades anti-helmntica,

antimalrica, antimicrobiana, antiprotozoria e pesticida, alm de ser txica para clulas tumorais (Alali et al., 1999). Dentre os compostos isolados da espcie, o cido caurenico, ou cido caur-ent-16-en-19-oico, um dos diterpenos mais estudados, para o qual j foram descritas diversas atividades biolgicas, desde inibidor da replicao do vrus HIV em linfcitos (Chang et al., 1998), como agente citotxico (Chavez et al., 1997; Costa-Lotufo et al., 2002; Zhang et al., 2004), trypanosomicida (Alves et al., 1995; Vieira et al., 2002), larvicida (Slimestrad et al., 1995), antimicrobiano (Padmaja et al., 1995; Velikova et al., 2000), vermfugo, esporicida (Padmaja et al., 1995), analgsico (Block et al., 1998), contraceptivo (Page et al., 1992), relaxante da musculatura lisa vascular artica de ratos (Tirapelli et al., 2004), at como agente antiinflamatrio (Paiva et al., 2002). O cido caurenico (I) um dos compostos intermedirios envolvidos na biossntese de vrios diterpenos caurenos, que tm em comum uma estrutura constituda por uma unidade peridrofenantreno (anis A, B e C) ligada, por uma ponte entre C-8 e C-13, a uma unidade ciclopentano (anel D). Este grupo de compostos, por apresentar um amplo espectro de atividades biolgicas, revisadas por Ghisalberti (1997) e Garca e colaboradores (2007), tem sido alvo de uma infinidade de estudos de modificaes estruturais no esqueleto caurnico com o objetivo de se obter substncias bioativas, seja por mtodos qumicos ou microbiolgicos.

12 20 9 1 2 3 4 10 5 6 8 15 7 11 13 14 16 17

COOH
18 19

O uso de mtodos biolgicos para transformao de compostos orgnicos tem sido foco de crescente ateno devido s suas vantagens inerentes. O esteviol (II) serve como exemplo desse tipo de transformao. Tendo uma estrutura qumica muito semelhante ao cido caurenico, diferindo deste por ter um grupo hidroxila no carbono 13, muitas atividades biolgicas distintas daquelas acima listadas para o cido caurenico j foram descritas. Na Stevia rebaudiana Bertoni (Asteraceae), o esteviol um composto qumico intermedirio, sintetizado atravs da via metablica do cido mevalnico, a partir do caureno. Dentro do complexo de Golgi, pode ser glicosilado ou ramnosilado para formar edulcorantes, como o esteviosdeo (III), por exemplo (Jarma et al., 2006).

OH
13 16 17

OGG

G=glucose G = glucose CO2H COOH II Esteviol CO COO G 2G III Esteviosdeo

O esteviol tem sido descrito como substncia txica, com atividade mutagnica e bactericida em Salmonella typhimurium TM-677 (Pezzuto et al., 1985). Inibio da absoro de glicose em intestino de hamster foi tambm observada aps tratamento com esteviol (Toskulkao et al., 1995). Alm disso, esteviol e esteviosdeo tambm tm sido considerados como drogas diurticas, possuindo atividade vasodilatadora sistmica que afeta a funo renal, induzindo diurese e natriurese (Melis, 1992). Tambm, como antidiabticos, por estimularem a secreo de insulina pelo pncreas (Jeppesen et al., 2000).

1.3. MECANISMOS DE DEFESA

1.3.1. INFLAMAO E RESPOSTA INFLAMATRIA

A inflamao uma resposta de defesa dos tecidos de um organismo a estmulos nocivos ou injria. Constitui-se de uma srie de eventos resultantes de alteraes celulares e vasculares. A resposta geralmente rpida e similar quando o estmulo de natureza qumica, fsica, microbiolgica ou imunolgica, sendo caracterizada por inchao e vermelhido (ou eritema) como resultado de uma transferncia de plasma e protenas do sangue para espaos intersticiais, comumente acompanhado por aumento do fluxo sanguneo local (hiperemia). Estas so as primeiras reaes visveis, que podem estar seguidas de deposio plaquetria, marginalizao dos leuccitos

polimorfonucleares (PMN) nos capilares sanguneos e subseqente infiltrao para os tecidos. Nos estgios mais avanados da inflamao, quando no h eliminao ou supresso do agente causador, o processo torna-se crnico e ocorre tambm a infiltrao de leuccitos mononucleares (MNC),

representados por linfcitos e moncitos (Cotran et al., 1994). A principal funo dos leuccitos a defesa dos tecidos, sendo o sangue sua principal via de transporte. Como esquematicamente ilustrado na Figura 4, um stio de infeco ou injria em qualquer tecido rapidamente atrai os leuccitos por meio de uma variedade de sinais moleculares produzidos localmente. Alguns desses sinais moleculares agem sobre os capilares, diminuindo a adeso entre as clulas endoteliais, ao mesmo tempo em que favorecem a adeso de superfcie para passagem dos leuccitos atravs do endotlio.

Os leuccitos, por sua vez, aderem inicialmente s clulas endoteliais atravs de selectinas e, posteriormente, para realizar a diapedese, ligam-se fortemente, mas de forma transitria, s integrinas. Outras molculas agem como quimioatratoras de tipos especficos de leuccitos, causando sua polarizao e seu deslocamento em direo ao stio inflamatrio (Alberts et al., 1994). Dessa forma, pelo menos trs etapas esto distintamente envolvidas no desenvolvimento de um processo inflamatrio agudo: (1) adeso dos leuccitos ao endotlio, (2) sua passagem atravs do mesmo e (3) sua migrao em direo ao estmulo quimiottico (Dekker et al., 2000; Mackai et al., 2000).

ROLAMENTO

ADESO
Molculas de adeso

TRANSMIGRAO

LMEN

Ativao endotelial

Ativao leucocitria

injria

Figura 4. Eventos leucocitrios na inflamao. Durante o processo inflamatrio, os leuccitos so atrados para a rea da leso por meio de citocinas prinflamatrias liberadas localmente. Primeiramente, rolam e aderem-se transitoriamente ao endotlio vascular, ocorrendo, ento, a diapedese; em seguida, migram em direo ao local da leso, onde exercem suas atividades de eliminao do agente causal e cooperam na reparao do tecido lesado.

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Das clulas com grande capacidade de responder a estmulos inflamatrios destacam-se os granulcitos (GNC) circulantes no sangue perifrico. Dentre esses, h os PMN, que constituem a populao celular primria na defesa aguda contra vrios tipos de microorganismos presentes no meio ambiente, acumulando-se rapidamente no stio de leso. Sua participao no processo inflamatrio multifuncional e envolve (1) reconhecimento seletivo do agente agressor, (2) resposta apropriada por meio de locomoo, (3) fagocitose do microorganismo e (4) sua subseqente destruio. Para tanto, possuem a habilidade de secretar substncias no s capazes de retardar a disseminao da infeco, mas, quando necessrio, tambm recrutar outros tipos de leuccitos para o foco infeccioso/inflamatrio (Cassatella, 1995). As citocinas inflamatrias so substncias qumicas circulantes no plasma e importantes mediadores das respostas vascular e celular

desencadeadas pelo estmulo inflamatrio agudo. Dentre elas, destacam-se as interleucinas 1 (IL-1), 6 e 8, o fator de necrose tumoral alfa (TNF-) e o fator estimulador de colnia de macrfagos e granulcitos (GM-CSF) (Cassatella, 1995; Springer, 1994). O neutrfilo uma clula que participa da defesa inata e, nos tecidos, est presente em todas as portas de entrada do organismo humano que fazem contato com o meio externo. Com um tempo de vida mdia na circulao de aproximadamente sete horas (Quesenberry et al., 2000), passam a maior parte desse tempo circulando no sangue perifrico, num processo passivo. Em contraste com a reao aguda, a inflamao crnica caracteriza-se por uma maior infiltrao de clulas MNC, incluindo macrfagos, linfcitos e plasmcitos, como reflexo de leso tecidual persistente (Cotran et al., 1994). Dentre essas clulas, os macrfagos ocupam posio de destaque comparvel ao papel principal desempenhado pelos PMN na reao aguda. Os macrfagos so clulas que se originam dos moncitos circulantes que, semelhana dos PMN, so descendentes de progenitores

hematopoiticos presentes na medula ssea (Lee et al., 1999). Aps diapedese, os moncitos distribuem-se nos mais diferentes tecidos do organismo dos mamferos (Reeves et al., 2000), tornando-se macrfagos residenciais. Em contraste com um tempo de vida de cerca de 24 horas para os moncitos circulantes, os macrfagos sobrevivem por vrios meses, durante os

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quais, ao responderem a vrios estmulos, especialmente de citocinas, tornamse ativados e capazes de exercer inmeras funes, como proliferao, sntese, armazenamento e secreo de molculas biologicamente ativas (enzimas proteolticas, componentes do sistema complemento, fibronectina, 2macroglobulina, prostaglandinas, fatores de crescimento, citocinas etc), atuam como clulas apresentadoras de antgenos para linfcitos, produzem metablicos reagentes do oxignio e outras molculas importantes para a eliminao de microorganismos (Cotran et al., 1994; Reeves et al., 2000).

1.3.1.1. Adeso celular

Alm da resposta inflamatria, o processo de adeso celular ocorre tambm em vrios eventos biolgicos, sendo essencial durante a morfognese, no crescimento, na organizao e estabilidade teciduais, na resposta do hospedeiro s infeces, nos processos de cicatrizao, assim como na resposta imunocelular. Organismos multicelulares possuem diferentes tecidos constitudos por clulas que esto em ntimo contato com uma rede complexa de macromolculas denominada matriz extracelular (MEC), a qual, alm de servir como suporte fsico, possui mltiplas funes biolgicas (Engel et al., 1991). Dentre elas, destacam-se a de reservatrio de diferentes hormnios, que controlam o crescimento e a diferenciao celulares, a de promover uma estrutura em malha na qual as clulas podem aderir, locomover-se, promover trocas entre si e com o ambiente. essencial, tambm, na reorganizao da forma do citoesqueleto celular, na migrao e na diferenciao durante a embriognese. Destaca-se na recuperao de leses e feridas por facilitar a localizao de macrfagos e outras clulas do sistema imunitrio na rea lesada (Alberts et al., 1994). A MEC constitui-se de uma combinao de protenas que variam de acordo com o tecido, tais como colgeno, fibronectinas, laminina, vitronectina, dentre outras, e que interagem por meio de mltiplos stios de interao (ou domnios), sendo cada um especfico para o acoplamento com outras molculas da matriz ou com receptores circulantes ou presentes na superfcie de clulas (Alberts et al., 1994).

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Como j descrito, para alcanar os locais de inflamao, os leuccitos perifricos devem sair da circulao sangnea e atravessar o endotlio. Para isto, empregam molculas de adeso (MA), primeiramente, ligando-se ao endotlio vascular e, posteriormente, migrando para dentro dos tecidos adjacentes (Mackai et al., 2000; Springer, 1994). Estes fenmenos so decorrentes da ao de diferentes mediadores inflamatrios, que tambm induzem as clulas endoteliais vasculares a expressarem diferentes MA, as quais, por sua vez, interagem com receptores proticos presentes na superfcie dos leuccitos. Estes tambm so estimulados e, quando ativados, passam a expressar nveis mais elevados de vrias MA, as quais se ligam a receptores proticos expressos na superfcie de clulas endoteliais. Essas interaes iniciais so as responsveis pela "captura" dos leuccitos perifricos circulantes, os quais "rolam" pela superfcie interna dos vasos (Lawrence et al., 1991; Mackai et al., 2000). As MA so, pois, glicoprotenas que medeiam o contato entre duas clulas ou entre a clula e a MEC, sendo responsveis pela adeso intercelular, adeso celular ao epitlio e ao endotlio, recrutamento e migrao seletiva de clulas inflamatrias dos vasos sangneos at o local da inflamao (Simmons, 1995). Esto agrupadas em quatro superfamlias, as imunoglobulinas, as selectinas, as integrinas e as caderinas, dependendo de suas caractersticas moleculares. As MA pertencentes famlia das selectinas so expressas em clulas endoteliais (E-selectina), plaquetas (P-selectina) e leuccitos (L-selectina) e medeiam os processos envolvidos no rolamento dos leuccitos ao longo da parede do vaso (Lawrence et al., 1991), enquanto as MA da famlia das integrinas promovem a adeso transitria dessas clulas ao endotlio (Springer, 1990). As integrinas so heterodmeros que formam uma classe especial de receptores constitudos por subunidades e , ambas cooperando para a formao dos domnios usados para acoplamento (Hynes, 1987; Hynes, 1992). A maioria das integrinas expressa em uma ampla variedade de clulas, ao mesmo tempo em que, a maioria das clulas expressam alguma integrina. Foram descritas at o momento 8 subunidades

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14 subunidades , de natureza glicoprotica e na forma de proteoglicanos facultativos (Veiga et al., 1997), cada uma delas, com um segmento transmembrnico hidrofbico nico (Hynes, 1992), com especificidade para componentes da MEC e ligantes da superfcie celular (Arnaout, 1990; Burridge et al., 1988; Springer, 1990). Deve-se ressaltar que cada receptor reconhece um ou mais ligantes e a especificidade de ligao de um determinado receptor pode ser marcadamente comprometida pelo ambiente em que ele se encontra ou pelo estado de ativao. Dessa forma, a expresso de uma integrina no necessariamente indica que ela ter um papel funcional na adeso, at mesmo se o seu ligante estiver presente em um contexto disponvel. Muitas vezes, precisam ser primeiramente ativadas por mediadores solveis, como hormnios e particularmente por citocinas, ou por protenas componentes da MEC (Hynes, 1992; Lampugnani et al., 1997; Springer, 1990) para, ento, aumentar sua afinidade e interagir com o ligante. Neste contexto, no domnio da fibronectina que interage com as integrinas expressas na superfcie celular, h a seqncia tripeptdica arginina-glicina-cido asprtico, conhecida como seqncia RGD, responsvel pelo acoplamento da fibronectina s integrinas 51, IIb3 e v, sendo que a seqncia cido glutmico-isoleucina-Ieucina-asparagina-valina (EILDV)

interage especificamente com a integrina 41, enquanto asparagina-glicinacido glutmico-alanina (DGEA) acopla-se a integrina 21 (Doherty et al., 1990).

1.3.1.2. Quimiotaxia
Alm da funo adesiva, os leuccitos tm funo quimiottica. A quimiotaxia caracteriza-se por ser um movimento celular direcional a favor ou contra um gradiente qumico e comum a vrias clulas eucariticas. No caso particular dos leuccitos, o mecanismo pelo qual estas clulas se acumulam no stio inflamatrio. Este fenmeno implica uma srie sucessiva de eventos que se iniciam com a polarizao celular, fixao ao substrato e retrao do corpo celular. Todos esses eventos dependem da dinmica do citoesqueleto de actina que se organiza em resposta ao sinal recebido (Wilkinson, 1996).

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Os atratores qumicos so, em geral, molculas pequenas e solveis que reconhecem e se ligam a receptores transmembrnicos especficos, via protena G, localizados na superfcie dos leuccitos. O sinal quimiottico liberado dessa interao o AMPc (adenosina 3, 5-monofosfato cclico), mensageiro intermedirio que ativa vias especficas com conseqente aumento da polimerizao de actina, produzindo filamentos ramificados (F-actina) na linha de frente, em direo ao sinal. Esta polimerizao localizada empurra a membrana celular para frente, acompanhada de contrao do plo posterior, a qual mediada pela protena motora miosina II (Chung et al., 2001). Na sua forma molecular monomrica, a actina solvel, mas quando polimerizada produz filamentos insolveis de considervel fora mecnica. As miosinas interagem com filamentos de actina e convertem a energia qumica do ATP (adenosina trifosfato) em trabalho mecnico, resultando na trao e movimento celular. Portanto, como resultado da ativao de receptores quimioatratores, os neutrfilos so estimulados a mover-se, rearranjar seu citoesqueleto e, por fim, fagocitar microorganismos. Alm disso, freqentemente ocorre degranulao e ativao da NADPH (nicotinamida adenina dinucleotdeo fosfato) oxidase, gerando metablicos txicos do oxignio (Bokoch, 1995). As substncias capazes de induzir quimiotaxia, denominadas

quimioatratoras, no constituem uma classe especfica de compostos e podem ter natureza exgena ou endgena. Dentre as substncias exgenas que provocam alteraes no comportamento locomotor dos leuccitos encontramse alguns produtos de bactrias, como os peptdeos N-formilados (f-MLP) (Johansson et al., 2002; Qu et al., 1995; Rabgaoui et al., 1994); certos agentes opiides como a casena (Lewis et al., 1983; Rabgaoui et al., 1994; Siddiqui et

al., 1999; Wang et al., 2001; Wilkinson, 1974; Wilkinson, 1988), alguns
derivados de bactrias como os lipopolissacardeos (LPS) (Qu et al., 1995) e protenas desnaturadas (Wilkinson, 1988). Dentre as substncias endgenas, as mais conhecidas so as citocinas, que, de modo geral, so capazes de estimular todos os tipos de leuccitos do sangue. Destas, destacam-se a IL-8, o TNF-, o interferon gama, alm de componentes do sistema complemento, como as fraes C3a e C5a, os produtos relacionados a lipoxigenao do cido araquidnico (leucotrienos), particularmente o LTB4, e o fator de ativao

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plaquetrio (PAF) (Bokoch, 1995; Cotran et al., 1994; Johansson et al., 2002; Lewis et al., 1983; Siddiqui et al., 1999; Wilkinson et al., 1988).

1.3.2. O SISTEMA IMUNITRIO

Aps a instalao de um agente patognico, o organismo reage para a sua eliminao, numa ao integrada entre fagcitos, protagonistas da reao inflamatria, e as clulas do sistema imunitrio. O local da infeco e o tipo de patgeno so fatores determinantes do tipo de resposta imunolgica que ser desencadeada. A resposta imunolgica adaptativa desenvolve-se aps o contato entre as clulas do sistema imune e um patgeno como, por exemplo, vrus, bactrias ou protozorios, o que lhe confere carter de especificidade (Roitt et

al., 2003). Estas clulas so capazes de identificar e reagir somente com as

molculas que so estranhas ao organismo. Outro fator que colabora para a ativao do sistema imunitrio adaptativo a reincidncia da agresso pelo mesmo agente, pois uma caracterstica especfica deste sistema a produo de uma memria imunolgica a partir da primeira infeco (Parham, 2001).

1.3.2.1. Clulas do sistema imunitrio adaptativo

Devido as suas importantes caractersticas de memria, especificidade e reconhecimento do no prprio, o sistema imunitrio adaptativo muito eficaz na defesa do organismo. Os tipos celulares que medeiam estas reaes so os linfcitos, em particular os do tipo B e T, e as clulas apresentadoras de antgenos (CAA), representadas por uma coleo de macrfagos e clulas dendrticas (Roitt et al., 2003).

1.3.2.1.1. Linfcitos
Principais clulas responsveis pela resposta imunolgica adaptativa, no ser humano, as clulas da linhagem linfide, antes de se tornarem clulas maduras e capazes de exercer funes especficas, passam por processos sucessivos de aquisio de imunocompetncia no timo ou na prpria medula ssea, denominados rgos linfides primrios. Aqueles que requerem um perodo de diferenciao no timo so denominados linfcitos T, enquanto os

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que continuam a se diferenciar no prprio stio produtor emergem como linfcitos B. Mais de 70% dos linfcitos circulantes so representados pela linhagem T, os quais participam ativamente na defesa do organismo contra infeces causadas por agentes intracelulares. A fase de desenvolvimento dos timcitos envolve um exame crtico de receptores produzidos. Desta forma, a seleo positiva envolve clulas T que podem reconhecer peptdeos apresentados por molculas do Complexo Principal de Histocompatibilidade (MHC) prprias, enquanto que a negativa elimina as clulas potencialmente auto-reativas, que poderiam ser ativadas por peptdeos normalmente apresentados por molculas MHC na superfcie das clulas saudveis. Como no tecido linfide perifrico que ocorrem as maiores chances dos linfcitos T encontrarem antgenos, aps a fase de amadurecimento no timo, essas clulas, agora imunocompetentes, ficam circulando entre a corrente sangnea e o tecido linfide perifrico at encontrarem o seu antgeno especfico, quando, ento, so induzidas a proliferar e se diferenciar em clulas T efetoras (Janeway, 2002). O encontro com um antgeno especfico provoca a fase final do desenvolvimento e diferenciao dos linfcitos T, onde as clulas T-CD8 tornam-se clulas T citotxicas para as clulas que expressam esses antgenos proticos, enquanto as clulas T-CD4, sob influncia de citocinas, tornam-se clulas T auxiliares subtipos 1 ou 2 (Ta1 e Ta2, respectivamente), sendo que o tipo celular que predominar depender do patgeno e do tipo de resposta imunolgica requerida (Parham, 2001). Em contraste com os linfcitos T, os linfcitos B no sangue perifrico, representam de 5 a 15% da populao circulante. Sua ativao por antgenos proticos requer a presena de linfcitos T, a qual facilitada pela expresso de molculas classe II do sistema HLA (Human Leukocyte Antigen); os antgenos de natureza lipdica, glicolipdica ou constitudos de protenas polimerizadas ou carboidratos estimulam as clulas B diretamente, as quais sofrem transformao blstica, originando os plasmcitos, clulas responsveis pela produo de diferentes classes de imunoglobulinas mediadoras da imunidade humoral.

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1.3.2.1.2. Macrfagos
Os macrfagos fazem parte do sistema fagocitrio mononuclear que se constitui de clulas de origem medular, incluindo os moncitos que trafegam no sangue perifrico e os macrfagos tissulares. Dependendo do tecido ou rgo onde se encontram, recebem diferentes nomes, como as clulas de Kuppfer do fgado, os histicitos dos linfonodos, os macrfagos alveolares e os esplnicos, quando nos pulmes e no bao, respectivamente. Da circulao, os moncitos migram para os tecidos, onde se transformam em macrfagos, clulas com elevada capacidade fagocitria, responsveis pela remoo de restos celulares e materiais estranhos particulados (Reeves et al., 2000). A ativao dos macrfagos um processo que culmina com o aumento do seu tamanho, elevao dos nveis de enzimas lisossomais, metabolismo ativo e grande habilidade de fagocitar e matar microorganismos, sendo assim efetivada por meio de toxinas bacterianas, molculas de adeso, citocinas secretadas por linfcitos T ativados e outros mediadores qumicos presentes nas reaes inflamatrias (Lee et al., 2003; Scott et al., 2003). Aps ativao, os macrfagos passam a sintetizar e secretar vrias molculas biologicamente ativas, coletivamente chamadas citocinas, que so importantes (Homolka et mediadores das respostas inflamatrias importantes e so imunolgicas as citocinas

al.,

2003).

Particularmente

produzidas que tm a habilidade de ativar linfcitos, os quais passam tambm a secretar mediadores, fechando e amplificando um crculo de respostas biolgicas responsveis no s pela eliminao de agentes invasores, mas tambm envolvidas nos processos para garantir o restabelecimento do organismo e desenvolvimento de resistncia. Como clula apresentadora de antgeno, os macrfagos tm a capacidade de reconhecer e, subseqentemente, internalizar antgenos, process-los e, posteriormente, expor fragmentos destes para os linfcitos T por meio de molculas de superfcie especficas do MHC (Roitt et al., 2003). Dessa forma, os macrfagos desempenham funes centrais na resposta imunolgica, assim como o fazem na resposta inflamatria. Primeiro eles so necessrios para processar e apresentar antgenos aos linfcitos T imunocompetentes, pois, ao contrrio das clulas B, as clulas T no so ativadas por antgenos solveis. Segundo, eles produzem numerosas citocinas,

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dentre elas a IL-1 e o TNF-, capazes de amplificar as respostas inflamatria e imunitria. Tambm, so elementos capazes de lisar clulas tumorais pela produo de metablitos txicos e enzimas proteolticas, sendo importantes na vigilncia imunolgica (Cotran et al., 1994).

1.3.2.2. Interao de linfcitos e antgenos

Os eventos celulares que decorrem da ativao de um linfcito so denominados coletivamente de transformao blstica e as clulas resultantes deste processo so referidas como clulas efetoras da resposta imunolgica. Morfologicamente, so caracterizados como linfoblastos e possuem elevada capacidade proliferativa. Como resultado, observa-se um aumento do nmero de clulas, da produo e secreo de citocinas, assim como de expresso de receptores especficos. As clulas efetoras originadas da ativao de linfcitos T-CD4 proliferam, dando origem a clulas auxiliares, responsveis pela propagao da resposta imunolgica por meio da produo e secreo de interleucinas. Os linfcitos T-CD8, aps contato com o antgeno, ativam-se e proliferam, originando tambm clulas capazes de produzir grandes quantidades de citocinas, que so secretadas para a eliminao do agente agressor. No caso de linfcitos B, aps transformao, muitos proliferam, dando origem aos plasmcitos, clulas especializadas na sntese de imunoglobulinas que so, ento, secretadas como anticorpos livres, como j citado anteriormente. Outros linfoblastos formam uma populao de memria especfica para o antgeno que induziu a resposta primria, readquirindo o aspecto morfolgico do linfcito inicial. So essas clulas que, quando re-expostas ao mesmo antgeno ou a outro cuja estrutura antignica seja muito semelhante, produzem uma resposta imunolgica secundria rpida e vigorosa (Reeves et al., 2000).

1.3.2.3. Ativao e proliferao de linfcitos

A ativao de linfcitos decorre da interao entre um antgeno e o receptor presente na superfcie celular com o qual ele pode interagir. Em clulas T-CD4, por exemplo, este evento culmina com a proliferao, diferenciao e produo de citocinas que medeiam as funes especficas de

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clulas T efetoras, como j citado. Eventos subseqentes, que ocorrem em segundos ou minutos aps a interao ligante-receptor, incluem mudanas no fluxo de ctions monovalentes (Na+ e K+) e a ativao de metiltransferases. Ao mesmo tempo, sntese e utilizao de fosfolipdeos aumentam, envolvendo fosfatidil inusitol, um constituinte dos fosfolipdeos de membrana. O influxo de Ca2+ central na ativao de linfcitos e ocorre em menos de cinco minutos aps interao com o mitgeno fitohemaglutinina (PHA), por exemplo, com receptores presentes na superfcie de linfcitos humanos. Algumas horas aps a interao ligante-receptor, a sntese de protenas aumenta, alcanando um pico entre 48 e 72 horas. Neste perodo, ocorre aumento da sntese de cido ribonuclico (ARN), assim como h a sntese de vrias protenas (Cooper, 1972). O contedo de ARN em linfcitos dobra em 48 horas e reflete-se em alteraes morfolgicas distintas da clula. Finalmente, aumento da sntese de cido desoxirribonuclico (ADN), a marca registrada da proliferao celular, inicia-se aps cerca de 36 horas, atingindo nveis mximos entre 48 e 72 horas (Greaves et al., 1972). Para que a proliferao celular ocorra, fatores de transcrio, que so ativados simultaneamente interao ligante-receptor, representam

intermedirios essenciais, os quais traduzem e direcionam sinais extracelulares em respostas transcricionais especficas. A regulao combinada da

transcrio envolve complexos multiproticos que se ligam de forma cooperativa a regies especficas do ADN alvo. Esta interao permite a convergncia de diferentes sinais para uma regio definida do ADN, a qual, por sua vez, exerce controle regulatrio rigoroso sobre a expresso dos genes alvos em resposta aos sinais recebidos. Neste contexto, complexos formados por fatores de transcrio da famlia NFATc (fator nuclear de clulas T ativadas), por exemplo, junto com protenas AP-1 (fator de ativao protena 1) e ras, integram vias de sinalizao dependentes de Ca2+, as quais regulam a expresso de genes que codificam protenas imunomodulatrias como IL-2, IL-4, IL-3/GM-CSF, TNF-, CD40 e Faz (Feske et al., 2000; Rao et al., 1997; Trama et al., 2000). A replicao de linfcitos T muito particular e determinada pela interao de IL-2 com seus receptores (IL-2-R) em nveis significativos para desencadear esta ao. Entretanto, clulas T no expressam IL-2-R a menos

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que sejam estimuladas por antgenos, anticorpos monoclonais especficos para clulas T, lectinas mitognicas ou forbol ster, por exemplo. Alm disso, uma vez exposta a esses agentes, cada clula T expressa IL-2-R de forma individual, entrando em fases proliferativas do ciclo celular de forma assincrnica. Se nveis de IL-2 no se mantiverem contnuos, a expresso de IL-2-R se mantm, mas a sntese de ADN no ocorre, uma vez que a interao com IL-2-R o fenmeno crucial para que ocorra a replicao do ADN (Cantrell et al., 1984). Um outro ponto de relevncia que a expresso de IL-2-R dependente da presena de antgeno e a retirada do estmulo do meio leva queda progressiva de seus nveis. Em paralelo, h o declnio, tambm progressivo, da proliferao celular e todas as clulas, eventualmente, passam a se apresentar na fase Go do ciclo celular, mesmo na presena de concentraes saturantes de IL-2 (Smith et al., 1985).

1.3.2.4. Resposta de linfcitos a mitgenos

Certas substncias possuem a habilidade de ativar e, subseqentemente, induzir a proliferao de linfcitos T, B ou de ambos

in vitro, sendo genericamente denominados mitgenos (Gery et al., 1972;

Janossy et al., 1972; Oppenheim et al., 1976). A Tabela 1 mostra uma seleo dessas substncias e sua especificidade com referncia populao estimulada. Enquanto a resposta dos linfcitos a antgenos in vivo especfica, gerando amplificao clonal, sua resposta a mitgenos in vitro inespecfica e influencia, simultaneamente, um grande nmero de clulas, levando-as a sofrer transformao blstica e, posteriormente, proliferar. Diferente do que acontece in vivo, esse estmulo proliferao no depende de clulas apresentadoras de antgenos, embora os mesmos mecanismos bioqumicos estejam aparentemente envolvidos

(Burgermeister et al., 2003). Esta propriedade favorece estudos experimentais e, Fitohemaglutinina (PHA) e Concanavalina A (ConA), lectinas extradas e purificadas de plantas que estimulam sub-populaes de clulas T, tm sido usadas como mitgenos para estudos de proliferao dessas populaes

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in vitro e a resposta resultante pode ser utilizada para qualificar e quantificar a

imunocompetncia dessas clulas (Myers, 1995).

Tabela 1. Mitgenos: caractersticas e clulas alvo.

Mitgeno Concanavalina A (Con A) Fitohemaglutinina (PHA) Lipopolissacardeo (LPS) Pokeweed mitogen (PWM) Dextran sulfato
Adaptado de Myers, 1995.

Fonte Canavalia einsformis Phaseolus vulgaris Bactrias gram negativas Phytolacca americana -

Tamanho molecular (D) 55.000

Clulas Alvo Linfcitos T Linfcitos T

Espcie(s) humana, camundongo humana, camundongo roedores humana e camundongo -

140.000
6

1 24 x 10

Linfcitos B Linfcitos TeB Linfcitos B

32.000 500.000

Como j visto, o primeiro passo para a ativao de um linfcito reside na interao de receptores de superfcie com um agente estimulante. A interao de um mitgeno com o receptor das clulas T (TcR), por exemplo, tambm inicia, na clula, eventos que envolvem o recrutamento de ons clcio e a ativao simultnea das enzimas tirosina quinases citosslicas fosfolipases C e A2, protena quinase C (PKC), protena quinase ativada por mitgeno (MAPK) e calcineurina. Estas, por via de cascatas metablicas especficas, produzem sinais direcionados ao ncleo, promovendo a transcrio de fatores prmitticos. Estes, por sua vez, conduzem os eventos da proliferao e de sntese de IL-2, a qual o principal mediador qumico da amplificao da resposta imunolgica (Cooper, 1972; Feske et al., 2000; Rao et al., 2005; Smith et al., 1985; Trama et al., 2000).

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So vrias as metodologias in vitro utilizadas para quantificar a ativao e a proliferao celulares. Dentre elas destacam-se os ensaios tradicionais, que incluem a incorporao de nucleotdeos radioativos (Brunner et al., 1968; Gillis et al., 1978), a reduo de sais tetrazlio (Mosmann, 1983), a incorporao de agentes fluorescentes (Lyons, 2000), a incorporao de anlogos de pirimidina (Kubbies et al., 1985) e a anlise por citometria de fluxo (Shapiro, 1985). Recentemente, a citometria de fluxo foi relatada como um instrumento til na avaliao de efeitos imunomoduladores sobre linfcitos humanos de produtos naturais (Machado Jr. et al., 2006), particularmente extratos de plantas medicinais. Os resultados emitidos por um citmetro de fluxo so originados de uma combinao de sinais que refletem no s o tamanho e a complexidade interna de cada tipo celular analisado, mas tambm incluem suas caractersticas topogrficas e de densidade ptica (Shapiro, 1985). Todos os citmetros de fluxo tm a capacidade de analisar vrios parmetros celulares simultaneamente e converter esta anlise em grficos de

coordenadas x e y, podendo se apresentar como histogramas, grficos de pontos, de densidade ou mesmo de contorno (Macey, 1994). A escolha do tipo de grfico repousa naquele que melhor representar ou traduzir os resultados obtidos.

1.4. PLANTAS MEDICINAIS COMO AGENTES PROMOTORES DA SADE O uso de plantas medicinais no tratamento de diversos tipos de doenas tradicional na cultura humana e os servios de sade e as instituies a eles ligados devem estar voltados para o aproveitamento deste conhecimento popular (Eldin et al., 2001). Esta preocupao parece estar presente em nosso pas, pois como fruto de deliberaes ocorridas j na 10 Conferncia Nacional de Sade realizada em Braslia em 1996, ressaltou-se, no pargrafo 286.12 do Relatrio Final, ... a

incorporao no SUS, em todo o pas, de prticas de sade como a fitoterapia, a homeopatia e a acupuntura..., deliberando-se tambm, no pargrafo 351.10,
sobre ...terapias alternativas e prticas populares, alm do incentivo a

fitoterapia e homeopatia na assistncia farmacutica pblica... (Sade,

1996).

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A fitoterapia ressurge, ento, como uma opo medicamentosa bem aceita e, quando domstica, acessvel a todos. Atualmente, cerca de 80% da populao dos pases de terceiro mundo faz uso de produtos naturais para o tratamento de problemas primrios de sade (Mans et al., 2000). Mesmo em pases industrializados, uma grande porcentagem dos produtos farmacuticos comercializados provm de produtos naturais (Eldin

et

al.,

2001),

representando, no mundo, cerca de 30% das vendas de drogas (Grabley et al., 1999).

1.5. PLANTAS MEDICINAIS COMO AGENTES ANTIINFLAMATRIOS, IMUNOMODULADORES E ANTI-TUMORAIS A diversidade de atividades biolgicas apresentadas por plantas usadas na medicina caseira vem sendo investigada e o espectro dessas aes amplifica na mesma proporo que metodologias mais especficas vo se consolidando cientificamente. Vrios modelos experimentais, in vivo e in vitro, esto hoje disponveis para tal investigao. De particular interesse so aqueles direcionados ao estudo das atividades antiinflamatrias e imunomodulatrias, devido ao crescente nmero de espcies vegetais utilizadas na medicina popular para o tratamento de doenas que comprometem o sistema imunitrio

(Yamaguchi, 1992), aquelas associadas ao cncer (Mans et al., 2000) e estados inflamatrios (Wagner, 1989). Neste contexto, um nmero cada vez maior de plantas tem sido utilizado na medicina tradicional pela sua eficincia em atenuar ou mesmo eliminar os efeitos indesejveis da resposta inflamatria e como moduladoras da resposta imunomodulatria. Estudos mais aprofundados, com o objetivo de descrever novos agentes teraputicos, tm revelado diferentes grupos de metablitos secundrios de natureza qumica variada como alcalides, flavonides, saponinas, taninos e lectinas como agentes protagonistas de relevantes atividades biolgicas (Balunas et al., 2005; Buss et al., 1995) Paralelamente, a utilizao de plantas medicinais para obteno de drogas anti-tumorais tem sido um importante caminho para descoberta de novas aplicaes clnicas baseadas nos estudos dos metablicos secundrios e seus derivados (Balunas et al., 2005).

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Para o desenvolvimento de novos frmacos com atividade anti-tumoral necessrio um melhor entendimento da dinmica do cncer, principalmente no que diz respeito cintica de crescimento tumoral, angiognese, heterogeneidade celular e aos mecanismos de invaso e metstase. Dentro deste contexto, as plantas tm se mostrado como importante fonte de agentes anti-tumorais, onde atualmente 60% desses agentes foram obtidos de recursos naturais, incluindo plantas, organismos marinhos e microorganismos (Cragg et al., 2005; Newman et al., 2003). Interessante notar que as formas jovens do microcamaro Artemia salina tm sido utilizadas como organismos alvo para detectar compostos bioativos em extratos de plantas e a toxicidade deste crustceo tem demonstrado correlao com atividades antitumoral (Colombo et al., 2001; Garcez et al., 2005; Oliveira et al., 2002; Shiomi

et al., 2002; Zhao et al., 1999) e anti-plasmodial (Solis et al., 1993). Artemia salina um micro-crustceo marinho da subclasse dos
Anostrceos, que apresenta de 8 a 13 mm de comprimento na forma adulta e, quando recm eclodido dos cistos, apenas uma frao de milmetros, sendo esta forma denominada nuplio. Por conta de suas reservas energticas em meio adequado, ou seja, salinidade marinha correspondendo a 3,5 g% de NaCI 28C, possui intensa atividade natatria, que se estende por mais de uma semana. O Teste de Letalidade para nuplios de A. salina (Michael et al., 1956) um teste universalmente aceito para deteco de toxinas em fungos, em plantas, em cianobactrias, alm de metais pesados e pesticidas (Carballo et

al., 2002). Os valores de CL50, ou seja, a concentrao da substncia em

estudo capaz de matar ou inviabilizar 50% da populao inicial de nuplios, servem de guia para ensaios posteriores de maior sofisticao, como aqueles que utilizam linhagens celulares para avaliao de drogas anticncer como acima referido. O potencial biolgico de extratos de plantas nativas e seus derivados identificados e isolados so de grande importncia, principalmente para pases como o Brasil, que tm despertado poltica e cientificamente para a explorao de suas potencialidades naturais, e ainda depende da indstria multinacional, muitas vezes, pagando um custo muito alto que poderia certamente ser minimizado atravs do uso de substncias naturais nacionais.

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Atualmente, as cincias mdicas buscam vrios tratamentos, drogas e meios de amenizar, controlar e curar as mais diversas desordens orgnicas, fsicas e psquicas do ser humano. Como as propriedades biolgicas do extrato de A. glabra, assim como do cido caurenico dele purificado, sobre diferentes sistemas biolgicos no so completamente conhecidas, almeja-se com este trabalho investigar seu potencial txico, antiinflamatrio, imunomodulador e sobre a adeso de clulas tumorais, contribuindo para ampliar os

conhecimentos farmacolgicos sobre a planta e seus compostos.

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2. OBJETIVOS

2.1. OBJETIVO GERAL

Investigar as atividades biolgicas in vitro do extrato de Annona glabra Linn. e do cido caurenico dele purificado em diferentes sistemas.

2.2. OBJETIVOS ESPECFICOS

Investigar:

sua toxicidade sobre leuccitos humanos seus efeitos sobre a quimiotaxia de granulcitos sua capacidade de induzir resposta imunomoduladora sobre linfcitos em seu estado basal e estimulados por fitohemaglutinina

seus efeitos sobre a viabilidade do microcrustceo Artemia salina seus efeitos sobre a viabilidade, a adeso de clulas HEp-2 e a expresso das integrinas 41 e 51

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3. MATERIAL E MTODOS

3.1. SOLUES Os sais e reagentes utilizados neste trabalho so de procedncia Merck, Sigma ou Reagen, salvo indicao contrria. Para o preparo das solues, utilizou-se gua obtida pelo sistema Puritech / Permution. As solues foram preparadas e em seguida esterilizadas (1) por calor mido (autoclavao a 121 C, 30 min, 1 atm) ou (2) por filtrao (0,22 m Acrodisc) e, posteriormente, armazenadas em temperaturas apropriadas para sua conservao (temperatura ambiente T.A., 4 a 8 C ou a 20 C), ao abrigo de luz, conforme indicado. Os ensaios realizados em condies de esterilidade foram manipulados em cmara de fluxo laminar vertical TROX modelo FLVQ TAM 12.

3.1.1. Soluo salina fisiolgica

Cloreto de sdio 150 mmol/l em gua.

3.1.2. Soluo salina tamponada com fosfatos (PBS)

A soluo tampo foi preparada dissolvendo-se NaH2PO4.2H20 (150 mmol/l), Na2HPO4 (150 mmol/l) e NaCl (154 mmol/l) em gua. Aps ajuste do pH para 7,27,4 com soluo de NaOH 1 N, procedeu-se a esterilizao por autoclavao e armazenamento a 4 8 C.

3.1.3. Soluo de cristal violeta a 1,0% (p/v)

Cristal violeta, na proporo de 1:100 em gua.

3.1.4. Soluo de azul de tripano a 0,4% (p/v)

Azul de tripano em soluo salina tamponada com fosfatos.

3.1.5. PBS suplementado (PBSS)

PBS foi suplementado, em condies asspticas, na hora do uso, com soro albumina bovina (BSA) 0,25% (p/v), glucose 0,1% (p/v), CaCl2 (0,9 mmol/l) e MgCl2 (0,5 mmol/l).

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3.1.6. Soluo hemolisante de Gey

Soluo A: NH4Cl (654,20 mmol/l), KCl (24,83 mmol/l), Na2HPO4.H20

(6,53 mmol/l), KH2PO4 (0,88 mmol/l), glucose (27,77 mmol/l), vermelho de fenol (0,05 g/l). Soluo B: MgCl2.6H20 (2,06 mmol/l), MgSO4.7H20 (0,56 mmol/l), CaCl2 (3,42 mmol/l). Soluo C: NaHCO3 (26,78 mmol/l). O pH de cada soluo foi ajustado para 7,2 7,4 com soluo de NaOH 1 N e os reagentes foram conservados a 4 C. No momento do uso, a soluo hemolisante foi preparada na proporo de 4:1:1:14 para as solues A, B, C e gua, respectivamente.

3.1.7. Meio RPMI 1640

RPMI 1640 (Gibco) em p foi dissolvido em gua conforme instrues do fabricante e suplementado com 3 g/l de bicarbonato de sdio. O meio foi, ento, esterilizado por filtrao, usando-se o sistema a vcuo Sterifil, Millipore, com filtro de 0,22 m de dimetro.

3.1.8. Meio RPMI suplementado com 10% (v/v) de soro humano

No momento do uso, soro humano obtido de uma mistura de soros provenientes de sangue de, pelo menos, vinte doadores, foi acrescentado ao meio RPMI 1640, na proporo de 1:10, em condies de esterilidade.

3.1.9. Meio RPMI suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino
No momento do uso, soro fetal bovino adquirido comercialmente, foi acrescentado ao meio RPMI 1640, na proporo de 1:10, em condies de esterilidade.

3.1.10. Meio com fitohemaglutinina (M-PHA)

Meio para caritipo comercial (Cultilab, Campinas/SP), contendo PHA em RPMI 1640, HEPES e soro fetal bovino foi conservado temperatura de -20 C e ao abrigo de luz, conforme instrues do fabricante e descongelado somente na hora do uso.

3.1.11. Soluo de H2SO4 1% (v/v)

cido sulfrico P.A., na proporo de 1:100 em gua.

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3.1.12. Soluo de casena a 5% (p/v)

Casena em p foi dissolvida em PBS (50mg/ml) e aquecida a 56 oC por 10 min. A soluo foi resfriada rapidamente a 4 oC, centrifugada a 1300 x g por 5 min para remoo de partculas insolveis, fracionada em alquotas e armazenada temperatura de -20 C, sendo descongelada apenas na hora do uso.

3.1.13. gua do mar sinttica (Fontana et al., 1998)

Soluo contendo NaCl (26,30 g/l), KCl (0,75 g/l), CaCl2.2H20 (1,47 g/l), MgCl2.6H20 (5,10 g/l), NaBr (0,21 g/l), NaHCO3 (0,21 g/l) e MgSO4.7H20 (6,20 g/l), com pH 8,1, ajustado com soluo de NaOH 1 N, e conservada temperatura ambiente.

3.1.14. Soluo de Tripsina a 0,25% (v/v)

Tripsina (Worthington Biochemical Corporation), 195 unidades/mg de protena, foi dissolvida na proporo de 1:400 em PBS e esterilizada por filtrao.

3.2. MATERIAL BOTNICO As amostras de Annona glabra foram coletadas nas proximidades de Antonina, Paran, durante o ms de abril de 1997, e identificadas pelo Professor Olavo Guimares, Departamento de Botnica da UFPR. Uma exsicata, sob o nmero de identificao UPCB 40.105, encontra-se depositada no herbrio da UFPR. Cascas do caule foram utilizadas para obteno do extrato e para o isolamento do cido caurenico. O esteviol foi obtido atravs de hidrlise cida de esteviosdeo extrado de Stevia rebaudiana Bertoni. Todos os procedimentos de obteno do extrato e isolamento do cido caurenico e esteviol foram realizados pelo Laboratrio de Produtos Naturais do Departamento de Qumica da UFPR, e gentilmente cedidos para este estudo pelo Professor Dr. Brs Heleno de Oliveira.

3.3. OBTENO DE LEUCCITOS HUMANOS Este trabalho foi aprovado pelo Comit de tica em Pesquisa do Setor de Cincias da Sade da UFPR, sob registro CEP/SD 039.SI.003/04-01, em abril de 2004 (ANEXO A). Para obteno de sangue perifrico de voluntrios sadios,

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foi realizado puno venosa e as amostras foram acondicionadas em frascos estreis contendo heparina sdica (Vacuette Greiner Bio-one).

3.3.1. Separao das populaes de leuccitos humanos

As clulas mononucleares (MNC: linfcitos e moncitos) foram separadas dos granulcitos (GNC: polimorfonucleares, eosinfilos e basfilos) por meio de centrifugao em condies de esterilidade, usando-se o gradiente de densidade Ficoll-PaqueTMPLUS 1,077 g/cm3 (Amersham, Biosciences). Aps centrifugao a 200 x g por 10 min a T.A., o plasma rico em plaquetas foi retirado e o volume original reconstitudo com PBS. Nova centrifugao a 800 x g por 25 min permitiu a separao do creme leucocitrio, que foi submetido ao gradiente de densidade. Aps centrifugao de 200 x g por 30 min T.A., os MNC recuperados da interface do gradiente foram lavados duas vezes com PBS (800 x g por 5 min), ressuspensos em RPMI suplementado com 10% (v/v) de soro humano e a concentrao ajustada para 106 clulas/ml, aps contagem em hemocitmetro de Neubauer. Os

granulcitos recuperados do sedimento, aps lise dos eritrcitos com soluo hemolisante de Gey, foram lavados duas vezes com PBS, ressuspensos em PBS suplementado, enumerados com o auxlio de um hemocitmetro e sua concentrao igualmente ajustada para 106 clulas/ml.

3.4. VIABILIDADE E CITOTOXICIDADE SOBRE LEUCCITOS HUMANOS A viabilidade dos leuccitos foi avaliada aps o processo de isolamento e durante todas as etapas dos procedimentos metodolgicos. Para tanto, usouse o teste com azul de tripano (Merchant et al., 1964). Populaes de leuccitos isoladas como descrito anteriormente foram diludas

apropriadamente em soluo de azul de tripano 0,4% e sua viabilidade observada ao microscpio ptico (Olympus CH30). As clulas discriminadas como viveis apresentaram-se ntegras, brilhantes, incolores e redondas, enquanto que as no viveis mostraram-se coradas em azul, muitas com perda da definio de contorno. A toxicidade do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre leuccitos humanos foi avaliada usando-se concentraes crescentes de cada tratamento (0,01 a 100 g/ml, de 0,01 a 100 M e de 0,001 a 10 M, respectivamente). Para MNC, as amostras foram

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incubadas por 5 dias, a 37 C, em atmosfera de 5-10% de CO2. Para GNC, as amostras foram incubadas a 37 C, por 2 e 5 horas.

3.5. PREPARO DE CITOCENTRIFUGADOS Para observao da composio das fraes celulares ensaiadas, lminas contendo 8x104 clulas das suspenses leucocitrias foram preparadas por centrifugao a 250 x g por 5 min em T.A., sob baixa acelerao, em citocentrfuga Cytopro (Wescor). Em seguida, as lminas secas ao ar e fixadas por 10 min em metanol foram coradas com May-Grnwald-Giemsa e finalmente diferenciadas e enumeradas com auxlio de um microscpio ptico. Fotografias foram obtidas usando-se o programa IMAGE PRO PLUS, verso 3.0.01.00 para Windows, acoplado ao microscpio.

3.6. COLORAO DE MAY-GRNWALD-GIEMSA Citocentrifugados secos ao ar e fixados em metanol foram recobertos completamente com corante de May-Grnwald 0,3% em metanol por 3 min; posteriormente, foi adicionado gua destilada tamponada (pH 6,8) sobre a lmina por 1 min. Em seguida, as lminas foram recobertas com corante de Giemsa diludo em gua tamponada (1:20) por 15 min, lavadas em gua corrente e secas ao ar.

3.7. ENSAIO DE QUIMIOTAXIA DE GRANULCITOS A quimiotaxia dos granulcitos foi observada em cmaras de Boyden. Granulcitos humanos (2x105 clulas) separados por gradiente de densidade e ressuspensos em PBSS (200 l) foram adicionados ao compartimento superior da cmara de Boyden e estimulados a migrar contra gradientes de concentraes crescentes do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol (0,01 a 100 g/ml, de 0,001 a 1 M e de 0,001 a 0,1 M, respectivamente) depositado no compartimento inferior. Filtros de policarbonato isentos de polivinilpirrolidona (Nuclepore, Neuroprobe), com poros de 5 m de dimetro, foram usados para separar os compartimentos. As cmaras foram, ento, incubadas a 37 C por 90 min e o nmero de leuccitos que migraram ativamente para o compartimento inferior foram enumerados com o auxlio de um hemocitmetro. O monitoramento da migrao espontnea dos leuccitos

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(controle) foi realizado com adio de PBSS no compartimento inferior da cmara. Como controle positivo da migrao celular usou-se casena 5% (p/v). Os resultados esto expressos como a porcentagem mdia de clulas recuperadas do compartimento inferior das cmaras em relao aos resultados obtidos para a casena (controle positivo).

3.8. ENSAIO DE IMUNOMODULAO Para avaliar os efeitos imunomodulatrios, clulas MNC (106 clulas/ml) foram incubadas em RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro humano e na presena de concentraes crescentes de extrato de A. glabra (0,01 a 100 g/ml), de cido caurenico e de esteviol (0,001 a 1 M), em placas estreis de 96 cavidades (TPP), a 37 C, por 5 dias, em atmosfera de 5 a 10% de CO2. Em alguns experimentos, adicionou-se 10% (v/v) do Meio para Caritipo enriquecido com fitohemaglutinina (Cultilab-Campinas/SP) mistura. Cada ensaio foi realizado em triplicata e, como resultado de cada experimento, utilizou-se a mdia da triplicata.

3.8.1. Ativao e proliferao de linfcitos avaliada por citometria de fluxo

Aps incubao, as clulas MNC foram transferidas para tubos de ensaio apropriados e analisadas em citmetro de fluxo modelo FACSCalibur, Becton & Dickinson, equipado com laser de Argnio (488 nm) e detectores de disperso para tamanho e complexidade interna. Para cada anlise, eventos foram adquiridos por 45 segundos, na velocidade mdia, em escala linear, e grficos baseados no tamanho (FSC - forward light scatter) e na complexidade interna (SSC - side light scatter) das clulas foram construdos. Delineou-se regies discriminatrias para as populaes de linfcitos (R1) e de blastos (R2). Os dados foram analisados usando-se o programa WinMDI 2.8. O ndice de transformao blstica (TB) foi avaliado usando-se a mdia aritmtica das triplicatas (X) dos valores obtidos, como a seguir:

TB =

(n de clulas presentes em R2 n de clulas presentes em R1) n de clulas presentes em R2

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O efeito proliferativo foi avaliado atravs do ndice de proliferao (IP), em que a mdia aritmtica das triplicatas (X) dos valores obtidos por ensaio foram aplicadas como a seguir:

IP =

X (n de clulas detectadas em R2)teste X (n de clulas detectadas em R2)controle

3.8.2. Ativao de linfcitos avaliada morfologicamente

A morfologia das clulas aps o perodo de incubao foi observada para os diferentes grupos em citocentrifugados corados com May-GrnwaldGiemsa usando-se microscopia ptica de imerso. Linfcitos foram

reconhecidos por seu aspecto morfolgico caracterstico, apresentando-se como clulas arredondadas, pequenas, com elevada relao ncleocitoplasmtica, citoplasma geralmente escasso, de colorao azul, ausncia de granulao especfica, ncleo arredondado, com cromatina densa, com agregados irregulares e eventual presena de estruturas semelhantes a nuclolos, porm mal definidos. Linfcitos transformados pela ao da fitohemaglutinina foram considerados como blastos ou linfoblastos e

identificados como clulas maiores do que linfcitos no-ativados, citoplasma azul intenso, geralmente vacuolizado, com complexo de Golgi desenvolvido, definido como uma rea no corada ao redor do ncleo; cromatina delicada, presena de dois ou mais nuclolos visveis, proeminentes e delineados (Lee et

al., 1999).

3.9. TESTE DE LETALIDADE PARA NUPLIOS DE Artemia salina

3.9.1. Ecloso dos cistos de Artemia salina

Cistos de Artemia salina, armazenados em geladeira a 4 C, foram transferidos para soluo de gua do mar sinttica e mantidos em aerao contnua durante o perodo de ecloso (48 e 72 horas), com iluminao lateral constante, temperatura de 28 C. Os cistos viveis liberam nuplios que possuem fototropismo positivo e intensa atividade natatria,

acumulando-se nas margens mais iluminadas do recipiente.

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3.9.2. Ensaio de letalidade dos nuplios

Em tubos de hemlise contendo concentraes crescentes de extrato de

A. glabra, cido caurenico ou esteviol (20 a 100 g/ml) em volume mximo

de 2 ml de gua do mar sinttica, foram adicionados exatamente 10 nuplios por tubo, os quais foram transferidos para a superfcie de um transiluminador de luz branca. Aps 24 horas, com auxilio de lupa, os nuplios viveis, ou seja, com movimento natatrio, foram enumerados.

3.9.3. Concentrao letal em 50% dos nuplios (CL50)

CL50 a concentrao de uma substncia capaz de matar ou inviabilizar 50% dos nuplios em soluo. Para o clculo da CL50 foi utilizado o programa PROBIT a partir de cinco diferentes concentraes ensaiadas para o extrato de A. glabra, o cido caurenico e o esteviol. Cada ensaio foi realizado em triplicata e, como resultado de cada experimento, utilizou-se a mdia da triplicata.

3.10. ENSAIO COM CLULAS HEp-2

3.10.1. Manuteno de clulas HEp-2 Clulas de carcinoma epidermide de laringe humana, ou HEp-2 (ATCC CCL23), cedidas gentilmente pelo Setor de Virologia do Servio de Anlises Clnicas do Hospital de Clnicas da UFPR, foram cultivadas em monocamada em meio RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino. A cada 4-6 dias, 105 clulas/ml foram subcultivadas em frascos
estreis de 25 cm2 (TPP) aps tripsinizao, a 37 C, em atmosfera de 5-10% de CO2.

3.10.2. Viabilidade e citotoxicidade

A viabilidade das clulas HEp-2 foi avaliada com azul de tripano usando-se o mesmo procedimento descrito para leuccitos humanos. Os efeitos txicos do extrato de A. glabra (0,01 a 10 g/ml), do cido caurenico (0,0001 a 0,01 M) e do esteviol (0,0001 a 0,01 M), foram avaliados aps incubao dessas clulas por 24 horas, a 37 C, com concentraes crescentes usando-se o corante azul de tripano.

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3.10.3. Ensaio de adeso

Clulas HEp-2 (5x104 clulas/ml) foram incubadas em RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e na presena de concentraes crescentes de extrato (0,01 a 10 g/ml), de cido caurenico ou de esteviol (0,0001 a 0,01 M), a 37 C, em placas de 96 poos (TPP). Aps 24 horas, o sobrenadante foi desprezado e cada poo lavado 2 vezes com PBS. As clulas foram fixadas por 5 min com metanol e coradas com cristal violeta a 1,0% (p/v) por 3 min. Em seguida, os poos foram lavados com gua e secos ao ambiente. O ndice de clulas aderidas foi obtido com auxlio do Programa UTHSCSA ImageToll for Windows, verso 3.00, o qual faz a captura de imagens disponibilizadas como objetos em tonalidades de cinza sobre um fundo claro contrastante. Para tanto, aps a incubao e eliminao das clulas no aderentes, as aderidas foram coradas e visualizadas em microscpio ptico invertido BIOVAL modelo XDS-1B. Vrios campos foram fotografados com auxilio de uma cmara fotogrfica digital SONY modelo DSCW5, como ilustrado na Figura 5-A. As fotos digitalizadas foram, ento, transferidas para um computador e submetidas a anlise pelo programa como a seguir. Inicialmente as imagens foram transformadas para escala de cinza, cuja intensidade da cor foi subjetivamente escolhida para capturar a maioria das clulas presentes no campo. Neste contexto, o intervalo de escala de cinza escolhido para todas as leituras foi entre zero e 55. Cada clula assim capturada passou a ser reconhecida como objeto e, como tal, foi delineada em vermelho e submetida a escrutnio (Figura 5-B). Cada ensaio foi realizado em triplicata e, como resultado de cada experimento, utilizou-se a mdia da triplicata. Depois de normalizados, os resultados foram expressos como a quantidade de clulas aderidas em cada cavidade em relao aos resultados obtidos para o controle.

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Figura 5. Aplicao do Programa UTHSCSA ImageToll for Windows, verso 3.00, para o estudo dos efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a adeso de clulas HEp-2. Aps exposio concentraes crescentes do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol por 24 horas, a 37C, clulas HEp-2 foram fixadas e coradas com soluo de cristal violeta 1% e fotografadas com auxlio de cmara digital Sony DSC-W5 (A). As fotos foram transferidas para um computador e analisadas. As imagens foram transformadas para escala de cinza, cujo intervalo foi entre zero e 55. Ao se acionar essa funo, cada clula que passou a ser reconhecida como objeto foi delineada em vermelho (B) e submetida a escrutnio.

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3.10.4. Expresso de molculas de adeso

Clulas HEp-2 (5x104 clulas/ml) foram incubadas em RPMI 1640 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino e na presena de concentraes crescentes de extrato (1 e 10 g/ml), de cido caurenico (0,001 e 0,01 M) e de esteviol (0,001 e 0,01 M) por 24 horas, a 37 C. Em seguida, as clulas foram liberadas por tripsinizao. Aps lavagem com PBS, 5l de soluo de anticorpos monoclonais conjugados ficoeritrina (PE) para 41 (Pharmingen/BD) e ao isotiocianato de fluorescena (FITC) para 51 (Immunotech) foram adicionados, e a mistura incubada ao abrigo da luz por 15 min, TA. As clulas marcadas foram ento, lavadas duas vezes com PBS e ressuspensas em 0,5 ml de soluo de paraformaldeido 1%. Os nveis de expresso de 41 e 51 nas clulas HEp-2 foram analisados em um citmetro de fluxo Becton & Dickinson, modelo FACSCalibur, equipado com laser Argnio 488 nm. Em todas as determinaes citomtricas, um mnimo de 104 clulas foi analisado e a linha limite de deteco baseou-se na mxima colorao obtida com a mesma populao, porm sem estar marcada com o anticorpo monoclonal.

3.11. ESTUDOS ESTATSTICOS Os resultados esto apresentados como a mdia 1 erro padro da mdia (EPM) quando n 3, e como a mdia 1 desvio padro (DP), quando n = 2. Para anlise estatstica dos resultados, usou-se a Anlise de Varincia (ANOVA one way); o teste post hoc empregado foi o teste de Tukey quando apropriado. Os clculos foram realizados utilizando-se o programa Statistica e valores de p 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

3.12. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS - FORMATAO As referncias bibliogrficas deste trabalho foram formatadas utilizando-se o programa EndNote, verso 9.0.0., tendo como padro o peridico The Journal

of Cell Biology.

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4. RESULTADOS E DISCUSSO

Como j referido, a incorporao de plantas medicinais ao aparato teraputico utilizado nas mais variadas doenas tem ganhado espao cada vez maior, o que refora a importncia das plantas medicinais como fonte de substncias que possuem atividade biolgica. Considerando o potencial biolgico do extrato de A. glabra e do cido caurenico como descrito na introduo deste trabalho, investigou-se suas propriedades sobre leuccitos humanos, clulas tumorais e sobre o microcrustceo Artemia salina usando ensaios in vitro clssicos, cujos resultados esto demonstrados e discutidos a seguir. Em paralelo, avaliou-se o comportamento do esteviol em ensaios similares, uma vez que este difere do cido caurenico apenas pela presena de uma hidroxila no carbono 13 do anel terpnico, como anteriormente citado.

4.1. ENSAIOS DE SOLUBILIZAO Como as metodologias escolhidas para investigar as atividades biolgicas do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol envolviam sistemas aquosos incompatveis com sua natureza, utilizou-se o etanol como solvente com a finalidade de maximizar sua incorporao em PBSS, RPMI suplementado e gua do mar sinttica, uma vez que este solvente j se mostrou adequado nos modelos experimentais propostos (Floro, 2006). Entretanto, no momento da incorporao, precipitao ou turvao em concentraes superiores a 100 g/ml para o extrato de A. glabra, a 100 M para o cido caurenico e a 10 M para o esteviol foram observadas. Dessa forma, para os estudos que compem este trabalho, as concentraes utilizadas foram sempre inferiores quelas cuja solubilidade se mostrou inadequada.

4.2. ENSAIOS COM LEUCCITOS HUMANOS

4.2.1. Toxicidade
A realizao de ensaios biolgicos com clulas humanas exige, alm de um solvente que permita a incorporao dos princpios ativos em meio aquoso, testes preliminares para avaliao de sua toxicidade. Neste contexto, o ensaio

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que utiliza o corante azul de tripano muito til, pois permite observar este efeito sobre as clulas em estudo, as quais possuindo membrana

citoplasmtica ntegra, com preservao da sua permeabilidade seletiva, excluem o corante (Merchant et al., 1964). Desta forma, clulas viveis, aps alguns minutos em contato com o corante, apresentam-se incolores, esfricas e refringentes, enquanto as clulas mortas ou inviveis coram-se em azul. Neste trabalho, o corante azul de tripano foi utilizado para avaliar no s a toxicidade do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre leuccitos humanos, como tambm sobre clulas tumorais, como ser mais adiante explorado. Em um primeiro momento, para a realizao dos ensaios de quimiotaxia e imunomodulao, os leuccitos obtidos de sangue perifrico de voluntrios sadios foram divididos em duas populaes, granulcitos (GNC) e

mononucleares (MNC), ambas obtidas aps centrifugao com gradiente de densidade. Como esperado, citocentrifugados corados com May-GrnwaldGiemsa das duas populaes demonstraram que linfcitos e moncitos predominaram entre os MNC (> 95%), enquanto neutrfilos e raros eosinfilos constituram mais de 99% da frao dos GNC (n = 3). Alm disso, somente amostras contendo 90% de clulas viveis aps o processo de isolamento, independente da frao em anlise, foram utilizadas nos experimentos. Com o objetivo de avaliar sua toxicidade, leuccitos GNC e MNC foram expostos a concentraes crescentes do extrato de A. glabra (0,01 a 100 g/ml), de cido caurenico (0,01 a 100 M) e de esteviol (0,001 a 10 M) e seus efeitos investigados com azul de tripano sob microscopia de luz, aps duas e cinco horas de incubao a 37C para os GNC e, para a populao de MNC, aps cinco dias de cultivo, a 37C, sob atmosfera de 5% de CO2. Esses perodos de incubao antes de se acessar a viabilidade celular, diferenciados entre as populaes, correspondem queles necessrios para a realizao dos ensaios de quimiotaxia com GNC e quele em que se pode observar alguma atividade imunomodulatria nas condies experimentais previamente

estabelecidas em nosso laboratrio (Machado Jr. et al., 2006). Para os MNC, avaliou-se tambm a possibilidade de efeitos na presena de PHA, uma vez que essas clulas seriam ativadas por este mitgeno. Os resultados apresentados foram normalizados em relao aos controles, constitudos de

40

populaes no expostas a nenhuma das substncias em estudo, adotando-os como 100% de viabilidade celular e esto ilustrados na Figura 6.

A
1 20

1 00

Viabiliadade (%)

80

60 40

EX 2h EX 5h

20

0 0,01 0,1 1 1 0 1 00

C o nc e nt ra o ( g/ m l)

Extrato de A. glabra (g/ml)

B
120 120

100

100

Viabiliadade (%)

80

80

60

A C 2h A C 5h

60

EST 2h EST 5h

40

40

20

20

0 0,01 0,1 1 10

0 0,001 0,01 0,1 1

C o ncent r ao ( M )

C o ncent r ao ( M )

cido Caurenico (M)

Esteviol (M)

Figura 6. Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de granulcitos humanos. Granulcitos obtidos de sangue perifrico de voluntrios sadios, aps isolamento em gradiente de densidade, foram expostos s concentraes indicadas do extrato de A. glabra (A), cido caurenico (B) e esteviol (C), e incubados por 2 e 5 horas, a 37C. Os pontos representam a mdia DP, em porcentagem, de clulas viveis verificada pelo teste de azul de tripano aps normalizao dos dados em relao ao controle (n = 3).

41

Para GNC, todas as concentraes utilizadas, independente do tratamento e do perodo de incubao, apresentaram comportamento semelhante, no sendo evidenciado nenhum efeito txico. Assim, para o extrato de A. glabra (Figura 6-A), cido caurenico (Figura 6-B) e esteviol (Figura 6-C) observou-se, respectivamente, na maior concentrao testada, 96,6 0,8, 94,9 0,9 e 98,5 2,6% (n = 3) de viabilidade em relao ao grupo controle aps duas horas de incubao. Da mesma forma, aps cinco horas de cultivo, a viabilidade celular mdia manteve-se em 103,3 3,8% para as clulas expostas ao extrato de A. glabra, em 95,0 1,7% para aquelas incubadas com cido caurenico e em 100,0 3,1% para os ensaios com esteviol (n = 3), todos em sua maior concentrao ensaiada. Quanto aos MNC (Figura 7), aps cinco dias de incubao, evidenciouse toxicidade somente para as clulas expostas ao cido caurenico na concentrao de 100 M (Figura 7-B), com 46,8 2,0 e 55,0 1,9% somente de viabilidade em relao ao controle, respectivamente, para aquelas cultivadas na ausncia e na presena de PHA. Tambm no foi evidenciado nenhum efeito txico para o extrato de A. glabra (Figura 7-A) e esteviol (Figura 7-C) sendo observado, respectivamente, na maior concentrao testada sem PHA, 97,6 1,2 e 87,0 1,3%, e com PHA, 95,9 1,9 e 100,0 0,5% (n = 3) de viabilidade em relao ao grupo controle. Com esses estudos foi possvel estabelecer as concentraes que seriam utilizadas para os ensaios propostos utilizando leuccitos humanos e que foram coincidentes com aquelas obtidas com os ensaios de solubilidade. A literatura relata estudos de citotoxicidade tanto para o extrato de

A. glabra, para o cido caurenico como para o esteviol, mas principalmente

sobre linhagens de clulas tumorais, como ser explorado mais adiante neste trabalho. Entretanto, atividades citotxicas do extrato de A. glabra e do cido caurenico j foram relatadas tambm para o Trypanosoma cruzi (Vieira et al., 2002) e, semelhana de A. muricata (Jaramillo et al., 2000), para espcies de

Leishmania (Carvalho et al., 2001). O efeito do cido caurenico isolado de Xylopia sp. e das partes areas de Wedelia paludosa tambm foi investigado
sobre formas tripomastigotas de Trypanosoma cruzi, apresentando uma CL50 de 0,57 mM (Vieira et al., 2002). Ainda, hemlise de eritrcitos humanos e

42

de camundongos, a 74,0 e 56,4 M para o cido caurenico (Costa-Lotufo et

al., 2002), respectivamente, e atividade contra dermatfitos (Boeck et al., 2005)

foram recentemente descritas.

A
1 20 1 00

Viabiliadade (%)

80

60 EX 40 EX + P HA

20

0 0,1 1 1 0 1 00 C o nc ede nt ra o ( g/(m l) Extrato A. glabra g/ml)

B
1 20 1 20

1 00 AC

1 00

Viabiliadade (%)

80

A C + P HA

80

60

60 EST EST + P HA

40

40

20

20

0 0,1 1 1 0 1 00

0 0,01 0,1 1 1 0

C o nc e nt ra o ( M )M) cido Caurenico (

C o nc e nt ra (o ( M ) Esteviol M)

Figura 7. Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de leuccitos mononucleares humanos. Mononucleares obtidos de sangue perifrico de voluntrios sadios, aps isolamento em gradiente de densidade, foram tratados com as concentraes indicadas de extrato de A. glabra (A), cido caurenico (B) e esteviol (C) e incubados por 5 dias em atmosfera de 5% de CO2, a 37 C. Os pontos representam a mdia DP, em porcentagem, de clulas viveis verificada pelo teste de azul de tripano, normalizados em relao ao controle (n = 3).

43

Entretanto, modificaes estruturais no C-16 ou no C-19 do cido caurenico no foram eficientes em aumentar a atividade trypanosomicida deste composto, assim como contriburam muito pouco para evitar sua ao ltica sobre eritrcitos (Vieira et al., 2002). Da mesma forma, somente derivados contendo grupos carboxilatos livres apresentaram atividade contra dermatfitos (Boeck et al., 2005), porm este efeito foi inferior ao observado para o cido caurenico. Por outro lado, glicosilao do C-17 intensificou a atividade

trypanosomicida (Batista et al., 2007), sugerindo que o acrscimo de um acar na molcula possa facilitar o transporte do cido caurenico atravs da membrana do parasita. Como nenhum trabalho que avaliasse a toxicidade sobre leuccitos humanos foi encontrado, os resultados aqui descritos colaboram com os estudos j existentes sobre a toxicidade dessas substncias sobre clulas normais. Como eles favorecem o uso do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol para estudos biolgicos com clulas humanas, preciso ressaltar que resultados de experimentao in vitro no devem ser comparados com a dinmica de um organismo vivo, pois neles tem-se um acmulo de metablicos no meio de cultura, os quais, devido ausncia das vias de biotransformao e excreo como normalmente ocorre in vivo, no podem ser eliminados do sistema, causando efeito nocivo que pode superestimar a toxicidade de substncias (Hayes et al., 2002).

4.2.2. Quimiotaxia
Dentro do processo inflamatrio, os leuccitos circulantes aderem-se ao endotlio capilar e, aps diapedese, ganham a MEC e direcionam-se para o local da leso atravs de um gradiente de concentrao qumico, aproximandose do agente causal. A, utilizam-se de armas para a eliminao do mesmo, com concomitante reparo do tecido. Todo esse processo acionado quando agentes fsicos, qumicos ou biolgicos, como bactrias e vrus, conseguem, de algum modo, ultrapassar as barreiras naturais dos organismos vivos, representadas principalmente pela pele e mucosas no homem, favorecendo o recrutamento de populaes celulares distintas com vistas sua eliminao. Quando este processo torna-se

44

exacerbado, ultrapassando os efeitos salutares, h a necessidade de se usar agentes que interfiram em uma ou mais das etapas que compem a resposta inflamatria. O ensaio de quimiotaxia como proposto por Boyden no incio dos anos 60 (Boyden, 1962) e suas variaes tm se mostrado teis como uma metodologia in vitro para se investigar o efeito de substncias extradas de plantas sobre a quimiotaxia de leuccitos (Chen et al., 2001; Hofbauer et al., 1999; Hofbauer et al., 2001; Muller et al., 1999; Shen et al., 2001). Neste trabalho, investigou-se o potencial do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol no recrutamento de fagcitos de sangue perifrico, em particular granulcitos, utilizando-se cmaras de Boyden. Para tanto, essas substncias foram adicionadas ao compartimento inferior das cmaras, separado do superior por filtros de policarbonato contendo poros de 5 m de dimetro. Para fins de comparao de efeito, utilizou-se a casena, uma protena reconhecidamente dotada de potente atividade quimiottica sobre GNC humanos (McCutcheon, 1955; Solymossy et al., 1986), para a qual os dados foram normalizados em 100%. Os resultados esto ilustrados na Figura 8. A percentagem mdia de clulas que migraram para o compartimento inferior das cmaras de Boyden, aps exposio s concentraes de 0,01, 0,1, 1, 10 e 100 g/ml do extrato de A. glabra, foi dependente da concentrao e significativamente menor (n = 4; p < 0,0001 para todas as concentraes) do que a observada para a populao controle (25,3 1,9%), exposta somente ao PBSS, com valores de 22,4 0,0%, 13,0 1,0%, 9,9 0,7%, 10,3 2,1% e 11,4 2,2%, respectivamente. Em contraste, observou-se um aumento significativo de clulas recrutadas tanto pelo gradiente de cido caurenico, com 38,9 2,8%, 32,5 2,4%, 29,6 1,7%, 13,7 2,9% para as concentraes respectivas de 0,001, 0,01, 0,1 e 1 M (n = 4; p < 0,0001 para todos), como para o de esteviol, com 30,6 4,7%, 35,8 13,2%, 54,9 10,2% (n = 4; p < 0,0001 para todos) para as concentraes de 0,001, 0,01 e 0,1 M, respectivamente. Nesta srie de experimentos, observou-se que o cido caurenico estimulou significativamente a quimiotaxia de GNC humanos a favor do seu gradiente em concentraes baixas e inibiu-a na concentrao mais elevada

45

ensaiada (1,0 M). J o esteviol demonstrou padro de efeito quimiottico atraente similar ao do cido caurenico e, na concentrao de 0,1 M, este efeito foi, inclusive, significativo tanto em relao ao controle como em relao ao efeito observado para o cido caurenico nas concentraes de 0,1 e 0,01 M (p = 0,01). Entretanto, quando comparados, o melhor efeito do cido caurenico na estimulao da migrao de granulcitos humanos foi em uma concentrao pelo menos 100 vezes inferior do esteviol, demonstrando um aspecto importante do ponto de vista de ao farmacolgica desses compostos com relao ao binmio dose-efeito. Relevante o fato de que no se deve excluir que um nmero maior de experimentos com o esteviol poderia modificar a interpretao desses resultados, uma vez que essas diferenas estatsticas talvez fossem minimizadas ou mesmo desapareceriam.

*
120 100 Migrao Celular (%) 80
0,000003 2 0,000032 0,00032 0,0032 0,032 p = 0,01 p = 0,01

*
60

*
40

* *

*
20 0

0, 00 1 0, 01

0, 01

0, 01

0, 1

0, 1

10 0

CAS PBSS PBS

EX

AC

0, 00 1

EST

Figura 8. Avaliao dos efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a quimiotaxia de granulcitos humanos. Granulcitos (GNC) obtidos de sangue perifrico de doadores sadios foram expostos s concentraes indicadas do extrato de A. glabra (EX - g/ml), de cido caurenico (AC - M), de esteviol (EST - M) e de casena (CAS), adicionadas ao compartimento inferior de cmaras de Boyden, e estimulados a migrar por noventa minutos, a 37 C. As colunas representam a porcentagem mdia EPM de GNC recuperados do compartimento inferior da cmara de Boyden em relao populao controle exposta ao PBSS (n = 4); [*] p < 0,0001 em relao ao controle (ANOVA, seguida do teste de Tukey). [*] Concentrao de cido caurenico (M) no extrato.

0, 1

10

46

Mesmo que o efeito quimiottico apresentado por ambos tenha sido significativo em relao populao controle, preciso notar que nenhum deles se mostrou superior ao efeito demonstrado pela casena. Neste contexto, a presena de receptores para a casena j foi descrita na superfcie tanto de granulcitos como de moncitos (Lewis et al., 1983). Alm disso, a casena uma protena do leite com ao opiide (Goody et al., 2001), com efeitos inibitrios descritos sobre as respostas imunes celular e mediada por anticorpos, na atividade de clulas NK, na expresso de citocinas e na atividade fagoctica, como revisado pelo grupo de Szabo (Szabo et al., 2002), decorrentes de sua interao com diferentes receptores opiides. Investigar os tipos de receptores presentes nos granulcitos que interagem com o cido caurenico e o esteviol poderia esclarecer o mecanismo de ao dessas substncias na modulao do efeito observado. Outro aspecto interessante que deve ser destacado nesse estudo que, segundo Oliveira e colaboradores (2002), o cido caurenico constitui cerca de 10%, em peso, do extrato de A. glabra utilizado, implicando que, nas concentraes de 10 e 100 g/ml desse extrato, cerca de 1 e 10 g/ml, respectivamente, corresponderiam ao seu contedo em cido caurenico, ou seja, corresponderiam a 0,0032 e 0,032 M em cido caurenico,

respectivamente, visto que, o extrato de A. glabra e o cido caurenico utilizados neste trabalho foram os mesmos utilizados por Oliveira e colaboradores. Assim, seria de se esperar que o extrato promovesse uma ao de recrutamento celular em favor de seu gradiente como o observado para as concentraes de 10 e 100 g/ml, e no um efeito contra o gradiente como o obtido. Entretanto, medida que se aumentou a concentrao de cido caurenico no sistema, observou-se diminuio proporcional da migrao celular. Uma pergunta que, ento, se tornou pertinente foi com referncia aos eventos que aconteceriam caso concentraes superiores a 100 M de cido caurenico pudessem ser avaliadas. Neste contexto, seria interessante repetir este ensaio utilizando um outro solvente, atxico para GNC humanos, que levasse a uma maior e melhor solubilizao do cido caurenico no PBSS.

47

Conseqentemente, maiores concentraes poderiam ser incorporadas ao sistema, permitindo investigar com mais detalhes esta atividade. Por outro lado, vrios estudos tm demonstrado que leuccitos respondem de formas diferentes a estmulos quimiotticos, dependendo de estarem ou no sensibilizados e/ou ativados pela presena de citocinas inflamatrias (Ozaki et al., 1987; Shalaby et al., 1985). A resposta das clulas na presena de cido caurenico, nas condies experimentais propostas, foi evidente, tanto que as mesmas ativaram-se e, consequentemente, migraram em favor de seu gradiente. Alm disso, este efeito pareceu estar associado a um nvel mnimo de concentrao do cido caurenico, pois medida que sua concentrao aumentava, a intensidade do efeito reduzia-se. Avaliar, portanto, o efeito de concentraes ainda menores do cido caurenico constitui-se um ponto necessrio e esclarecedor deste particular. J para o grupo tratado com extrato, observou-se uma resposta negativa em relao ao gradiente, porm a amplitude desse efeito foi muito semelhante para as concentraes entre 0,1 e 100 g/ml. Nesta ltima concentrao, o efeito foi, inclusive, muito prximo daquele causado pelo cido caurenico a 1,0 M. Assim, possvel que concentraes mais elevadas de cido caurenico no extrato possam contribuir para um efeito inibitrio. Mas, com certeza h neste extrato substncias outras promotoras do efeito inibidor da quimiotaxia observado, cuja potncia superior quela promovida pelo cido caurenico ali presente, e que devem ser investigadas. Relatos sobre a interferncia de extratos preparados de plantas medicinais ou de compostos deles purificados sobre a inibio da quimiotaxia de leuccitos humanos como o aqui demonstrado para o de A. glabra so particularmente frequentes na literatura (Hofbauer et al., 1999; Hofbauer et al., 2001; Ihantola-Vormisto et al., 1997), inclusive em trabalhos recentes divulgados por nosso grupo (Presibella et al., 2006). Entretanto, foi intrigante o fato de o extrato da A. glabra, o qual tem cido caurenico em concentrao relativamente elevada, demonstrar comportamento inibitrio. Mas, por outro lado, os resultados obtidos com o cido caurenico purificado vm de encontro ao relato recente de que ratos portadores de colite induzida por cido actico, previamente tratados com cido caurenico purificado da leguminosa Copaifera langsdorffii, demonstraram reduo da

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inflamao associada a um aumento da atividade da mieloperoxidase, uma enzima considerada marcadora de infiltrao neutroflica (Paiva et al., 2002), corroborando com a indicao de uma atividade pr-migratria para este composto. O movimento celular direcional, ou a quimiotaxia, constitui-se de uma etapa fundamental dos processos que regulam e medeiam sincronicamente as respostas imune e inflamatria, e depende de um grupo de substncias definidas genericamente como fatores quimiotticos (FQ), ou ligantes capazes de induzir uma locomoo direcional a favor ou contra um gradiente de concentrao (Wilkinson et al., 1988). Se h um ligante, necessrio que a clula em questo apresente um ou mais receptores que permitam o acoplamento deste ligante. Dessa forma, tanto o cido caurenico como o esteviol demonstraram comportamento de FQ, pois os resultados mostraram que ambos foram capazes de promover a quimiotaxia de GNC humanos a favor de seus gradientes, implicando que essas clulas so dotadas de um ou mais receptores que permitem sua interao. A quimiotaxia de granulcitos especificamente compreende um processo complexo, constitudo por uma infinidade de ligantes e seus receptores. H um certo grau de especificidade da substncia quimiottica em relao clulaalvo, assim como uma relao dose-dependente. Por exemplo, algumas substncias como a casena, que so muito potentes em ativar a quimiotaxia de neutrfilos, podem provocar moderada resposta em moncitos e ser inativa para linfcitos. Outras estimulam vrios tipos celulares, mas em concentraes diferentes, como o caso do f-MLP, o qual ativo a 10-9 M para neutrfilos, e a 5x10-9 M para moncitos (Wilkinson et al., 1988). Ainda, h substncias que podem, eventualmente, ligar-se a diferentes tipos de receptores com diferentes intensidades de ligao, assim como um receptor pode acoplar-se a ligantes diferentes. Esta situao referida na literatura como promiscuidade receptor-

ligante (Broxmeyer et al., 1999).

A maioria dos receptores proticos envolvidos na migrao celular pertence famlia de receptores associados ao complexo heterotrimrico da protena G (Rang et al., 2001), os quais respondem atravs de uma sucesso de interaes e desacoplamentos das subunidades , e at a associao final com uma enzima-alvo, a qual ativa uma ou mais molculas sinalizadoras,

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tambm denominadas mensageiros secundrios (Alberts et al., 1994). Em regra, a transduo de sinal desses receptores se d pela hidrlise do fosfatidilinusitol 4,5-bifosfato (PIP2) em seus mensageiros intermedirios, o inusitol 1,4,5-trifosfato (IP3) e o diacilglicerol (DG). O IP3 mobiliza as reservas intracelulares de Ca2+, levando a um aumento transitrio de Ca2+ intracelular, enquanto o DG estimula a fosfoquinase C, que atravs da fosforilao de uma infinidade de molculas efetoras promove uma variedade de respostas celulares (Ben-Baruch et al., 1995). Ou seja, a ativao de um receptor e/ou o mecanismo de transduo por ele desencadeado direciona o comportamento celular e culmina no

desencadeamento de uma ou mais atividades celulares, incluindo os mecanismos observados nas respostas inflamatrias como a mobilizao de Ca2+ intracelular (Hallet et al., 1990), rearranjo do citoesqueleto, exocitose, induo da expresso de receptores de superfcie, mudanas na adeso e agregao (Smith et al., 1979), produo de superxidos (Thelen et al., 1993), aumento da atividade metablica (Bokoch, 1995), quimiotaxia (Zigmond, 1977), dentre outras, como revisado por Dudez e colaboradores (2002). Portanto, possvel que os efeitos observados tanto para o extrato de

A. glabra como para o cido caurenico e o esteviol sobre a mobilizao de

GNC humanos envolvam mecanismos relacionados cascata complexa da quimiotaxia, a qual depende do tipo celular envolvido, do ligante, da estrutura e configurao dos receptores, da protena G envolvida e das diferentes enzimasalvo que so ativadas no processo, alm da possibilidade de, para o extrato de

A. glabra em particular, devido sua complexidade em termos de composio,

serem resultantes da somatria de respostas moleculares causadas por cada um de seus constituintes isoladamente. J para o cido caurenico, estudos recentes apontam para uma ao tanto em nvel de membrana celular via protena G (Tirapelli et al., 2004), quanto de ncleo (Zhang et al., 2004), sugerindo que o mecanismo quimiottico observado neste estudo possa estar envolvido diretamente com a ativao de receptores associados protena G ou, indiretamente, com a induo da produo de alguma quimiocina por regulao da expresso de seus genes, como j sugerido para a IL-8 (Taub et al., 1994).

50

Devido s semelhanas estruturais, o esteviol pode tambm estar atuando por mecanismos semelhantes aos do cido caurenico, porm com intensidades diferentes. Estudos mais aprofundados, incluindo definio de receptores, devem ser realizados por meio de ensaios experimentais mais especficos, que possam esclarecer os mecanismos moleculares envolvidos, dos quais aplicaes teraputicas possam ser exploradas.

4.2.3. Imunomodulao
Um dos objetivos deste trabalho foi o de se avaliar a ao do extrato de

A. glabra,

do

cido

caurenico

do

esteviol

sobre

potencial

imunomodulatrio de linfcitos humanos em seu estado basal e quando estimulados por fitohemaglutinina, uma vez que, aps a instalao de um agente patognico, o organismo reage para a eliminao do mesmo numa ao integrada entre os fagcitos, protagonistas da reao inflamatria, e as clulas do sistema imunitrio ou imunolgico. Para tanto, observou-se seus efeitos sobre a capacidade de ativao de clulas MNC obtidas de sangue perifrico de indivduos sadios, avaliada pela transformao blstica, e sobre sua capacidade proliferativa. A estratgia utilizada para avaliar esses parmetros por citometria de fluxo, ilustrada com detalhes na Figura 9, baseou-se essencialmente no trabalho recente de Machado Jr. e colaboradores (2006). Brevemente, grficos obtidos aps anlise das amostras por citometria de fluxo correlacionando o tamanho celular versus a complexidade interna, serviram de base para delimitar subjetivamente duas regies. A primeira, R1, contendo clulas de pequeno tamanho e de menor complexidade interna, como o caso dos linfcitos em seu estado basal (Figura 9-A). E a regio R2, compreendendo clulas ativadas (denominadas linfoblastos), ou seja, que sofreram alterao morfolgica, tambm conhecida como transformao blstica, e que se caracterizam por tamanho e complexidade interna maiores em relao a linfcitos basais (Figura 9-B). preciso esclarecer que nem todos os linfcitos de uma populao de sangue perifrico sofrem ativao quando simultaneamente estimulados, permanecendo na regio R1. Assim sendo, a regio R2 inclui clulas da regio R1 quando se est analisando um efeito de ativao.

51

S S C FSC

Figura 9. Representao grfica em pontos para anlise da atividade imunomodulatria de linfcitos por citometria de fluxo. Os grficos representam populaes de mononucleares, em que as caractersticas de tamanho (FSC) e complexidade interna (SSC) foram utilizadas para distinguir cada populao e definir as regies para avaliao da proliferao de linfcitos do grupo controle (A) e do grupo tratado, neste caso com fitohemaglutinina (B). A regio delimitada por R1 corresponde populao de linfcitos normais no ativados; R2 corresponde a populao de linfcitos ativados, os quais se transformam em linfoblastos, e as regies no delimitadas compreendem outras clulas e debris. Citocentrifugados preparados dessas populaes e corados com May-Grnwald-Giemsa demonstram, respectivamente, predominncia de linfcitos (C) e de blastos (D). (1000x).

52

Alm da citometria de fluxo e como bem caracterizado no trabalho de Machado Jr. (2006), a ativao de linfcitos tambm pode ser acompanhada morfologicamente, examinando-se preparaes citolgicas coradas com MayGrnwald-Giemsa. Neste estudo, anlise de citocentrifugados das populaes de MNC incubadas por cinco dias somente em meio de cultura convencional demonstrou que, em mdia, 90,2 4,9% dessas clulas permaneceram com morfologia de linfcitos (Figura 9-C), confirmando dados da literatura e sugerindo que essas clulas por si s, no tm a habilidade de se ativar. Entretanto, quando expostas a fitohemaglutinina, somente 5,1 3,5% das clulas permaneceram com morfologia caracterstica de linfcitos, sendo o restante representado por linfoblastos, ilustrados na Figura 9-D. Assim, avaliou-se a capacidade do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol de interferirem na ativao e na proliferao de linfcitos humanos em seu estado basal, presentes na frao de MNC obtidos de indivduos sadios. Com os resultados apresentados na Figura 10, foi possvel constatar que nenhuma das concentraes ensaiadas dessas substncias interferiu na transformao blstica ou na proliferao de linfcitos, indicando que essas substncias so desprovidas da capacidade de ativar linfcitos humanos e, como conseqncia, promover sua proliferao. Como visto anteriormente, a resposta dos linfcitos a antgenos in vivo especfica, gerando amplificao clonal; e sua resposta a mitgenos in vitro inespecfica e influencia, simultaneamente, um grande nmero de clulas, levando-as a sofrer transformao blstica e proliferao. Esta propriedade favorece estudos experimentais com a fitohemaglutinina, uma lectina extrada e purificada de Phaseolus vulgaris que tem a habilidade de estimular in vitro sub-populaes de clulas T humanas levando-as a proliferar (Myers, 1995). Como a fitohemaglutinina j havia demonstrado competncia para estimular a proliferao de linfcitos humanos na metodologia proposta (Floro, 2006; Machado Jr. et al., 2006), avaliou-se se o extrato de A. glabra, o cido caurenico e o esteviol poderiam interferir na ativao dessas clulas quando simultaneamente expostas ao mitgeno. Os resultados desta avaliao esto demonstrados na Figura 11. Da mesma forma, observou-se que em nenhuma das concentraes na ensaiadas dessas substncias ou houve na

interferncia

transformao

blstica

53

A
3

Transformao blstica

0 0,01 PBS 0,1 1 EX 10 100 0,001 0,01 0,1 1 0,001 0,01 0,1 1

AC

EST

B
3

ndice de proliferao

0 0,01 PBS 0,1 1 EX 10 100 0,001 0,01 AC 0,1 1 0,001 0,01 0,1 1

EST

Figura 10. Efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a transformao blstica e a proliferao de linfcitos humanos. Mononucleares obtidos de sangue perifrico foram cultivados por 5 dias, a 37C, em atmosfera de 5% de CO2, com as concentraes indicadas do extrato de A. glabra (EX - g/ml), cido caurenico (AC - M) e esteviol (EST M). Cada coluna em (A) representa a mdia EPM de linfcitos que sofreram transformao blstica, obtida da relao entre a diferena do nmero de eventos detectados por citometria de fluxo nas regies R1 e R2 de, pelo menos, trs experimentos independentes, realizados em triplicata. Em (B), cada coluna representa a mdia EPM do ndice de proliferao, obtido da relao entre o nmero de eventos detectados por citometria de fluxo na regio R2 e o controle (no tratado) de, pelo menos, trs experimentos independentes, realizados em triplicata.

54

A
3

Tranformao blstica

0 0,01 PHA 0,1 1 EX+P 10 100 0,001 0,01 0,1 1 0,001 0,01 0,1 1

AC+P

EST+P

B
3

ndice de proliferao

0 0,01 PHA 0,1 1 EX+P 10 100 0,001 0,01 0,1 1 0,001 0,01 0,1 1

AC+P

EST+P

Figura 11. Efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a transformao blstica e a proliferao de linfcitos humanos estimulados por fitohemaglutinina. Mononucleares obtidos de sangue perifrico foram cultivados por 5 dias, a 37C, em atmosfera de 5% de CO2, com as concentraes indicadas do extrato de A. glabra (EX - g/ml), cido caurenico (AC - M) e esteviol (EST - M) na presena de fitohemaglutinina (PHA). Cada coluna em (A) representa a mdia EPM de linfcitos que sofreram transformao blstica, obtida da relao entre a diferena do nmero de eventos detectados por citometria de fluxo nas regies R1 e R2 de, pelo menos, trs experimentos independentes, realizados em triplicata. Em (B), cada coluna representa a mdia EPM do ndice de proliferao, obtido da relao entre o nmero de eventos detectados por citometria de fluxo na regio R2 e o controle (no tratado) de, pelo menos, trs experimentos independentes, realizados em triplicata.

55

proliferao de linfcitos induzida por fitohemaglutinina, indicando que essas substncias so tambm desprovidas da capacidade de atuar sobre linfcitos humanos ativados. Como visto na introduo deste trabalho, a interao de um mitgeno como a fitohemaglutinina com o receptor das clulas T (TcR), por exemplo, inicia, na clula, eventos que envolvem o recrutamento de ons clcio e a ativao simultnea de vrias enzimas. Neste contexto e devido aos efeitos observados com essas substncias sobre a quimiotaxia de granulcitos, a qual tambm envolve Ca2+, a ausncia de atividade foi causa de surpresa. Entretanto, na literatura no h estudos relacionados atividade imunomodulatria sobre MNC humanos do extrato de A. glabra, do cido caurenico ou do esteviol. Digno de nota, porm, o relato recente de Ohkoshi e colaboradores (2004), os quais, investigando as atividades biolgicas de derivados do cido caurenico obtido do extrato de Mikania hirsutissima (Compositae), sobre linfcitos de sangue perifrico humano, observaram que seus derivados hidroxilados nos carbonos 2, 3, 16 e 17, os cidos 2, 16, 17-trihidroxi-ent-caurano-19-oico e 3, 16, 17-trihidroxi-ent-caurano19-oico apresentaram significativa atividade imunomodulatria. Assim, possvel que a ausncia de efeito observada neste estudo possa estar relacionada estrutura qumica desses compostos, onde ambos apresentamse insaturados entre os carbonos 16 e 17. Nesse contexto, a presena de oligossacardeos em molculas ou a formao de glicoconjugados promovem respostas melhores em estudos imunomoduladores por aumentarem a afinidade entre receptores e ligantes (Brandley et al., 1990). Interessante seria, ento observar se os derivados do cido caurenico do que C-17 apresentaram no seriam atividade tambm trypanosomicida dotados de aps

glicosilao

atividade

imunomoduladora.

56

4.3. TESTE DE LETALIDADE PARA NUPLIOS DE Artemia salina Este ensaio foi utilizado neste trabalho como modelo para se observar os efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre o comportamento de nuplios de Artemia salina (Figura 12, A e B) e os ensaios foram executados de acordo com a metodologia descrita por Meyer (1982) e modificada por Fontana e colaboradores (1998), ilustrada na Figura 12 (C a F). Brevemente, diluies seriadas (20 a 100 g/ml) dessas substncias incorporadas em etanol e diluies com etanol (1 a 3,5% v/v), isoladamente, foram preparadas com soluo aquosa de sal marinho sinttico e incubadas com nuplios recm eclodidos, como descrito em detalhes na seo de Material e Mtodos. Os resultados esto apresentados na Tabela 2 como CL50, obtida com auxlio do software PROBIT. Dentro da faixa de concentrao testada, somente o cido caurenico apresentou atividade txica para os nuplios, com uma CL50 de 54,4 M, corroborando em parte, com os estudos de Zani e colaboradores (1995), os quais demonstraram resultados para esta substncia com relao a A. salina e, tambm, para T. cruzi em concentraes superiores.

Tabela 2. Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de nuplios de Artemia salina. Tratamento
Extrato de A. glabra (g/ml) cido caurenico (M) Esteviol (M)

CL50
> 100 54,4 > 100

Intervalo de confiana de 95%

47,3 74,7 -

Nuplios viveis de A. salina foram transferidos para tubos contendo concentraes crescentes de extrato de A. glabra, cido caurenico ou esteviol (20 a 100 g/ml) em volume mximo de 2 ml de gua do mar sinttica. Aps 24 horas, nuplios viveis foram enumerados e usados para calcular a CL50 com auxlio do Programa PROBIT. Os resultados foram obtidos de quatro experimentos independentes, realizados em triplicata.

57

Figura 12. Artemia salina, suas formas de vida e ensaio de letalidade. Nuplio eclodindo do cisto (A). Forma adulta (B). Cistos de A. salina mantidos a 8C foram transferidos para gua do mar sinttica e mantidos em temperatura ambiente por 48 a 72 horas, sob iluminao e aerao constantes (C) at ecloso dos nuplios (D, 400x), caracterizada pelo movimento natatrio intenso e fototropismo positivo dos microcrustceos (E). Em seguida, so co-incubados com a(s) substncia(s) em estudo por 24 horas sob iluminao constante (F).
A e B, fonte: Centro de referncia de Artemia, Universidade de Ghent Blgica.

58

A literatura no relata estudos semelhantes para o extrato de A. glabra ou para o esteviol. No entanto, em ensaios com larvas de Aedes aegypti, o extrato apresentou CL50 de 27 g/l (Mendonca et al., 2005), enquanto uma CL50 de 84,2 M foi descrita para embries de ourio-do-mar (Costa-Lotufo et al., 2002), implicando que diferenas biolgicas entre insetos e animais marinhos podem ser as responsveis pelas respostas distintas observadas para o extrato de A. glabra.

4.4. ENSAIOS COM CLULAS HEp-2 Linhagens celulares em geral, e de clulas tumorais em particular, constituem modelos experimentais in vitro apropriados para se avaliar o potencial biolgico de extratos de plantas e substncias puras, pois proliferam de forma contnua, dentro de um ambiente controlado fsica e quimicamente, minimizando interferncias comuns nos organismos vivos. Nesse sentido, criase um ambiente que favorece o estudo de substncias ou de misturas de substncias, como o caso de extratos preparados de plantas medicinais, relacionado toxicidade, proliferao, migrao, adeso, espalhamento, interaes celulares, diferenciao

etc,

desvendando

possibilidades

oferecendo direcionamento para estudos mais aprofundados, usando inclusive modelos vivos. Com o objetivo de se avaliar os efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a adeso de clulas tumorais, utilizou-se clulas HEp-2 como modelo, ilustradas na Figura 13, estabelecidas de carcinoma epidermide de laringe humana implantado em camundongos (Moore et al., 1955). So clulas muito resistentes a variaes ambientais, como temperatura, nutrientes e radiao ultravioleta; multiplicam-se avidamente aderindo-se, simultnea e espontaneamente, a superfcies inertes, como o vidro ou a base de frascos de cultura, sendo apropriadas e convenientes para estudos de adeso celular. Estudos relatam que a confluncia entre as clulas parece ser mediada pela adeso clula-clula, o que favorece a sua resistncia s variaes ambientais (Mazurov et al., 2003).

59

H uma observao clnica comum com relao aos carcinomas, os quais so de origem epitelial como as clulas HEp-2 deste estudo, de que seu espalhamento, ou disseminao metastsica, se faz pelos vasos linfticos e sanguneos, em contraste com os sarcomas, que se espalham geralmente via hematognica. Sabe-se que h conexes entre os vasos linfticos e sanguneos e que clulas tumorais so capazes de se mover entre esses sistemas pelas anastomoses hematolinfticas (Franks et al., 1997).

Figura 13. Cultura de clulas HEp-2. Clulas HEp-2 (A, contraste de fase) foram estabelecidas de carcinoma epidermide de laringe humana e podem ser mantidas proliferando in vitro em meio RPMI 1640 suplementado com 10% de soro bovino fetal. Tm a propriedade de se aderir naturalmente superfcies slidas, como a base do frasco de cultura, espalhando-se para se aderirem mais firmemente matriz (B, contraste de fase), cuja morfologia pode ser melhor observada aps colorao com soluo de cristal violeta 1% (C).

liberao de

clulas

tumorais

individuais

ou

em

pequenos

aglomerados parece estar relacionada ao fato de que tumores malignos tm suas clulas mais frouxamente aderidas umas s outras do que aquelas provenientes de tumores benignos, sendo, portanto, mais facilmente

destacveis. A base molecular desta reduo de capacidade adesiva tem sido relacionada diminuio da expresso de molculas de adeso,

60

freqentemente observada em clulas metastsicas (Reeves et al., 2000) ou de seus receptores. Neste contexto, os efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre as propriedades de adeso de clulas HEp-2 quando mantidas em cultura tornaram-se relevantes como um modelo experimental preliminar.

4.4.1. Toxicidade
Prioritariamente a realizao dos ensaios de adeso e semelhana dos leuccitos, excluiu-se a possibilidade dessas substncias serem txicas para essas clulas, tratando-as com concentraes crescentes do extrato de

A. glabra (0,01 a 10 g/ml), de cido caurenico (0,0001 a 0,01 M) e de

esteviol (0,0001 a 0,01 M) por 24 horas, a 37C. Em seguida, sua viabilidade foi observada com auxlio do corante azul de tripano. Como ilustrado na Figura 14, nenhum dos tratamentos se mostrou txico nas condies experimentais utilizadas, mantendo a viabilidade, em mdia, superior a 95% quando comparada populao no-tratada (controle), normalizada em 100% (n = 3).

1 20

1 20

1 00

1 00

Viabiliadade (%)

80

80 AC

60

60 EX 40

EST

40

20

20

0 0,01 0,1 1 1 0

0 0,0001 0,001 0,01

C o nc e nt ra o ( g/ m l)

Figura 14. Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a viabilidade de clulas HEp-2. Clulas HEp-2 foram tratadas com extrato de A. glabra (EX), cido caurenico (AC) e esteviol (EST) como indicado por 24 horas, a 37C, em meio RPMI 1640, suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino. Os pontos representam a porcentagem mdia DP de clulas viveis, verificada pelo teste de azul de tripano em relao ao controle, cuja viabilidade foi normalizada em 100% (n = 3).

61

Em contraste com nossos resultados e como j referido anteriormente, o efeito txico de algumas espcies da famlia Annonaceae j foram estudos, incluindo a A. glabra e o cido caurenico, que demonstraram atividade txica principalmente sobre linhagens de clulas de carcinoma. Neste contexto, potencial citotxico de A. purpurea sobre clulas KB de nasofaringe (Camacho et al., 2003) e de A. muricata sobre clulas U-937 (Jaramillo et al., 2000) j foi descrito. Estudos fitoqumicos demonstraram que esta famlia apresenta, em seus extratos, polifenis, quercetina, alcalides (Leboeuf et al., 1975), flavonides (Santos et al., 2000), acetogeninas e diterpenos. As acetogeninas annoglaxina e 27-hidroxibullatacina, isoladas de A. glabra, demonstraram atividade txica sobre clulas tumorais de mama, rim, prstata e pncreas (Liu et al., 1999) e sobre linhagem celular de hepatoma humano, sendo esta ao causada pela diminuio do potencial transmembrnico de mitocndrias, induzindo a uma apoptose prematura (Chen et al., 2004). Um grande nmero de diterpenos j foi caracterizado em relao ao potencial antitumoral, sendo o paclitaxel, extrado de Taxus brevifolia, um exemplo dessa classe de compostos, atualmente uma das principais armas no tratamento contra o cncer (Kumar et al., 2004). De forma mais restrita, poucos so os estudos que relatam atividade antitumoral do cido caurenico. Neste sentido, quando extrado de A. glabra, demonstrou inibio da proliferao de clulas de cncer de fgado por aumento do ndice de apoptose na concentrao de 25 M, com inibio da expresso do gene bcl-2 e aumento da expresso do gene bax (Zhang et al., 2004). Sua atividade genotxica sobre fibroblastos de pulmo de hamster chins (Cavalcanti et al., 2006) tambm foi recentemente descrita. Para o esteviol, a literatura relata estudos particularmente controversos sobre o seu potencial mutagnico. Por exemplo, Pezzuto e colaboradores apontaram uma atividade mutagnica sobre linhagens de Salmonella

typhimurium TM677, sendo este resultado favorecido pela presena de uma

hidroxila no carbono 13 e de uma ligao insaturada entre os carbonos 16 e 17 na estrutura qumica da molcula (Pezzuto et al., 1985). Terai e colaboradores (2002) confirmaram o efeito mutagnico do esteviol e apontaram o 15-oxoesteviol como o metablito responsvel por esta ao. Efeitos txicos e

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teratognicos em hamters tambm j foram relatados (Wasuntarawat et al., 1998). Em contraste, o grupo de Suttajit (1993), usando Salmonella

typhimurium TA98 e TA100 e cultura de linfcitos humanos, no demonstrou

atividade mutagnica para o esteviol (Suttajit et al., 1993). Sekihashi e colaboradores (2002), usando o teste do cometa para avaliar o potencial genotxico do esteviol sobre clulas TK6 e WTK1, tambm no evidenciaram nenhuma atividade de dano ao ADN. Da mesma forma, no foram observados danos ao ADN sobre rgos de camundongos aps administrao de vrias concentraes de esteviol (Sekihashi et al., 2002). O fato de nenhuma dessas substncias afetar a viabilidade das clulas HEp-2 nas condies experimentais empregadas neste estudo, primeiro, confirma sua caracterstica de robustez in vitro j descrita, o que pode no ser o perfil das linhagens celulares utilizadas nos outros estudos. interessante notar que as clulas HEp-2 proliferam abundantemente in vitro na ausncia de CO2, qualidade esta no apreciada pela maioria das linhagens celulares acima citadas, as quais, se para sobreviver em condies artificiais so totalmente dependentes de uma tenso relativamente baixa de CO2, quanto mais para proliferar indefinidamente. Alm disso, e certamente o ponto mais importante para as discrepncias entre os resultados desse estudo com os citados na literatura, seja o fato de que, para esses, o tempo de exposio dessas clulas aos agentes seja superior ao utilizado neste trabalho, o qual se limitou a 24 horas, em contraste com o perodo de 48 ou 72 horas geralmente adotado para estudos de citotoxicidade. De qualquer forma, a ausncia de efeitos txicos permitiu seu uso como modelo, com a finalidade de se investigar a ao dessas substncias sobre suas propriedades de aderncia.

4.4.2. Adeso celular

Os efeitos dessas substncias sobre a interao de clulas HEp-2 com a base do frasco de cultura foram avaliados logo aps seu sub-cultivo, onde 105 clulas foram expostas a concentraes crescentes do extrato de A. glabra (0,01 a 10 g/ml), de cido caurenico (0,0001 a 0,01 M) e de esteviol (0,0001 a 0,01 M) por 24 horas, tempo este suficiente para que essas clulas tornem-se aderidas base do frasco.

63

Conforme ilustrado na Figura 15, o extrato de A. glabra e o cido caurenico demonstraram interferir de forma significativa na adeso

espontnea de clulas HEp-2 a superfcies slidas na maioria das concentraes testadas, em contraste com o esteviol, cuja populao permaneceu inalterada.

*
0,0000032 0,00032

2
0,000032

1,8
0,0032

p < 0,0001

1,6 1,4 Adeso celular 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 0,01 PBS 0,1 EX 1 10 0,0001 0,001 AC 0,01 0,0001 0,001 EST 0,01

Figura 15. Efeito do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a adeso de clulas HEp-2 base dos frascos de cultura. Clulas HEp-2 foram tratadas com as concentraes indicadas do extrato de A. glabra (EX - g/ml), cido caurenico (AC M) e esteviol (EST - M) por 24 horas a 37C. Cada coluna representa o ndice mdio de adeso celular EPM em relao ao controle (PBS) de, pelo menos, quatro experimentos independentes, realizados em triplicata, obtida aps fotomicrografia e anlise de imagem pelo programa UTHSCSA ImageToll for Windows, verso 3.00. *p 0,05 em relao controle (ANOVA, seguida do teste de Tukey). [*] Concentrao de cido caurenico (M) no extrato.

64

Nas concentraes de 0,1 e 1 g/ml do extrato e de 0,001 M do cido caurenico, observou-se o mximo de estmulo, com ndices de adeso de 1,16 0,08, 1,15 0,03 e 1,18 0,05 em relao ao controle, respectivamente (n = 4; p 0,05). J a 10 g/ml de extrato e a 0,0001 e 0,01 M de cido caurenico, os efeitos na adeso foram significativamente inibitrios (n = 4; p 0,05), com somente cerca da metade da populao mantendo-se aderida (0,54 0,07; 0,71 0,04 e 0,55 0,11, respectivamente) quando comparada populao no tratada. A interao de clulas com substratos slidos fundamental para que ocorra uma srie de funes vitais como adeso, proliferao, migrao e diferenciao. Estes substratos so representados pela MEC, composta por uma variedade de macromolculas secretadas localmente, incluindo

fibronectina e vitronectina, dentre outras, formando uma rede organizada, em estreita associao com a superfcie celular que a produz, a qual, alm de servir como suporte, possui mltiplas funes biolgicas. Neste contexto, a adeso de clulas normais de uma forma geral, e de clulas tumorais em particular, entre si e entre elas e a matriz que as suporta decorrente da sua interao com molculas de adeso por meio de receptores apropriados (Akiyama et al., 1990), expressos tanto nas clulas, como nas paredes dos vasos e na MEC. Como os resultados demonstraram que tanto o extrato de A. glabra como o cido caurenico colaboraram significativamente para aumentar a aderncia de clulas HEp-2 base do frasco de cultura, formulou-se a hiptese de que essas substncias pudessem aumentar a adeso de clulas tumorais ao substrato de tal forma que minimizaria, ou mesmo impediria, seu desligamento, com conseqente inibio da formao de metstases, por meio da modulao da expresso de receptores de integrinas. Assim, investigou-se nessas clulas a expresso de 41 e 51, dois receptores que medeiam no s a interao intercelular, mas tambm entre as clulas e algumas protenas abundantes no s na MEC como tambm na superfcie de clulas HEp-2 (Cotter et al., 1998), como a fibronectina e o colgeno.

65

4.4.3. Expresso de molculas de adeso

A citometria de fluxo um mtodo bastante utilizado para se investigar a presena de molculas sobre a superfcie celular. Neste trabalho, foi usada para se observar os efeitos do extrato de A. glabra, do cido caurenico e do esteviol sobre a atividade imunomoduladora de linfcitos humanos como anteriormente visto, e tambm para investigar a expresso de 41 e 51. Para tanto, clulas HEp-2 foram marcadas com anticorpos monoclonais especficos para esses antgenos aps serem expostas, por 24 horas, a 37 C, a 1 e 10 g/ml do extrato de A. glabra, 0,001 a 0,01M de cido caurenico e 0,001 a 0,01 M de esteviol. Como ilustrado na Figura 16, clulas HEp-2 no expressam as protenas 41 e 51 em sua superfcie e nenhum dos tratamentos efetuados alterou esta condio. Com esta srie de experimentos no foi possvel esclarecer quais os mecanismos responsveis pelo aumento significativo da adeso de clulas HEp-2 base do frasco de cultura. possvel que a aderncia espontnea dessas clulas em cultura se d pela prpria secreo de molculas adesivas, como a fibronectina, por exemplo, e que ambos os tratamentos com o extrato de A. glabra e com o cido caurenico tenham favorecido a sntese dessas ou outras molculas. Muitas clulas tumorais expressam, de fato, receptores da famlia das integrinas em sua superfcie e uma boa frao das interaes entre clulas tumorais e a membrana basal mediada por essas molculas. Entretanto, estudos utilizando anticorpos monoclonais demonstraram que colgenos tipo I e IV, laminina e fibronectina esto presentes na superfcie de clulas HEp-2 (Cotter et al., 1998) como j citado. Interessante neste caso seria comparar a expresso de algumas protenas adesivas em clulas HEp-2 antes e aps tratamento com essas substncias. Alm disso, investigar o comportamento adesivo dessas clulas usando fibronectina, colgeno e vitronectina, por exemplo, imobilizadas previamente na base do frasco de cultura poderia esclarecer se h a colaborao do extrato de A. glabra e do cido caurenico nesta atividade, uma vez que essas protenas so capazes de ativar clulas com respeito modulao de sua secreo, como tambm na expresso de receptores para interao.

66

41 51
Figura 16. Expresso de molculas de adeso em clulas HEp-2. Clulas HEp-2 foram tratadas por 24 horas, a 37 C, com extrato de A. glabra (1 e 10 g/ml), cido caurenico (0,001 e 0,01 M) ou esteviol (0,001 e 0,01 M). Em seguida, foram marcadas com anticorpos monoclonais anti41-PE e anti51FITC e a expresso avaliada por citometria de fluxo. (A) populao no-tratada (controle); (B) populao tratada com 0,001 M de cido caurenico.

4.5.

CIDO CAURENICO E ATIVIDADES BIOLGICAS

ESTEVIOL:

ESTRUTURA

QUMICA

A Tabela 3 resume as atividades biolgicas avaliadas neste trabalho atravs de diferentes sistemas e os efeitos decorrentes do tratamento com cido caurenico e esteviol, os quais diferem entre si estruturalmente por uma hidroxila no carbono 13 do anel terpnico. A primeira diferena interessante refere-se ao perfil de toxicidade com relao s populaes ensaiadas, apresentando-se o cido caurenico incuo tanto para GNC humanos como para a linhagem HEp-2 at a concentrao de 100 M, em contraste com os MNC, que se tornaram inviveis nesta concentrao. Para os nuplios de A. salina, observou-se que, dentro do intervalo de concentrao ensaiado, o cido caurenico apresentou CL50 de 54,4M, enquanto a CL50 para o esteviol encontra-se em concentraes superiores a 100M. Os efeitos sobre a quimiotaxia de GNC, a 1,0 M, foram antagnicos e somente o cido caurenico interferiu na adeso natural de clulas HEp-2 ao plstico.

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Tabela 3. Atividades biolgicas do cido caurenico e do esteviol. Ensaio

MNC Toxicidade GNC HEp-2

cido caurenico (M) Esteviol (M)

100 54,4 0,001 e 0,01 1,0 0,001 0,0001 e 0,01 > 100 1,0 -

A. salina*
Imunomodulao Quimiotaxia de GNC Adeso de HEp-2

() estmulo; () inibio e (-) ausncia de atividade; * CL50.

O conceito de similaridade, onde substncias so agrupadas de acordo com seus efeitos biolgicos ou propriedades fsico-qumicas, tem sido extensivamente aplicado, particularmente no que se refere busca de substncias farmacologicamente ativas. Alm disso, o estudo da relao estrutura-atividade e dos mecanismos moleculares de ao de fundamental importncia para um melhor entendimento dos variados efeitos de um composto qumico no ambiente e seus efeitos diretos na sade humana (Bender et al., 2004). Uma das principais metas concernente ao desenvolvimento de novos frmacos identificar substncias qumicas que possam ter a habilidade de se ligar a uma molcula alvo e desencadear uma resposta biolgica especfica. Neste aspecto, as interaes de uma clula com outras clulas ou com o ambiente sua volta, bem como os mecanismos envolvidos nesses fenmenos, so complexos e, de um modo geral ocorrem atravs de interaes ligantereceptor. A informtica molecular, como um paradigma, associa vrios conceitos, informaes e suposies para predizer a interao de molculas com receptores biolgicos e a eficcia dessa relao (Bender et al., 2004). Em adio, a relao entre estrutura e atividade tem sido utilizada para predizer se

68

uma substncia dotada de uma ou mais atividades biolgicas, determinando seu potencial farmacolgico (Arena et al., 2004). A atividade biolgica de um composto reside nas caractersticas qumicas estruturais da molcula. Alguns dos fatores que determinam, por exemplo, os efeitos txicos de compostos qumicos estranhos em sistemas biolgicos so: (1) suas caractersticas moleculares relacionadas ao tamanho, simetria, forma e outras propriedades relacionadas sua estrutura; (2) caractersticas da estrutura eletrnica isoladamente ou em combinao com outras molculas; (3) propriedades fsico-qumicas, especialmente relacionadas solubilidade; e (4) propriedade de interferir nos processos normais e atividade em nvel molecular (mecanismo de ao) (McKinney, 1985). O cido caurenico e o esteviol, por pertencerem a uma classe de compostos que vm, ao longo da ltima dcada, demonstrando diversidade de efeitos biolgicos, tm sido alvo de vrias modificaes estruturais, com o objetivo de, por um lado, potencializar alguns dos efeitos descritos ou, por outro, torn-los menos txicos ou, ainda, como prottipos para desenvolvimento de novas molculas bioativas (Rates, 2001), aspectos esses amplamente explorados na reviso recentemente publicada por Garca e colaboradores (2007). Ensaios biolgicos rpidos, como aqueles que avaliam a inibio das comunicaes intercelulares ou da polimerizao da tubulina, que observam a modulao da apoptose ou induo da proliferao, como os descritos neste trabalho, tm sido utilizados com o objetivo de se avaliar, de forma preliminar, o potencial farmacolgico de substncias puras ou misturas. A associao de alguns desses ensaios amplamente utilizada como screening, no sentido de selecionar biforos, ou molculas associadas com toxicidade, que possam ser usados como alvos farmacologicamente estratgicos (Combes, 2000). Neste trabalho, modelos clssicos foram empregados para avaliar algumas atividades biolgicas do extrato de Annona glabra Linn, do cido caurenico dele purificado e do esteviol, obtido de S. rebaudiana. Entretanto, em nenhum dos ensaios realizados foi possvel estabelecer os mecanismos que levaram s diferenas de comportamento observadas. Mas, se de um lado, esta lacuna ficou por ser preenchida, por outro lado, algumas das aes observadas ainda no foram relatadas e, dessa forma, associadas a outras informaes j

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descritas, renem uma base rica de dados cientficos importantes que estimulam investigaes futuras, no s para esclarecer os mecanismos de ao envolvidos, mas tambm para contribuir na busca de drogas com valor teraputico. No Brasil, h cerca de cem mil espcies vegetais catalogadas, mas somente cerca de 8% foram estudadas quanto a sua composio qumica, e estima-se que pouco mais de mil espcies tenham sido avaliadas quanto s propriedades teraputicas (Varanda, 2006). Dessa forma, grande parte de fitoderivados, em especial aqueles provenientes de plantas nativas, no foi analisado cientificamente quanto aos seus efeitos, sua eficcia e segurana de sua utilizao. Portanto, importante que estudos como o aqui relatado sejam realizados, no s pelo esclarecimento que eles podem trazer populao que os utiliza, mas tambm porque se tem no Brasil uma riqueza natural de difcil medida, que certamente nos trar, no s divisas cientficas quando estudada, mas certamente nos levar a superar a vigente dependncia externa por parte da indstria farmacutica brasileira.

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5. CONCLUSES
Os resultados apresentados neste trabalho e as consideraes que deles puderam ser derivadas permitem concluir que:

o extrato de A glabra e o esteviol no apresentam toxicidade para leuccitos humanos e clulas HEp-2 at a concentrao de 100 M, enquanto o cido caurenico, nessa mesma concentrao,

compromete significativamente a viabilidade de MNC;

o extrato de A. glabra inibe a quimiotaxia natural de granulcitos, de acordo com a dose, sugerindo potencial antiinflamatrio;

o cido caurenico (0,001 a 0,01 M) e o esteviol (0,1 M) apresentam atividade indutora da migrao de granulcitos, sendo a atividade do esteviol, pelo menos, 100 vezes inferior do cido caurenico;

o extrato de A. glabra, o cido caurenico e o esteviol no apresentam atividade imunomodulatria, avaliada sobre a

transformao blstica e a proliferao de linfcitos humanos, basal e estimulada por fitohemaglutinina;

o cido caurenico apresenta atividade txica sobre nuplios de

Artemia salina, com CL50 de 54,4 M;

o extrato de A. glabra e o cido caurenico interferem na adeso de clulas de carcinoma epidermide de laringe humana sobre matriz plstica, de forma dependente da dose, mas esta ao no resultante da expresso das integrinas 41 e 51.

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ANEXOS

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TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO a) A proposta deste projeto estabelecer um painel de ensaios biolgicos in vitro, que possam, de forma dinmica, demonstrar atividades biolgicas de constituintes de plantas medicinais tradicionalmente utilizadas pela populao e, simultaneamente contribuir para a elucidao dos mecanismos celulares e moleculares envolvidos. b) Caso voc participe da pesquisa, ser necessrio doar uma amostra de sangue a qual ser obtida por puno venosa de uma de suas veias, localizadas na regio da prega do cotovelo. A quantidade de sangue por voc doada ser destinada separao dos leuccitos para padronizao e realizao de ensaios biolgicos. c) Como em qualquer outro diagnstico clnico-laboratorial, voc poder experimentar alguns leves desconfortos relacionados a essa coleta, porm de ordem passageira. d) Esto garantidas todas as informaes pertinentes ao projeto que voc queira obter, antes, durante e depois do estudo. e) A sua participao neste estudo voluntria. Voc tem a liberdade de se recusar a participar do estudo ou, se aceitar participar, retirar seu consentimento a qualquer momento. f) Se qualquer informao relacionada ao estudo for divulgada em relatrio ou publicao, isto ser feito sob forma codificada, para que a confidencialidade do doador seja mantida. g) Em caso de necessidade, voc poder comunicar-se imediatamente com Almeriane Maria Weffort-Santos, nos telefones 3360 4087 ou 3232 4037. h) Todas as despesas necessrias para a realizao dessa pesquisa (exames, etc...) no so de responsabilidade do doador. i) Pela sua participao no estudo, voc no receber qualquer valor em dinheiro. j) Quando os resultados forem publicados, no aparecer seu nome e, sim, um cdigo.

Eu, _________________________________________, abaixo assinado, li o texto acima e compreendi a natureza e o objetivo desse estudo do qual fui convidado a participar. Eu entendi que sou livre para interromper minha participao no estudo a qualquer momento sem justificar minha deciso e concordo voluntariamente em participar deste estudo.

_______________________________ __/__/__ Assinatura do doador Data

_______________________________ __/__/__ Assinatura do Pesquisador Data

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