1.

INTRODUO O setor da pecuria leiteira no Brasil tem apresentado uma evoluo substancial

neste milnio. Desde 1997 que a aquisio anual de leite pelas indstrias tem sido crescente, apresentando variao anual positiva em todos os anos (IBGE, 2011). Neste cenrio, a produo de leite no Brasil em 2010 chegou a 20.966.730 milhes litros de leite, o que correspondeu a um aumento de 7,0% no comparativo com os 19.601.655 milhes de litros observados em 2009. No obstante, sabe-se que o aumento gradual da produo leiteira em um rebanho comercial bem manejado e em condies favorveis normalmente est associado a um estresse metablico e principalmente uma queda na fertilidade e eficincia reprodutiva (THATCHER et al., 2010). Vrias tecnologias vm sendo utilizadas para aumentar a produtividade em rebanhos leiteiros, sendo uma delas a administrao da somatotropina recombinante bovina (rbST), que pode aumentar a produo de leite em 3,5 kg/dia nos dois primeiros meses de lactao aps o tratamento em vacas primparas e multparas da raa Holandesa (RIVERA et al., 2010). Alm da produo de leite, sabe-se que a administrao exgena do rbST tambm apresenta efeitos na fertilidade de fmeas bovinas (SANTOS et al., 2000). Por exemplo, j foi demonstrado experimentalmente que o uso do rbST aumentou o nmero de folculos pequenos (2 a 5 mm) e mdios (6 a 9 mm) nos ovrios (GONG, 2002; KIRBY et al., 1997), aumentando o desenvolvimento do folculo desde a fase primria at a terciria, o que ocorreu em paralelo a um aumento na quantidade de receptores de GH (GHR) nos complexos cumulus-ocito (COCs; KOLLE et al., 1998). Na prtica, difcil distinguir os efeitos diretos do rbST e de outros hormnios metablicos na funo reprodutiva, mas a administrao do rbST aumentou as concentraes circulantes do fator de crescimento semelhante insulina do tipo 1 (IGF-1) e insulina, estimulando a
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proliferao, diferenciao e desenvolvimento celular, e regulando a esteroidognese e a apoptose nas clulas da granulosa (MAIN et al., 2010). Aps avaliar os efeitos da rbST sobre a maturao nuclear e citoplasmtica de ocitos bovinos e a sua competncia e desenvolvimento embrionrio in vitro at o estdio de blastocisto, Kuzmina et al. (2007) observaram que a influncia do rbST na competncia do desenvolvimento de ocitos bovinos maturados in vitro modulado pelas clulas da granulosa. H quase duas dcadas que o rbST tem sido utilizado associado a programas de ovum pickup e fecundao in vitro (OPU-FIV) com o intuito de melhorar a qualidade e quantidade dos ocitos recuperados (De La SOTA et al., 1993; GONG et al., 1993; LUCY et al., 1993). O efeito do tratamento com rbST ao longo do tempo, ou seja, a intervalos quinzenais por vrias semanas consecutivas, pode por um lado aumentar o nmero de folculos disponveis para a aspirao em programas de OPU-FIV (BOLS et al., 1998; TRIPP et al., 2000), mas pode, por outro lado, causar alteraes morfolgicas nas clulas do cumulus e dificultar a aspirao dos ocitos de folculos aspirados (BOLS et al., 1998). Vrios estudos tm comprovado uma tendncia de melhoria na qualidade oocitria nos animais tratados com rbST (BEVERS et al., 1997; PAVLOK et al., 1996; PIVATO et al., 1999), com o aumento na taxa de clivagem e subseqente produo in vitro de embries (RAMOS et al., 2007). Em adio, a suplementao de GH e IGF-1 ao meio de maturao in vitro (MIV) levou a um aumento significativo na produo in vitro de embries, comprovando desta forma os benefcios tambm in vitro da adio destes hormnios na competncia oocitria (MOREIRA et al., 2002). Da mesma forma que os experimentos envolvendo a produo in vitro de embries bovinos, a administrao de rbST em fmeas doadoras tambm parece afetar positivamente a produo in vivo de embries bovinos. Em estudo recente, o efeito in
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vivo da pr-estimulao ovariana com rbST aumentou a taxa de clivagem e a produo de blastocistos e, quando associado ao FSH, melhorou a qualidade dos ocitos obtidos de vacas da raa Gir (RAMOS et al., 2007). Tendo em vista os efeitos predominantemente positivos do rbST na produo in vivo e in vitro de embries bovinos, mas potencialmente negativos no metablico energtico animal, a nossa hiptese que a administrao cumulativa (intervalos quinzenais por 120 dias) de distintas doses de rbST (50% ou 100% da dose recomendada) em fmeas lactantes da raa Guzolando a partir do pico da lactao promover uma curva bifsica na eficincia de produo in vivo e in vitro de embries, com uma melhoria inicial seguida da diminuio na produo de embries quando na dose padro (100%), com a manuteno da eficincia na dose reduzida (50%). Desta forma, este experimento teve como objetivos avaliar o efeito da administrao cumulativa de distintas doses de rbST sobre (a) na produo in vivo de embries, aps a superovulao (nmero total e proporo de estruturas viveis, qualidade embrionria e cintica de desenvolvimento), (b) a produo in vitro de embries por OPU-FIV (taxa de recuperao oocitria, qualidade oocitria, e desenvolvimento in vitro de embries), e (c) em parmetros sanguneos de certos substratos associados ao metabolismo energtico intermedirio e metabolismo dos carboidratos, lipdeos e das protenas.

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2.

REVISO DE LITERATURA

2.1 Hormnio do Crescimento, Growth Hormone (GH), Hormnio Somatotrfico (STH) ou Somatotropina (ST) O GH ou hormnio somatotrfico (STH) age estimulando as clulas somticas, algo necessrio principalmente durante a fase de crescimento (ENRIGHT et al., 1993). O GH um polipeptdeo de cadeia nica, formado por 191 aminocidos, cujo nico gene, mapeado no cromossomo 19q-26qter em bovinos, compe-se de 5 exons intercalados por 4 ntrons, totalizando 2856 pares de base (RODRIGUES et al., 1998). O hormnio liberado pela adenohipfise mediante uma srie de estmulos fisiolgicos que envolvem, entre outros fatores, aes do fator liberador de GH (GRF ou GHRH) e da somatostatina (SRIF ou GHIH), flutuaes nas concentraes sangneas de glucagon, insulina, fatores de crescimento semelhantes insulina 1 e 2 (IGF-1 e IGF-2, respectivamente), hormnios estrognicos (ENRIGHT et al., 1993), alm de processos metablicos e fisiolgicos (LUCY, 2000). O GH pode influenciar na formao de protenas e cidos nuclicos dos tecidos corporais (LAWRENCE & FOWLER, 2002). Esse estmulo sntese protica , provavelmente, resultante de um aumento na atividade dos ribossomos envolvidos no processo de traduo. Outra forma de atuar do GH de forma direta ou indireta, atravs do IGF-1, que estimula os processos anablicos como a diviso celular e o crescimento do esqueleto. Alm disso, o GH exerce efeitos metablicos importantes, como a inibio do transporte de glicose para os tecidos perifricos (resistncia perifrica insulina), com elevao da glicemia (atividade diabetognica), e concomitante elevao da taxa de oxidao de lipdeos (atividade lipoltica) e aminocidos (LAWRENCE e FOWLER, 2002).
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No crescimento ps-natal, o GH no possui glndula-alvo, mas o rgo com maior concentrao de receptores para GH o fgado (LUCY et al., 1998). A ST quando se liga ao seu receptor no fgado estimula uma srie de mudanas metablicas que influenciam no crescimento e metabolismo dos bovinos (ETHERTON e BAUMAN, 1998). Estas mudanas aumentam a sntese e secreo do fator de crescimento semelhante insulina do tipo 1 (IGF-1), assim como a protena carreadora 3 do IGF-1 (IGFBP3; JONES e CLEMMONS, 1995). Por sua vez, o IGF-1 estimula o crescimento e o desenvolvimento de vrios tipos celulares (JONES e CLEMMONS, 1995). O efeito da ST no crescimento e na reproduo pela liberao de IGF-1 do fgado (JONES & CLEMMONS, 1995). Uma vez liberado pelo fgado, o IGF-1, via circulao sangunea, atua endocrinamente via receptor para o IGF-1 (IGF-1r) no tecido reprodutivo, como os folculos ovarianos, ocitos, clulas da granulosa, corpo lteo, ovidutos, endomtrio, miomtrio, placenta, hipotlamo e hipfise (ARMSTRONG & WEBB, 1998; HEAP et al., 1996; SPICER et al., 1995). 2.1.1. O SISTEMA IGF: FATORES DE CRESCIMENTO SEMELHANTE INSULINA DO TIPO 1 (IGF-1) E 2 (IGF-2) E PROTENAS DE LIGAO DE IGFs (IGFBPs) Os fatores de crescimento semelhantes insulina dos tipos 1 e 2 (IGF 1 e 2) so hormnios peptdicos com baixo peso molecular e caractersticas estruturais e atividade metablica semelhantes pr-insulina (YOSHIMURA, 2003), tambm conhecidos como somatomedinas, com aes conhecidas, na funo reprodutiva, sobre a maturao do ocito, ovulao, implantao e embriognese. O IGF-2 similar ao IGF-1 na estrutura e funo, agindo tambm por meio do IGF-1r, mas com menor potncia, por apresentar menor afinidade. Contrrio ao que ocorre com a secreo de IGF-1 heptico,
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a ST parece no controlar ou participar na secreo de IGF-2 (VICINI et al., 1991), o qual apresenta uma funo predominantemente pr-natal. Localmente, estes dois fatores (IGF-1 e -2) produzem efeitos parcrinos e autcrinos sobre a proliferao celular. Em mamferos, o IGF-1 e o IGF-2 esto envolvidos na estimulao das clulas foliculares e tambm na maturao do ocito (LORENZO et al., 2002). O IGF-1 regula a formao do antro e aumenta a atividades da aromatase, regulando a ao do FSH nas clulas da granulosa dos folculos antrais (BAKER et al., 1996; ZHOU et al., 1997). O desenvolvimento do folculo depende da espcie animal, havendo diferenas no sistema ovariano em resposta aos IGFs. As clulas ovarianas tambm sintetizam e secretam o IGF-1, sendo que as clulas da granulosa sintetizam IGF-1, enquanto que as da teca interna sintetizam o IGF-2 (PERKS et al., 1999). Aes importantes do sistema do eixo do IGF ovariano so observadas quando atuam em sinergismo com as gonadotrofinas FSH ou LH, auxiliando na mitognese e na esteroidognese (GUTIERREZ et al., 1997). Este sinergismo do sistema do IGF ovariano aumenta o nmero de receptores para as gonadotrofinas e a sntese de IGF-1 nas clulas da granulosa (ADASHI, 1998; SPICER et al., 1995). Consequentemente, h uma alta correlao entre a quantidade de transcritos para o IGF-1 e a quantidade de receptores para o FSH (ADASHI, 1998; BESNARD et al., 1997). Os efeitos biolgicos dos IGFs so modulados pelas protenas de ligao de IGFs (IGFBPs), havendo pelo menos seis protenas (IGFBP-1 e -6) conhecidas, com efeitos de inibio de ao biolgica de IGFs, reduo de degradao de IGFs, ou mesmo potencializao de suas aes (LUCY et al., 2000). Em bovinos, a sntese local de IGFBP-2 e IGFBP-4, duas das protenas de ligao de maior importncia no eixo do sistema IGF ovariano, ocorre na granulosa e na teca, respectivamente (ARMSTRONG
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et al., 1998). A manuteno de baixa atividade das IGFBPs totais no grupo de folculos , pelo menos em parte, regulada pelo FSH e por dois outros mecanismos identificados at o momento como, a reduo na expresso do gene de IGFBP-2 (ARMSTRONG et al., 1998) e a induo de atividade proteoltica contra a IGFBP-4 (FORTUNE et al., 2001; RIVERA et al. 2001). O IGF-1 e as IGFBPs exercem papel fundamental na dominncia folicular, durante o desenvolvimento dos folculos. Os nveis de IGFBP no fludo folicular alteram-se durante a foliculognese (MONGET et al., 1996) em resposta, em parte, sntese e secreo do IGF-1 e do IGF-2 no ovrio promove, os quais promovem a degradao de IGFBPs (ADASHI, 1998; BESNARD et al., 1997). Por exemplo, durante o estabelecimento da dominncia folicular, as concentraes de IGF-1 no fluido folicular aumentam, enquanto que as concentraes de IGFBP-2 diminuem (FORTUNE et al., 2001; GINTHER et al., 2002). De fato, Ginther et al. (2002) confirmaram que as concentraes de IGFBP-2, -4 e -5 no fluido folicular so menores ou nulas no folculo dominante (FD) e maiores no folculo subordinado (FS). Por outro lado, o FD possui maior atividade das proteases especficas para a IGFBP-4, quando comparado aos FS, liberando IGF-1, o que provavelmente potencializa ou permite a ao biolgica do IGF1 e, consequentemente, das gonadotrofinas na estimulao do crescimento e na diferenciao folicular, resultando no estabelecimento da dominncia (FORTUNE et al., 2001; MIHM et al., 2000; RIVERA et al., 2001). As IGFBPs agem diretamente no crescimento das clulas ovarianas (RECHLER, 1997). Em folculos atrsicos, as IGFBPs se encontram em altas concentraes (STEWART et al., 1996), impedindo a atuao do IGF-1 nos seus receptores posicionados na granulosa, afetando o crescimento e diferenciao dos folculos
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atrsicos. Por outro lado, IGFBP-2, -3, -4 e -5 degradada pelas proteases, mantendo a concentrao baixa no lquido folicular dos folculos dominantes (BESNARD et al., 1997). Uma das proteinases foliculares que j foi relatada em bovinos e eqinos a pregnancy-associated plasma protein A, ou PAPP-A (MAZERBOURG et al., 2003), sendo especfica para IGFBP-4 (LAWRENCE et al., 1999), IGFBP-5 (LAURSEN et al., 2001) e responsvel pela degradao da IGFBP-2 em bovinos e sunos (MONGET et al. 2003). A concentrao baixa de IGFBPs inibitrias permite uma maior ao biolgica do IGF-1 nos folculos dominantes. A diminuio nestas IGFBPs por causa de uma diminuio na expresso de mRNA (IGFBP-2) e um aumento na degradao proteoltica da IGFBP-2, -4 e -5 pela PAPP-A no fluido folicular, processo que provavelmente participa da seleo de folculos dominantes. Em contraste, nveis e/ou stios de expresso de IGF-1, IGF-2, IGFBP-4, IGFBP-5 em clulas foliculares diferem fortemente entre as espcies de mamferos, sugerindo que esses fenmenos podem desempenhar papis espcie-especficos ou secundrios no ovrio durante a foliculognese (MAZERBOURG et al., 2000). Quando testado in vitro, a IGFBP-3 inibiu os efeitos estimulatrios do IGF-1 em clulas da granulosa de bovinos. Consequentemente, os nveis de IGFBPs diminudos podem, de fato, conduzir a uma maior ao biolgica do IGF-1 (SPICER et al. 2002). 2.1.2. SOMATOTROPINA RECOMBINANTE BOVINA (rbST) A rbST ou hormnio do crescimento recombinante de bovinos foi um dos primeiros produzidos em escala comercial com protena recombinante, com seu uso na rea animal visando o aumento na produo de leite (BAUMAN, 1999). Este hormnio est ligado ao crescimento (GLUCKMAN et al., 1987) e regulao de processos fisiolgicos e metablicos dos animais por meio da sntese de IGF-1 e protenas de
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ligao (IGFPBs), que so seus mediadores hormonais nos processos metablicos (LUCY, 1996). Quando administrada sistemicamente, a rbST persiste circulando por at trs semanas aps a aplicao (CUSHMANN et al., 2001) e, segundo Lucy et al. (2000), a maior influncia da rbST na reproduo feita de modo indireto, atravs do IGF-1. Vrios grupos relataram que tanto o rbST quanto o FSH e os estrgenos estimulam a expresso de IGF-1 nas clulas da granulosa (ATHANASSIOUS, 2000; BLEY et al., 1997; MONGET e MONNIAUX, 1995). De fato, a administrao de rbST em animais duplicou os nveis de IGF-1 sanguneo (BAUMAN, 1999). A rbST aumenta a populao de folculos em animais de origem europia (DE LA SOTA et al., 1993; BOLS et al., 1998; GONG et al., 1993, 1996, 1997; WEBB et al., 1994; KIRBY et al., 1997) e em vacas zebunas da raa Nelore (BURATINI Jr. et al., 2000; CARTER et al., 1998). Postula-se que o efeito deste hormnio ocorra primeiramente na fase de recrutamento do crescimento folicular, no sendo afetada a seleo de folculos grandes e a taxa de ovulao. Porm, Crystal et al. (1997) relataram que o nmero de folculos com dimetros de 3 a 5 mm e de 6 a 9 mm foi maior em vacas tratadas com rbST em relao quelas no tratadas. Como o GH, o IGF-1, e as IGFBPs so importantes no controle da funo ovariana, o rbST parece promover o aumento do IGF-1 no fluido folicular (HERRLER et al., 1994), o que poderia melhorar a qualidade dos ocitos e, consequentemente, a maturao e desenvolvimento embrionrio in vitro at o estdio de blastocisto. A rbST exgena pode tambm preservar os ocitos da degenerao atrsica (PAVLOK et al., 1996) e quando utilizadas antes do incio das sesses de OPU tem sido postulado como uma estratgia valiosa para aumentar o nmero e a qualidade dos ocitos coletados in
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vivo e dos embries produzidos in vitro em bovinos. Interessantemente, a adio de rbST (IZADYAR et al., 1998) ou de IGF-1 (MARKKULA e MAKAREVICH, 2001) ao meio da maturao in vitro atuou positivamente na maturao nuclear e na capacidade de desenvolvimento dos ocitos, refletidas no aumento na taxa de desenvolvimento at o estdio de blastocisto. Da mesma forma, Ramos et al. (2007) avaliaram o efeito da pr-estimulao ovariana com rbST, associada ou no ao FSH, sobre a populao folicular, a recuperao de ocitos e a produo in vitro de embries em vacas Gir, e observaram que a administrao de rbST aumentou a taxa de clivagem e a produo de blastocistos, concluindo que, quando associado ao FSH, houve melhora na qualidade dos ocitos recuperados. Por outro lado, embora o recrutamento de folculos tenha aumentado antes da aspirao folicular em animais tratados com rbST, Bols et al. (1998) relataram que o nmero e a qualidade dos ocitos, assim como o nmero de blastocistos produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados de fmeas tratadas com rbST, no foram afetados. Contudo, vrios estudos tm demonstrado uma melhoria na qualidade oocitria em animais tratados com rbST (BEVERS et al., 1997; PIVATO et al., 1999; PAVLOK et al., 1996), apesar de ainda haver controvrsia e falta de consistncia quanto aos resultados experimentais. A utilizao de rbST em fmeas doadoras tambm tem sido favorvel na produo in vivo de embries aps a superovulao. Um dos primeiros relatos da utilizao de rbST em vacas superovuladas foi realizado por Gong et al. (1991), que observaram tambm um aumento na populao de folculos mediado por um aumento nas concentraes de IGF-1 e insulina circulantes (GONG et al., 1993). Em novilhas, foi demonstrado que o rbST aumentou o nmero de folculos menores que 5 mm de dimetro (HWANG et al., 1997; GONG et al., 1997), enquanto que em vacas, este
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aumentou o nmero de folculos mdios (6 a 9 mm), todos potencialmente responsivos estimulao por gonadotrofinas, sugerindo que a populao folicular alvo do tratamento com rbST, podendo beneficiar a resposta superestimulao ovariana com FSH ou anlogos, o que, obviamente, pode variar em funo da raa, paridade, idade e condies metablicas relacionadas lactao (DE LA SOTA et al., 1993; KIRBY et al., 1997; LUCY et al., 1993). A associao de rbST em protocolos de superovulao, tm apresentado no s um aumento na populao de folculos antrais, como tambm uma melhora da maturao oocitria e um aumento de embries transferveis (HERRLER et al., 1994; GONG et al., 1996). Essa melhora da maturao oocitria e aumento de embries transferveis tambm foram observados por Gong et al. (1993) quando a rbST foi associada ao eCG. Na tentativa de registrar a influncia do rbST nas superovulaes, Moreira et al. (2001) aplicaram a rbST em doadoras, no momento da inseminao, mas no constataram diferena significativa no nmero e na viabilidade dos embries colhidos entre o grupo rbST e o grupo controle; porm, o nmero de ocitos no fecundados por colheita foi menor no grupo rbST, demonstrando seu efeito benfico na produo in vivo de embries, j que o tratamento com rbST aumentou a percentagem de embries classificados como transferveis. Segundo THATCHER et al. (2001), os efeitos que so atribudos ao rbST so, basicamente, acelerao do desenvolvimento embrionrio e modulao dos fatores de crescimento das protenas do tero e oviduto. Em resumo, os dados atuais da literatura indicam o efeito positivo da administrao de rbST em fmeas bovinas sobre a funo reprodutiva. Estes efeitos parecem estar associados a um espectro amplo de aes nos gametas e embries, no ambiente ovariano, tubrico e uterino, e na modulao homeorrtica do metabolismo
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sistmico, que fundamentalmente melhoram a qualidade oocitria, favorecem o desenvolvimento embrionrio e culminam, potencialmente, com o estabelecimento de uma gestao vivel, o que, em termos aplicados, contribuem para o aumento da fertilidade e eficincia reprodutiva. No obstante, as inter-relaes biolgicas entre as funes reprodutivas, produtivas, fisiolgicas e metablicas ainda devem ser melhor elucidadas quando da utilizao de rbST em fmeas em lactao, especialmente quando administrado de forma crnica, cumulativa, para que no somente sejam optimizadas a produo leiteira e produo de embries, mas tambm para que seja salvaguardado o bem estar e a sade das fmeas lactantes.

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3. Captulo I1

O Capitulo I ser adequado s normas de publicao da revista Animal Reproduction Science

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Efeito da somatotropina recombinante bovina (rbST) na produo in vivo de embries de fmeas bovinas da raa Guzolando

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3.1 Introduo Os maiores entraves dos programas comerciais de transferncia de embries (TE) a grande variao individual em resposta ao tratamento superestimulatrio (NOGUEIRA et al., 2002; BARROS & NOGUEIRA, 2004), o que comumente observado tanto em vacas e novilhas Bos taurus indicus (BARUSELLI et al., 2003) quanto em Bos taurus taurus (SARTORI et al., 2004), com uma tendncia de raas leiteiras apresentarem uma variao ainda maior, provavelmente em decorrncia dos efeitos metablicos da produo leiteira (THATCHER et al., 2010). Alguns protocolos hormonais que sincronizam o desenvolvimento da onda folicular tm se revelado teis para a superestimulao ovariana, ou superovulao (SOV), basicamente por facilitarem o manejo das doadoras e reduzirem o intervalo de tempo necessrio para a execuo de um programa de superovulao em doadoras, alm de produzirem pelo menos o mesmo nmero de embries dos tratamentos tradicionais utilizados (NAGANO et al., 2004). Para optimizar-se ainda mais a eficincia na resposta aos protocolos de SOV, pesquisas tm sido desenvolvidas no intuito de aumentar a populao folicular presente na fase de recrutamento para melhorar a resposta aos protocolos de SOV e, consequentemente, melhorar a eficincia reprodutiva dos animais domsticos (FORTUNE, 2003). Neste sentido, a rbST parece influenciar positivamente o nmero de folculos recrutados e/ou a resposta aos protocolos de SOV (BURATINI et al., 2000; GONG et al., 1991). A maior quantidade de receptores para a
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rbST encontrada no fgado, que responsvel pela produo do fator de crescimento semelhante insulina (IGF-1). Entretanto, a maioria dos outros tecidos tambm responde rbST. No sistema reprodutor, esse hormnio atua sobre receptores no tero e ovrios, induzindo-os produo de IGF-1 (LUCY, 2000), tambm estimulando o aumento no nmero de receptores para o IGF-1 (IGF-1r), o que favorece, em seu final, o crescimento folicular ovariano (FONSECA et al., 2001; KOZICKI et al., 2005). H uma grande variao da resposta fisiolgica administrao de rbST conforme a espcie animal. Em bovinos, h uma grande variabilidade de interao deste hormnio sobre a superovulao e sobre a produo e o desenvolvimento embrionrio, tanto em fmeas de raas Bos taurus indicus (MORAES JUNIOR et al., 2008; VASCONCELOS et al. 2011), quanto Bos taurus taurus (NEVES et al., 2005). Desta forma, este experimento avaliou o efeito quantitativo e qualitativo da administrao cumulativa do rbST por 120 dias a partir do pico da lactao em fmeas lactantes da raa Guzolando sobre a eficincia de produo in vivo de embries aps a superestimulao folicular ovariana. 3.2 Material e Mtodos 3.2.1. Local e Animais Os experimentos foram conduzidos na Fazenda Teotnio, localizada na latitude de 45130 sul e longitude de 393435 oeste, a uma altitude 291 m, no municpio de Madalena, Cear, durante o perodo de maro a novembro de 2011. Foram utilizadas 14 fmeas multparas hgidas da raa Guzolado, cclicas e com ciclos estrais regulares, selecionadas aps exames clnico e ginecolgico completos. Os animais foram mantidos em regime semi-intensivo com pastejo rotacionado de Tifton,

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suplementao de silagem de milho, concentrado, sal mineral e gua a vontade durante todo perodo experimental. Os valores mdios referentes idade, escore de condio corporal (ECC), nmero de lactaes, dias em lactao e pico de produo de leite dos animais utilizados nos experimentos so apresentados na Tabela 1.

Tabela 1. Caractersticas zootcnicas e produtivas (mdia d.p.) de doadoras da raa Guzolado (n=14) utilizadas nos experimentos Caractersticas Mdia d.p. Idade (ano) ECC (1 a 5) Nmeros de lactaes Dias em lactao* Pico de produo de leite/dia (L/dia) 10,2 2,2 3,0 0,4 6,1 0,3 68,3 0,6 18,2 0,6

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*Dias em lactao no incio do experimento, com o trmino aos 184,0 0,6 dias de lactao.

3.2.2. Grupos Experimentais Os animais foram separados em trs grupos experimentais: (a) controle (n= 4), pela administrao de 5 mL de soluo fisiolgica a 0,9% (SF) por via IM, (b) G-250 mg (n=5) e (c) G-500 mg rbST (n=5), pela administrao de 250 mg e 500 mg de rbST (Boostin, Schering-Plough Sade Animal Indstria e Comrcio Ltda., Brasil), respectivamente, por via IM. Todas as fmeas receberam tratamento com SF ou com uma das duas distintas doses de rbST no incio do experimento (68,3 0,6 dias em lactao; Tabela 1), com administraes repetidas a intervalos de 14 dias, at o dia 181 7,0 de lactao, o que representou um perodo de 16 semanas. Exatamente seis dias aps a aplicao de SF ou rbST, e a cada quatorze dias foi realizado as inseminaes artificiais aps o tratamento superovulatrio. Entre o intervalo de 60 dias das SOVs

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realizaram-se quatro sees de ovum pickup (OPU) nas fmeas dos trs grupos experimentais, conforme abaixo, no perodo de maro a julho. 3.2.3. Produo in vivo de embries 3.2.3.1. Protocolo de mltipla ovulao (SOV), inseminao artificial (IA) e coleta de embries Foi utilizado um total de 200 mg de FSH (Folltropin-V, 400 mg, Bioniche Animal Health Inc., Canad) diludos em 20 mL de gua destilada, para a superovulao de cada fmea doadora. A administrao do hormnio foi com intervalos de 12 h em oito subdoses decrescente (4,0; 4,0; 3,0; 3;0; 2,0; 2,0; 1,0; 1,0 mL). Todas as doadoras foram inseminadas com smen do mesmo touro da raa Holandesa e da mesma partida. O protocolo da SOV e os procedimentos tcnicos seguem abaixo: Dia 0: Colocao de dispositivo intravaginal impregnado com 1,55 g de progesterona (CIDR, Pfizzer, Brasil) e administrao de 2 mg de benzoato de estradiol (Estrogin , Farmavet, Brasil) por via intramuscular (IM). Dia 4: Incio da SOV, com aplicao de 4 mL de FSHp (Folltropin-V, 400 mg, Bioniche Animal Health Inc., Canad) s 6:00 h e 4 mL s 18:00 h, por via IM. Dia 5: Aplicao de 3 mL de FSHp s 6:00 h e 3 mL s 18:00 h, por via IM. Dia 6: Aplicao de 2 mL de FSHp s 7:00 h e 2 mL s 19:00 h, por via IM, concomitante administrao de 0,150 mg de d-cloprostenol (anlogo da PGF2, Prolise, Arsa S.R.L., Argentina), e remoo do dispositivo vaginal de progesterona. Dia 7: Administrao de 1 mL de FSHp s 7:00 h, concomitante administrao de 0,150 mg de d-cloprostenol, e 1 mL de FSHp s 19:00 h, por via IM.
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70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88

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Dia 8 e 9: Observao de estro das doadoras, com a inseminao artificial (IA) realizada 12 h e 24 h aps o incio do estro. Dia 15: Coleta dos embries por via cervical (Figura 1).

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Figura 1. Protocolo de superovulao (SOV) dos trs grupos experimentais: controle (n= 4), G-250 mg rbST (n=5) e G-500 mg rbST (n=5).

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3.2.3.2. Coleta, avaliao e armazenagem dos embries No Dia 15 do protocolo, as fmeas doadoras foram submetidas ao procedimento de coleta e recoleta de embries por via cervical, conforme Cruz et al. (2008). As fmeas foram contidas sequencialmente por tratamento, sempre uma de cada grupo experimental, no tronco de conteno, onde foram avaliadas quanto resposta superovulatria pela contagem estimada do nmero de corpos lteos (CL) e folculos anovulatrios por ovrio e por fmea, por meio de ultassonografia (US) ALOKA SSD 500V (Aloka Co., Japo). Em seguida, realizou a anestesia epidural com 5 mL de

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cloridrato de lidocana a 2% (Anestsico L, Eurofarma, Brasil) e a limpeza da regio perineal com gua corrente e antissepsia com lcool a 70%. Para a coleta das estruturas, foi utilizado um cateter de Foley de no. 18 ou 20, com um mandril metlico adaptado em seu interior para conferir rigidez e permitir a introduo do instrumento no tero por via cervical. Aps a passagem do cateter de Foley pela crvix, posicionou-se a regio do balo no corpo do tero, onde ento o balo foi inflado com um volume de aproximadamente 13 a 15 cm3 de ar, impedindo o refluxo do lquido infundido. Em seguida, procedeu-se a retirada do mandril e a conexo com o equipo em forma de Y. A soluo de D-PBS (Dulbeccos PhosphateBuffered Saline, Nutricell, Brasil), aquecida a 37C, foi utilizada para a lavagem uterina. Seguindo os procedimentos preconizados por Robertson e Nelson (1998), foram procedidas lavagens uterinas com um volume de 1 L da soluo de coleta. O lquido oriundo da lavagem dos cornos uterinos foi recolhido em um filtro de coleta, com o excedente de fluido sendo filtrado. No final do procedimento de coleta, procedeu-se a recoleta uterina, conforme Cruz et al. (2008); para tanto, as fmeas coletadas permaneceram com o cateter de Foley posicionado no trato reprodutivo, com 200 a 300 mL da soluo de coleta no tero; as fmeas doadoras eram ento liberadas por 20 a 40 min, quando ento eram novamente contidas no tronco de conteno para a re-lavagem uterina com at 500 mL de meio de coleta. No laboratrio, o contedo de cada filtro de coleta ou recoleta foi depositado em placas de Petri de 100 x 20 mm, com marcaes quadriculadas no fundo para a pesquisa dos embries sob lupa estereomicroscpica, sendo as estruturas lavadas e transferidas para uma placa de Petri de 35 x 15 mm contendo meio Holding (Nutricell, Brasil),
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onde os embries foram classificados em viveis e inviveis, com os embries viveis sendo ainda classificados segundo a qualidade morfolgica e o estdio de desenvolvimento embrionrio, de acordo com Stringfellow e Seidel (1998).

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3.2.4. Anlise Bioqumica Um total de 12 amostras de sangue (plasma e soro) foram coletadas de cada fmea doadora, a intervalos de 14 dias, com as coletas realizadas nos mesmos dias das aplicaes de rbST diretamente da veia caudal, em tubos a vcuo heparinizados e sem anti-coagulante do tipo (Vacutainer, BD, EUA), e centrifugados (Centrfuga Fanen Exelsa Baby I, Modelo 206, Fanem, Brasil) a 3500 RPM por 15 min. O plasma e o soro foram aliquotados em duplicatas em microtubos de 2,0 mL (Axigen Scientific MCT 200B, EUA), e armazenados em freezer a -80C. As amostras do soro foram utilizadas para a anlise bioqumica quantitativa do colesterol (COL), triglicerdeos (TRIG), lipoprotena de muito baixa densidade (VLDL), lipoprotena de alta densidade (HDL), lipoprotena de baixa densidade (LDL), uria (URE) e glicose (GLI). A quantificao dos metablitos foi realizada no Laboratrio de Anlise Clnicas do Ncleo de Assistncia Mdica Integrada (NAMI), na Universidade de Fortaleza (UNIFOR), atravs de mtodo colorimtrico por meio de kits reagentes especficos para cada substncia (LABTEST, Brasil) em uma mquina automatizada (LABTEST 240, LABTEST, Brasil). 3.2.5. Delineamento Experimental e Anlise Estatstica O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso, com trs tratamentos (controle, G-250 mg rbST e G-500 mg rbST), em 14 repeties (nmero de animais), e duas sees de SOV (incio e fim) como fatores principais. Os dados para as variveis estudadas (total de corpos lteos e folculos anovulatrios e estruturas recuperadas; taxa de recuperao; total e proporo de embries viveis, estruturas no fecundadas, estruturas degeneradas; proporo dos estdios de desenvolvimento e qualidade
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embrionria; concentraes de componentes sricos analisados) foram submetidas ao teste de normalidade; os dados normais e os normalizados mediante transformaes matemticas (logartmica, arco seno) foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) ou ao teste paramtrico de Student-Newman-Keuls (SNK) para comparao de mdias, na probabilidade de 5%. Dados qualitativos foram realizados pelo teste do 2, para P<0,05. As anlises foram executadas atravs do programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc, 1997).

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3.3. Resultados Foram superovuladas 14 vacas da raa Guzolanda com duas sees para cada animal nos grupos controle (n=4), rbST 250 mg (n=5) e rbST 500 mg (n=5), totalizando 349 corpos lteos e 155 folculos anovulatrios observados por ultrasonografia, 226 estruturas recuperadas e 113 embries viveis (50,0%). Os resultados da resposta ovulatria e estruturas recuperadas de vacas da raa Guzolanda nos distintos grupos experimentais esto descriminados na Tabela 2. Quando comparado ao Grupo Controle, a utilizao de distintas doses de rbST por 16 semanas, a intervalos de 14 dias, no afetou a resposta ovulatria, o nmero de folculos anovulatrios e o nmero de estruturas recuperadas, mas as propores de embries viveis e de estruturas degeneradas no G-250 mg rbST foram significativamente inferiores do que nos grupos controle e G-500 mg rbST (P<0,05). O uso do rbST no afetou a cintica de desenvolvimento embrionrio, representado pelo o nmero e proporo de mrulas compactas, blastocistos iniciais, blastocistos, blastocistos expandidos, ou de qualidade morfolgica embrionria (Figura 2). Porm, houve uma reduo na qualidade embrionria no G-250 mg rbST em relao
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os grupo controle e ao G-500 mg rbST, com base na qualidade morfolgica (Figura 3), com um menor nmero de embries Grau 1 e maior de Grau 3 na dose de 250 mg de rbST (P<0,05).

Tabela 2. Resposta ovulatria e estruturas recuperadas (mdia d.p.) aps a superovulao de vacas da raa Guzolanda submetidas ou no ao tratamento om rbST Variveis Folculos Anovulatrios Estimativa do total de CLs Estruturas Recuperadas Embries Viveis Degenerados Controle 4,9 1,5a 12,8 1,1a 8,6 1,8a 5,7 1,5a (46/69) 66,6%aA 3,1 0,6a (23/69) 33,4%aB Tratamento 250 mg 4,4 1,3a 12,4 2,5a 8,0 1,9a 2,7 1,2a (27/80) 33,7%bB 5,2 1,8a (53/80) 66,3%bA 500 mg 4,1 1,3a 12,2 2,0a 7,7 1,9a 4,0 1,3a (40/77) 51,9%aA 3,6 1,5a (37/77) 48,1%aA

186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197

a,b: A,B:

Nmeros mdios seguidos de letras desiguais na mesma linha diferem pelo teste de SNK (P< 0,05). Nmeros seguidos de letras desiguais na coluna diferem estatisticamente pelo texto do 2, para (P<0.05).

Os resultados das anlises bioqumicas de componentes sricos relacionados ao metabolismo energtico animal so apresentados na Tabela 3. No houve diferena significativa no escore da condio corporal (ECC) e concentraes plasmticas de triglicerdeos, LDL, uria e glicose entre os grupos experimentais. J os teores sricos de colesterol e HDL foram menores (P<0,05) nos dois grupos tratados com rbST, com a concentrao de VLDL no grupo rbST 500 mg sendo semelhante ao grupo controle, mas mais elevada que no grupo rbST 250 mg.

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(%)

198 199 200 201 202 203 204

Figura 2. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%) por tratamento, aps o agrupamento em estdios de desenvolvimento, para embries produzidos in vivo aps a superovulao de vacas da raa Guzolanda submetidas ou no ao tratamento cumulativo com rbST.
a,b:

Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

(%)

205 206 207 208 209 210

Figura 3. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base na qualidade morfolgica, para embries produzidos in vivo a aps a superovulao de vacas da raa Guzolanda submetidas ou no ao tratamento cumulativo com rbST.
a,b:

Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

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211 212

Tabela 3. Escore de condio corporal (ECC) e parmetros bioqumicos sanguneos mdios (mdia d.p.) do perodo do experimento em fmeas Guzolanda nos grupos Controle, G-250 mg rbST e G-500 mg rbST Grupo ECC TRIG* COL* VLDL* LDL* HDL* URIA GLICOSE Experimental (1 a 5) 2,7 0,3a (mg/dL) 18,0 5,3a (mg/dL) 147,5 47,0a (mg/dL) 3,6 1,0ab (mg/dL) 51,3 31,8a (mg/dL) 92,6 24,2a (mg/dL) 18,3 8,7a (mg/dL) 44,7 16,7a

Controle

G-250 mg rbST

2,7 0,4a

16,5 5,3a

129,9 46,0b

3,3 1,1b

44,0 30,9a

84,0 22,4b

18,7 8,9a

45,1 17,0a

G-500 mg rbST

2,7 0,3a

19,1 7,8a

130,6 32,0b

3,8 1,5a

48,3 16,3a

79,3 20,5b

18,6 7,9a

49,2 24,7a

213 214 215

ab:

Nmeros seguidos de letras desiguais na coluna diferem pelo teste de SNK (P< 0,05). *TRIG: triglicerdeos; COL: colesterol; VLDL: lipoprotenas de muito baixa densidade; LDL: lipoprotenas de baixa densidade; HDL: lipoprotenas de alta densidade

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3.4.

Discusso As distintas doses de somatotropina recombinante bovina, aplicada por um

perodo repetitivo por vrias semanas, no influenciou nos parmetros de reposta ovulatria, na possvel falha de ovulao (folculos anovulatrios), no nmero de estruturas recuperadas, de embries viveis e de embries degenerados em fmeas da raa Guzolanda quando comparadas ao grupo controle no estimulado. Estes resultados so semelhantes aos encontrados por Moraes Junior et al. (2008) e Vasconcelos et al. (2011) na espcie Bos taurus indicus, e Neves et al. (2005) na espcie Bos taurus taurus e diferentes aos relatados por Kuehner et al. (1993), Herrler et al. (1994) e Nagano et al. (2004) na espcie Bos taurus taurus. Entretanto, a proporo de embries viveis foi inferior e a de degeneradas maior no grupo de 250 mg de rbST do que as observadas no controle e no G-500 mg rbST, sinalizando que a dose de rbST pode influenciar no percentual de embries viveis e nas estruturas degeneradas. A somatotropina pode no ter melhorado o recrutamento folicular e a quantidade de estruturas recuperadas na raa Guzolando da espcie Bos taurus taurus x Bos taurus indicus do presente estudo, como sugerido em outros estudos. Nagano et al. (2004) sugeriram que a rbST aumentaria o recrutamento folicular e a quantidade de estruturas recuperadas, pelo fato do seu RNA mensageiro j ter sido identificado nas clulas do cumulus e da granulosa de ocitos bovinos. Segundo Lucy (2000), a rbST aumenta as concentraes plasmticas do hormnio do crescimento, do IGF-1 e da insulina (LUCY, 2002), provavelmente explicando o efeito possivelmente benfico destes hormnios sobre maturao dos ocitos (PAVLOK et al., 1996), tanto por efeito direto (IZADYAR et al., 1998) quanto indireto pela estimulao das clulas da granulosa (SPICER et al., 1993).

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A administrao de rbST parece no ter afetado significativamente a cintica de desenvolvimento embrionrio, o que difere dos resultados de Nagano et al. (2004) que demonstraram o efeito significativo da rbST no desenvolvimento embrionrio, com um aumento na proporo de mrulas compactas e blastocistos, alm da diminuio da proporo dos blastocistos iniciais. A taxa de desenvolvimento embrionrio, com base na qualidade morfolgica grau 1, os embries produzidos in vivo foram melhores propocionalmente nos grupos controle e 500 mg, ou seja, o uso de 250 mg de rbST diminui a qualidade embrionria, com uma diminuio de embries de Grau 1 e um aumento de Grau 3. Nos estudos de MAFFILI et al. (2001), o uso da rbST em conjunto superovulao no aumentou a quantidade de embries produzidos, mas melhorou a qualidade e o desenvolvimento embrionrios. A melhora na qualidade embrionria pde ser atribuda a uma maior expresso do IGF-1r nos embries coletados no dia 7 de fmeas superovuladas (MOORE et al., 2007). Segundo Moreira et al. (2002) e Mtango et al. (2003), a adio da somatotropina ao meio de cultivo in vitro melhorou a taxa de clivagem e o desenvolvimento embrionrio. As doses de rbST no influenciaram o ECC ao longo do tempo neste estudo, o que corrobora com Lucci et al. (1998) que tambm no observaram diferenas no ECC entre o grupo tratado com rbST e o controle. A mudana na condio corporal dos animais tratados com rbST foram observados por Rivera et al. (2010) com mdia durante o perodo de estudo de 3,00 0,01 e 2,88 0,01 para as vacas do grupo controle e as tratadas com rbST, respectivamente. Os nveis sricos de COL e HDL foram inferiores nos grupos rbST 250 e 500 mg (P<0,05) quando comparados ao grupo controle. A ao da somatotropina mediada pelo IGF-1, sintetizado nos hepatcitos (HADLEY, 1996), que, entre outras funes, aumenta
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a captao e absoro de lipoprotenas (GRUMMER e CARROLL, 1988), justificando a diminuio das concentraes sricas de COL e HDL dos animais que receberam tratamento com rbST. Portanto, a somatotropina provoca profundas modificaes no metabolismo dos lipdeos e carboidratos, aumentando a liplise, reduzindo a deposio de triglicerdeos no tecido adiposo, acarretando um redirecionamento na utilizao de nutrientes e reduzindo a utilizao de glicose pelos tecidos perifricos (MATOS, 1998). O nvel srico de VLDL do grupo G-500 mg rbST foi maior (P< 0,05) do que o grupo G-250 mg, com tendncia tambm de ser maior do que o grupo controle. Entretanto, a maior concentrao de lipdeos no sangue ocorre quando h um aumento na gordura absorvida via intestinal ou aquela proveniente da liplise (JENKIS e JENNY, 1989). Desta forma, a somatotropina aumenta a mobilizao de cidos graxos (liplise) presentes no tecido adiposo (PAMELA E HARVEY, 1997), fornecendo uma via energtica alternativa por promover a liberao de cidos graxos no esterificados na circulao sangunea para uso no metabolismo energtico tecidual (MCDOWELL e ANNISON,1991). Durante a absoro intestinal e a mobilizao de gorduras, o fgado captura VLDL do sangue, hidrolizando e reesterificando os cidos graxos, e em seguida devolvendo ao sangue cidos graxos na forma de triglicerdeos, fosfolpideos e steres de colesterol. No entanto, os nveis sricos de triglicerdeos e LDL, pelo metabolismo dos lipdeos, de uria pelo metabolismo dos aminocidos e protenas, e de glicose, importante substrato energtico, no foram influenciados pela administrao de distintas doses de rbST ao longo do tempo. A somatotropina possui ao metablica ao alterar o catabolismo dos carboidratos e das gorduras, reduzindo a utilizao da glicose (PEEL e BAUMAN, 1987) e aumentando a glicemia. Percebe-se que no houve um efeito diabetognico do GH nos
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animais tratados com rbST, j que a glicose nos grupos rbST 250 e 500 mg se manteve semelhante ao grupo controle. Desta forma, mesmo que a anlise da insulina plasmtica nestes animais ainda esteja pendente, podemos inferir que no deve ter havido uma resistncia perifrica insulina neste animais, por bloqueio metabotrpico da alocao de transportadores GLUT-4, insulino-dependentes, tanto no msculo esqueltico quanto no tecido adiposo (LAWRENCE e FOWLER, 2002). Isto deve ter sido uma caracterstica associada a um balano energtico positivo que permitiu a manuteno de nveis plasmticos nos animais tratados semelhana ao grupo controle. Embora os nveis de triglicerideos no mostrem com evidncia o metabolismo de lipdeos que est ocorrendo no organismo animal, a reduo dos seus nveis poderia evidenciar que um efeito lipoltico discreto possa ter ocorrido nos tratamentos com rbST (BAUMAN, 1992). A uria tambm no foi influenciada pela rbST, indicando um efeito mnimo, se presente, no catabolismo protico para a produo de energia. A uria empregada nos perfis metablicos como indicador do metabolismo protico do animal em curto prazo. Em adio, a somatotropina possui efeito de partio do nitrognio para atender s exigncias da glndula mamria. Dietas ricas em protena fermentveis esto associadas com concentraes maiores de amnia no rmen do que aquelas com protenas de degradao mais lenta. Da mesma forma, em um balano energtico negativo, com a diminuio de utilizao de glicose no metabolismo energtico e um aumento na liplise, pode haver um aumento no catabolismo protico pela desaminao ou transaminao de aminocidos para fornecer cadeias carbnicas ao metabolismo intermedirio, gerando desta forma uria como subproduto. Desta forma, as concentraes de uria no sangue tambm esto relacionadas ao turnover protico do animal (GONZLEZ et al., 2000). Entretanto, o

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mecanismo que fornece aminocido para as clulas secretoras da glndula mamria no pode ser observado, pois ainda no foi realizada a anlise da protena do leite. Em resumo, a administrao de somatotropina recombinante bovina (rbST) em fmeas lactantes da raa Guzolando no afetou significativamente ou negativamente os parmetros metablicos e fisiolgicos estudados. Porm, a utilizao de meia dose de rbST (G-250 mg) causou uma diminuio na proporo de embries viveis e uma reduo na qualidade morfolgica embrionria em relao ao grupo controle ou ao grupo de dose inteira de rbST (G-500 mg).

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2

4. Captulo II2

O Capitulo I ser adequado s normas de publicao da revista Animal Reproduction Science

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Efeito cumulativo da somatotropina recombinante bovina (rbST) na produo in vitro de embries de vacas de fmeas lactantes da raa Guzolando

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4.1. Introduo As tcnicas de ovum pickup e fecundao in vitro (OPU-FIV) tem se mostrado como ferramentas promissoras, quando associadas, para a multiplicao gentica animal, em especial em bovinos, devido possibilidade de recuperao in vivo de ocitos de fmeas doadoras em diferentes status reprodutivos (pr-pberes, em anestro, cclicas, gestantes), potencializando a utilizao de fmeas com caractersticas zootcnicas desejveis (BARUSSELI et al., 2007). Dentre as distintas geraes de biotecnologias reprodutivas, a PIV de embries pela tcnica de fecundao in vitro (FIV) pode contribuir para uma maior produo de embries e produtos nascidos por doadora, por unidade de tempo, quando comparada a protocolos de superovulao e transferncia de embries (TE) clssicos, especialmente para raas bovinas zebunas (BOUSQUET et al., 1999). No entanto, mesmo com os progressos obtidos nos processos de maturao in vitro (MIV), fecundao in vitro (FIV) e cultivo in vitro (CIV) para o desenvolvimento embrionrio, a PIV de embries ainda apresenta algumas limitaes que precisam ser melhoradas e solucionadas. Alguns hormnios, como o hormnio do crescimento (GH), vm sendo utilizados com o intuito de sincronizar a onda folicular ovariana, incrementar a quantidade de folculos ovarianos para a OPU, a qualidade oocitria aps a recuperao por puno folicular, e melhorar o desenvolvimento in vitro de embries de melhor qualidade
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morfolgica obtidos aps a PIV (HANSEL et al., 1996; GOODHAND et al., 1999). A somatotropina recombinante bovina (rbST) ou hormnio do crescimento biossimilar foi um dos primeiros hormnios produzidos em escala comercial como protena recombinante (BAUMAN, 1999). A maior quantidade de receptores para o rbST encontrada no fgado, onde responsvel pela produo e secreo do fator de crescimento semelhante a insulina do tipo 1, o IGF-1. Entretanto, a maioria dos outros tecidos tambm responde ao rbST, com este hormnio, no sistema reprodutor, atuando sobre receptores no tero e nos ovrios, induzindo produo de IGF-1 tecidual (LUCY, 2000). A meia-vida plasmtica do rbST menor do que o GH endgeno (8 vs. 40 min.), devido a diferenas quanto a modificaes ps-traducionais (BYATT et al., 1992). Porm, as preparaes farmacolgicas de rbST utilizadas comercialmente para o incremento da produo de leite so manufaturadas para a liberao lenta do hormnio, o que permite persistir em circulao por at trs semanas aps a aplicao (CUSHMANN et al., 2001). Quando administrada em fmeas bovinas pberes, a rbST aumenta a populao de folculos ovarianos (GONG et al., 1991; 1993; KIRBY et al., 1997) e tem sido demonstrado um efeito positivo em ocitos e embries bovinos quando adicionada aos meios de maturao, fecundao e cultivo in vitro de embries, aumentando a proporo de embries viveis produzidos in vitro (SUZUKI et al., 2000). Vrios estudos utilizando distintos tratamentos hormonais em fmeas doadoras tm sido desenvolvidos visando fundamentalmente o aumento da eficincia da produo in vitro de embries (HANSEL et al., 1996; GOODHAND et al., 1999). Em estudo conduzido por Pivato et al. (1999), a administrao de rbST resultou em uma tendncia de obteno de um maior nmero mdio de ocitos aps a OPU in vivo. Porm, a maioria
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388 389 390 391 392 393 394

dos estudos tem avaliado um efeito mais imediato da administrao do rbST na produo in vitro ou mesmo in vivo de embries, com a avaliao do efeito da utilizao crnica e cumulativa deste hormnio na funo reprodutiva estando ainda pouco esclarecida. Neste sentido, este experimento avaliou o efeito quantitativo e qualitativo da administrao cumulativa do rbST por 120 dias a partir do pico da lactao em fmeas lactantes da raa Guzolando sobre a taxa de recuperao e qualidade oocitria e a produo in vitro subseqente de embries. 4.2. Material e Mtodos 4.2.1. Local e animais Os experimentos foram conduzidos na Fazenda Teotnio, localizada na latitude de 45130 sul e longitude de 393435 oeste, a uma altitude 291 m, no municpio de Madalena, Cear, durante o perodo de maro a novembro de 2011. Foram utilizadas 14 fmeas multparas hgidas da raa Guzolado, cclicas e com ciclos estrais regulares, selecionadas aps exames clnico e ginecolgico completos. Os animais foram mantidos em regime semi-intensivo com pastejo rotacionado de Tifton, suplementao de silagem de milho, concentrado, sal mineral e gua a vontade durante todo perodo experimental. Os valores mdios referentes idade, escore de condio corporal (ECC), nmero de lactaes, dias em lactao e pico de produo de leite dos animais utilizados nos experimentos so apresentados na Tabela 1.

395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406

50

407 408

Tabela 1. Caractersticas zootcnicas e produtivas (mdia d.p.) de doadoras da raa Guzolado (n=14) utilizadas nos experimentos Caractersticas Mdia d.p. Idade (ano) ECC (1 a 5) Nmeros de lactaes Dias em lactao* Pico de produo de leite/dia (L/dia) 6,6 2,2 3,1 0,3 5,1 0,3 61,5 7,9 18,0 0,6

409 410 411 412 413 414 415 416 417 418 419 420 421

*Dias em lactao no incio do experimento, com o trmino aos 181,0 7,0 dias de lactao.

4.2.2. Grupos Experimentais Os animais foram separados em trs grupos experimentais: (a) controle (n= 4), pela administrao de 5 mL de soluo fisiolgica a 0,9% (SF) por via IM, (b) G-250 mg (n=5) e (c) G-500 mg rbST (n=5), pela administrao de 250 mg e 500 mg de rbST (Boostin, Schering-Plough Sade Animal Indstria e Comrcio Ltda.), respectivamente, por via IM. Todas as fmeas receberam tratamento com SF ou com uma das duas distintas doses de rbST no incio do experimento (61,5 5,0 dias em lactao; Tabela 1), com administraes repetidas a intervalos de 14 dias, at o dia 181,0 7,0 de lactao, o que representou um perodo de 16 semanas. Exatamente seis dias aps a aplicao de SF ou rbST, e a cada quatorze dias, realizaram-se sees de ovum pickup (OPU) nas fmeas dos trs grupos experimentais, conforme abaixo, no perodo de maro a julho. 4.2.3. Produo in vitro de embries 4.2.3.1. Puno folicular transvaginal guiada por ultrassonografia ou Ovum Pick Up (OPU) As doadoras foram contidas em tronco de conteno, submetidas anestesia epidural com 5 mL de cloridrato de lidocana a 2%, com antisepsia da regio perineal
51

422

423 424 425 426

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com gua, sabo neutro e lcool a 70%. A OPU foi realizada de acordo com a metodologia descrita por Pieterse et al. (1988) e adaptada por Seneda et al. (2003), com o uso da ultrasonografia (ALOKA SSD 500V, Aloka Co., Japo), com transdutor convexo de 5,0 MHz acoplado a uma guia de aspirao transvaginal (WTA Ltda., Brasil). As aspiraes foram realizadas com agulhas descartveis 20 G (WTA Ltda.), acoplada a uma tubulao de silicone com 2 mm de dimetro e 80 cm de comprimento (WTA Ltda.), que por sua vez era conectada a um tubo cnico de 50 mL contendo 10 mL de meio LAV (1 mL de PBS, 12,5 UI de heparina e 1% de soro fetal bovino). A presso da bomba vcuo (WTA, Watanabe Tecnologia Aplicada BV-003) foi mantida de 35 a 50 mmHg (fluxo de 15 mL de meio/min). A guia de aspirao foi introduzida na vagina, posicionada no fundo de saco vaginal, junto frnix cervical e, com o auxlio da manipulao transretal, os ovrios foram posicionados na linha de puno indicada na tela do aparelho de ultrasonografia, com os folculos acima de 2 mm sendo puncionados e aspirados. 4.2.3.2. Lavagem, Seleo e Transporte O material aspirado nos tubos de 50 mL foi transferido para um filtro de coleta de embries (Nutricell) e lavado com PBS a 37C. O contedo folicular aspirado foi depositado em placas de Petri de 100 x 20 mm para a pesquisa sob lupa estereomicroscpica. Os complexos cumulus-ocito (CCOs) foram transferidos para placas de 30 x 15 mm contendo TCM 199 (com sais de Hanks) e classificados de acordo com a qualidade morfolgica em Graus I, II, III e IV, conforme Leibfried e First (1979). Os CCOs viveis (Graus I, II e III) foram armazenados em criotubos contendo o meio de maturao para transporte (MIVt - Nutricell), identificados por nmero correspondente a cada doadora, e colocados em um transportador de ocitos (To-16c WTA), sendo

440 441 442 443 444 445 446 447 448 449

52

450 451 452 453 454

mantidos a 38,5C at a chegada ao Laboratrio de Biologia Molecular e do Desenvolvimento da Universidade de Fortaleza (UNIFOR). O tempo de coleta das 14 fmeas doadoras variou de 4 a 6 h, sendo o tempo desde a coleta da primeira fmea doadora at a chegada ao laboratrio e colocao em maturao in vitro (MIV) definitiva foi de 8h. 4.2.3.3. Maturao in vitro (MIV) Os CCOs foram lavados trs vezes em gotas contendo meio de MIV (Nutricell) em placas de Petri de 100 x 20 mm, sendo em seguida transferidos para microgotas contendo 70 L de meio de MIV em placas de Petri de 60 x 15 mm, enumeradas e contendo oito gotas de MIV com leo mineral (SIGMA-ALDRICH, EUA), temperatura de 38,8C, em atmosfera gasosa de 5% de CO2. Grupos de at 15 CCOs eram colocados em cada microgota, sendo individualizadas por animal. O perodo de MIV foi de 24 h, contados a partir do momento da colocao dos CCOs em meio MIVt em nvel da fazenda. 4.2.3.4. Fecundao in vitro (FIV) Os CCOs maturados foram lavados trs vezes em 900 L de meio de fecundao (FEC-Nutricell) suplementado com 10 L de heparina e 40 L de soluo PHE (Nutricell). O smen proveniente de uma nica partida de touro da raa Holandesa foi descongelado em gua a 37C por 30 s, sendo em seguida depositado em um tubo criognico de 2 mL, sobre um gradiente de Percoll de 90 e 45% (Nutricell), e submetido a uma fora de centrifugao de 968 g durante 5 min. Aps a centrifugao, os espermatozides (sptz) no fundo do tubo criognico foram retirados e colocados em 2 mL de meio de capacitao (CAP; Nutricell), sendo submetidos novamente centrifugao
53

455 456 457 458 459 460 461 462 463

464 465 466 467 468 469 470 471 472

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a 968 g por 3 min. Aps a segunda centrifugao, o excesso de meio CAP foi retirado sendo adicionada do mesmo volume de meio FIV (Nutricell) suplementado com 10 L de heparina e 40 L de soluo PHE .Em seguida, removia-se 5 L da suspenso e adicionava-se em 95 L de gua para a determinao da concentrao espermtica, pela contagem das clulas espermticas em cmara de Neubauer. A concentrao espermtica final foi ajustada para 25 x 106 espermatozides vivos/mL. Posteriormente, os CCOs e os sptz foram co-incubados em temperatura de 38,8C por 18 a 22 h, em 5% de CO2 em ar. 4.2.3.5. Cultivo in vitro (CIV) Aps a FIV, os presumveis zigotos foram lavados por trs vezes em gotas de meio SOF (Nutricell) e depositados em gotas de 70 L, recobertas por leo mineral. O desenvolvimento dos blastocistos foi avaliado aos seis dias e meio (152 a 158 h) aps o incio da fecundao (Dia 0). 4.2.4. Delineamento Experimental e Anlise Estatstica O delineamento experimental foi inteiramente ao acaso, com trs tratamentos (controle, 250mg-rbST e 500mg-rbST), em 14 repeties (nmero de animais), e oito sees de OPU-PIV como fatores principais. Os dados para as variveis estudadas (nmero total de estruturas recuperadas e taxa de recuperao; nmero e proporo de CCOs viveis, proporo de acordo com a qualidade dos CCOs; taxa de clivagem; taxa de blastocisto; total e proporo de embries viveis, proporo dos estdios de desenvolvimento e qualidade embrionria; concentraes de componentes sricos analisados) foram submetidas ao teste de normalidade; os dados normais e os normalizados mediante transformaes matemticas (logartmica, arco seno) foram submetidos anlise de varincia (ANOVA) ou ao teste paramtrico de Student54

480 481 482 483 484

485 486 487 488 489 490 491 492 493 494 495

496 497 498

Newman-Keuls (SNK) para comparao de mdias, na probabilidade de 5%. Dados qualitativos foram comparados pelo teste do 2, para P<0,05. As anlises foram executadas utilizando o programa Statistical Analysis System (SAS Institute Inc, 1997). 4.3. Resultados Foram realizadas oito sesses de aspirao folicular (OPU) a intervalos de 14 dias, em um total de 112 aspiraes das 14 fmeas doadoras dos trs grupos experimentais: controle (n=4), G-250 mg rbST (n=5) e G-500 mg rbST (n=5). Das oito sesses de OPU, os CCOs recuperados nas primeiras seis (931 de CCOs totais e 605 de CCOs viveis) foram destinados produo in vitro de embries, obtendo-se uma taxa de 35,5% de mrulas compactas + blastocistos (215/605) no Dia 6 de desenvolvimento. Os CCOs recuperados nas duas ltimas sees de OPU (382 de CCOs) foram destinados preservao de material a -80oC para futura anlise molecular. O efeito do tratamento com somatotropina recombinante bovina (rbST) sobre o nmero mdio de estruturas recuperadas por OPU de vacas da raa Guzolanda apresentado na Tabela 2. No houve diferena significativa quanto ao nmero mdio de CCOs totais e viveis, e GI, GII, GIII e AT/DEG entre os grupos. Porm, quando comparado ao grupo Controle, houve uma reduo no nmero de CCOs de Grau I (GI) nos Grupos 250 mg e 500 de rbST e aumento no nmero de CCOs de Grau IV (GIV), Tabela 3. Na Tabela 3 percebe-se superioridade do grupo controle na qualidade de CCOs Grau I obtidos em relao aos grupos tratados com rbST, com a obteno de um menor nmero de CCOs de Grau IV. Do total de CCOs recuperados, obteve-se uma maior

499 500 501 502 503 504 505 506 507 508 509 510 511 512 513 514 515 516 517

55

518 519

freqncia de recuperao de ocitos de Grau III em relao s estruturas classificadas como Graus I, II e IV nos trs grupos experimentais. Tabela 2. Nmero de complexos cumulus-ocito (CCOs) totais, viveis e por qualidade morfolgica (mdia d.p.) recuperados de fmeas Guzolanda submetidas ou no quinzenalmente ao tratamento com rbST, seguido de sees de aspirao folicular in vivo, para um total de oito sees CCOs Controle Totais Viveis GI* GII* GIII* AT/DEG* 10,2 4,6a 6,5 3,0a 0,8 0,8a 1,5 1,3a 4,2 2,0a 2,8 2,3a Tratamento 250 mg rbST 13,5 3,3a 7,7 2,4a 0,3 0,3b 1,8 0,9a 5,6 2,1a 3,9 1,8a 500 mg rbST 11,2 1,9a 6,5 2,1a 0,4 0,4ab 1,5 1,4a 4,7 0,6a 2,9 1,6a

520 521 522 523

524 525 526 527 528 529

a,b: *

Nmeros seguidos de letras desiguais na coluna diferem pelo teste de SNK (P<0,05). Grau 1- GI; Grau 2- GII; Grau 3 GIII; Atrsico e Degenerado AT/DEG.

Tabela 3. Nmero total de estruturas recuperadas por OPU e proporo de recuperao baseada na qualidade oocitria entre os tratamentos e entre os graus de qualidade oocitria conforme classificao morfolgica Tratamento Estruturas Recuperadas n Viveis Grau I Grau II Grau III Grau IV AT/DEG 206 26 47 133 32 88 Controle % 63,1a 7,9aC 14,4aC 40,7aA 9,8bC 26,9aB 250 mg rbST n 307 12 73 222 79 155 % 56,7a 2,2bD 13,4aC 41,0aA 14,6aC 28,6aB 500 mg rbST n 260 17 54 189 72 114 % 58,2a 3,8bD 12,1aC 42,3aA 16,1aC 25,5aB

530 531

a,b:

A,B,C:

Nmeros seguidos de letras desiguais na linha diferem estatisticamente pelo teste do 2, para P<0.05. Nmeros seguidos de letras desiguais na coluna diferem estatisticamente pelo teste do 2, para P<0.05.

56

Tabela 4. Nmero de complexos cumulus-ocito (CCOs) totais, viveis e por qualidade morfolgica (mdia d.p.) recuperados em oito sees de aspirao folicular in vivo (OPU) de fmeas Guzolanda submetidas ou no quinzenalmente ao tratamento com rbST
Grupos Experimentais OPU 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8 Totais Viveis GI Nmero de CCOs GII GIII
a

GIV
a

AT/DEG

Controle

G-250 mg rbST

G-500 mg rbST

18 34 27 32 33 49 65 69 35 74 87 59 85 59 72 70 46 50 55 51 62 76 51 55

6 19 20 24 17 40 44 39 15 28 50 42 39 45 51 37 24 28 33 26 30 56 38 25

0,3 0,5 0,0 0,0 0,0 0,0 1,5 1,9 a 0,5 0,6 a 1,8 1,5 a 2,0 2,4 a 0,5 0,6 a 0,2 0,4 a 0,2 0,4 a 0,2 0,4 a 0,4 0,5 a 0,0 0,0 0,2 0,4 a 1,2 1,3 a 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,6 0,6 a 0,4 0,4 a 0,2 0,2 a 1,2 1,1 a 1,0 1,4 a 0,0 0,0

0,8 1,3 0,8 0,9 a 0,8 0,9 a 0,3 0,4 a 0,5 0,6 a 3,5 4,4 a 3,0 2,9 a 2,3 1,8 a 1,4 1,1 a 1,2 1,6 a 1,8 1,3 a 2,6 1,5 a 0,4 0,5 a 3,2 0,8 a 2,4 2,4 a 1,6 1,3 a 0,6 0,9 a 0,2 0,4 a 1,4 1,1 a 0,8 1,8 a 0,2 0,4 a 4,8 3,6 a 2,2 3,0 a 0,6 0,9 a

0,5 0,9 4,0 2,2 a 4,3 2,3 a 4,3 5,0 a 3,3 3,6 a 4,8 4,1 a 6,0 4,1 a 7,0 7,6 a 1,4 2,2 a 4,2 0,8 a 8,0 3,1 a 5,4 2,7 a 7,4 5,3 a 5,6 3,6 a 6,6 3,3 a 5,8 4,7 a 4,2 3,0 a 5,4 3,9 a 4,6 2,1 a 4,0 2,5 a 5,6 5,5 a 5,2 4,9 a 4,4 1,8 a 4,4 4,7 a

0,0 0,0 2,3 1,3 a 1,0 1,2 a 2,0 2,6 a 1,0 0,8 a 0,5 1,0 a 0,3 0,5 a 0,5 0,9 a 0,8 0,8 a 3,6 4,8 a 3,6 3,8 a 2,6 1,5 a 4,4 2,9 a 0,4 0,9 a 0,4 0,9 a 0,0 0,0 0,6 1,3 a 4,0 4,6 a 2,2 2,5 a 3,4 3,4 a 2,4 5,4 a 1,4 2,2 a 0,0 0,0 a 0,4 0,5 a

3,0 4,3 a 1,5 1,6 a 0,8 0,9 b 0,0 0,0 a 3,0 3,9 a 1,8 2,1 a 5,0 4,0 a 7,0 4,8 a 3,2 2,8 a 5,6 4,7 a 3,8 1,8 a 0,8 1,3 a 4,8 3,3 a 2,4 2,2 a 3,8 2,0 a 6,6 6,3 a 3,8 4,5 a 0,4 0,5 a 2,2 1,9 ab 1,6 1,1 a 4,0 4,6 a 2,6 1,1 a 2,6 1,3 a 5,6 2,3 a

a,b: *

Nmeros seguidos de letras desiguais na coluna diferem pelo teste de SNK (P<0,05). Grau 1- GI; Grau 2- GII; Grau 3 GIII; Atrsico e Degenerado AT/DEG.

57

192 193 194 195 196 197 198 199 200 201 202 203

O efeito cumulativo da administrao ou no de oito doses de rbST a intervalos quinzenais seguida de sees de OPUs sobre o nmero mdio de estruturas recuperadas de vacas da raa Guzolanda so apresentados na Tabela 4. No houve diferena significativa entre os tratamentos durante as sees de OPU. Exceto os ocitos atrsicos ou degenerados (AT/DEG) que foram maiores nos grupos 250 mg e 500 mg na OPU 3. O efeito da administrao crnica de rbST de vacas da raa Guzolanda sobre o potencial de desenvolvimento embrionrio in vitro subseqente apresentado na Tabela 5. O desenvolvimento embrionrio foi maior nos grupos controle e G-500 mg rbST.

Tabela 5. Taxas de desenvolvimento embrionrio de COCs de fmeas bovinas da raa Guzolanda utilizados para a PIV de embries, submetidas ou no quinzenalmente ao tratamento com rbST Desenvolvimento embrionrio CIV Taxa de Mrula 126 e Blastocisto 61 48,4a 219 80 36,5b 197 74 37,5ab Controle n % Tratamento 250 mg rbST CIV n % 500 mg rbST CIV n %

204 205 206 207 208 209 210 211 212 213

a,b:

Nmeros seguidos de letras desiguais na linha diferem estatisticamente, para P<0.05. Taxa de desenvolvimento no D 6 baseada no nmero total de estruturas colocadas em CIV.

A Tabela 6 demonstra o efeito cumulativo da administrao ou no das doses de rbST a intervalos quinzenais seguida de sees de OPUs sobre o desenvolvimento embrionrio ao longo das OPUs. Nas OPU 1 e 2, os grupos controle e 500 mg tiveram melhores desenvolvimento embrionrio. Na OPU 3 o controle foi superior aos demais tratamentos e semelhante na OPU 4 ao grupo 250 mg e superior ao grupo 500 mg. Nas sees de aspiraes 4 e 6, os grupos foram semelhantes.

58

214 215 216 217

Tabela 6. Taxas de desenvolvimento embrionrio de COCs de fmeas bovinas da raa Guzolada utilizados para a PIV de embries, submetidas ou no quinzenalmente ao tratamento com rbST Controle OPU CIV 1 2 3 4 5 6 6 19 20 24 17 40 n 6 14 11 7 7 16 % 100a 73,6a 55,0a 29,1a 41,1a 40,0a CIV 15 28 50 42 39 45 n 10 20 7 16 13 14 % 66,6a 71,4a 14,4b 38,1a 33,3ab 31,1a CIV 46 50 55 51 62 76 n 11 12 5 13 11 22 % 23,9b 24,0b 9,0b 25,5a 17,7b 28,9a 250 mg rbST 500 mg rbST

218 219 220 221 222 223 224 225 226 227

a,b:

Nmeros seguidos de letras desiguais na linha diferem estatisticamente, para P<0.05.

Os efeitos da administrao de rbST na cintica de desenvolvimento embrionrio e na qualidade morfolgica so apresentados nas Figuras 1 a 9 abaixo. No houve efeito do rbST sobre o estdio de desenvolvimento embrionrio classificados como Mrula, Blastocisto Inicial e Blastocisto, mas aumentou (P<0,05) a cintica de desenvolvimento at o estdio de Blastocisto Expandido nas vacas tratadas com 250 mg de rbST em relao ao controle e ao tratamento com 500 mg (Figura 1). Nenhuma diferena foi observada, porm, na qualidade embrionria entre os grupos experimentais (Figura 2).

59

(%)

228 229 230 231 232 233

Figura 1. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base no estdio de desenvolvimento, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas das raas Guzolanda.
ab

:Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

(%)

234 235 236 237 238 239

Figura 2. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base na qualidade morfolgica, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

60

240 241 242 243 244

Quando avaliado ao longo das distintas sees de OPU-PIV, observou-se que o desenvolvimento at o estdio de mrula compacta foi maior no grupo 250 (P<0,05) do que no Controle na seo de OPU 4 (Figura 3). No obstante, no houve diferena significativa entre os estdios de desenvolvimento embrionrio nos tratamentos entre as demais sees de OPU.

(%)

245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257 258

Figura 3. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base no estdio de desenvolvimento de mrula compacta, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

Em geral, a utilizao da somatotropina no afetou significativamente a cintica de desenvolvimento embrionrio ao longo das sees de aspirao folicular in vivo. Na Figura 4 pode-se evidenciar que houve um maior nmero de embries no estdio de blastocisto inicial no grupo 250 mg em relao ao grupo controle. J o grupo G-500 mg rbST apresentou um menor nmero de embries no estdio de blastocisto na OPU 2 em relao ao grupo controle (Figura 5). No houve diferena em desenvolvimento entre grupos, ao longo das aspiraes, quanto ao desenvolvimento at o estdio de blastocisto expandido (Figura 6).
61

(%)

259 260 261 262 263 264

Figura 4. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base no estdio de desenvolvimento de blastocisto inicial, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

(%)

265 266 267 268 269

Figura 5. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base no estdio de desenvolvimento de blastocisto, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

62

(%)

270 271 272 273 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283

Figura 6. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base no estdio de desenvolvimento de blastocisto expandido, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

A qualidade morfolgica de embries produzidos in vitro de Graus 1 e 2 no foram afetadas entre os tratamentos ao longo das aspiraes foliculares in vivo (Figuras 7 e 8). Porm, uma maior proporo de embries de qualidade morfolgica menor (Grau 3) foi observado no grupo controle em relao ao grupo de 500 mg de rbST na OPU 3.

63

(%)

284 285 286 287 288 289

Figura 7. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base na qualidade morfolgica grau 1, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

(%)

290 291 292 293 294 295

Figura 8. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base na qualidade morfolgica grau 2, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

64

(%)

296 297 298 299 300 301 302

Figura 9. Taxa de desenvolvimento embrionrio (%), com base na qualidade morfolgica grau 3, para embries produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas da raa Guzolanda.
ab

: Colunas com superscritos desiguais diferem estatisticamente, P<0.05.

303 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313

4.4. Discusso O tratamento com a somatotropina recombinante bovina (rbST) no foi eficiente para aumentar a quantidade e a qualidade dos complexos cumulus-ocitos (CCOs), onde os nmeros de CCOs viveis no diferiram (P>0,05) entre os tratamentos. O uso do rbST promoveu uma diminuio (P<0,05) na qualidade de CCOs de Grau I, mas no alterou a qualidade dos Graus II e III e ao longo das aspiraes os tratamentos foram semelhantes. Estes achados foram semelhantes aos relatados por Ramos et al. (2007), que observaram que o rbST no melhorou a qualidade morfolgica dos complexos cumulus-ocito recuperados, pois no aumentou a porcentagem de ocitos classificados como viveis. Estudos anteriores demonstraram que a administrao de rbST antes das OPU no se mostrou benfica na taxa de recuperao de ocitos em bovinos (BOLS et
65

314 315 316 317 318 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332 333 334 335 336 337

al.1998; TRIPP et al., 2000); este fato pode ser atribudo ao deste hormnio na morfologia da parede folicular e do CCOs ou pela ao do IGF-1, resultando no impedimento da recuperao do CCOs (TRIPP et al., 2000). A rbST tambm pode promover uma assincronia entre o crescimento folicular e desenvolvimento do CCO, causando uma reteno de CCO parede folicular (BOLS et al., 1998). Em nossos estudos, no houve uma melhora dos grupos tratatados rbST ao longo das sees de OPU nos CCOs recuperados e na qualidade oocitria. No presente estudo, as OPUs foram realizadas uma vez a cada 14 dias com os melhores resultados de CCOs viveis sendo observados nas sexta (n=10,1) e stima (n=9,6) sees de OPU, o que no corrobora com os resultados de Ferraz et al. (2000), que relataram que o primeiro procedimento de OPU apresenta melhores resultados, igualando-se apenas a intervalos superiores a 60 dias; porm, a OPU semanal ou quinzenal mantm uma mdia de 8,3 CCOs viveis em bovinos. Apesar de no haver diferena significativa na produo total de CCOs com base nas doadoras submetidas oito OPUs do presente estudo, Petyim et al. (2003) relataram uma diferena na produo de ocitos em Bos taurus taurus aps 16 ou 32 sesses com intevalos OPU de 12 dias. A administrao de rbST no melhorou taxa de produo in vitro de embries. Estes resultados so similares aos relatados por BOLS et al. (1998), TRIP et al. (2000), ROTH et al. (2002) e diferentes dos relatados por Ramos et al. (2007), os quais observaram que a somatotropina pareceu melhorar a maturao dos ocitos, pois aumentou as taxas de clivagem (P<0,05) e a produo de blastocistos (P<0,01) quando utilizada sozinha, e melhorou o desenvolvimento embrionrio (P = 0,064) ao estdio de blastocisto quando associada ao FSH. Uma das mudanas obtidas com a administrao de rbST o aumento das concentraes intrafoliculares de IGF-1 (ROTH et al., 2002), o
66

338 339 340 341 342 343 344 345 346 347 348 349 350 351 352 353 354

que poderia resultar no aumento da eficincia do desenvolvimento embrionrio in vitro subseqente, por melhorar a qualidade oocitria. Block et al. (2007) observaram que adio de 100 ng/mL de IGF-1 ao meio de cultivo embrionrio in vitro melhorou significativamente o desenvolvimento embrionrio, diminuindo a perda embrionria e melhorando a taxa de prenhez. Neste sentido, alteraes na expresso gnica no estdio de blastocisto, potencialmente induzida pelo IGF-1, podem ter contribudo para o aumento da sobrevivncia dos embries tratados com IGF-1 quando transferidos para a fmeas receptoras (BONILLA et al., 2011). Em resumo, a administrao de 250 ou 500 mg de rbST em fmeas lactantas da raa Guzolanda no aumentou a eficincia de obteno de ocitos em nmero e qualidade e no afetou a produo in vitro de embries quando comparado ao Grupo Controle. Porm, o grupo de 250 mg acelerou significativamente o desenvolvimento at o estdio de blastocisto expandido, produzidos in vitro a partir de ocitos aspirados in vivo por OPU de fmeas das raas Guzolanda, o que apresenta-se como um possvel benefcio, j que embries mais desenvolvidos tendem a resultar em maiores taxas de prenhez aps a transferncia para fmeas receptoras. Mais estudos so necessrios para avaliar esta possibilidade.

67

5. CONCLUSES GERAIS Os resultados do presente estudo nos permitiram chegar s seguintes concluses gerais: (a) O tratamento com meia dose de rbST (250 mg) diminuiu a resposta in vivo quanto proporo e qualidade de embries viveis recuperados aps o tratamento superovulatrio de fmeas lactantes Guzolanda, com o uso da dose inteira de rbST (500 mg) no apresentando diferenas com relao ao Grupo Controle (0 mg de rbST). Da mesma forma, no houve uma alterao significativa evidente do metabolismo energtico em fmeas Guzolanda lactantes administradas de rbST em meia dose ou dose inteira a partir do pico da lactao. (b) A administrao cumulativa de 250 ou 500 mg de rbST quinzenalmente por 120 dias a partir do pico da lactao em fmeas lactantes da raa Guzolando no melhorou a qualidade oocitria e a produo in vitro de embries subseqente em relao ao Grupo Controle, mas a meia dose (250 mg de rbST) aumentou a proporo de embries em estdios mais avanados de desenvolvimento (blastocisto expandido).

68

6. CONSIDERAES FINAIS Um maior e melhor entendimento das particularidades das espcies domsticas quanto s alteraes hormonais endcrinas e a dinmica folicular necessrio para adequar o tratamento superovulatrio para cada uma delas, visando uma melhoria na maturao folicular e, conseqentemente, melhora na produo in vivo e in vitro embries. O rbST surge como uma possibilidade para o avano da SOV e OPU-FIV na espcies bovina. Portanto os resultados ainda bastante divergentes, entre os mais renomados grupos de pesquisa, sendo indicativo da biologia molecular para que se tenha um entendimento ao nvel do tecido ovariano.

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