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Captulo 3
Tcnicas histolgicas
Luzia Ftima Gonalves Caputo Lycia de Brito Gitirana Pedro Paulo de Abreu Manso

A histologia a cincia que estuda as clulas no contexto da estrutura tecidual e a inter-relao delas com os constituintes da matriz extracelular. A histotecnologia proporciona o entendimento dos fundamentos tcnicos para a anlise dos elementos teciduais, normais ou patolgicos, isto , suas clulas e os elementos da matriz extracelular, abrangendo diversas tcnicas histoqumicas. Os procedimentos tcnicos aplicados na histotecnologia incluem tcnicas citoqumicas, histoqumicas, imuno-histoqumicas, voltadas para a pesquisa cientfica e para o diagnstico patolgico, alm de anlises em nvel de microscopia eletrnica. Neste captulo, sero realizadas consideraes somente sobre as tcnicas histolgicas voltadas para a anlise histoqumica e imunohistoqumicas dos tecidos. A tcnica histolgica representa um conjunto de procedimentos tcnicos que, inicialmente, se difundiu entre os diversos profissionais das cincias naturais, como os botnicos e zoologistas, sendo empregada tambm pelos anatomistas e histologistas da poca. Geralmente, os estudiosos utilizavam um

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microscpio simples para descrever os tecidos; porm, somente duzentos anos aps a descoberta do microscpio, a utilizao da tcnica histolgica foi utilizada como ferramenta para diagnstico histopatolgico. Por volta de 1828, Rudolph Virchow, mdico alemo e antropologista, utilizou a anlise histopatolgica como ferramenta bsica e essencial em qualquer laboratrio de histologia e/ou anatomia patolgica para elaborar as bases da patologia celular. Histotecnologista, ou histotcnico, a designao conferida ao profissional responsvel por executar a tcnica histolgica para atuar em instituies de sade, instituies voltadas pesquisa cientfica e ao controle de qualidade, normalmente em laboratrios de histo ou anatomopatologia. Sua funo, alm de ser essencial aos servios de sade, pelo apoio ao diagnstico e ao tratamento de pacientes, est tambm localizada de forma central no moderno paradigma mdico anatomoclnico. Os procedimentos utilizados para se obterem amostras de tecido ou preparados histolgicos retirados de um organismo para exame microscpico incluem: coleta do material, fixao, clivagem, processamento, incluso, microtomia (corte) e colorao. No caso de tecidos calcificados, o material descalcificado aps a fixao e, em seguida, realizam-se os outros procedimentos, os quais discutiremos um a um. Vale a pena ressaltar a importncia do planejamento para a execuo de qualquer procedimento que envolva a tcnica histolgica, pois tal planejamento facilita e evita acontecimentos indesejados durante a realizao de qualquer etapa desse processo. De forma geral, a organizao um dos principais fatores para se criar um ambiente seguro para o desempenho do trabalho. Um laboratrio limpo e organizado fundamental para se desenvolver um bom trabalho, ao contrrio de um que apresente bancada entulhada por materiais e sem espao adequado para a realizao dos procedimentos. Deve-se evitar tambm empilhar caixas e deixar coisas pelo cho, obstruindo ou dificultando o trnsito dos trabalhadores no laboratrio.

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1. Coleta, fixao e clivagem


A . Coleta

Consiste em remover amostras de tecido de um determinado organismo. Essa coleta pode ser feita quando o organismo ainda est vivo, por meio de bipsia ou durante uma cirurgia, ou mesmo post mortem, durante a realizao de necropsia de animais ou seres humanos. Quando a coleta realizada para diagnstico de determinada enfermidade, o material originado de necropsia ou bipsia deve ser previamente analisado por um patologista, o qual fornecer o laudo macroscpico, ressaltando aspectos macroscpicos da pea anatmica, como cor, tamanho e aparncia do rgo analisado. Durante a coleta, tambm devemos respeitar algumas regras que so fundamentais para a boa qualidade final da amostra, que sero abordadas mais adiante. Aps a coleta, o material deve ser registrado em um livro prprio de protocolo, para registro. Por meio desse registro, o material ser identificado por um nmero, que o acompanhar durante todos os procedimentos da tcnica histolgica. Em instituies credenciadas para realizar procedimentos histopatolgicos, o material obtido cirurgicamente deve ser acompanhado de uma ficha com o pedido da anlise histopatolgica, contendo a identificao do rgo e as datas da fixao e de entrada do material no laboratrio. Essa ficha tcnica dever conter a identificao do paciente (nome, sexo, cor, idade, estado civil, nacionalidade, naturalidade e profisso) e, no caso de paciente de rede hospitalar, devero ser informados sua qualificao (registro ou nmero do leito), registro ambulatorial, ou consultrio particular, identificao do mdico responsvel, data da interveno cirrgica, descrio da bipsia, morte ou necropsia, e outros dados que o mdico julgar importantes, que auxiliaro o histopatologista no diagnstico.

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Para material proveniente de trabalhos experimentais com animais em instituies de pesquisa credenciadas, o registro dever ser feito aps a eutansia, em livro prprio. No livro de registro experimental devem constar a identificao do laboratrio, a data da eutansia, os rgos colhidos, o tipo de procedimento realizado com o animal experimental (por exemplo, infeco), o ttulo do projeto e as observaes necessrias para avaliao do pesquisador ou tecnologista. Atualmente, deve-se realizar tambm o registro no comit de tica da instituio, que aprovar a realizao da pesquisa, fornecendo o nmero de protocolo. Esse nmero importante, pois deve ser informado ao se elaborar um trabalho cientfico, seja uma dissertao de mestrado, tese de doutorado, publicao em revista indexada, ou outro meio de divulgao cientfica. Tratando-se de animal experimental nativo, originrio diretamente do meio ambiente, o pesquisador deve submeter o seu projeto ao Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renovveis (Ibama) a fim de obter uma autorizao para coleta, sem a qual poder estar sujeito a sanes da legislao vigente. Sem esses registros, o material no poder ser manipulado no laboratrio, podendo o responsvel pela coleta responder a processo na Justia por desrespeito s leis vigentes no territrio nacional. Notas de biossegurana Todo material biolgico coletado para anlise potencialmente infectante. Assim, deve-se ter muito cuidado durante a coleta e a manipulao dos espcimes, utilizando sempre os equipamentos de proteo individual (EPI). imprescindvel, durante os procedimentos de coleta, o uso de luvas, jaleco, mscara e culos de proteo. Voc deve ainda procurar se informar na instituio sobre qual a poltica de descarte de material infectado. Nunca descarte material biolgico ou seus derivados em lixo comum.

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B. Fixao

Voc alguma vez refletiu sobre o que acontece quando esquecemos um pedao de carne fora da geladeira? Por que a carne apodrece? O que, realmente, acontece com esse material? Ao se remover qualquer material (rgo ou tecido) de um organismo aps a sua morte, esse material inicia um processo de autlise, ou seja, por no receber o suprimento necessrio de oxignio e de substncias essenciais ao seu funcionamento, comea a haver acmulo de dixido de carbono nos tecidos e, em suas clulas, inicia-se o processo autoltico, no qual enzimas lisossomais atuam no citoplasma da prpria clula. Ao se colocar um pedao de carne na geladeira, esse processo atrasado; porm, fora da geladeira a autlise acelerada. Assim, ao se analisar as estruturas teciduais de um determinado rgo ao microscpio, precisa-se preservar os tecidos, sendo imprescindvel a realizao do processo de fixao. A fixao uma das etapas mais importantes da tcnica histolgica, pois visa interromper o metabolismo celular, estabilizando as estruturas e os componentes bioqumicos intra e extracelulares, preservando e conservando os elementos teciduais, alm de permitir a penetrao de outras substncias subsequentes fixao. Diversos protocolos de fixao e tipos de fixadores so citados na literatura tcnica; porm, nenhum desses procedimentos de fixao reconhecido como perfeito. Alguns fixadores se revelam excelentes para determinadas estruturas tissulares, enquanto outros so preferenciais para as clulas ou mesmo excelentes para anlise da bioqumica tecidual. Alm disso, h, tambm, fixadores indicados para a preservao da antigenicidade dos elementos teciduais que sero analisados pela imuno-histoqumica, em contraste com aqueles que no preservam as molculas antignicas. Porm, no existe um fixador ideal que

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alcance todos os objetivos da fixao, mas deve-se investigar qual o fixador mais apropriado para o tipo de material a ser analisado. Por essa razo, devese consultar a literatura cientfica antes de se realizar qualquer tipo de experimento ou interveno cirrgica. Basicamente, existem dois tipos de fixao: a fsica e a qumica. De fato, sempre se utiliza uma associao dos dois tipos de fixao, pois mesmo a fixao qumica sempre pode sofrer a influncia de um fator fsico ambiental, como a temperatura. Outros fatores fsicos podem influenciar na fixao, como as ondas eletromagnticas (micro-ondas) e a agitao molecular (ultrassom). A fixao qumica obtida quando se utilizam substncias qumicas capazes de formar reaes com os stios das biomolculas, estabilizando-as e impedindo a alterao tecidual, tanto qumica quanto fsica. Inicialmente, os fixadores eram divididos em duas classes: (1) fixadores coagulantes ou desnaturantes, que precipitam as protenas dos tecidos. Esses fixadores tambm so chamados de fixadores no aditivos, pois no se ligam s protenas; (2) fixadores no coagulantes ou aditivos, que se ligam s protenas, precipitando-as. Sabe-se pouco sobre os efeitos dos fixadores qumicos; porm, na tcnica histolgica se utiliza uma ou mais substncias qumicas, denominadas lquidos ou misturas fixadoras, reunindo vrias substncias numa tentativa de superar as desvantagens de uma determinada substncia pela vantagem de outra substncia adicionada mistura. Tais misturas so capazes de agir sobre os tecidos de forma a buscar a melhor preservao dos elementos teciduais. A escolha de um fixador depende da natureza do processo patolgico presente no tecido, da estrutura celular e/ou tecidual, ou, ento, da natureza bioqumica do elemento que se deseja preservar. Por essas razes, o histotcnico deve conhecer os diversos tipos de fixadores e saber qual a compatibilidade do fixador com os diversos mtodos de colorao, com a propriedade antignica

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do elemento tecidual, visando adequar o tipo de fixador com a propriedade dos vrios tipos de tecidos. Essas informaes so importantes para auxiliar o pesquisador ou o patologista. Atualmente, com frequncia se utiliza a classificao de fixadores descrita por Leong (1996), que teve como base a classificao desenvolvida por Hopwood (1977), sem muitas alteraes. Leong classificou as substncias fixadoras da seguinte maneira:
Fixadores aldedos: formaldedo, glutaraldedo e paraformaldedo co-

mercial.
Agentes oxidantes: tetrxido de smio, dicromato de potssio,

permanganato de potssio e cido crmico.


Agentes desnaturantes ou coagulantes de protenas: metanol, etanol,

acetona e cido actico.


Mecanismo desconhecido: cloreto de mercrio, cido pcrico e sais

de zinco.
Combinao de reagentes: tetrxido de smio e glutaraldedo, tetrxido

de smio e iodeto de zinco, glutaraldedo e carbodiamida e formaldedo com glutaraldedo.


Fixao a seco: carbowax 6000 (20% de polivinil lcool ou 20%

de polietileno glicol) ou fixao no vapor.


Micro-ondas: fixao pelas ondas eletromagnticas com ou sem a

utilizao de agentes fixadores. Ser dada maior ateno aos fixadores aldedos, pois estes so fixadores base de aldedos de amplo uso nos laboratrios de anatomia patolgica e de histologia. Os fixadores aldedos comumente utilizados so o formaldedo, o glutaraldedo, e o paraformaldedo, que o prprio formaldedo na sua forma

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pura polimerizada. Esses fixadores formam ligaes cruzadas com as protenas tissulares, tornando-as insolveis em forma de um gel. Dentre os fixadores aldedos, o formaldedo comercial o mais usado na rotina histolgica devido ao seu baixo custo financeiro, alm de ser de fcil preparo. Contudo, algumas consideraes se fazem necessrias. O formaldedo comercial, um gs incolor, comercialmente fornecido em soluo na concentrao de 37% ou 40%. Ao se preparar uma soluo base de formaldedo comercial a 10%, de fato a soluo estar a 3,7% ou 4%; apesar disso, convencionou-se chamar essa soluo de formalina, ou formaldedo a 10%. Outro ponto importante a se mencionar que o formaldedo, na presena de gua, encontra-se na sua forma monomrica. J o paraformaldedo, por ser livre de metanol, muito utilizado para a fixao de tecidos a serem analisados pela microscopia eletrnica, pois o metanol pode ocasionar grandes prejuzos, interferindo nas anlises ultraestruturais. Porm, o paraformaldedo comercial tem sido recomendado para anlise imuno-histoqumica. Na realidade, o formaldedo contm polmeros de paraformaldedo comercial, mas que s sero hidrolisados quando diludos em gua. Quando o formaldedo exposto luz, isto , ao oxignio atmosfrico e tecidual, ocorre a oxidao do formaldedo, formando cido frmico. O cido frmico pode se precipitar nos tecidos sob a forma de um pigmento de colorao marrom, sendo considerado um artefato. Para se evitar a formao desse precipitado, deve-se preparar o fixador em solues tamponadas, ou, ento, adicionar carbonato de clcio (giz) para neutralizar a ao do pH da soluo. Contudo, o giz s recomendado em ltimo caso, pois poder deixar reas de pseudocalcificao tecidual. A seguir, encontram-se alguns dos fixadores aldedos e suas principais caractersticas:

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Formalina 10%

Formaldedo comercial .......................................100 mL gua destilada ................................................900 mL Caractersticas:


soluo hipotnica (clulas intumescidas); pode levar deposio de pigmento formlico; baixo custo; fixa bem as protenas.

Tempo de fixao: 24-48 horas. Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas. Tratamento prvio dos cortes para a retirada do pigmento formlico
Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada. Imergir os cortes em uma soluo saturada de cido pcrico em etanol

95% por 24 horas.


Lavar as lminas em gua corrente at desaparecer a cor amarela do

cido pcrico.
Seguir com o protocolo da colorao desejada.

Notas de biossegurana Ao manipular formaldedo, ou solues contendo essa substncia, deve-se fazer uso de luvas, mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com exausto. O preparo de solues fixadoras deve ser feito em capela de exausto. Por serem muito volteis e sensveis luz, as solues contendo formaldedo devem ser guardadas ao abrigo da luz em vidro mbar firmemente fechado. O formaldedo txico quando ingerido, inalado ou em

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contato com a pele. A inalao deste composto pode causar irritao nos olhos, nas mucosas e no trato respiratrio superior. Em altas concentraes, pode causar bronquite, pneumonia ou laringite. Este composto classificado como carcinognico e teratognico. Nunca descarte solues contendo formaldedo ou outras solues fixadoras em esgoto sanitrio convencional; procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
Formol-salino

Formaldedo comercial........................................100 mL gua destilada................................................900 mL Cloreto de sdio...................................................9 g Caractersticas:


soluo isotnica; pode levar deposio de pigmento formalnico; indicado para algumas reaes histoqumicas.

Tempo de fixao: 24 a 48 horas. Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas. Indicado para algumas reaes histoqumicas.
Formalina tamponada de Carson ou formalina em tampo Millonig

Formaldedo comercial ........................................100 mL gua destilada.................................................900 mL Fosfato de sdio monobsico.................................18,6 g Hidrxido de sdio..............................................4,2 g Caractersticas:
utilizar soluo isotnica em pH 7,2 - 7,4 (310 mOsm);

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indicado para a microscopia eletrnica e microscopia de luz; provoca menor extrao de elementos celulares; microtomia sofrvel de tecidos com muito sangue; no interfere na maioria das coloraes; fixa muito bem a maioria dos tecidos; preserva a imunorreatividade de hormnios gastrintestinais, quan-

do preparado com paraformaldedo comercial no lugar do formaldedo comercial. Tempo de fixao: 24 a 72 horas. Lavagem: gua corrente por 1 a 2 horas.
Formalina-alcolica

Formaldedo comercial........................................100 mL lcool 95%...................................................900 mL Caractersticas:


utilizada para a observao de minerais (cobre, magnsio, ferro

e clcio); indicada para tecido nervoso, parasitas, glicognio, amiloide e mucossubstncias. Tempo de fixao: 24 a 48 horas. Lavagem: lcool 95% por 1 hora iniciando a desidratao.
Formalina neutra tamponada 10%

Formaldedo comercial........................................100 mL gua destilada.................................................900 mL Fosfato de sdio monobsico.....................................4 g Fosfato de sdio dibsico.......................................6,5 g

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Caractersticas:
soluo hipotnica (clulas intumescidas); aproximadamente 165 mOsm; pH 6,8; indicada para clulas pancreticas, bactrias, alguns tipos de

carboidratos, clulas do tecido conjuntivo, fungos, minerais, tecido nervoso, pigmentos e glndulas. Tempo de fixao: 24-72 horas. Lavagem: gua corrente por 1 ou 2 horas.
AFA ou FAA lcool - formalina - cido actico:

Etanol (95 - 100%)..........................................85 mL Formaldedo comercial..........................................10 mL cido actico glacial............................................5 mL Caractersticas:


um fixador de rpida penetrao; preserva relativamente bem a morfologia, cidos nucleicos e

carboidratos;
os lipdeos no so preservados; misturar no momento do uso; muito utilizado para fixar helmintos.

Tempo de fixao: 4 a 48 horas em tecidos e 10 a 30 minutos para esfregaos e/ou distenses. Lavagem: direto para o lcool 95% do processador.

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Vrios so os fatores que influenciam no processo da fixao, interferindo diretamente na preservao tecidual e, em ltima instncia, no tecido que se deseja observar. Assim, deve-se analisar criteriosamente o protocolo de fixao para identificar os fatores que podem influenciar diretamente na fixao do tecido a ser analisado e consequentemente interferir na preservao tecidual. Esses fatores so:
temperatura; espessura do tecido; penetrao; tempo de fixao; escolha do fixador; relao volume do fixador tamanho do espcime; estocagem apropriada; pH do fixador; osmolaridade da soluo fixadora; adio de sais na mistura; concentrao dos fixadores.
C. Clivagem

A clivagem consiste em reduzir as dimenses dos fragmentos dos tecidos coletados. Dependendo do tipo de fixador empregado, a clivagem poder ocorrer em at algumas horas aps a fixao. Na clivagem ideal, os fragmentos devem atingir cerca de 3 mm de espessura; porm, dependendo do tipo de rgo, esse fragmento pode chegar a mais do que 5 mm (Figuras 1 e 2).

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Figura 1. Clivagem de coluna verte- Figura 2. Clivagem com 3mm de bral de camundongos Swiss webster. espessura.

A reduo das dimenses do fragmento facilita a penetrao dos fixadores e a difuso dos reagentes durante as demais etapas do processamento dos tecidos. Para uma boa anlise histolgica, devemos respeitar algumas regras durante a coleta, a fixao e a clivagem:
fixar o tecido logo aps a coleta da amostra; retirar, primeiramente, os rgos conhecidamente com alto metabolis-

mo, pois so os primeiros a sofrer autlise;


nunca comprimir o material a ser fixado com pina ou qualquer outro

instrumental, pois a fora imprimida pode causar distoro da estrutura tecidual;


para se obter uma boa fixao de rgos encapsulados, a cpsula deve

ser removida;
os fragmentos devem possuir preferencialmente 3 mm de espessura,

pois geralmente os fixadores no penetram mais do que isto em tempo hbil de evitar a autlise.

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para se obterem fatias delgadas de rgos compactos, como fgado,

bao, rins, entre outros, coloque-os sobre uma placa de cortia ou placa de Petri, previamente revestida com parafina, e com uma gilete nova e afiada proceda confeco dos fragmentos;
como os fragmentos frequentemente se deformam durante a fixao,

conveniente que, aps essa etapa, sejam novamente clivados com gilete, de modo que cada fragmento apresente uma superfcie lisa de corte que servir no somente de orientao ao tcnico durante o processo de incluso, mas tambm auxiliar a etapa subsequente, ao se desbastar o bloco;
usar, no mnimo, vinte vezes o volume de fixador em relao ao

volume dos fragmentos a serem fixados. Agitar, suave e periodicamente, os fragmentos dos rgos durante a fixao do material para que o fixador se misture uniformemente no frasco;
os frascos utilizados para a fixao devem ter boca larga, pois, alm de

facilitar o acesso aos fragmentos, ou mesmo aos rgos inteiros, esses costumam aumentar seu volume aps a fixao;
nunca coloque o material a ser fixado em um frasco vazio, pois este

pode se aderir superfcie do vidro, impedindo que o fixador penetre na rea em contato com o vidro;
acondicionar os tecidos clivados em cassetes histolgicos identificados

(Figuras 3 e 4).

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Figura 3. Espcime clivado e acondicionado em cassetes histolgicos.

Figura 4. Cassete identificado pronto para o processamento.

Notas de biossegurana Durante o procedimento de clivagem do material, tome muito cuidado com as navalhas e giletes utilizadas. O material perfurocortante, bem como os restos de material biolgico, devem ser descartados em lixo prprio.
2. Descalcificao

Em muitos tecidos, verifica-se a deposio de sais minerais, como clcio e fosfato. Por exemplo, o tecido sseo uma especializao do tecido conjuntivo, sendo rgido e inflexvel devido presena de cristais de hidroxiapatita em sua matriz extracelular. Em microscopia de luz, existem dois procedimentos tcnicos que auxiliam o estudo do tecido sseo: (1) a descalcificao, que remove a poro mineral e analisa somente os constituintes orgnicos do tecido sseo; e (2) o desgaste, que permite analisar os componentes inorgnicos do tecido. Comentaremos neste captulo somente o procedimento da descalcificao, que visa retirada dos componentes inorgnicos, como fosfato de clcio presente em tecidos sseos, em tumores sseos ou em determinadas patologias.

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A descalcificao, por remover os sais de clcio, se faz necessria para tecidos mineralizados, pois os cristais de clcio destroem o fio da navalha, criando dentes que impedem a confeco de bons cortes e levam formao de artefatos tcnicos, impedindo a anlise histolgica adequada. A escolha do mtodo de descalcificao depende da urgncia, do grau de mineralizao, do interesse da investigao, das tcnicas de colorao que se pretende empregar e do tipo de fixador utilizado. Quanto mais rpida for a ao de um descalcificador, pior ser a preservao morfolgica do tecido.
A prtica da descalcificao

Aps a coleta o tecido, este deve ser fixado, lavado para retirar o excesso de fixador e, s ento, submetido descalcificao. A descalcificao pode ser realizada por mtodos qumicos e fsicos. Os mtodos qumicos utilizam solues descalcificadoras em pH cido, solues quelantes e meios de troca inica. Os mtodos fsicos esto sempre associados a descalcificao qumica, englobando a dissociao eletroltica e submisso do material contido em solues descalcificadoras, ao ultrassom e s micro-ondas, que aceleram o processo de descalcificao.
Descalcificao qumica

A. Descalcificao por cidos Os descalcificadores cidos possuem a propriedade de solubilizar sais minerais. Na matriz inorgnica dos tecidos mineralizados, ocorrem principalmente sais de fosfato e de carbonato, que so pouco solveis na gua. Esse mtodo possui a vantagem de ser simples; porm, recomenda-se fazer um banho neutralizante com hidrxido de amnia ou oxalato de amnia ou sdio aps a descalcificao.

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A desvantagem desse mtodo a ocorrncia de dilatao e hidrlise da matriz ssea e destruio de enzimas, cidos nucleicos e polissacardeos. A soluo descalcificadora cida age removendo o clcio dos sais de carbonato ou fosfato presentes no osso, efetuando uma troca inica que resulta na formao de um sal de clcio solvel. Algumas das solues descalcificadoras constituem-se de cidos orgnicos ou inorgnicos, que sero citados a seguir. Existe um grande nmero de agentes descalcificadores cidos, incluindo cidos fracos ou fortes, que podem ser aquosos ou alcolicos, diludos ou no em agentes fixadores.
cidos fortes - possuem maior poder descalcificante, causando dano

aos tecidos, principalmente aos ncleos que so hidrolisados, o que prejudica a utilizao posterior de corantes nucleares. Esse tipo de descalcificador empregado para anlises urgentes; para material no urgente, aconselham-se agentes quelantes pelos motivos que sero descritos mais adiante. cido ntrico (HNO3) - no causa o intumescimento dos tecidos e proporciona maior nitidez nas coloraes. Geralmente utilizado em concentraes de 5% a 10%, no se devendo expor o tecido a esta soluo por mais de 48 horas. um descalcificador rpido muito prejudicial ao tecido. cido clordrico (HCl) - um dos cidos de ao rpida mais utilizados. Geralmente usado em soluo tampo, como, por exemplo, o sulfato de sdio a 5% ou 10%, ou, ainda, diludo em lcool. cido ntrico aquoso a 5%: cido ntrico.........................................................5 mL gua destilada......................................................95 mL

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cido ntrico aquoso a 10%: cido ntrico........................................................10 mL gua destilada......................................................90 mL Formalina - cido ntrico: Formaldedo.........................................................10 mL gua destilada......................................................80 mL cido ntrico........................................................10 mL Fluido de Perennyi: cido ntrico 10%................................................40 mL Etanol absoluto.....................................................30 mL cido crmico 0,5%.............................................30 mL
cidos fracos - os cidos mais usados nas misturas descalcificadoras

so o cido actico, cido pcrico e cido frmico. Os cidos actico e pcrico tambm so muito utilizados em misturas fixadoras, fixando ao mesmo tempo em que descalcificam os tecidos pouco mineralizados, como os tecidos embrionrios. Dentre os cidos, o cido frmico o mais utilizado na soluo de 5% a 10 %. cido frmico (HCOOH) - pode ser utilizado em soluo a 5% aquosa ou alcolica, ou em mistura fixadora com o formol 10% a 20%. Geralmente usado em solues tampes, como o tampo citrato de sdio, que proporciona uma melhor colorao em relao ao mtodo com cido ntrico. cido frmico a 5%: cido frmico 90%.................................................5 mL gua destilada......................................................95 mL

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cido frmico a 5%: cido frmico 90%.................................................5 mL gua destilada......................................................95 mL Formalina cido frmico: cido frmico 90%...............................................10 mL Formaldedo comercial...............................................5 mL gua destilada......................................................85 mL Mistura descalcificadora cido frmico-clordrico: Soluo A cido clordrico 8%: cido clordrico concentrado .......................40 mL gua destilada..........................460 mL Soluo B cido frmico 8%: cido frmico......................................................40 mL gua destilada....................................................460 mL Soluo de uso: (preparar antes de usar): Soluo A.........................................................500 mL Soluo B..........................................................500 mL cido pcrico (C6H2(NO2)3OH) - esse cido age muito lentamente e utilizado principalmente em soluo aquosa saturada para descalcificar tecidos embrionrios. Os tecidos devem ser lavados em lcool 70% aps a descalcificao para remover o precipitado amarelo. Procedimentos gerais para a descalcificao por misturas cidas: 1- A pea a ser descalcificada no deve possuir mais do que 5 mm de espessura. Esta deve ser clivada para isso.

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2- O volume da mistura descalcificadora deve ser de dez a vinte vezes as dimenses da pea a ser descalcificada. 3- O material a ser descalcificado deve estar suspenso na mistura descalcificadora, pois o clcio, ao sair do tecido, se deposita no fundo do frasco (Figura 5). 4- A mistura descalcificadora deve ser substituda a cada 24 horas. O tempo de descalcificao depender das dimenses da pea e do tipo de soluo descalcificadora. 5- Ao trmino da descalcificao, deve-se neutralizar, os tecidos com uma soluo alcalina de sulfato de sdio (Na 2SO4) a 5% por 24 horas. 6- Lavar com vrios banhos de gua por um perodo de 48 horas. 7- Seguir a rotina de processamento histolgico.

Figura 5. Suspenso dos tecidos durante a descalcificao.

B. Descalcificao por resinas de troca inica

Essa resina promove a acelerao do processo de descalcificao pela rpida troca inica entre o cido frmico e os fosfatos ou carbonatos de clcio tecidual, proporcionando, alm da rapidez, boa preservao dos detalhes

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celulares, com qualidade superior aos mtodos de descalcificao por cidos. Essa resina pode ser reaproveitada. Resina : WIN 3000 (resina de troca inica).............................100 g cido frmico em soluo aquosa a 10% ...................800 mL

Figura 6. Resina de troca inica.

C. Mtodos histoqumicos

So mtodos escolhidos quando se deseja preservar enzimas (fosfatase alcalina e desidrogenases), cidos nucleicos e polissacardeos (glicognio) presentes no tecido sseo. Os mtodos habituais que utilizam descalcificadores cidos no permitem a anlise dessas molculas e substncias. Os mtodos histoqumicos incluem dois procedimentos para a descalcificao.

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Mistura de tampes - nesse procedimento, os sais de clcio so

removidos do osso, quando imersos em soluo tampo de citrato com pH 4,5. Uma desvantagem desse mtodo a inativao reversvel da fosfatase alcalina, que se torna ativa aps a neutralizao com a soluo de sdio barbital. Procedimento para a descalcificao: 1- Fixar os tecidos em lcool 80% de 24 a 48 horas. 2- Descalcificar com a soluo tampo (4C) o tempo de descalcificao varia de acordo com o tamanho da pea e seu grau de mineralizao. 3- Lavar em gua corrente e depois em gua destilada. 4- Neutralizar em soluo de sdio barbital a 37C por 6 horas. 5- Lavar em gua corrente por 6 horas. Tampo cido ctrico-citrato (pH 4,5): cido ctrico 1N...................................................50 mL Citrato de amnio 1N..............................................50 mL Sulfato de zinco 1%.................................................2 mL Clorofrmio........................................................0,1 mL
Agentes quelantes - so compostos orgnicos que se ligam ao on

clcio (metal, ver tabela peridica) formando um metal quelado, por exemplo, sequestrante ou versene (cido etilenediaminetetractico ou EDTA). Esse mtodo bem lento, sem dano ao tecido. Assim, como as misturas de tampes, ele inativa a fosfatase alcalina, que reativada aps um banho de 2 a 6 horas em soluo de cloreto de magnsio 6%. A descalcificao por agentes quelantes no produz artefatos durante a maioria das coloraes histolgicas, diferente da descalcificao por cidos, que gera artefatos quase irreversveis.

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Descalcificantes quelantes (EDTA) EDTA neutro: Sal de EDTA dissdico............................................250 g gua destilada.................................................1.750 mL A soluo fica esbranquiada e deve ser neutralizada (pH=7,0) pela adio de aproximadamente 25g de hidrxido de sdio. Hilleman e EDTA de Lee: Sal de EDTA dissdico.............................................5,5 g gua destilada......................................................90 mL Formoldedo comercial.............................................10 mL Soluo descalcificadora EDTA em Tampo Fosfato 0,1M: 1) Tampo fosfato 0,1 M para o preparo final da soluo descalcificadora de EDTA: Tampo fosfato 0,1 M (pH=7,0): Soluo A: Fosfato monobsico de sdio.........................................13,7g gua destilada..............................................................1 L Soluo B: Fosfato dibsico de sdio..............................................35,8g gua destilada..............................................................1 L Para 1 litro coloca-se em um bquer 750 mL da soluo B e adicionase gota a gota a soluo A at o pH atingir o pH 7,0.

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Soluo de uso do descalcificador EDTA em tampo fosfato 0,1 M: EDTA....................................................................100 g Tampo fosfato 0,1 M (soluo 1)........... .................1000 mL Acertar o pH do EDTA para 7,0 com hidrxido de sdio 10 M Procedimento: 1- Suspender o espcime no lquido (Figura 5) descalcificador, com o volume igual ou superior a vinte vezes o volume da pea. 2- Trocar a soluo descalcificadora diariamente. Se possvel, manter o frasco em agitao. 3- Testar aps duas a trs semanas, para ver se j ocorreu a descalcificao. 4- Lavar em gua por algumas horas. 5- Proceder ao processamento histolgico.

Descalcificao fsica

A. Descalcificao eletroltica ou ionizao eltrica Esse mtodo permite a formao de um campo eltrico entre dois eletrodos, fazendo os ons de clcio migrarem rapidamente do osso (anodo) para o eletrodo de carbonato (catodo). Os radicais cidos migram para o anodo. um mtodo rpido; porm, a temperatura no deve exceder 45oC. Aps a descalcificao, recomenda-se a neutralizao das peas, com soluo sulfato de sdio (Na2SO4) a 5% por 24 horas, para evitar a formao de artefatos durante a colorao. Aps a neutralizao, as peas devem ser lavadas em vrios banhos de gua por no mximo 48 horas.

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Soluo descalcificadora eletroltica: cido frmico a 90% ..........................................100 mL cido clordrico....................................................80 mL gua destilada....................................................820 mL

Figura 7. Descalcificao eletroltica.

B. Descalcificao com auxlio das micro-ondas O efeito benfico do calor foi reconhecido antes da era das microondas e foi primeiramente utilizado durante o procedimento de fixao por Ehrlich (1898) para acelerar a fixao qumica por meio de calor externo. As micro-ondas penetram vrios centmetros para dentro dos tecidos biolgicos, e o calor produzido pode ser controlado pela potncia e o tempo de exposio. O calor o principal responsvel pelos efeitos produzidos pelas micro-ondas, assim como a agitao molecular e o fluxo eletromagntico, acelerando o processo de descalcificao. Durante o aquecimento, a energia termal aumenta a dinmica molecular, na qual a agitao molecular induzida pela oscilao do campo eletromagntico aumentar a coliso de molculas, acelerando as reaes qumicas. Esse mtodo reduz o tempo de descalcificao; o que normalmente levaria dias, nesse mtodo levar somente algumas horas.

Tcnicas Histolgicas | 115

Deve-se imergir a pea na mistura descalcificadora de escolha e irradiar as micro-ondas. C. Descalcificao com auxlio do ultrassom Assim como as micro-ondas, o ultrassom acelera o processo de descalcificao, promovendo a agitao molecular, com a vantagem de no elevar a temperatura, mantendo as estruturas celulares. Como possvel saber se a pea est totalmente descalcificada? Existem mtodos fsicos e qumicos que permitem controlar o momento de finalizao da descalcificao. Mtodos fsicos
Manipulao do operador: tenta-se dobrar a pea ou inserir

uma agulha bem fina e verificar, assim, o grau de mineralizao.


Teste radiolgico: o raio-X o mtodo mais sensvel e confivel

para acompanhar a descalcificao. Mtodos qumicos


Teste do oxalato de amnia: esse mtodo detecta a presena

de clcio no lquido descalcificador, indicando se a descalcificao est completa ou no. Teste do oxalato de Amnia / Hidrxido de Amnia: Solues estoque: Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5%: Hidrxido de amnia 28%.....................................5 mL gua destilada..................................................95 mL

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Soluo B estoque de oxalato de amnia 5%: Oxalato de amnia...............................................5 mL gua destilada..................................................95 mL Soluo de uso de oxalato de amnia / hidrxido de amnia Soluo A soluo estoque de hidrxido de amnia 5% - 5 mL Soluo B soluo estoque de oxalato de amnia 5% - 5 mL A soluo deve ser preparada no momento do uso. Procedimento: 1- retirar 5 mL de lquido descalcificador do fundo do frasco que em se encontra a pea; 2- colocar em um tubo Falcon de 15 mL; 3- adicionar ao tubo 10 mL da soluo de uso de oxalato de amnia-hidrxido de amnia; 4- misturar bem e deixar repousar em p por 12 horas; 5- se a descalcificao for completa, o lquido se manter lmpido; caso contrrio, haver precipitao do clcio; 6- esse processo deve ser repetido at que o lquido descalcificante se encontre lmpido por dois dias. Muitos inconvenientes podem ser gerados durante o processo de descalcificao e, para minimiz-los, devemos tomar alguns cuidados Regras gerais para uma boa descalcificao:
somente descalcificar tecidos muito bem fixados; reduzir ao mximo o tamanho da pea a ser descalcificada,

reduzindo assim o tempo de descalcificao;

Tcnicas Histolgicas | 117

a lavagem do material essencial antes da descalcificao e

antes do processamento subsequente;


renovar o descalcificador diariamente, pois esse vai perdendo

sua concentrao original;


o volume do lquido descalcificador deve ser no mnimo vinte

vezes o tamanho da pea;


verificar constantemente se a descalcificao foi finalizada; neutralizar sempre os tecidos aps a descalcificao por substn-

cias cidas. Notas de biossegurana Ao manipular solues cidas e agentes quelantes, deve-se fazer uso de luvas especficas para manipulao qumica, de mscara com filtro prprio para vapores cidos e orgnicos, e deve-se faz-lo em local arejado e com exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto. Deve-se, previamente, consultar as fichas de emergncia qumica das solues cidas e quelantes antes da sua manipulao. A inalao destes compostos pode causar irritao e queimaduras. Nunca descarte solues cidas em esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
3. P rocessamento Processamento

O princpio do processamento histolgico consiste na difuso de reagentes para o interior dos tecidos e na remoo do lquido tecidual que, aps a fixao do material, o prprio fixador empregado. O processamento tecidual tambm torna os fragmentos rgidos capazes de proporcionar o seccionamento de fatias finas e delicadas para a observao ao microscpio.

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Diversas substncias podem ser utilizadas como meio de incluso; porm, no processamento convencional, comumente se utiliza a parafina. O processamento para incluso de material em parafina passa por trs etapas: desidratao, clarificao e impregnao.
A. Desidratao

A desidratao consiste na remoo da gua dos tecidos, pois as substncias previamente utilizadas para incluso em parafina no se combinam homogeneamente com a gua. Vrios so os agentes desidratantes. A substncia utilizada na rotina histolgica o lcool etlico, por produzir bons resultados e possuir baixo custo. Contudo, outros agentes desidratantes tambm so eficientes, variando apenas o tempo de desidratao.
B. Clarificao ou diafanizao

A clarificao visa remover completamente o lcool do interior dos tecidos, preparando-os para as etapas subsequentes. A remoo do lcool de extrema importncia, pois a parafina no se mistura homogeneamente com o lcool. Dessa forma, fundamental a completa remoo do lcool para que a parafina possa penetrar completamente no interior dos tecidos. Para remover o lcool e preparar o tecido para a penetrao da parafina utiliza-se, nessa etapa, o xilol. Conforme o xilol penetra o tecido, em substituio ao lcool, o material se torna mais claro, transparente. Por essa razo, essa etapa denominada clarificao.
C. Infiltrao em parafina

A infiltrao dos elementos teciduais em parafina importante, pois a parafina tambm o meio de incluso tecidual. Para a infiltrao, ela deve ter

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sido previamente aquecida, pois a parafina lquida somente em temperatura entre 56C a 60C, sendo slida temperatura ambiente. Os tecidos tambm podem ser infiltrados por outros meios de incluso, necessitando de processamentos especiais dependendo do meio de incluso. Meios de incluso como polietilenoglicol (carbowax), resinas hidroflicas e hidrfobas, gelatina, dentre outros, funcionam como meios alternativos de incluso dependendo do objetivo da anlise. O processamento dos tecidos possui variveis que podem afetar consideravelmente os resultados do processo histolgico. Dentre as variveis, temos: condies de operao (manual ou equipamentos automtico), temperatura, caractersticas e concentrao dos reagentes utilizados e as propriedades qumicas dos tecidos.
Processamento manual (Figura 9)

Limitaremos aqui a descrio para material destinado a incluso em parafina. Desidratao Para a desidratao adequada, necessrio que o volume do lcool seja vinte vezes o volume da amostra. Contudo, sendo a gua mais densa do que o lcool, ela tende a se localizar no fundo do frasco aps a sua retirada do tecido, exatamente onde a amostra se encontra (Figura 8). Para que a desidratao seja satisfatria e a gua se acumule no fundo do frasco, recomenda-se:
agitar constantemente o recipiente, para que a gua se misture

ao lcool;
realizar vrias trocas de lcool, pois a gua ser eliminada com o

lcool desprezado;

120 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

usar recipientes de fundo largo para diminuir o nvel de gua; nunca aquecer o lcool, pois, alm de ser perigoso, o meio

ficar hidratado mais facilmente.

Figura 8. Material sendo desidratado e clarificado.

Clarificao Apesar de as substncias diafanizadoras serem insolveis em gua e solveis no lcool, que removido da pea durante a clarificao, deve-se tomar algumas precaues:
agitar o frasco para melhorar a difuso (sada do lcool e

entrada do xilol); antigamente, esse procedimento seria reprovado, pois como o lcool menos denso do que a gua, ele ficaria na superfcie do frasco e no estaria em contato com a pea (Figura 8);
proceder, no mnimo, a duas trocas com a substncia clarificadora; no deixar o material por muito tempo em xilol, pois ele resseca

muito o material, interferindo na sua qualidade.

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Impregnao A impregnao deve ser realizada em estufa a 60oC. Os fragmentos sero transportados de uma parafina a outra em intervalos de tempo predeterminados. No se deve realizar somente uma passagem pela parafina, pois ser insuficiente para remover todo o xilol dos tecidos. Contudo, recomenda-se nunca deixar o material permanecer na parafina por muito tempo, pois como a parafina somente lquida em temperatura alta, o calor em um longo perodo de tempo poder causar grande dano ao tecido. Figura 9. Processamento manual de tecidos.

Processamento automtico

Existem dois tipos de equipamentos automticos (processadores) acessveis no mercado e que so tambm chamados histotcnicos ou autotcnicos. Um tipo de processador o carrossel (Figura 10), mais tradicional e de baixo custo, no qual os cassetes contendo os fragmentos so colocados em uma cesta que transportada mecanicamente de forma a imergir os cassetes em cada reagente. Outro tipo possui uma cmara fechada, na qual

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os reagentes so transferidos de recipiente a recipiente e, esses processadores automticos, chamados processadores com transferncia de fluidos. Ambos os equipamentos possuem doze estgios de processamento. Alguns processadores esto acoplados a um sistema de vcuo (Figura 11) que, no do tipo carrossel, est no ltimo banho de parafina. Nos processadores com transferncia de fluidos, o vcuo pode ser includo em todos os banhos do processo. Todo o processamento ocorre em vcuo, revelando significativa melhoria dos resultados em perodos de tempo reduzido, em comparao aos resultados obtidos no processamento sem vcuo. importante salientar que os recipientes com parafina para infiltrao possuem termostatos que controlam a temperatura ideal de infiltrao. Alm disso, todos os processadores possuem agitao automtica. O trabalho com processadores automticos mais confivel, pois no ocorre falha humana durante o processamento. O tcnico somente deve programar o aparelho e trocar os reagentes para obter um bom processamento do material. O protocolo de execuo tambm elaborado pelo prprio tcnico e pode ser alterado a qualquer momento de forma simples e rpida. Geralmente, os aparelhos so programados para trabalhar durante toda a noite e, no dia seguinte pela manh, o material estar pronto para ser includo. Outro fato considerado quando se quer ganhar tempo na rotina laboratorial, pois se pode programar o equipamento para trabalhar durante feriados e finais de semana.

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Figura 10. Processador de tecidos automtico.

Figura 11. Sistema de vcuo.

Protocolos de processamento Os protocolos de processamento variam de acordo com:


as dimenses dos fragmentos do material a ser processado; tipo de reagentes utilizados; tipo do espcime biolgico (material humano, de rato, de

camundongo, entre outros);


tipo de tecido; processamento automtico ou manual; presena de vcuo.

Citaremos um dos protocolos utilizados para processamento de tecidos clivados com 3mm de espessura: Passo 1 2 3 4 Estgio Desidratao Desidratao Desidratao Desidratao Reagente lcool 70 % lcool 80 % lcool 90 % lcool 95 % Durao 1h 1h 1h 1h

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5 6 7 8 9 10 11 12

Desidratao Desidratao Desidratao Desidratao Clarificao Clarificao Impregnao Impregnao

lcool 100 % lcool 100% lcool 100% lcool 100% Xilol I Xilol II Parafina I Parafina II

1h 1h 1h 1h 1h 1h 1h 2h

Fatores que influenciam no processamento


Temperatura; Vcuo; Agitao.

Notas de biossegurana Todo material utilizado no processamento de tecidos altamente inflamvel. Use luvas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol. Este elemento txico para as vias areas. Quando inalado por tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior. No descarte os resduos do processamento em esgoto sanitrio comum, procure saber em sua instituio qual a poltica de descarte de substncias qumicas.

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4. Incluso

A incluso se baseia em colocar, com o auxlio de uma pina previamente aquecida, os tecidos que foram previamente infiltrados em parafina no interior de um molde que j contm parafina lquida com a superfcie a ser seccionada (a ser cortada ao micrtomo) para baixo (Figuras 11, 12, 13 e 14). Os fragmentos devem ser colocados na parafina enquanto aquecidos, evitando-se a formao de bolhas de ar em torno deles. Aps o resfriamento, os blocos de parafina com o material includo so obtidos. Para se realizar uma boa incluso, necessrio que o fragmento esteja completamente desidratado, clarificado e corretamente impregnado. Quando se observa que uma dessas etapas no foi corretamente efetuada (observando reas opacas ou esbranquiadas no material), deve-se, nesse caso, retroceder o processamento executando-o da seguinte forma:
remover a parafina de infiltrao com vrios banhos do agente

clarificador (xilol);
aps a completa remoo da parafina, proceder remoo do xilol,

passando o fragmento por vrias trocas do agente desidratante (lcool), ou mesmo gua, caso o tecido no tenha sido desidratado corretamente;
em seguida, desidratar e clarificar novamente; infiltrar e incluir o material novamente em parafina.

importante que logo aps o trmino da infiltrao seja efetuada a incluso, evitando que o material se torne quebradio e retrado pelo efeito da temperatura da parafina aquecida.

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Figura 12. Central de incluso.

Figura 13. Incluso do material.

Figura 14. Colorao do suporte com identificao do tecido.

Figura 15. Blocos prontos para a microtomia.

Em alguns laboratrios de histologia, observa-se que o tcnico remove os fragmentos da parafina de infiltrao e deixa-os esfriar at o momento da incluso. Esse comportamento est totalmente errado. O fragmento, ao ser novamente submetido ao da temperatura elevada (56-58oC), pode ter sua textura consideravelmente prejudicada pelo calor. Assim, devemos incluir o fragmento logo aps o trmino da infiltrao. A temperatura da parafina de incluso pode estar cerca de 5C acima do ponto de fuso da parafina. Essa temperatura necessria para que possamos manusear o fragmento dentro do molde, que por vezes metlico e esfria rapidamente. No mercado existem aparelhos que possuem dispositivos que auxiliam no processo de incluso, como tanques de acondicionamento da

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amostra. Nesses equipamentos, o termostato permite o controle mais preciso da temperatura. As centrais de incluso (Figura12) possuem normalmente duas placas, uma aquecedora para efetuar a incluso, e outra refrigerada para resfriar os moldes com as amostras includas. Essas centrais tambm possuem um local para aquecimento das pinas que sero utilizadas durante a incluso. Esses aparelhos facilitam o procedimento da incluso, principalmente por manterem a mesma temperatura de infiltrao em todos os tanques e placas, diminuindo consideravelmente o tempo gasto com a incluso propriamente dita. Dependendo do fabricante, alguns produtos, ao serem adicionados parafina de incluso, alteram a sua consistncia, tornado-a mais macia ou mais densa. A mudana de consistncia deve ser avaliada, pois sua consistncia um fator importante na microtomia. Dentre as substncias que podem ser adicionadas parafina, tm-se: cera de abelha, estearina, cera de carnaba, dietileno glicol, dentre outras. Outro fato a ser considerado o uso de cassetes durante o procedimento at a incluso. Os cassetes de plstico so aconselhados, pois permitem escrever, a lpis, o nmero de registro do material. Os cassetes tambm so importantes para a microtomia, pois podem ser adaptados ao micrtomo. Procedimentos para incluso (Figuras 13, 14, 15,16 e 17)
Abrir o cassete e verificar o nmero de fragmentos contidos no

cassete.
Selecionar o molde a ser utilizado de acordo com as dimenses dos

fragmentos a serem includos de maneira a sobrar cerca de 2 mm de parafina nas margens do bloco.
Preencher o molde com parafina lquida pr-aquecida. Com o auxlio de uma pina, selecionar o fragmento, sem deix-lo

esfriar, e coloc-lo no molde preenchido previamente com parafina.

128 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Colocar a base do cassete, ou suportes, sobre o molde de maneira

que a parafina entre em contato com o cassete. Se para a incluso no se utilizar o cassete, deve-se utilizar um papel para escrever a identificao do bloco.
Levar o molde com o material includo para a placa resfriada. Quando o molde comear a suar, o momento certo de retirar o

bloco do molde. Figura 16. Procedimento de incluso. Figura 17. Molde com material que foi includo.

Orientao dos fragmentos A orientao dos fragmentos de rgos no molde um processo importante na confeco dos cortes e anlise dos tecidos. Por exemplo, rgos tubulares, como intestinos, devem ser includos no plano transversal; fragmentos de msculos tambm devem ser includos, considerando-se seus planos longitudinais e transversais. Ao se incluir um fragmento de pele, deve-se considerar a anlise de suas estruturas bsicas, isto , a epiderme e a derme. Pequenos fragmentos de tecidos podem ser includos paralelamente, enquanto fragmentos alongados so orientados longitudinalmente. Para melhor compreenso do sentido desses materiais durante a incluso, sugere-se que o tcnico procure atualizar seu conhecimento bsico sobre a

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histologia, consultando a literatura especializada ou buscando orientao com o chefe ou pesquisador do setor. Notas de biossegurana A parafina altamente inflamvel, mantenha esta substncia longe de chamas. Evite queimaduras, pois as placas e pinas utilizadas neste procedimento so aquecidas. A incluso deve ser realizada em local arejado ou com exausto. Os vapores de parafina so txicos s vias respiratrias.
5. Microtomia

Para permitir a anlise dos tecidos ao microscpio de luz, eles devem ser seccionados em fatias bem finas e uniformes. A espessura ideal varia de acordo com o objetivo de estudo; recomenda-se a espessura de 4 a 6 mm na rotina dos laboratrios. O instrumento capaz de confeccionar cortes com tal preciso o micrtomo (Figura 18), sendo constitudo por trs partes: corpo, porta-bloco e porta-objeto. Considera-se, ainda, que em alguns modelos possua duas manivelas, uma manivela de ajuste e outra de corte. Existem dois tipos de micrtomos: do tipo rotatrio, tambm conhecido como do tipo Minot, em que o material, no porta-objeto, vai de encontro navalha que est imvel no porta-navalha; e o do tipo corredia, que avana o porta-navalha e vai de encontro ao porta-objeto onde se encontra a amostra. Encontram-se venda no mercado diversos modelos dos dois tipos de micrtomo, podendo ser automticos ou manuais. Muitos micrtomos foram desenvolvidos para confeccionar cortes a partir de blocos de parafina, outros, para realizar cortes congelados, e h ainda aqueles micrtomos especficos para a microscopia eletrnica, chamados ultramicrtomos, capazes de confeccionar cortes ultrafinos. A ttulo de conhecimento geral, iremos descrever alguns destes modelos.

130 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Figura 18. Micrtomo.

Micrtomos

Micrtomo rotativo ou modelo Minot: so instrumentos peque-

nos e mais utilizados para microscopia de luz para tecidos includos em parafina.
Criostato: utilizado para confeccionar cortes de tecidos que foram

congelados. Esse equipamento consiste de um micrtomo rotatrio acondicionado dentro de uma cmara frigorfica com temperatura abaixo de 20 oC (Figura 19). Figura 19. Criostato.

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Micrtomo de corredia: indicado quando os blocos contm frag-

mentos grandes, podendo ser utilizado para bloco de gelatina ou parafina. um micrtomo muito pesado, o que evita qualquer tipo de vibrao mecnica. Muito utilizado para a confeco de cortes de tecido nervoso.
Micrtomo de congelao: esse tipo de micrtomo usado para

cortes de material fresco congelado. O sistema desse micrtomo igual ao do micrtomo de corredia, em que a navalha que se move em direo amostra, que permanece imvel. equipado com um cilindro de dixido de carbono lquido que congela as amostras de tecidos e a navalha. Esse tipo de micrtomo muito utilizado em centros cirrgicos para um diagnstico rpido.
Ultramicrtomo: utilizado para confeccionar cortes de material includo

em resinas acrlicas ou epoxi. Esse equipamento permite seces semifinas (com espessura em micrmetros) de pequenas amostras para microscopia de luz, e ultrafinas (com espessura em nanmetros) em microscopia eletrnica. O ultramicrtomo vem adaptado com suporte para navalhas de vidro para a confeco de cortes semifinos, e suportes para facas de diamante ou safira, utilizadas para confeccionar cortes ultrafinos. um micrtomo automtico que possui um controle de operao mecnica.
Micrtomo do tipo serra: um micrtomo especial utilizado para

cortar ossos calcificados, vidros ou cermicas. As amostras includas em resinas so movidas contra uma serra de diamante.
Micrtomo vibratrio: utilizado para fazer seces de tecidos frescos

de material no fixado, ou tecidos moles; tambm utilizado para a obteno de cortes de tecidos vegetais. O nome do micrtomo deriva do fato de ele possuir um sistema de alta vibrao da navalha para cortar o tecido. Diferentes graus de vibraes podem ser produzidos para cortar os tecidos de diferentes densidades.

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Notas de biossegurana Utilize luvas ao cortar em criostatos, e lembre-se de que no caso de material congelado, os espcimes no esto fixados.
Navalhas (ou facas)

Existe uma variedade de navalhas disponveis no mercado, variando de qualidade conforme o grau de dureza do material, o meio de incluso ou o tipo de micrtomo.
Navalhas de ao: so fabricadas com ao de alta qualidade. A super-

fcie de corte do ao no deve possuir impurezas e nem ser revestida por substncias anticorrosivas. Essas navalhas so tradicionalmente usadas para microtomia de material includo em parafina.
Navalhas de ao para criostato: so navalhas mais resistentes e total-

mente livres de impurezas, contendo ainda 12% a 15% de material cromado ou de teflon, pois no oxidam na presena de gua e oferecem maior durabilidade.
Navalhas descartveis: possuem adaptadores prprios, alm de produ-

zirem cortes de alta qualidade por no comprimirem os tecidos e permitirem cortes sequenciais, denominados cortes em fita. Essas navalhas so confeccionadas em platina ou material cromado para prolongar o uso do gume ou fio da navalha muito afiado. Para confeco de cortes includos em parafina, so comercializadas navalhas descartveis de alto e baixo perfis; as navalhas de alto perfil servem para microtomia de tecidos mais slidos, enquanto as de baixo perfil servem para cortar tecidos mais delicados. As navalhas descartveis so recomendadas por possurem custo menor em relao s de ao, alm de dispensarem a utilizao de equipamentos, como afiadores automticos, que so muito caros. Assim, representam economia de tempo para o tcnico, que no mais precisar amolar suas navalhas.

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Existem tambm navalhas descartveis de tungstnio para a execuo de cortes de rgos ou osso inclusos em resinas acrlicas. Execuo dos cortes Com o auxlio de uma navalha bem afiada, um micrtomo bem aferido e um bloco contendo material condizentemente includo, possvel iniciar a microtomia. Material e equipamento necessrio:
micrtomo; pina histolgica com ponta curva; banho-maria; cuba com gelo; pincel (opcional); gaze; bloco de tecido; navalha bem afiada; suporte para lminas; lminas com adesivo; placa aquecedora (opcional); estufa a 58oC.

Procedimento para a microtomia (Figuras 20, 21, 22 e 23)


1- Fixar o bloco no micrtomo. 2- Colocar o maior eixo do bloco verticalmente ao fio (gume) da navalha. Se o rgo possuir cpsula, essa deve ficar no lado superior do bloco. 3- Acertar o bloco para que a sua superfcie fique paralela navalha.

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4- Colocar no micrtomo uma navalha j utilizada (velha) para desbastar o bloco (retirar o excesso de parafina at se alcanar o material). 5- Aparar o bloco (desbastar). 6- Substituir navalha velha por nova e afiada. 7- Resfriar o bloco para endurecer mais a parafina e umedecer a superfcie do tecido. Pode-se utilizar um cubo de gelo, o qual deve ter a superfcie lisa para entrar em contato com a superfcie do material. 8- Secar a navalha e o bloco com cuidado para no atingir o fio da navalha nem causar ranhuras. 9- Efetuar a microtomia propriamente dita, obtendo os cortes com o auxlio de uma pina, a qual auxilia na manipulao da fita formada. 10- Retirar a fita do micrtomo, com o auxlio da pina, e transport-la para o banho-maria, para realizar a distenso dos cortes. A temperatura do banho-maria deve estar em torno de 40oC para que os cortes se distendam sobre a superfcie da gua, evitando-se a formao de pregas. Pode-se, tambm, aps a execuo dos cortes, coloc-los em banho-maria em temperatura ambiente e distend-los em placa aquecedora com a temperatura em torno de 40 oC a 45 oC. 11- Se o tecido formar dobras, ainda no banho-maria, elas devem ser removidas com o auxlio de uma pina curva, pois tais dobras interferem na anlise histolgica. 12- Coletar o corte com lmina limpa e adesivada. 13- Transferir a lmina com o corte para uma placa aquecedora. 14- Levar a lmina estufa aquecida a 60 oC para retirar o excesso de parafina e melhorar a adeso do corte a lmina.

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Figura 20. Microtomia de tecidos.

Figura 21. Distenso dos cortes em banho-maria.

Figura 22. Coleta ou pescagem dos cortes.

Figura 23. Lminas em um suporte para secar.

Preparo prvio das lminas As lminas devem ser muito bem limpas e desengorduradas para que os cortes no se desprendam da lmina durante as etapas subsequentes.
Marcao: as lminas devem ser identificadas com o nmero de

registro correspondente ao bloco, o que pode ser feito com lpis de diamante (permanente) ou lpis dermogrfico. Adesivos Geralmente, como os cortes podem se soltar das lminas durante a colorao, para evitar que se desprendam podem-se usar adesivos colocados antes da microtomia nas lminas lavadas e secas.

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Os adesivos mais usados so:


albumina de Mayer; gelatina; celoidina polylisina (para imuno-histoqumica); silano (para tcnicas imuno-histoqumicas, hibridizao in situ e

PCR). Problemas que podem ocorrer durante a microtomia A maioria dos artefatos observados nos cortes causada por problemas com a navalha durante a microtomia ou durante o processamento. Vamos listar alguns dos problemas: Problemas Principais causas 1. A navalha e o bloco no esto paralelos 2. O bloco de forma irregular de paredes no paralelas 1. Fitas de cortes curvas ou 3. Borda de corte da navalha irregulares irregular 4. Parafina misturada no homogeneamente ou impura 1. Faca mal afiada 2. Faca ou bloco quente 2. Cortes comprimidos, irregulares 3. ngulo irregular da navalha ou pregueados 4. Parafuso do micrtomo solto 3. Fragmentao dos cortes ou rasgados 1. Incluso imperfeita 2. Parafina quente demais durante a infiltrao ou incluso

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4. Arranhaduras nos cortes ou cortes divididos em segmentos

5. Os cortes que se aderem no bloco ao subir o brao do micrtomo

6. Espessura desigual no mesmo corte, lembrando veneziana

7. Enrolamento dos cortes

8. Fragmentao do tecido durante a microtomia ou separao do tecido do bloco de parafina

1. Parafina suja (no filtrada durante a incluso) 2. Sujeira no molde de incluso 3. Sujeira no bloco ou na navalha 4. Dente na faca 1. ngulo da navalha grande demais 2. Borda da faca suja 3. Faca sem fio 4. Borda do bloco suja de parafina 1.Tecido duro demais 2. Parafuso solto 3. Bancada do micrtomo com vibrao 4.Tecido queimado durante a infiltrao ou incluso 1. Parafina muito dura 2. Navalha cega 3. ngulo incorreto da navalha 1. O lcool ou o clarificador no foram completamente removidos 2. Parafina de infiltrao ou incluso muito quente 3. Excessiva clarificao do tecido 4. A infiltrao foi insuficiente 1. Bloco grande demais 2. Parafusos soltos 3. ngulo da faca pequeno demais

9. Cortes aparecem alternadamente finos e grossos

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Notas de biossegurana Uma causa frequente de acidente em laboratrios de histotcnica a falta de ateno na manipulao de navalhas durante a confeco do corte. A microtomia deve ser realizada em local calmo, onde o tcnico possa se concentrar exclusivamente no seu trabalho. Muito cuidado ao descartar as navalhas. Utilize sempre caixas de descarte especial para perfurocortantes. Lembre-se de que os funcionrios do setor de limpeza podem se acidentar com navalhas descartadas indevidamente.
6. Colorao dos tecidos

A utilizao de corantes fundamental para visualizar os tecidos ao microscpio de luz. Aps a microtomia, as clulas e o material extracelular so habitualmente transparentes e os corantes melhoram a visualizao das estruturas teciduais. Os corantes aplicados para corar tecidos que foram previamente fixados so chamados corantes no vitais, como a hematoxilina, eosina, fucsina, entre outros. Podemos tambm corar clulas em cultura ou clulas de organismos ainda vivos; nesse caso, necessria a utilizao de corantes chamados vitais, que no causam danos s clulas e tambm no interferem no metabolismo celular. Dentre eles, temos: o azul de tripan, verde janus B, vermelho tripan, azul de metileno, vermelho neutro, entre outros. Para compreender os conceitos bsicos sobre coloraes, devemos conhecer algumas definies importantes.
O que so corantes?

Os corantes (Figura 24) so compostos orgnicos, aromticos e ionizveis, fundamentalmente baseados na estrutura do benzeno. Contudo, esses corantes

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so incolores e necessitam da adio de novos grupos qumicos sua estrutura chamados cromforos (C=O cetona, C=N carboamnico, N=N azoico, N=O nitroso, NO2 nitro e C=C etileno). Quanto mais cromforos em um corante, mais intensa ser a sua cor. A unio do cromforo aos compostos aromticos constitui os cromgenos, compostos benznicos contendo grupamentos cromforos. Para que o corante se ligue especificamente aos elementos tissulares, necessrio que um grupo auxiliar do corante, denominado auxocromo, se ligue ao cromgeno. O auxocromo determina o carter cido ou bsico do corante. As aminas bsicas (-NH2) e os grupos hidroxila cidos (-OH) so exemplos de auxocromos. Simplificando: Corantes so compostos orgnicos aromticos formados pelo cromgeno e auxocromo e coram seletivamente os componentes teciduais, como as clulas e a matriz extracelular. De acordo com a carga inica, os corantes podem ser cidos, bsicos ou neutros.
Corantes cidos: possuem auxocromo aninico (carga eltrica negativa

(-)), com afinidade por componentes bsicos do tecido (catinico (+)). As estruturas coradas pelos corantes cidos so chamadas acidfilas, como, por exemplo, o citoplasma e matriz extracelular. Um exemplo de corante cido a eosina.
Corantes bsicos: possuem auxocromo catinico (+) com afinidade

por componentes cidos dos tecidos (aninico (-)). As estruturas coradas pelos corantes bsicos so chamadas basfilas, como o ncleo. A hematoxilina um exemplo clssico de corante bsico.

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Figura 24. Esquema da associao do corante com os tecidos.

Os corantes podem ser naturais ou sintticos (artificiais), sendo tambm chamados corantes biolgicos, por revelar estruturas biolgicas dos tecidos.
Naturais: hematoxilina, ndigo, orcena, brasilina, entre outros. Artificiais: so aqueles derivados do benzeno.

As coloraes podem ser classificadas segundo a ao do corante, o tempo de colorao e a sua cromatizao. Para compreender essa caracterizao, necessrio conhecer a definio de dois termos da tcnica histolgica: o mordente e a diferenciao. Mordente: um elemento, metal ou ons de metal, que se liga covalentemente ao corante e facilita a ligao do corante ao tecido. O mordente empregado para reforar a ao dos corantes e tornar as coloraes mais seletivas, podendo ser usado antes, durante (adicionado soluo corante) ou aps a utilizao do corante.

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Diferenciao: esse termo se refere remoo do excesso de corante do tecido, descorando seletivamente determinada estrutura e melhorando a sua visualizao. As coloraes podem ainda se caracterizar segundo a: A. Ao
Diretas: quando o corante penetra no interior dos tecidos sem trata-

mento intermedirio com mordente.


Indiretas: quando necessrio um tratamento intermedirio com

uma soluo mordente para o corante se ligar ao tecido durante a colorao. B. Tempo
Progressiva: a colorao feita gradualmente sem a necessidade de se

proceder sua diferenciao, isto , que seja retirado o excesso do corante.


Regressiva: hipercora-se o tecido e posteriormente remove-se seu

excesso pela diferenciao para melhor visualizao dos elementos teciduais. B. Cromatizao Depende da quantidade de corantes utilizados durante a execuo de uma determinada tcnica de colorao.
Monocrmica = 1 cor. Bicrmica = 2 cores. Tricrmica = 3 cores. Policrmica = mais de 3 cores.

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Aps os comentrios apresentados, deve-se ainda aprofundar alguns conhecimentos sobre a colorao. Aps a microtomia, o preparado histolgico est pronto para ser corado. Deve-se, inicialmente, utilizar uma colorao que proporcione uma viso geral de todo o tecido de modo a permitir a identificao dos elementos teciduais, propiciando o diagnstico histolgico. A colorao pela hematoxilina (H) e pela eosina (E) cumpre muito bem esse papel. Nessa colorao, os ncleos so corados pela hematoxina, sendo evidenciados em roxo, enquanto o citoplasma e os espaos intercelulares so corados pela eosina, sendo visualizados em rosa. Havendo a necessidade de se identificar certos elementos teciduais especficos, empregam-se tcnicas histoqumicas especiais. H diversos mtodos especiais de colorao que propiciam uma melhor identificao de determinados componentes teciduais. Por exemplo, a colorao pelo mtodo tricomtico de Masson, que utiliza corantes especiais, permite evidenciar tecido muscular e fibras colgenas; a colorao pela resorcina fucsina de Weigert demonstra fibras do sistema elstico; o azul de toluidina em pH cido uma colorao especfica para mastcitos. Outros mtodos utilizados para identificao de elementos teciduais podem utilizar sais pesados a base de prata metlica e no corantes. Nessa categoria podem-se citar o mtodo da reticulina de Gomori, que identifica especificamente as fibras reticulares do tecido conjuntivo, sendo o mtodo de Grocott especfico para fungos, e o mtodo de PAMS, especfico para membrana basal. Em determinadas coloraes histoqumicas, certas substncias, ao se combinarem com o tecido, formam uma nova substncia, e essa ligao pode ser irreversvel. Essa a base da colorao com o azul da Prssia (ou Perls) e do mtodo que utiliza o cido peridico associado ao reativo de Schiff (PAS). Na colorao com o azul da Prssia, devido ao do cido clordrico, o ferro

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conjugado s protenas ionizado e evidenciado aps reao com o ferrocianeto de potssio. O resultado dessa reao produz um precipitado azul e insolvel de ferrocianeto frrico. Na reao do mtodo do PAS, o cido peridico oxida os grupos hidroxila vicinal dos hidratos de carbono do glicognio, mucoprotenas e glicoprotenas, os quais so convertidos a grupamentos aldedicos, de modo que a cadeia polissacardica se transforma numa cadeia polialdedica. Os compostos aldedos se combinam com o reagente de Schiff, que incolor, e esse complexo formado revela-se como um composto colorido. As coloraes histolgicas de rotina e especiais, quando surgiram na patologia clssica, constituram uma grande revoluo e avano na metodologia de estudo da clula, fornecendo subsdios importantes para a anlise dos tecidos, e representam o ponto de partida para o uso de tcnicas mais modernas incorporadas rotina de investigao. A seguir, encontram-se algumas sugestes de tcnicas histoqumicas. Para evidenciar Ncleo e citoplasma Melancitos Clulas do tecido nervoso Secrees celulares Mastcitos e eosinfilos Clulas HE, Feulgen, Papanicolau, Shorr, Giemsa, azul de toluidina, metil green-pironina Fontana-Masson Violeta cresil, azul de toluidina, Golgi (Prata) PAS, PAS alcian blue pH 1,0 ou 2,5 AB-safranina, Geimsa, azul de toluidina, sirius red em pH 10,2

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Para evidenciar Glicoprotenas neutras Proteoglicanos Glicoprotenas no colagenosas Elementos fibrosos base de colgenos Fibras do sistema elstico

Elementos da matriz extracelular PAS PAS-alcian blue em pH 1,0 ou pH2,5 PAMS, reticulina Tricomtica de Masson, tricomtica de Gomori, picrossirius red Resorcina fucsina de Weirgert

Para evidenciar Tecido conjuntivo

Tecidos especficos Tricomtica de Masson, tricomtica de Gomori, Goldner, picrossirius red, reticulina de Gomori Giemsa, reticulina de Gomori Sudan black Coloraes tricromticas, azul de toluidina Coloraes tricromticas, PAS alcian blue em pH1,0 ou pH 2,5

Tecido linfoide e mieloide Tecido adiposo Tecido muscular Tecido cartilagionoso

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Para evidenciar Fungos de forma geral

Micro-organismos Grocott e PAS Warthin-Starry, Giemsa Mtodo de Fite, Wade, Kinyoun Giemsa, HE, leishman, PAS, hematoxilina frrica, Feulgen HE HE Mucicarmin, PAS, prata metenamina

Treponema pallidun, Leptospira, Helicobacter pylori Mycobacterium leprae Giardia lamblia, Entamoebahistolytica, Trichomonas vaginalis
Helmintos Incluses virais Criptococcus

Consideraes importantes

Geralmente as estruturas teciduais so visualizadas na mesma cor, ou muito semelhante em tom ao do corante utilizado. Essa propriedade conhecida como ortocromasia. Porm, em alguns casos, certos elementos teciduais, ao serem visualizados aps a sua interao com o corante, exibem uma cor distinta do corante. Esse fenmeno designado metacromasia. Algumas tcnicas de colorao podem demonstrar a metacromasia, como a colorao pelo azul de toluidina em condies especficas, que evidencia em magenta os grnulos dos mastcitos e os proteoglicanos da matriz cartilaginosa.

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Procedimentos gerais para coloraes

Antes de iniciar qualquer colorao, devemos nos lembrar de que, aps a microtomia, os cortes dos tecidos esto impregnados pela parafina, que precisa ser removida para que os corantes penetrem e se combinem com os elementos teciduais. O procedimento geral para qualquer colorao o seguinte:
Desparafinizao: visa retirada da parafina dos cortes aps a microtomia.

Esse procedimento realizado com o auxlio do xilol, a mesma substncia utilizada para a clarificao dos tecidos durante o processamento para a confeco do bloco contendo o fragmento do material a ser analisado.
Hidratao: realizada por meio de sequncias alcolicas em concen-

traes decrescentes, ou seja, lcool 100%, 95%, 80%, 70%, at a gua destilada. Cabe ressaltar que a maioria dos corantes se encontra diluda em gua, devendo o ltimo banho ser com gua. Porm, quando se utiliza um corante alcolico, deve-se interromper a hidratao em lcool 70%.
Colorao: a imerso propriamente dita dos cortes no corante,

favorecendo a combinao de suas estruturas com o corante para posterior visualizao em microscpio de luz.
Desidratao: retira a gua do tecido, pois os meios de selagem no

so miscveis em gua, e so necessrios para a confeco dos preparados histolgicos permanentes. Assim, utiliza-se com concentraes alcolicas crescentes: lcool 70%, 80%, 95% e 100%.
Clarificao: utiliza-se o xilol como lquido intermedirio entre o lcool

e o meio de selagem.
Selagem ou montagem da lmina propriamente dita: a etapa final da

preparao da lmina para anlise ao microscpio de luz. Essa etapa consta em cobrir o tecido com uma lamnula de vidro, usando uma substncia para fixar a lmina lamnula (selagem).

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Protocolos de colorao para os tecidos

Colorao pela hematoxilina mayer e eosina-floxina

Solues: A) Hematoxilina de Mayer (Mayer, 1903): Hematoxilina.........................................................1 g gua destilada..............................................1000 mL Iodato de sdio................................................. 0,2 g Almen de amnia ou potssio................................. 50 g cido ctrico.........................................................1 g Hidrato de cloral..................................................50 g Dissolver a hematoxilina na gua destilada agitando (aquecer um pouco at 60 C). Acrescentar o iodato de sdio e o almen. Agitar at dissolver totalmente. Adicionar, ento, o cido ctrico e o hidrato de cloral. Deixar agitando para que todos os componentes se dissolvam totalmente. A cor final do corante vermelho-violeta. O corante estar pronto para o uso imediato e poder ser usado por cerca seis meses (no mximo), sem que ocorra o amadurecimento exagerado. Nota tcnica: existem vrios tipos distintos de solues para o preparo da hematoxilina, como a de Mayer, Harris, Delafield e Erlich. Esses tipos de solues variam de acordo com o tempo de colorao, aplicao e composio qumica do corante. A hematoxilina de Harris muito utilizada nos laboratrios de anatomia patolgica por produzir bons resultados com um tempo curto de colorao. A hematoxilina de Mayer apresenta bons resultados, porm com um tempo maior de colorao. As hematoxilinas de Erlich e

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Delafield so empregadas em tecidos sseos que sofrero a ao por descalcificadores contendo cidos fortes. A seguir, sero descritos os mtodos de colorao pela hematoxilina e eosina, utilizando a hematoxilina de Mayer e a de Harris. B) Eosina-floxina: 1- Soluo estoque de eosina 1% em gua destilada. 2- Soluo estoque de floxina 1% em gua destilada. 3- Soluo de uso de eosina-floxina: Eosina 1% (soluo estoque 1)............................100 mL Floxina 1% (soluo estoque 2).............................10 mL lcool etlico 95%...........................................780 mL cido actico glacial PA........................................ 4 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada. 2- Corar com a hematoxilina de Mayer durante 20 minutos 1. 3- Lavar em gua corrente durante 25 minutos. 4- Comear a desidratao com lcool 70% durante 1 minutos. 5- Corar pela eosina-floxina durante 2 minutos. 6- Lavar rapidamente em lcool 95%. 7- Desidratar em 3 banhos de lcool absoluto por 1 minuto cada. 8- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar. Resultados: ncleos em azul e citoplasma em vrias tonalidades de rosa.
Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e ainda se obterem bons resultados.
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Notas de biossegurana Ateno, pois o xilol e o lcool so altamente inflamveis. Use luvas nitrlicas, jaleco e mscara com filtro de proteo contra vapores orgnicos. Durante a manipulao dos reagentes, evite contato com o lquido e o vapor de xilol. Esse elemento txico para as vias areas e, quando inalado por tempo prolongado, pode causar a morte. Em caso de incndio, extinguir com espuma, p qumico seco ou dixido de carbono. O vapor de xilol mais pesado do que o ar, exigindo capela com exausto inferior.
Colorao pela hematoxilina de Harris e eosina-floxina

Solues: A) cido-lcool a 1%: cido clordrico (HCl)..........................................1 mL Etanol a 70%...................................................99 mL B) gua amoniacal: Hidrxido de amnio (NHOH)..........................2 a 4 mL gua destilada......................................800 a 1000 mL C) Carbonato de ltio saturado: Carbonato de ltio (LiCO)...................................1,54 g gua destilada................................................100 mL D) Eosina-floxina (ver o mtodo de hematoxilina de Mayer e esosinafloxina)

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E) Hematoxilina de Harris (Harris, 1900): Hematoxilina .....................................................5,0 g Etanol a 100%..............................................50,0 mL Almen de potssio ou de amnio...........................100 g gua destilada..............................................1.000 mL xido mercrio (p vermelho) (HgO)......................2,5 g Dissolva o almen em gua destilada com o auxlio de uma placa aquecedora e um agitador magntico em um recipiente. Dissolva a hematoxilina no lcool temperatura ambiente, em recipiente separado. Lentamente, misture as duas solues aquecendo em placa aquecedora, at entrar em ebulio. Retire da fonte de calor e, com cuidado, acrescente lentamente o xido mercrio, que faz com que a soluo entre rapidamente em ebulio, podendo transbordar do recipiente. Retorne a soluo para a fonte de calor at que adquira a cor prpura-escura. Esfrie, e a soluo estar pronta. Para o uso: Acrescente 20 mL de cido actico glacial para intensificar a colorao dos ncleos. Filtre sempre antes de cada uso. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Corar com soluo recm-filtrada de hematoxilina de Harris por 6 a 10 minutos2.
Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e ainda se obterem bons resultados.
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3- Lavar em gua de torneira por 5 minutos. 4- Diferenciar em lcool-cido, com 1 ou 2 mergulhos. 5- Lavar rapidamente em gua de torneira. 6- Colocar em soluo fraca de gua amoniacal ou de carbonato de ltio saturada at que os cortes fiquem azul-brilhantes. 7- Lavar completamente em gua de torneira por 10 minutos. 8- Colocar em lcool etlico a 80% por 1 a 2 minutos. 9- Contracorar em soluo de eosina-floxina por 2 minutos3. 10- Desidratar a partir do lcool 95%. 11- Desidratar com 3 banhos de lcool absoluto. 12- Clarificar em 3 banhos de xilol e selar. Resultados: Ncleos..............................................................azul Citoplasma...........................................rseo a vermelho Demais estruturas tissulares.........................rseo a vermelho Nota de biossegurana: O xido mercrio txico, venenoso e combustvel (oxidante).
Mtodo de colorao pelo Giemsa de Lennert (Lennert, 1978)

Solues: A) cido actico 0,5%. B) lcool isoproplico.


Recomendamos fazer um teste prvio, pois, conforme o material, esse tempo poder ser reduzido e ainda se obterem bons resultados.
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C) lcool etlico 95%. D) Xilol E) Soluo de Giemsa: Giemsa Merck em soluo estoque..........................20 mL gua destilada..................................................80 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar as lminas at a gua destilada. 2- Corar utilizando a soluo de uso de Giemsa por 1 hora. 3- Diferenciar em cido actico 0,5% - 3 mergulhos 4- Continuar a diferenciao em lcool etlico 95%, olhando sempre ao microscpio (o tempo varia de acordo com o tipo e espessura do tecido). 5- Desidratar em lcool isoproplico - 3 banhos, de 3 minutos cada. 6- Clarificar em xilol e selar. Nota: A soluo de Giemsa descora com o tempo; aconselha-se examin-la e fotograf-la o mais rpido possvel. Resultados: Citoplasma..........................................................rosa Ncleos.............................................................azul Hemcias.......................................................vermelho

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Grnulos de mastcitos.......................................prpura Bctrias..............................................................azul Parasitas da malria..................................................azul

Mtodo do cido peridico + reativo de Schiff (PAS)

(McManus, 1946) Solues: A) cido Peridico 0,5%. B) Reagente de Schiff: Fucsina bsica........................................................1 g Metabissulfito de sdio ou bissulfito de sdio..................2 g gua destilada.................................................200 mL cido clordrico 1 N..........................................20 mL Procedimento: 1- Dissolver em 200 mL de gua destilada quente, 1 g de fucsina bsica. 2- Deixar entrar em ebulio. 3- Esfriar at 50 C. 4- Adicionar 2 g de metabissulfito ou dissulfito ou bissulfito de sdio anidro. 5- Filtrar. 6- Colocar uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e em seguida adicionar 20 mL de cido clordrico 1 N. 7- Agitar, esfriar e guardar na geladeira em frasco mbar ou envolvido em papel alumnio.

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8- No dia seguinte, colocar uma pitada de carvo ativado e filtrar. O filtrado deve ficar branco ou cor-de-palha; caso contrrio, deve-se colocar mais uma pitada de metabissulfito de sdio anidro e filtrar novamente. C) Soluo sulfurosa: Soluo estoque: Metabisssulfito de potssio ou bissulfito de potssio...10 g gua destilada................................................200 mL cido clordrico 1 N..........................................10 mL Soluo de uso: Soluo estoque..........................................................6 mL gua destilada........................................................114 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Colocar as lminas na soluo de cido peridico 1% por 15 minutos. 3- Lavar em gua destilada por 5 minutos. 4- Corar pelo Schiff (guardado na geladeira e no escuro 4), por 15 minutos temperatura ambiente. 5- Colocar em trs trocas de soluo sulfurosa de uso durante 5 minutos cada e desprezar aps o uso.

Envolver o vidro com papel alumnio.

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6- Lavar em gua destilada por 4 minutos. 7- Corar pela hematoxilina de Mayer durante 10 minutos. 8- Lavar em gua corrente durante 5 minutos. 9- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Membrana basal, mesngio, fibrina, muco, amiloide, coloide, de colorao rsea a vermelho prpura.
Mtodo de Gomori para fibras reticulares (Gomori, 1937)

Solues: A) Soluo de permanganato de potssio 1%. B) Soluo de cido oxlico 3%. C) Soluo de almen de ferro 2%. D) Soluo de nitrato de prata amoniacal de uso: Nitrato de prata 10% (aquoso).............................20 mL Hidrxido de potssio 10% (aquoso)........................5 mL Hidrxido de amnia 28% (aquoso): adicionar aos poucos, gotejando at que o precipitado marrom desaparea, sempre agitando. A soluo se tornar transparente. Acrescentar ento 3 gotas de nitrato de prata 10%, agitando. Acrescentar gua destilada na proporo de 1:1. Acrescentar finalmente 25 mL de gua.

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E) Formaldedo 10%: (1 parte de formaldedo comercial + 3 partes de gua destilada) F) Cloreto de ouro 1%. G) Tiossulfato de sdio 5%. Observao: Os cortes devem ser aderidos em lminas quimicamente limpas e desengorduradas, com uma fina camada de albumina de Mayer. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Mergulhar em soluo de permanganato de potssio 1% por 1 minuto. 3- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 4- Descorar pelo cido oxlico 3% por 3 minutos. 5- Lavar em gua corrente por 3 minutos. 6- Colocar as lminas no almen de ferro 2% ou sulfato de ferro e alumnio por 1 minuto. 7- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 8- Soluo de nitrato de prata amoniacal (soluo de uso) por 1 minuto. 9- Lavar em gua destilada por 5 minutos. 10- Formaldedo 10% por 3 minutos. 11- gua corrente por 5 minutos.

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12- Soluo de cloreto de ouro 1% por 10 minutos. 13- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 14- Tiossulfato de sdio 5% por 1 minuto. 15- Lavar em gua corrente por 2 minutos. 16- Desidratar, clarificar e selar. Resultado: Fibras reticulares ...........................negro. Mtodo de colorao tricromtica de Masson (Masson, 1929) Solues: A) Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico: cido pcrico.....................................................1,2 g gua destilada.................................................100 mL B) Soluo fixadora de Bouin: Soluo aquosa, saturada, de cido pcrico ...750 mL Formalina (37-40%)..........................................250 mL cido actico, glacial...........................................50 mL C) Soluo de uso de hematoxilina frrica de Weigert: Misturar, em partes iguais, as solues estoques A e B (100 mL da soluo A + 100 mL da soluo B). Soluo estoque 1: Hematoxilina, cristais................................................1 g Etanol, 95%..................................................100 mL

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Soluo estoque 2: Cloreto frrico (FeCl ), 29%..................................4 mL gua destilada..................................................95 mL cido clordrico concentrado (HCl)............................1 mL D) Soluo de fucsina cida - Biebrich Scarlet: Biebrich Scarlet (C.I. 26905), soluo aquosa a 1%....90 mL Fucsina cida (C.I. 42685), soluo aquosa a 1%.......10 mL cido actico glacial.............................................1 mL E) Soluo de cido fosfotngstico - fosfomolbdico: cido fosfotngstico................................................5 g cido fosfomolbdico..............................................5 g gua destilada..................................................200 mL F) Soluo de azul de anilina: Azul de anilina....................................................2,5 g cido actico glacial..............................................2 mL gua destilada.................................................100 mL G) Soluo de cido actico glacial a 1%: Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada. 2- Colocar no lquido de Bouin por 1 hora a 56 oC ou

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temperatura ambiente, por uma noite, se os cortes foram fixados em formalina. Essa etapa no necessria se a fixao for feita no lquido de Bouin. 3- Deixar esfriar por 10 minutos. 4- Lavar em gua corrente at que os cortes fiquem claros. Em seguida, enxaguar em gua destilada. 5- Corar na soluo de hematoxilina frrica de Weigert por 10 minutos. 6- Lavar em gua corrente por 10 minutos. Aps, enxaguar em gua destilada. 7- Corar em soluo aquosa de Biebrich Scarlet a 1% por 5 minutos. 8- Enxaguar em gua destilada. 9- Colocar na soluo de cido fosfotngstico-fosfomolbdico por 10 a 30 minutos. 10- Corrar em soluo de azul de anilina por 15 a 30 minutos. 11- Enxaguar em gua destilada. 12- Diferenciar na soluo aquosa de cido actico a 1%, por 3 a 5 minutos. 13- Desidratar a partir do etanol a 95%, clarificar com xilol e selar. Resultados: Ncleos............................................................preto Msculo, citoplasma, queratina..............................vermelho Colgeno.............................................................azul

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Mtodo de Weigert (Weigert, 1898)

Solues: A) Resorcina fucsina de Weigert: Fucsina bsica........................................................2 g Resorcina.............................................................4 g gua destilada................................................200 mL Cloreto frrico 30 %.........................................25 mL Dissolver 2 g de Fucsina bsica e 4 g de Resorcina em 200 mL de gua destilada em ebulio. Adicionar 25 mL de cloreto frrico a 30%, deixando ferver por mais 5 minutos. Filtrar e desprezar o filtrado. O precipitado que ficou no papel de filtro deve ser dissolvido em 200 mL de etanol 90% aquecido. Aps esfriar, completar para 200 mL com etanol 90% e juntar 4 mL de cido clordrico concentrado. O corante deve ser guardado na geladeira, pois o lcool pode evaporar com o calor. B) Soluo de persulfato de potssio 10% ou monopersulfato de potssio 10% ou oxona 10% C) Soluo de Van Gieson: Fucsina cida, soluo aquosa a 1%...........................5 mL cido pcrico, soluo saturada aquosa (21 g para 1 L de gua) ..................................100 mL cido clordrico concentrado................................0,25 mL

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Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at o lcool 70%. 2- Oxidar pela oxona 10% (desprezar aps o uso). 3- Corar pela resorcina-fucsina durante 1 hora. 4- Passar por 3 banhos de lcool 95% (em borris), para retirar o excesso de corante por alguns segundos em cada banho. 5- Lavar em gua destilada. 6- Contracorar ou no com a soluo de Van Gieson 7- Desidratar rapidamente em 3 banhos de lcool absoluto (em borris). 8- Clarificar em 3 banhos de 3 minutos de xilol. Resultados: Fibras elsticas ......................................... marrom-avermelhado.

Mtodo da prata metenamina de Grocott (Grocott, 1955)

Solues: A) Soluo de cido crmico (trixido de cromo) a 4%. B) Soluo de nitrato de prata a 5%. C) Soluo de metenamina (hexametilenotetramina) a 3%. D) Soluo de brax a 5%.

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E) Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina: Soluo de nitrato de prata a 5%.............................5 mL Soluo de metenamina a 3%..............................100 mL F) Soluo de trabalho de nitrato de prata-metenamina: Soluo estoque de nitrato de prata-metenamina...........25 mL gua destilada..................................................25 mL Soluo de brax a 5%.........................................2 mL Prepare no momento de usar. No use se ficar turva. G) Soluo de bissulfito de sdio ou metabissulfito de sdio a 1%: Prepare no momento de usar. H) Soluo de cloreto de ouro a 0,1%. I) Soluo de tiossulfato de sdio (hipossulfato de sdio) a 5%. J) Soluo estoque de light green a 0,2%:

Light green SF yellow.......................0,2 g


gua destilada.................................................100 mL Aps misturar, acrescente 0,2 mL cido actico glacial. K) Soluo de uso de light green: Soluo estoque de light green ...............................10 mL gua destilada...................................................50 mL

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Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Oxidar pela soluo de trixido de cromo a 4%, preparada no momento de usar, e deixar por 1 hora. 3- Lavar em gua de torneira por poucos segundos. 4- Colocar na soluo de bissulfito de sdio a 1% por 1 minuto. 5- Lavar em gua corrente por 5 a 10 minutos. 6- Enxaguar em gua destilada; 3 trocas. 7- Colocar os preparados na soluo de trabalho de nitrato de prata-metenamina, preparada no momento de usar, e deixar na estufa a 58C - 60C, por 50 a 60 minutos. 8- Enxaguar em gua destilada vrias vezes. 9- Colocar na soluo de cloreto de ouro a 0,1% e deixar por 2 a 5 minutos. 10- Enxaguar em gua destilada. 11- Colocar na soluo de tiossulfato de sdio a 5%, e deixar por 2 a 5 minutos. 12- Lavar em gua de torneira. 13- Contracorar na soluo de trabalho de light green por 30 a 45 segundos (esse tempo pode variar). 14- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Fungos ............................nitidamente delineados em preto Mucina.....................................................cinza-escuro Parte interna de miclios e hifas.....................rosa-acinzentado Fundo..............................................................verde

164 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Mtodo de Warthin-Starry (Kerr, 1938)

Solues: A) cido ctrico 1%. B) Soluo de gua acidulada: gua tridestilada deionizada...............................1000 mL Acrescentar a soluo de cido ctrico a 1%, o suficiente para alcanar o pH 4,0. C) Soluo impregnante de nitrato de prata a 1%: Nitrato de prata.....................................................1 g gua acidulada................................................100 mL D) Soluo de nitrato de prata 2% para revelao: Nitrato de prata.....................................................2 g gua acidulada................................................100 mL E) Soluo de hidroquinona a 0,15%: Hidroquinona cristalina qualidade fotogrfica...............0,15 g gua acidulada...............................................100 mL F) Soluo de gelatina a 5%: Gelatina pura......................................................10 g gua acidulada................................................200 mL

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Conservar as solues de nitrato de prata 2%, gelatina 5% e hidroquinona 0,15% em frascos de Erlenmayer de 50 mL, em banho-maria 54 C, at preparar a soluo G: G) Soluo reveladora: Nitrato de prata 2%..........................................1,5 mL Gelatina 5%..................................................3,75 mL Hidroquinona 0,15%........................................2,0 mL Misturar num pequeno bquer os ingredientes acima na ordem descrita, assegurando-se que a mistura do nitrato de prata e gelatina esteja totalmente completa. Aps isso, adicionar a hidroquinona. Preparar a soluo somente na hora de usar. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Impregnar pela soluo de nitrato de prata a 1%, por 30 minutos em banho-maria pr-aquecido 43 oC. 3- Preparar a soluo reveladora. Usar a soluo imediatamente aps colocar a hidroquinona. 4- Recobrir os cortes com a soluo reveladora, preparada no momento do uso. Os cortes tornam-se marrons-claros ou amarelos. Controlar ao microscpio. As espiroquetas aparecem em negro com fundo amarelo ou marrom-claro. 5- Lavar rapidamente em gua morna comum (56oC). 6- Mergulhar em gua destilada. 7- Desidratar a partir do lcool 95%, clarificar e selar.

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Resultados: Espiroquetas, corpos de Donovani...negro Colorao de fundo....................de amarelo a marrom-claro Referncias: C. H. Bridges e L. G. Luna estudaram vrias modificaes da tcnica, que se encontra publicada em Lab. Invest.,1957.
Sirius red em pH 10,2 (Bogomoletz,1980; Luque,1989)

Soluo: A) Soluo de sirius red em pH 10,2:

Sirius red ou direct red 80......................................0,5g


gua destilada..................................................45 mL lcool absoluto.................................................50 mL
Adicionar NaOH 0,1N, at atingir o pH 10,2. Deixar repousar por 2 horas. Gotejar lentamente o cloreto de sdio 20% em baixo de luz

forte at aparecer o precipitado.


Deixar repousar durante a noite sob luz forte e filtrar na manh

seguinte. Esta soluo dura um ms temperatura ambiente; mas pode durar mais, caso fique na geladeira. Aps um ms, aumentar o tempo de colorao.

Tcnicas Histolgicas | 167

Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar os cortes at a gua destilada. 2- Corar por 5 minutos pela hematoxilina de Mayer. 3- Lavar em gua corrente por 5 minutos. 4- Lavar em gua destilada por 2 minutos. 5- Passar pelo lcool 70% por 3 minutos. 6- Corar pela soluo de sirius red pH 10,2 por 1 hora ou mais. 7- Lavar em gua corrente por 10 minutos. 8- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Grnulos do eosinfilos......................................vermelho Ncleos..............................................................azul

Mtodo de Fite (Fite, 1947)

Solues: A) Vaselina terebentina: Terebentina......................................................70 mL Vaselina...........................................................30 mL ou Soluo de leo de Anilina - Xilol: leo de anilina..................................................30 mL Xilol..............................................................70 mL

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B) Soluo de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen: Fenol, cristais fundidos........................................2,5 mL Etanol absoluto...................................................5 mL Fucsina bsica.....................................................0,5 g gua destilada..................................................50 mL Primeiro, deve-se dissolver a fucsina bsica no etanol, juntar o fenol e, por ltimo, adicionar a gua destilada. Esta soluo deve ser filtrada. C) Soluo de lcool-cido a 1%: cido clordrico..................................................1 mL lcool etlico (etanol) a 70%................................99 mL D) Soluo estoque de azul de metileno: Azul de metileno.................................................1,4 g Etanol a 95%.................................................100 mL E) Soluo de trabalho de azul de metileno: Soluo estoque de azul de metileno........................10 mL gua destilada...................................................90 mL cido actico glacial............................................0,5 mL Procedimento: 1- Desparafinizar as lminas em 2 trocas, de 10 minutos cada, em soluo de vaselina terebentina ou leo de anilina xilol em estufa 60oC. Lembrar-se de que essas solues devem estar a 60oC antes de imergir as lminas.

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2- Deixar os cortes secarem ao ar por 15 minutos. O filme de leo remanescente prevenir a retrao e os danos aos cortes. 3- Corar na soluo filtrada de carbol-fucsina de Ziehl-Neelsen por 30 minutos. 4- Lavar em gua de torneira por 10 minutos. 5- Diferenciar os cortes na soluo de lcool-cido a 1% at que fiquem rosa-plidos. 6- Lavar em gua corrente por 3 minutos. 7- Contracorar com a soluo de trabalho de azul de metileno por 30 segundos a 1 minuto. 8- Enxaguar, em gua de torneira, o excesso de soluo de trabalho de azul de metileno. 9- Desidratar os cortes rapidamente, em 2 trocas cada, em etanol a 95% e etanol absoluto. 10- Clarificar em xilol; 2 trocas de 2 minutos cada. 11- Selar. Resultados: Bacilos da lepra e outros cido resistentes...............vermelho. Fundo....................................................... azul-plido.
Mtodo do mucicarmim (Southgate, 1927)

Solues: A) Soluo estoque mucicarmim de Southgate: Carmim...............................................................1 g Hidrxido de alumnio.............................................1 g

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Etanol a 50%........................................................100 mL Cloreto de alumnio, anidro..............................................5 g Faa essa soluo em banho-maria. Quando frio, filtre. B) Soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate: Soluo-estoque de mucicarmim de Southgate...............10 mL gua destilada..................................................90 mL C) Soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert: Partes iguais das solues estoque A e B (100 mL de A + 100 mL de B). Ver o mtodo de colorao pela tricromtica de Masson. D) Soluo de amarelo metanil a 0,25%: Amarelo metanil.......................................................0,25 g gua destilada........................................................100 mL cido actico glacial................................................0,25 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar at a gua destilada. 2- Deixar na soluo de trabalho de hematoxilina frrica de Weigert por 7 minutos. 3- Lavar em gua corrente de torneira por 10 minutos. 4- Corar na soluo de trabalho de mucicarmim de Southgate por 30 minutos e descart-la aps o uso. 5- Enxaguar rapidamente em gua destilada.

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6- Contracorar na soluo de amarelo metanil por 1 minuto. 7- Desidratar a partir do etanol 95%. 8- Clarificar e selar. Resultados: Mucina......................................................rosa-escuro Cpsula de Cryptoccocus sp............................ rosa-escuro Ncleos............................................................preto Fundo............................................................amarelo Mtodo de Feulgen para DNA (Feulgen e Rossenbeck, 1924) Solues: A) cido clordrico 1N: cido clordrico................................................8,3 mL gua destilada...............................................91,7 mL B) Metabissulfito de sdio 0,5%. C) Reagente leuco fucsina de Schiff (ver mtodo do cido peridico + reativo de Schiff (PAS)). Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar dos cortes at a gua destilada. 2- Lavar os cortes em cido clordrico 1N em temperatura ambiente.

172 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

3- Transferir para o cido clordrico 1N pr-aquecido, a 60oC para hidrolisar os cortes. O tempo de hidrlise depende do fixador utilizado:
Formaldedo = de 8 a 12 minutos. Bouin = de 5 a 8 minutos. Helly = em torno de 5 minutos.

4- Transferir para a soluo o reagente leuco fucsina de Schiff durante 45 minutos. 5- Lavar em 3 banhos de metabissulfito de sdio 0,5%, de 2 minutos. 6- opcional contracorar com light green 1% durante 1 minuto. 7- Desidratar, clarear e montar. Resultados: DNA.................................................. vermelho-prpura Citoplasma.........................................................verde
Mtodo de Colorao pelo alcian blue em pH 2,5

(Lev. e Spicer, 1964). Solues: A) Soluo de cido actico glacial a 3%. B) Soluo de alcian blue:

alcian blue, 8GX.................1 g


Soluo de cido actico a 3%............................100 mL

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C) Soluo de nuclear fast red (kernechtrot):

Nuclear fast red (kernechtrot) ................0,1 g


Soluo de sulfato de alumnio a 5% .....................100 mL Aquea a soluo lentamente, at ferver. Esfriar e filtrar. Acrescente timol para preservar. Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar at gua destilada. 2- Colocar em soluo de cido actico glacial a 3% e deixar por 3 minutos. 3- Corar na soluo de alcian blue por 30 minutos. 4- Lavar em gua corrente por 10 minutos. 5- Enxaguar em gua destilada. 6- Contracorar com a soluo de nuclear fast red filtrada por 5 minutos. 7- Lavar em gua corrente por 1 minuto. 8- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Mucossubstncias cidas sulfatadas e carboxiladas......... azul escuro Ncleos................................................vermelho a rosa Citoplasma...................................................rosa-plido

174 | Conceitos e Mtodos para a Formao de Profissionais em Laboratrios de Sade

Mtodo de colorao pelo alcian blue, pH 1,0

(Lev e Spicer, 1964) Solues: A) Soluo de cido clordrico 1N: cido clordrico..............................................83,5 mL gua destilada..............................................916,5 mL B) Soluo de cido clordrico 0,1 N: Soluo de cido clordrico 1N..............................10 mL gua destilada..................................................90 mL C) Soluo de alcian blue:

Alcian blue, 8GX...................1 g


Soluo de cido clordrico 0,1 N........................100 mL Procedimento: 1- Desparafinizar e hidratar as lminas at gua destilada. 2- Colocar na soluo cido clordrico 0,1N e deixar por 3 minutos. 3- Corar pela soluo de alcian blue por 30 minutos. 4- Retirar o excesso de corante com papel de filtro. No enxaguar em gua. 5- Desidratar, clarificar e selar. Resultados: Mucossubstncias sulfatadas .....................................azul-escuro

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Notas de biossegurana Ao manipular vrios produtos qumicos para os mtodos de colorao, use mscara com filtro prprio para vapores orgnicos, em local arejado e com exausto. O preparo dessas solues deve ser feito em capela de exausto, evitando sempre o contato com a pele ou a vias respiratrias. Observe a ficha de segurana de cada produto qumico utilizado para os mtodos de colorao, muitos so danosos sade se inalados, engolidos, ou se entrarem em contato com a pele. Nunca descarte as solues corantes ou qualquer soluo preparada para o desenvolvimento das coloraes em esgoto sanitrio convencional, procure saber a poltica de descarte de produtos txicos de sua instituio.
7. Tcnicas imuno-histoqumicas

Os corantes auxiliam o estudo histolgico das caractersticas qumicas teciduais e, no caso de algumas coloraes especiais, destacam regies especficas do tecido ou at mesmo classes de protenas. Contudo, para se identificar alguns elementos teciduais, em situaes normais ou patolgicas, preciso reconhecer certas protenas especficas, o que no possvel por meio das tcnicas histoqumicas. Para tal, recomenda-se a utilizao de mtodos imunohistoqumicos, que, como o prprio nome sugere, renem conhecimentos prprios da imunologia, histologia e qumica. A imuno-histoqumica se baseia na capacidade de certas substncias com afinidade especfica para determinados elementos, isto , anticorpos. Os anticorpos, ao reconhecerem especificamente uma protena-alvo, possibilitam a identificao molecular de elementos teciduais com observao nos diferentes tipos de microscpio. A imuno-histoqumica tem diversas aplicaes como mtodo de auxlio ao diagnstico de doenas inflamatrias, infecciosas e neoplasias, alm de ser utilizada para determinar fatores preditivos e prognsticos no cncer.

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O que so anticorpos?

Os anticorpos (Ac) ou imunoglobulinas (Ig) so um grupo especial de glicoprotenas produzidas naturalmente por clulas do sistema imunolgico de diversas espcies animais e so classificados em cinco isotipos (tipos de imunoglobulinas): IgA, IgD, IgE, IgG e IgM. O antgeno uma substncia que, em condies apropriadas, capaz de estimular a produo de um determinado anticorpo. Quando um antgeno originrio, por exemplo, de bactrias, fungos, vacinas, penetra no organismo, ele reconhecido como elemento estranho, desencadeando uma srie de eventos, como a produo de anticorpos que reconhecero especificamente esse antgeno. O reconhecimento do antgeno pelo anticorpo ocorre de duas formas: qumica, pela afinidade entre essas molculas; e estrutural, pois os anticorpos possuem uma estrutura tridimensional que se adapta perfeitamente estrutura do antgeno, realizando uma ligao designada chave-fechadura. Ao se introduzir um antgeno especfico em um animal, este reagir contra esse antgeno e, aps um determinado tempo, ser possvel isolar anticorpos que reconheam o antgeno do soro desse animal. Os anticorpos so utilizados para determinar a presena desse antgeno em um tecido de outro animal. Atualmente, os anticorpos comercializados por grandes empresas so obtidos a partir de diferentes animais, como, por exemplo: camundongo, rato, coelho, macaco, porco, dentre outros, utilizando metodologias avanadas.
Aplicabilidade do uso de anticorpos

Os anticorpos podem ser utilizados em clulas em cultura, ou em cortes histolgicos de tecidos processados segundo a tcnica de incluso em parafina, em cortes obtidos pelo mtodo de congelao ou ainda includo em resina.

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importante notar que, independentemente do mtodo de processamento histolgico, deve-se ter o cuidado de preservar o antgeno no tecido, evitando modificaes na sua conformao tridimensional ou na composio qumica. A preservao adequada dos antgenos depende de uma boa fixao e de um bom processamento. O fixador utilizado em imuno-histoqumica deve ser capaz de preservar tanto a morfologia tecidual quanto o antgeno, alm de impedir sua extrao e deslocamento durante o processamento do material. No existe o fixador ideal; porm, deve-se conhecer o mecanismo de ao tecidual de cada soluo fixadora para escolher o mtodo de fixao mais adequado. O formol, assim como os demais fixadores aldedicos, ao estabelecer ligaes cruzadas com as protenas teciduais, torna as protenas insolveis na forma de um gel. Essas ligaes formam uma malha que pode impedir a ligao do anticorpo ao antgeno tecidual, alm de mudar a configurao tridimensional dos antgenos. Quanto maior o tempo de fixao, isto , o tempo em que um determinado tecido submetido ao fixador, mais pontes sero formadas. Por essa razo, importante controlar o tempo de fixao necessrio para preservar as estruturas teciduais. Para haver reao entre o antgeno e o anticorpo em materiais fixados por aldedos, necessrio desmascarar os antgenos, desfazendo as pontes intermoleculares formadas durante a fixao. Com esse objetivo, utiliza-se um procedimento denominado recuperao antignica. Existem diversos mecanismos para se recuperar os antgenos em um tecido. A escolha do mtodo ideal depende do tipo de tecido a ser analisado e da prtica do laboratrio. Os principais mtodos de recuperao antignica so:
Mtodo enzimtico, empregando-se enzimas como a tripsina ou pepsina.

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Mtodo fsico-qumico por aquecimento, utilizando-se panela de pres-

so, panela a vapor, banho-maria e micro-ondas, devendo o material ser imerso em uma soluo de tampo citrato ou tris-EDTA.
Mtodo fsico-qumico por sonicao5, isto , realiza-se a sonicao

em tampo citrato ou tampo tris-EDTA. A reao imuno-histoqumica deve ocorrer em temperatura e pH controlados. Por essa razo, as lminas devem ser mantidas em estufa ou geladeira durante o procedimento e os cortes cobertos por uma soluo tamponada. Temperaturas elevadas aceleram a reao entre antgeno e anticorpo, embora diminuam a especificidade do anticorpo ao antgeno. Temperaturas mais baixas diminuem a velocidade da reao, aumentando tal especificidade. Geralmente, na rotina laboratorial, utilizam-se estufas reguladas a 37C em um tempo de reao de 1 hora, ou geladeira a 4C em um tempo de reao de um dia para o outro (over night). A reao imuno-histoqumica tambm pode variar dependendo do pH do meio em que a reao ocorre. Assim, utiliza-se uma soluo de tampo fosfato (PBS) ou tampo tris (TBS) em pH 7,0 para recobrir os cortes durante as lavagens ou para diluir as demais solues. Tampo fosfato (PBS) pH 7,2 0,1M: Fosfato de sdio, dibsico (Na2HPO4), anidro..................1,48 g Fosfato de sdio, monobsico (NaH2PO4), anidro..............0,43 g Cloreto de sdio (NaCl)..............................................7,2 g gua destilada......................................................1000 mL
5

Sonicao o procedimento que utiliza a energia das ondas sonoras, mais comumente o ultrassom, aplicado sobre determinados sistemas qumicos.

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Outro fator que influencia a reao a concentrao do anticorpo. Os anticorpos devem estar diludos em uma concentrao que permita o reconhecimento do antgeno pelo seu respectivo anticorpo, sem haver perda de sua especificidade. Para se encontrar a diluio ideal de cada anticorpo, deve-se proceder a um teste utilizando-se um controle positivo, isto , um material que se tenha conhecimento prvio da sua positividade ao anticorpo que se deseja testar. Assim, usam-se diversas diluies at se encontrar a diluio onde a marcao seja bem evidente e no haja reao inespecfica de modo a mascarar a reao. Para visualizar a reao, os anticorpos devem estar marcados com alguma substncia capaz de exibir cor. Em geral, utiliza-se um anticorpo associado a enzimas que, em etapa posterior, reagiro com substncias cromgenas, ou anticorpos diretamente associados a fluorforos, radioistopos ou ouro coloidal. A tcnica enzimtica mais usual na rotina laboratorial utiliza vrias substncias. Inicialmente, empregam-se anticorpos associados a uma vitamina chamada biotina (anticorpo biotinilado). Esse anticorpo reage com a estreptavidina, uma protena que possui quatro stios de ligao. A estreptavidina que se encontra complexada a trs molculas de biotina ligadas enzima peroxidase reconhecer, atravs de um stio vazio, a biotina presente no anticorpo secundrio. A peroxidase reage com o perxido de hidrognio na presena de 3,3-diaminobenzidina (DAB), que funciona como um doador de eltrons para a reao. O DAB reduzido se precipita no local da reao, sendo o produto dessa reao visualizado como um precipitado castanho (Figuras 25 e 26).

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Figura 25. Repesentao da tcnica imuno-histoqumica indireta. O antgeno presente no tecido reconhecido pelo anticorpo primrio. Um anticorpo secundrio biotinilado se liga ao anticorpo primrio. A estreptavidina se ligar por meio do seu stio livre biotina, que est associada a peroxidase. Uma soluo contendo perxido de hidrognio reage com a peroxidase na presena do DAB, formando um precipitado insolvel castanho no local da reao.
H2O2+DAB H2O2+DAB

Figura 26. Tcnica imuno-histoqumica indireta utilizando o mtodo de estreptavidina biotina-peroxidase revelada por DAB.(A) Marcao nuclear identificando o receptor de progesterona. (B) Marcao citoplasmtica identificando a desmina.

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Existem outros mtodos enzimticos, assim como outros cromgenos, que so relatados em literatura mais especfica. Pode-se tambm utilizar anticorpos associados a fluorforos. As primeiras tcnicas imuno-histoqumicas descritas utilizavam fluorforos associados a anticorpos como marcadores, e so utilizadas at hoje. Diversas substncias so utilizadas com este propsito, como FITC (isotiocianto de florescena), TRICT (isotiocianato de tetrarodamina), Alexa 488, Cy5, dentre outras, mas necessitam de um microscpio de fluorescncia para visualizar a reao, o que torna por vezes esta tcnica mais onerosa. Normalmente, os anticorpos que fazem ligao com os antgenos teciduais (anticorpos primrios) no esto associados a enzimas ou fluorforos. Dessa forma, para visualiz-los, utilizam-se anticorpos secundrios complexados peroxidase ou a fluorforos. Assim, denomina-se esse mtodo como mtodo indireto. Contudo, h anticorpos primrios comerciais j associados com enzimas, e, por essa razo, chama-se esse tipo de reao mtodo direto. A marcao direta diminui o risco de reaes inespecficas pela diminuio de etapas, em contraste com reaes indiretas, que amplificam o sinal facilitando a identificao dos antgenos. Mesmo com o cuidado na escolha da concentrao adequada dos anticorpos e na manuteno da temperatura e do pH, podem ocorrer reaes inespecficas com componentes teciduais carregados eletricamente ou com receptores de imunoglobulinas teciduais. Podemos eliminar essa marcao recobrindo esses stios inespecficos antes da reao com uma soluo contendo albumina e um soro. Soluo de bloqueio de stios inespecficos : PBS....................................................................200 mL Leite em p desnatado....................................................5 g Filtrar a soluo.

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Soluo de uso: Filtrado de leite 2,5%...............................................100 mL Albumina bovina.........................................................2,0 g Soro fetal bovino........................................................8 mL Guardar soluo em geladeira. Outro elemento capaz de causar reaes inespecficas a peroxidase endgena tecidual. Esse problema s ocorre quando o mtodo escolhido o enzimtico, pois o substrato cromgeno reagir tanto com a peroxidase ligada ao anticorpo da reao quanto com a peroxidase tecidual. Nesse caso, devemos inibir a ao da enzima, utilizando uma soluo de perxido de hidrognio (H2O2) 3%. Para garantir a sua qualidade, sempre importante incluir um controle positivo e controle negativo da reao. O controle positivo obtido com um material que sabidamente possui o antgeno analisado. Esse material permitir confirmar, por sua marcao positiva, a qualidade da reao, caso as lminas testadas forem negativas. O controle negativo feito omitindo-se o anticorpo primrio nas lminas testadas, ou utilizando o mesmo isotipo do mesmo animal no qual foi produzido o anticorpo primrio. Assim, com esses cuidados, o resultado da reao permite garantir que as demais etapas da reao no esto reconhecendo inespecificamente nenhum componente tecidual. A seguir, segue uma sugesto de protocolo de reao indireta para material includo em parafina. Nesse procedimento, utiliza-se a panela de presso como equipamento para auxiliar na etapa de recuperao antignica e um anticorpo secundrio biotinilado, isto , associado biotina.

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Protocolo: 1- Aps confeccionar os cortes e aderi-los em lminas previamente tratadas com adesivo, deixar o corte aderir lmina por um dia em estufa 37 oC. 2- Desparafinizar e hidratar as lminas, deixando-as por 5 minutos em cada banho nas respectivas solues (ver pretapa da colorao). 3- Colocar cerca de 2 litros de tampo citrato em pH 6,0 em uma panela de presso. Deixar esquentar e, quando o tampo estiver fervendo, colocar as lminas imersas no tampo e fechar a panela. Quando a panela comear a apitar, deixar por mais 1 minuto e apagar o fogo. Aliviar a presso pela vlvula de segurana da panela e deixar a panela destampada para esfriar um pouco a soluo (cerca de 10 minutos). Aps esse tempo, lavar os cortes em gua corrente por mais 10 minutos. 4- Lavar as lminas por 10 minutos em PBS (tampo fosfato de sdio 0,1M em pH 7,2) trocando o tampo por duas vezes. 5- Incubar com anticorpo primrio de um dia para o outro ( over night) em geladeira a 4C. Cobrir os cortes delicadamente com o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida. 6- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5 minutos. 7- Incubar as lminas por 20 minutos em uma soluo de perxido de hidrognio 3% em PBS. 8- Lavar as lminas em PBS em trs banhos consecutivos de 5 minutos.

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9- Incubar com anticorpo secundrio biotinilado por 1 hora em estufa a 37C. Cobrir os cortes delicadamente com o anticorpo, mantendo as lminas em cmara mida. 10- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5 minutos. 11- Incubar com a estreptavidina-peroxidase por 30 minutos em cmara mida, em temperatura ambiente. 12- Lavar as lminas em PBS em 3 banhos consecutivos de 5 minutos. 13- Incubar as lminas em uma soluo contendo 10mg de DAB diludos em 10 mL de PBS e cerca de 150 mL de perxido de hidrognio 3%. Controlar o tempo de reao ao microscpio, observando o precipitado castanho se formar nos locais onde o anticorpo reagiu. Essa reao pode durar em torno de 3 minutos. 14- Lavar as lminas em gua por 5 minutos. 15- Contracorar as lminas em hematoxilina diluda por 30 segundos. 16- Lavar as lminas em gua corrente por 5 minutos. 17- Desidratar, clarificar e montar. Importante: nunca deixe secar os cortes durante a reao imuno-histoqumica! Notas de biossegurana Durante o procedimento, tomar os cuidados citados anteriormente para o manuseio do xilol e do lcool. Manusear a panela de presso com cuidado para evitar queimaduras ou exploses. Como o DAB um produto altamente txico e tem potencial carcinognico por exposio prolongada, evite respirar o p seco e o contato com a pele ou mucosas e sempre utilize luvas

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e jaleco durante a manipulao. Esse elemento tambm txico para o meio ambiente, despreze a soluo de DAB num frasco plstico e adicione 10 mL de hipoclorito de sdio para cada 100 mL dessa soluo. Procure saber a poltica de descarte de substncias prejudiciais ao meio ambiente de sua instituio.
8. Meios de selagem

Os meios de selagem, comumente chamados montagem, podem ser permanentes ou provisrios. Os meios permanentes so meios resinosos e hidrofbicos, sendo necessria a completa remoo da gua do interior dos tecidos pela desidratao e pela clarificao com o diluente do meio de selagem. Os meios provisrios so meios hidroflicos e no necessitam da remoo da gua dos tecidos, sendo os preparados descartados aps a observao ao microscpio. Meios de selagem hidrofbicos e permanentes Esses meios podem ser sintticos, como o DPX e o Entelan, ou naturais, como o blsamo do Canad ou a goma de Damar. Existem vrios protocolos para diluio desses meios. Citaremos apenas o da goma de Damar. Goma de Damar.................................................200 g Xilol.............................................................100 mL Misturar, e esperar dissolver. Acrescentar mais goma ou xilol caso se queira uma textura mais ou menos viscosa.

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Meios de selagem hidroflicos ou provisrios

Esses meios so utilizados quando os corantes aplicados perdem a sua capacidade tintorial, ou mesmo quando o contedo de determinadas estruturas teciduais se altera quando os tecidos so submetidos a desidratao ou aos meios de selagem que tem o xilol como diluente. A seguir, citamos um dos meios de selagem hidroflicos mais utilizados, a gelatina - glicerina, por ser de baixo custo e de fcil aplicao. Gelatina............................................................10 g gua destilada..................................................60 mL Aquea at que a gelatina esteja dissolvida. Acrescente, depois, 70 mL de glicerina.
9. Artefatos de tcnica

So alteraes das imagens de tecidos quando os preparados histolgicos so observados ao microscpio. Isso pode ocorrer devido a manipulaes fsicas ou qumicas durante as etapas da tcnica histolgica. Os artefatos, por exemplo, podem ser ocasionados por:
dente na navalha de corte, causando fendas; talco na luva utilizada pelo tcnico; precipitado de corantes ou mesmo pigmentos que se depositaram

sobre o tecido;
retrao ou intumescimento tecidual provocado por algum componen-

te qumico do fixador;
autlise associada proliferao bacteriana devido demora em se

fixar o material;
fragmentao e/ou rachadura do tecido provocada por elevao da

temperatura da parafina durante o processamento.

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dobras no tecido formadas durante a microtomia; bolhas provocadas durante a selagem da lamnula sobre o preparado

histolgico.

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