ANLISIS CUALITATIVO Y CUANTITATIVO DE LA COMPOSICIN DE LA LECHE SEMIDESCREMADA DOS PINOS Martnez, E.a y Villalobos, A.

b Laboratorio de Bioqumica General Escuela de Qumica, Universidad Nacional, Costa Rica

a.

Escuela de Qumica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. Telfono: (+506)2277 3351 Fax: (+506) 2277 3579 Correo-e: erime89@gmail.com b. Escuela de Qumica, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional, Heredia, Costa Rica. Telfono: (+506)2277 3351 Fax: (+506) 2277 3579 Correo-e: alevu_07@hotmail.com

RESUMEN
La leche es un alimento de consumo diario en la dieta humana y este representa un gran potencial benfico para la salud humana. Debido a las propiedades de la leche es necesario realizar investigaciones en las que se torna de suma importancia conocer la composicin qumica de este alimento. A nivel experimental se realiz la extraccin de los distintos compuestos de los que est compuesta la leche, por medio de la precipitacin de la casena de la leche en medio cido, posteriormente se realiz una extraccin metanlica-etrea para la separacin de los esteroles de los cidos grasos, y por ltimo se realiz una extraccin alcalina para realizar la separacin de los componentes proteicos. Posteriormente se realiz un anlisis cualitativo y cuantitativo tanto de carbohidratos y azcares. Los esteroles se analizaron por el mtodo de Liebermann-Bouchard y el anlisis de cidos grasos por el mtodo de la Sulfo-fosfovainillina. Los resultados obtenidos indican que se la leche analizada contiene 20 g de grasa por mililitro, 480 g de carbohidratos por mililitro, 32 g protena por mililitro y no contiene una cantidad analizable de lpidos en su composicin. Producto de las operaciones realizadas se concluye que la leche eta compuesta de diversos compuestos desde distintas grasas, adems de carbohidratos y protenas principalmente, y que se torna de suma importancia realizar estudios sobre la leche debido a la importancia de ella en el consumo humano. Palabras Clave: Leche, Acido Graso, Esterol, Liebermann-Bouchard, Vainillina.

ABSTRACT
Milk is a food for daily consumption in the human diet and this is a great potential to benefit human health. Due to the properties of milk research is needed in which it becomes extremely important to know the chemical composition of this food. For the experiment was extracted from the various components of milk which is made by means of precipitation of milk casein in acid, then was extracted in methanol-ether to separate the sterols of fatty acids, and finally made an alkaline extraction for the separation of protein components. Subsequently conducted both qualitative and quantitative analysis of carbohydrates and sugars. The sterols were analyzed by the method of Liebermann-Bouchard and fatty acid analysis by the method of Sulpho-phosphovainillin. The results indicate that the milk samples containing 20 g of fat per milliliter, 480 g of carbohydrate per ml, 32 g protein per milliliter and does not contain a parsable number of lipid composition. Product of operations is concluded that milk its composed of several compounds from different fats, carbohydrates and protein as well mainly, and that becomes very important studies on the milk because of the importance of her human consumption. Key words: Milk, fatty acids, sterols, Liebermann-Bouchard, Vanillin.

INTRODUCCIN La leche se compone principalmente de agua, grasa, protena, lactosa con pequeas cantidades de cidos orgnicos y minerales [9]. La leche es una emulsin de glbulos, donde cada glbulo est rodeado de grasa por una membrana compuesta de fosfolpidos y protenas por el que la grasa se mantiene en una fase acuosa en forma de

emulsin sumamente fina. Las vitaminas liposolubles A, D, E y K se encuentran dentro de la porcin de grasa de la leche [9]. La grasa de la leche se compone principalmente de los triglicridos (98%), que se encuentran dentro de los glbulos y otros lpidos (2%) en la leche que incluyen diacilglicridos, monoacilglicridos, fosfolpidos, colesterol, glicolpidos y cidos grasos libres. Los cidos grasos

(AG) en la leche muestran una variacin considerable y ms de 400 diferentes (AG) se han identificado en la leche, que varan en longitud de la cadena y el nmero, posicin y geometra de los dobles enlaces. Sin embargo, hay slo unos pocos de estos cidos grasos que estn presentes en niveles de inters (Cuadro 1). Los cidos grasos se componen de carbono (C), hidrgeno (H) y oxgeno (O) dispuestos como un esqueleto de la cadena de carbono con un grupo carboxilo (-COOH) en un extremo [7]. Cuadro 1. Distintos cidos grasos presentes en la leche ovina [9]

Los cidos grasos de leche de vaca contiene un promedio de 70% de cidos grasos saturados, un 25% de cidos grasos monoinsaturados y un 5% de cidos grasos poli-insaturados. Los cidos grasos ms abundantes son el C16:0 (cido palmtico) y el C18:1 (cido oleico) [6], como se observa en el Cuadro 1. En la Figura 1 se muestra una conformacin detallada de la composicin de la grasa en su forma de glbulos en la leche ovina.

En comparacin con la leche de otras especies leche de vaca tambin contiene una gran proporcin de cidos grasos de cadena corta, de los cuales C4:0 y C6:0 son nicos a la leche de los rumiantes. La composicin de la grasa de leche es esencial para muchas de las propiedades de los productos lcteos. El equilibrio entre los cidos grasos de cadena corta insaturados y cidos grasos de larga cadena puede afectar a las propiedades de transformacin, la calidad del producto y las caractersticas organolpticas de la leche [9]. Adems de las grasas, otro gran constituyente de la leche son las protenas, Se considera que existen dos tipos fundamentales de protenas lcteas. Una cantidad relativamente pequea, se haya adsorbida en la pelcula que rodea a los glbulos grasos, se le denomina protenas de la membrana del glbulo de grasa (MFGM por sus siglas en Ingls) como se observa en el cuadro 2, no se conocen muy bien la naturaleza de estas protenas pero parece ser que algunas actividades enzimticas de la leche se hayan localizadas all. La eliminacin de esta pelcula suele dar lugar a la aparicin de grasa libre capaz de alterar las caractersticas de solubilidad de la leche. La mayor parte de las protenas lcteas son retenidas en la leche descremada tras la separacin de los glbulos grasos. Las protenas de la leche descremada se pueden separar en varias fracciones: Casena en un 80% y en un 20% Albmina y globulina, adems de Proteasa-Peptona y Nitrgeno no proteico en fracciones muy pequeas [14]. En el cuadro 2 se observa la composicin de la leche en trminos de las protenas y grasas constituyentes de un glbulo de grasa de leche bovina: Cuadro 2. Composicin del glbulo de grasa en la leche ovina (mg/Kg de leche) [3]

Figura 1. Estructura general de la grasa de la leche ovina [2]

Los carbohidratos de la leche estn representados en su mayora por la lactosa (Figura 2), el nico carbohidrato libre presente en todas las leches, que se encuentra en cantidades importantes. Se sintetiza en la glndula mamaria y tiene un sabor que es relativamente poco azucarado, poco soluble y posee un efecto reductor [5]. La lactosa es muy estable frente al ataque enzimtico; sin embargo, es la ms sensible a la accin microbiana. Dentro de la composicin qumica de la leche, la lactosa representa el 4.9% aproximadamente, y es conocida como el azcar de la leche [3].

La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena neutra precipita [11], como se observa en la ecuacin 1: Ec, 1. La casena precipitada puede tornarse nuevamente soluble por la adicin de calcio o una base, por el cambio del pH ms all del punto isoelctrico. De hecho la casena se purifica por su precipitacin con cido y disolucin con bases por varias veces. A pesar que la casena no se coagula comnmente en el hervido, podr haber coagulacin, si la leche estuviera ligeramente cida o si se emplean temperaturas elevadas. As la leche fresca ligeramente cida tiene tendencia a coagular [14]. El mtodo qumico de Liebermann-Burchard para la determinacin de colesterol en una muestra lipdica se basa en el desarrollo de una coloracin verde en presencia de anhdrido actico y cido sulfrico concentrado con temperatura, despus de 30 min de reaccin [12]. La intensidad de la coloracin es medida por absorcin en el espectrofotmetro a 620 nm. La intensidad tiene una relacin lineal con la concentracin de colesterol entre 100 y 600g, se debe realizar una solucin control de colesterol de diferentes concentraciones para realizar una comparacin [10]. El mecanismo de la reaccin que ocurre entre el colesterol y el reactivo de LiebermannBourchard se muestra en la Figura 3.

Figura 2. Estructura de lactosa es un disacrido formado por una molcula de D-galactosa y otra molcula de D-glucosa, unidos por un enlace glicosdico [13].

La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los grupos fosfato estn unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en la leche se encuentra en forma de sal clcica(caseinato clcico). La casena representa cerca del 77% al 82% de las protenas presentes en la leche y el 2,7% en composicin de la leche lquida [1]. El alto nmero de residuos de prolina en la casena causa un especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una fuerte y ordenada estructura secundaria. La casena no contiene puentes di sulfuro. De igual manera la falta de estructura secundaria es importante para la estabilidad de la casena frente a la desnaturalizacin por calor. La carencia de estructura terciaria facilita la situacin al exterior de los residuos hidrofbicos lo que facilita la unin entre unidades proteicas y la convierte en prcticamente insoluble en agua. En cambio es fcilmente dispersable en lcalis diluidas y en soluciones salinas tales como oxalato sdico y acetato sdico [1].

Figura 3. Mecanismo de reaccin del colesterol con anhdrido actico en medio cido (Reaccin Liebermann-Bourchard). El compuesto formado absorbe de 600-620nm [4] n

La especificidad de la reaccin de la sulfofosfovanillina con los lpidos fue determinada para estos metabolitos por su potencial para el anlisis de lpidos, esta reaccin es comparable con la reaccin de ninhidrina para los aminocidos. La sulfofosfovainillina muestra su versatilidad en que se aplica tanto a los extractos de lpidos como de las soluciones de lipoprotenas. La reaccin de este compuesto cromofrico con los lpidos brinda una coloracin rojiza clara que absorbe a 530-540 nm [10]. El mecanismo de reaccin de la sulfofosfovainillina es complejo y se ha propuesto el que se muestra en la Figura 4.

SECCIN EXPERIMENTAL El anlisis de lpidos en leche se realiz en tres etapas, la primera parte correspondi a la extraccin de las fases acuosa, metanlica, etrea y alcalina. Posteriormente se realiz el anlisis cualitativo y por ltimo el anlisis cuantitativo como se detalla a continuacin:
Parte 1: Extraccin y separacin de componentes

Extraccin Acuosa En dos tubos de 16100 mm se colocaron 2,5 mL de leche, se agreg a cada tubo 5 mL de cido tricloroactico 9,0% m/v; se mezcl suavemente y se dej en reposo, se repiti la agitacin cada minuto por 3 minutos. Luego de este tiempo se dio la aparicin de grumos, se tap el tubo con tapn de hule y se centrifug a mxima velocidad en centrfuga clnica por 5 minutos. Se separaron los sobrenadantes y se transfirieron a una probeta de 25 mL. Se afor a 25 mL el volumen de lquido contenido en la probeta con agua destilada. Se mezcl y se transfiri a un recipiente rotulado como extracto acuoso. Extraccin Etrea Metanlica
Se transfirieron los sedimentos del paso anterior a un solo tubo de ensayo. Se agreg a los sedimentos en el tubo, 2 mL de metanol 99% m/m, se agit enrgicamente durante 3 minutos y se dej reposar por 2 minutos. Se agreg otros 2 mL de metanol y se repiti el proceso de mezclado. Se agreg 2 mL de ter de petrleo (40:60), y se coloc el tapn de hule, se agit enrgicamente por 3 minutos y se dej en reposo por 2 minutos. Se repiti este proceso agregando otros 2 ml de ter de petrleo (40:60). Aparecieron tres fases ntidamente separadas y se centrifug por 5 minutos en centrfuga clnica a mxima velocidad. Se traslad la fase lquida superior a una probeta de 25 mL rotulada extracto etreo. Se traslad la fase lquida inferior a una probeta de 25 mL rotulada extracto metanlico". Se afor a 25 mL, con ter de petrleo el extracto etreo y se guard dicho extracto en un recipiente apropiado. Se afor a 25 mL, con metanol el extracto metanlico y se guardo dicho extracto en un recipiente apropiado.

Figura 4. Mecanismo de reaccin de los lpidos con el reactivo de la sulfo-fosfovainillina. El compuesto formado absorbe de 530-540nm [10].

Da a da la investigacin encuentra nuevos componentes tanto del ncleo como de la membrana del glbulo de grasa de la leche ovina, relacionados con la salud humana. Por lo tanto, el potencial benfico de la grasa de la leche contina siendo atractivo para su exploracin y de ah la importancia de llevar a cabo estos anlisis [2].

Extraccin Alcalina Al sedimento que se centrifug de la extraccin etreametanlica en cada tubo, se le agreg 6 mL de NaOH 1.0 M, se suspendi por agitacin y se coloco en bao mara por 10 minutos, y posteriormente se enfri en bao de agua. Se separ el sobrenadante y se transfiri a una probeta de 25 mL. Se agreg al sedimento centrifugado 6 mL de NaOH 0,1 M, se suspendi por agitacin y se coloc en bao mara por 10 minutos, se enfri en bao de agua. Se tap el tubo con tapn de hule y se centrifug a mxima velocidad en centrfuga clnica por 5 minutos. Se separ el sobrenadante y se transfiri a la probeta de 25 mL con el sobrenadante de la primera extraccin con NaOH 1,0 M. Se complet el volumen a 25,0 mL con NaOH 0,33 M, se mezcl y se transfiri a un recipiente rotulado como extracto alcalino. Se guardaron todos los extractos en refrigeracin.
Parte 2: Anlisis Cualitativo Se realizaron las siguientes pruebas cualitativas a los cuatro extractos: -

Prueba de Vainillina:

A 100,0 L de la solucin problema en un tubo de 13100 mm, se le agreg 100,0 L de cido sulfrico concentrado. Se mezcl, se tap el tubo con una bola de vidrio y se puso en bao Mara por 10 minutos. Se sac el tubo del bao, se dej enfriar a temperatura ambiente. Se le aadi 4,0 mL de cido fosfrico concentrado y se mezcl; luego se le agreg 1,0 mL del reactivo de vainillina. Se mezcl muy bien y se puso en bao de agua a 35-40C por 15 minutos.
Parte 3: Anlisis Cuantitativo

cuantitativamente los azcares totales por fenol-sulfrico, leda a 480 nm, el almidn por Lugol, leda a 570 nm y las protenas por Biuret, leda a 550 nm, en aquellos extractos en que se obtuvieron resultados cualitativos positivos para cada caso. En el caso de estas pruebas se realizaron los
Se procedimientos conocidos con anterioridad de prcticas pasadas, y en el caso de la determinacin de lpidos insaturados y esteroles se realizaron los procedimientos cuantitativos de Lpidos Insaturados por SulfoFosfovainillina y de esteroles por el mtodo de Liebermann-Bouchard de la siguiente forma: -

determin

Extracto acuoso: Molisch, Lugol, NelsonSomogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y Biuret. Extracto metanlico: Molisch, Lugol, NelsonSomogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff, Biuret, Liebermann y Vainillina. Extracto etreo: Liebermann y Vainillina Extracto Alcalino: Molisch, Lugol, NelsonSomogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y Biuret.

Anlisis de Lpidos Insaturados por Sulfofosfo-vainillina

Para las pruebas de Molisch, Lugol, Nelson-Somogyi, Antrona, Bial-Orcinol, Selliwanoff y Biuret, se utiliz los procedimientos ya antes conocidos de prcticas pasadas, en el caso de las pruebas de Vainillina y Liebermann se sigui el siguiente procedimiento:

Se construy una curva patrn conteniendo 3, 6, 9, 12 y 15 mg/mL de cido oleico. Se agreg 10 L de etanol (blanco), patrn y muestra a un tubo de ensayo de 16x100 mm. Se agreg 100 L de cido sulfrico concentrado a cada tubo y se mezcl bien en un agitador vrtex. Se agreg 5 mL de reactivo de Fosfovainillina y se mezcl en un agitador vrtex, se espero la aparicin de un color rosado y se ley a 540 nm en un lapso no mayor a 30 minutos. -

Anlisis de Bouchard

Esteroles

por

Liebermann-

Se construy una curva patrn conteniendo 2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL de colesterol. Se coloc 6 mL de -

Prueba de Liebermann

A 50,0 L de la incgnita se agreg 2,0 mL de reactivo de Liebermann. Se coloc el tubo en un sitio oscuro y se esper 15 minutos. Hasta la aparicin de un color de azul al verde.

reactivo de Liebermann-Bouchard en un tubo de ensayo de 16x100 mm. Se agreg 100 L de cido actico glacial, estndar y muestra, y se mezcl bien con un agitador vrtex. Se ley a 650 nm en un lapso no mayor a 10 minutos.

RESULTADOS Y ANLISIS
Absorbancia

0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 0 5 10 concentracion 15 y = 0.0377x R = 0.9976

Cuadro 3. Resultados de las diferentes pruebas cualitativas para los diferentes extractos obtenidos de la leche.
Prueba/Fase Acuosa Molisch Positivo Lugol Negativo Nelson Negativo Antrona Negativo Bial Positivo Seliwanoff Positivo Biuret Negativo Liebermann *NA Vainillina *NA *NA: No Aplica 0.14 0.12 0.1 Etrea *NA *NA *NA *NA *NA *NA *NA Positivo Positivo Metanlica Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Alcalina Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo *NA *NA

Figura 7. Curva de calibracin por Biuret, utilizando patrones de albmina de suero bovino de diferente concentracin, para la determinacin de protenas en la leche, leda a 550 nm en un Spectronic 20 D+.

Absorbanci

0.08 0.06 0.04 0.02 0 0 20 40 60 80

y = 0.0012x R = 0.9971

100

120

0.045 0.040 0.035 0.030 0.025 0.020 0.015 0.010 0.005 0.000 0.00 5.00 10.00

y = 0.0028x R = 0.9984

15.00

20.00

Figura 5. Curva de calibracin por Fenol Sulfrico, utilizando patrones de glucosa de diferente concentracin, para la determinacin de azcares totales en la leche, leda a 480 nm en un Spectronic 20 D+.

Figura 8. Curva de calibracin por Sulfo-fosfo-vainillina, utilizando patrones de cido oleico de diferente concentracin, para la determinacin de lpidos insaturados en la leche, leda a 540 nm en un Spectronic 20 D+.

0.25 0.6 0.2 0.15 0.1 0.05 0.1 0 0 50 100 150 200 0 0 100 200 300 400 500 600 0.5 y = 0.001x + 0.0481 R = 0.7634 0.4 0.3 0.2 y = 0.0009x R = 0.8243

Figura 6. Curva de calibracin por Lugol, utilizando patrones de almidn de diferente concentracin, para la determinacin de almidones en la leche, leda a 570 nm en un Spectronic 20 D+.

Figura 9. Curva de calibracin por Liebermann-Bouchard, utilizando patrones de colesterol de diferente concentracin, para la determinacin de esteroles en la leche, leda a 650 nm en un Spectronic 20 D+.

Es importante recalcar que para la obtencin Fig.9 los patrones de colesterol utilizados fueron de 100, 200, 300, 400 y 500 g/mL, debido a que la disolucin madre de colesterol que nos brindaron era de 1 mg/mL, por lo que los patrones sugeridos en el procedimiento de 2, 4, 6, 8 y 10 mg/mL no se podan preparar a partir de esta disolucin madre. Como se muestra en el cuadro 3, la fase o extracto acuoso mostr un resultado positivo para Molisch, Antrona y Bial, por lo que sugiere que se encuentran presentes azcares, por este motivo este extracto acuoso solamente se cuantific mediante el mtodo de Fenol sulfrico. El azcar ms importante que se encuentra en la leche es la lactosa, un carbohidrato soluble en agua, lo que concuerda que el mismo se haya encontrado en la fase acuosa, ya que cuando se agreg el cido tricloroactico a la leche, se formaron 2 fases: la fase slida, que contena las grasas y protenas y la fase acuosa que contena los carbohidratos. La presencia de carbohidratos en esta fase es debido a que los mismos son solubles en el cido tricloroactico ya que forman puentes de hidrgeno entre los grupos hidroxilo de los carbohidratos con el grupo carboxlico del cido. En el cuadro 3 tambin observamos que para el extracto etreo Liebermann y Vainillina resultaron positivos, lo que resulta en la presencia de lpidos insaturados y esteroles como el colesterol. Lo cual es concordante con lo esperado debido a que las grasas se separaron de la fase acuosa por precipitacin con cido tricloroactico y luego se realizaron extracciones con ter de petrleo y etanol, dejando as las grasas (no hidrosolubles) en la fase etrea y los dems compuestos hidrosolubles en la fase metanlica. La fase metanlica deba contener protenas solubles y otros compuestos hidrosolubles, pero segn el cuadro 3, al resultar negativo para todas las pruebas, supone una cantidad muy pequea de los mismos, tal vez por la clase de leche que utilizamos. Para el extracto alcalino segn el cuadro 3, solamente dio positivo para la prueba de Biuret, prueba que detecta protenas. En este caso se trata de la casena, protena encontrada en mayor proporcin en la leche. La casena se separ de la leche junto con las grasas, mediante la adicin del cido tricloroactico; la casena no es soluble ni en ter de petrleo ni en metanol, razn por la cual segua slida en la extraccin etrea-metanlica. La casena al

tratarse con hidrxido de sodio se convierte en caseinato de sodio y se solubiliza, razn por la cual esta protena la encontramos en este extracto. A continuacin mostramos para los distintos extractos las absorbancias y concentraciones, junto con la respectiva curva de calibracin con que fueron cuantificados los componentes de la leche. Cuadro 4. Resumen de las absorbancias y concentraciones de los distintos extractos, utilizando para su cuantificacin la prueba especfica que aqu se menciona.
Prueba cuantitativa Liebermann Acuoso A C
(g/mL)

Etreo 0,006 5,4 x10-6 NA NA 0,000 0,000 NA NA

Alcalino NA NA NA NA NA NA 0,152 5,73

NA NA 0,312 0,0936 NA NA NA NA

Fenol sulfrico Vainillina

A C ((g/mL) A C
(g/mL)

Biuret

A C
(g/mL)

*A: absorbancia, C: concentracin *NA: no aplica El extracto metanlico no se someti a cuantificacin debido a que el mismo present solamente resultados negativos en todas las pruebas cualitativas anteriormente mencionadas. Para la cuantificacin del extracto acuoso se realiz una dilucin de 0,4 mL de extracto en 100 mL de agua destilada. En la cuantificacin por Vainillina y Liebermann del extracto etreo, no se realiz dilucin alguna; y para la cuantificacin por Biuret del extracto alcalino no se realiz dilucin alguna tampoco. En el extracto etreo la cuantificacin con la vainillina result en una concentracin de cidos grasos de 0 g/mL, puede ser porque la leche semidescremada utilizada posee muy pocos de estos lpidos insaturados. A parte que el procedimiento sugiere el calentamiento adicional en bao mara, lo cual no se debe realizar porque el calentamiento que provoca el cido sulfrico es suficiente, y un extra calentamiento puede provocar datos errneos. Adems que la curva de calibracin realizada utiliz

el cido oleico como patrn, estaba viejo por lo que la instauracin del acido graso se oxida a un epxido que posteriormente se abre por medio de la hidrlisis del epxido, por lo cual al no haber doble enlace la reaccin con la fosfovainillina no se da o se da muy baja. La concentracin de esteroles en la leche, segn la cuantificacin por Liebermann del extracto etreo nos da de 5,4 x10-6 g/mL, lo cual es una cantidad bastante pequea, esto debido a que el procedimiento segn el manual sugera el calentamiento de las disoluciones antes de hacer su lectura en el espectrofotmetro, lo cual al realizarlo el color verde desarrollado inicialmente se perdi y por ende su absorbancia no es la correcta ni su concentracin tampoco. Segn las especificaciones detalladas en la leche utilizada se informa que; contiene 5 gramos de grasa, 12 gramos de carbohidratos y 8 gramos de protena, esto referido a 250 mL, por lo que para 1 mL sera: 20 g de grasa por mililitro de leche, 480 g de carbohidratos por mililitro de leche y 32 g protena por mililitro de leche. Por lo que los resultados, segn el cuadro 4, de concentracin obtenidos para grasas (Liebermann), protenas (Biuret) y carbohidratos (Fenol sulfrico) no coinciden con las tericas especificadas en la informacin nutricional de la leche, esto debido a las razones anteriormente mencionadas en el caso de Liebermann y Vainillina; y para el caso de Biuret se obtuvo un resultado menor que el terico debido a que las protenas se encuentran en el extracto acuoso, el cual es el ltimo extracto que se obtiene, por ende luego de todo el tratamiento que se le realiz a la leche, parte de la protena pudo quedar en los diferentes extractos, eso s, quedando la mayora en el extracto alcalino. En el caso de la cuantificacin por Fenol sulfrico, se obtuvieron datos errneos, por errores de los analistas que realizaron esta curva de calibracin. CONCLUSIONES En la prueba cuantitativa de Fosfo-sulfo-vainillina no debe de ser calentada en bao mara luego de la adicin de los diferentes reactivos, ya que puede resultar en datos errneos. En cuanto al patrn de cido Oleico para la realizacin de la curva de calibracin en la cuantificacin de lpidos en leche es necesario realizar la preparacin de la disolucin patrn de este acido

antes de hacer el anlisis y no utilizar uno que sea viejo para evitar la oxidacin de la instauracin. Es necesario realizar un blanco de 100 L en etanol en el primer patrn en la reaccin con sulfofosfovainillina y no con agua como indica el mtodo debido a que mejora la introduccin de los patrones en la curva de calibracin y realizar los aforos de los patrones con este mismo solvente. En la prueba de Liebermann, la disolucin resultante no debe de calentarse antes de realizar la lectura espectrofotomtrica, ya que la intensidad del color desarrollado previamente al calentamiento disminuye significativamente y los resultados podran resultar errneos. Para la cuantificacin exacta de los componentes de la leche, se debera de utilizar un procedimiento en el cual tome en cuenta la reparticin de los diferentes componentes a analizar en los distintos extractos de la leche. Para una mejor visualizacin, en modo de laboratorio, de la reparticin de los componentes de la leche en los distintos extractos y una mejor cuantificacin es recomendable utilizar leche que no sea semidescremada o descremada, sino leche entera. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
[1]

Agenjo, C. (1948). "Industrias lcteas". 1era edicin. Espaa-Calpe S.A

[2]

Angulo A., Mahecha L., Olivera A., (2009) Sntesis, Composicin y Modificacin de la Grasa de la Leche Bovina: Un nutriente valioso para la salud humana. Revista MVZ Crdoba, Vol. 14, Nm. 3, septiembre-diciembre., pp. 1857-1859
[3]

Bienzobas, G., Muoz H., (1999) Leche y derivados: En Alimentos: composicin y propiedades., Pamplona. Facultad de Farmacia. Universidad de Navarra. EUROGRAF, p. 84
[4]

Burke, R. W; Diamondstone B. I; Velapoldi R. A. and Menis O., (1974), Mechanisms of the Liebermann-Burchard and Zak Color Reactions for Cholesterol, Clinical Chemistry, p 799-801.

[5]

Cheftel, Jean-Claude. Cheftel, Henri., (2000) Introduccin a la Bioqumica y Tecnologa de los Alimentos, Volumen 1, Editorial Acribia, Zaragoza, Espaa, p 48
[6]

Grummer, R.R., (1991). Effect of feed on the composition of milk fat. Journal of Dairy Science p74.
[7]

Jensen, R.G. (2002). The Composition of bovine milk lipids, Invited Review. Journal of Dairy Science p 85.
[8]

Johnson, K.R., Ellis, G., Toothill, C., (1977) The Sulpho-Phosphovainillin Reaction for Serum Lipids., Clinical Chemistry., Vol. 23., No. 9., pp 1969, 1977.
[9]

Juhlin, J., (2010)., Factors associated with spontaneous oxidized flavour in cows milk. Faculty of Veterinary Medicine and Animal Science. Department of Animal Breeding and Genetics. Uppsala., Doctoral Thesis., pp 9-11
[10]

Kenny A. P (1952), The Determination of Cholesterol by the Liebermann-Burchard Reaction, Biochemical Journal , 52(4): 611619.
[11]

Miller D., (2001). Qumica de Alimentos, Manual de Laboratorio. Limusa Wiley, Mxico
[12]

Nollet, L. M. (1996).; Handbook of Food Analysis; M. Dekker, Nueva York

[13]

Tecnologa Asptica (2001), La revolucin en el procesamiento y envasado de la leche. Revista Chilena de Nutricin. Volumen 28, Suplemento N1, p 109
[14]

Zvala, J. M., (2005), Aspectos Nutricionales y Tecnolgicos de la Leche., Direccin General de Promocin Agrcola. Ministerio de Agricultura. Direccin de Crianzas, Per, p11-14.