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GENTICA MOLECULAR

Biologia Molecular?
Fuso de trs reas da CINCIA BSICA

Biologia

Biomol Qumica Fsica

Biologia Molecular?
Caractersticas Biolgicas e funcionamento das molculas Mecanismos de

Estuda os aspectos fsicos, qumicos e biolgicos das molculas principalmente macromolculas os cidos nuclicos e seus produtos, as protenas

Biologia Molecular?
Cincia recente com o incio (aproximado) na dcada de 50

Uma cincia bsica que permitiu grandes avanos em cincia aplicada como a Engenharia Gentica e Biotecnologia Parte das metodologias utilizadas em biologia molecular subsdios para outras reas como fisiologia, medicina, fsica, botnica, zoologia dentre outros

CONTEDO PROGRAMTICO

1) cidos Nuclicos: Caractersticas principais 2) O cdigo gentico e controle do fluxo informao gentica 3) Introduo ao DNA recombinante

CONTEDO PROGRAMTICO
1) cidos Nuclicos: caractersticas principais DNA e a informao gentica A dupla hlice do DNA e o dogma central da biologia molecular Estrutura do DNA Topologia do DNA Cromossomos, cromatina e Nucleossomo Replicao do DNA Mutabilidade e reparo de DNA

CONTEDO PROGRAMTICO
2) O cdigo gentico e o fluxo informao gentica Mecanismos de transcrio em procariotos Mecanismos de transcrio em eucariotos Processamento de RNA Mecanismos de traduo Cdigo gentico

CONTEDO PROGRAMTICO
3) O controle da informao gentica Regulao gnica em eucariotos Regulao gnica em procariotos Regulao gnica durante o desenvolvimento

CONTEDO PROGRAMTICO
4) Introduo ao DNA recombinante Aplicaes da biologia molecular Tcnicas de anlise

AVALIAO
3 provas tericas parciais, no cumulativas Apresentao de seminrio Ser considerado aprovado o aluno que obtiver a mdia das notas maior ou igual a 6.0 e frequncia maior ou igual a 75%. A disciplina no oferecer prova substitutiva e sim a possibilidade de uma avaliao complementar (recuperao). Esta avaliao englobar toda a disciplina ministrada no perodo a que se refere. Para participar do processo de recuperao o aluno dever ter obtido nota final igual ou superior a 5,0 e frequncia maior ou igual a 75%.

Alternativamente, podero ser solicitados a realizao de trabalhos de pesquisa extra-classe que contribuiro na mdia de avaliao.

AVALIAO
Prova I 09/11 Prova II 07/12 Prova III 18/01 Alteraes nas datas de prova s sero feitas mediante situaes excepcionais

BIOLOGIA MOLECULAR - CBNC 22


BIBLIOGRAFIA BSICA Bibliografia Bsica: 1. WATSON, J. D.; BAKER, T. A.; BELL S. P.; GANN A.; LEVINE M.; LOSICK R. Biologia Molecular do Gene, 5.edio, Editora Artmed, 2006 2. WATSON, J. D. ; MYERS, R. M.; CAUDY, A. A.; WITKOWSKI, J. A. DNA recombinante, genes e genomas, 3 edio, Editora Artmed, 2008 3. LEWIN, B. Genes IX , Editora Artmed, 2008 Bibliografia Complementar 1. ALBERTS, B. LEWIS, J.; BRAY, D. Biologia Molecular da clula, 4 Edio, Editora Artmed 2004 2. LODISH, H., BERK, A.; MATSUDAIRA P. e colaboradores. Biologia Celular e Molecular - 5 Edio, Editora Artmed

BIOLOGIA MOLECULAR O DNA COMO MATERIAL GENTICO

Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

DNA e RNA forma descritos pela primeira vez em 1869 por F. Miescher (bilogo suo) Isolou um material contendo fsforo do ncleo das clulas no pus descartado de bandagens cirrgicas nuclena
Friedrich Miescher

Relatou que o contedo do ncleo era constitudo de uma poro acdica (DNA) e uma alcalina (histonas)

Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos


A composio qumica do DNA foi determinada em 1909 pelo mdico russo Phoebus Levene no Instituto Rockefeller (bases nitrogenadas, acar e fosfato) e demonstra que estes so polmeros, ou seja, formados por muitas repeties de uma mesma subunidade. Em 1929 Levene tambm estabeleceu que existia uma diferena qumica entre os dois cidos nuclicos, o DNA e o RNA, termos que comearam a ser largamente utilizados. No entanto, Levene morreu em1940, antes que o significado dessas molculas fosse esclarecido.
Phoebus Aaron Theodor Levene

O DNA Como Material Gentico

Durante muito tempo se acreditou que era impossvel que as caractersticas genticas fossem codificadas por uma molcula linear simples formado por somente 4 nucleotdeos como o DNA

Acreditava-se que ele formava um arcabouo para as molculas o qual seria o verdadeiro material gentico Protenas eram consideradas pela maioria grande maioria da comunidade cientfica como o provvel constituinte gentico.

O DNA Como Material Gentico

Em 1928, Frederick Griffith fez uma srie de experimentos com ratos infectados com a bactria Streptococcus Griffith tinha duas linhagens da bactria Streptococcus. A linhagem S (smooth) possuia um envelope de polissacardeo que tornava a aparncia das colnias lisas e brilhantes. A linhagem R (rough) as colnias no possuam este envelope e as colnias tinham uma aparncia opaca e mas rugosa.

Frederick Griffith

O DNA Como Material Gentico

Princpio Transformante -DNA Frederick Griffith - 1928

O DNA Como Material Gentico Em 1931 Oswald Avery, Collin MacLeod e Maclyn MacCarty deram prosseguimento aos experimentos de F. O. Avery C. Macleod Griffith

M. MacCarthy

Os resultados de seus esforos foram publicados em 1941


Romperam clulas S mortas e removeram os lipdeos e carboidratos Dividiram o extrato purificado em trs fraes: Frao 1 + Protease Frao 2 + RNAse Frao 3 + DNAse

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Qual o componente celular responsvel pela informao?

Princpio transformante - Griffiths

O DNA Como Material Gentico

Avery, MacLeod e MacCarty demonstraram que o DNA o material gentico??? Parte do meio cientfico ainda no ficou convencida...

Acreditavam que o DNA era um catalisador para a ativao de genes constitudos de protenas...

No incio dos anos 50 muitos cientistas testavam os bacterifagos Sabiam que o vrus injetava algo na bactria que causava sua propagao O que era injetado DNA ou protena?

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O DNA Como Material Gentico Bacterifagos vrus que infectam bactrias


Compostos unicamente por DNA e protena!
Fagos Cabea

Cauda Fibras da Cauda Clula bacteriana


DNA, Protena ou DNA + Protena?

Bacterifago T2 Infectando uma clula de E. coli

Microscopia eletrnica de transmisso do fago T2 infectando E. coli. O fago T2 utiliza parte da cauda para injetar seu material gentico na bactria

O DNA Como Material Gentico


Lise

Bacterifago T2

Propagao

Injeo do material gentico

Ciclo ltico de um bacterifago *Existe tambm um ciclo denominado de lisognico o material gentico do vrus incorporado ao do hospedeiro

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O DNA Como Material Gentico


Aps o fim da segunda guerra mundial (08/05/1945), diversos fsicos que haviam trabalhado anteriormente com energia nuclear estavam migrando para a biologia Em 1952 Hershey e Chase demonstraram o papel essencial do DNA atravs de experimentos utilizando istopos radiativos
Martha Hershey e Alfred Chase

Eles comearam a trabalhar com bactrias e bacterifagos (ou fagos), o que posteriormente ajudou a fundar a BIOLOGIA MOLECULAR!

O DNA Como Material Gentico

O experimento de Hershey e Chase


Protenas do fago marcadas com 35S
5. Radioatividade encontrada no meio lquido

Centrifugao
1.Cultura de bactrias e infeco por fagos crescidos previamente na presena de 35S 2. Agitao da cultura em um liquidificador capsdio se desprende 3.Radioatividade encontrada nas protenas 4.Separao capsdios no meio lquido bactrias fundo (slido)

Material gentico injetado pelo fago o DNA

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O DNA Como Material Gentico

O experimento de Hershey e Chase


DNA do fago marcado com 32P

5. Radioat. encontrada no meio slido

Centrifugao
1.Cultura de bactrias e infeco por fagos crescidos previamente na presena de 32P 2. Agitao da cultura em um liquidi. capsdio se desprende 3.Radioatividad e encontrada no DNA 4. Separao capsdios no meio lquido bactrias fundo (slido)

Radiao encontrada no interior das bactrias Material gentico injetado pelo fago DNA

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PROVA DEFINITIVA DNA O MATERIAL GENTICO

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Em 1952 quando foi provada que a molcula de DNA era realmente a detentora da informao gentica comeou-se a dar importncia s suas caractersticas qumicas e estruturais

Muitos trabalhos que haviam sido negligenciados comearam a mostrar sua importncia

Em 1938, o fsico britnico William Thomas Astbury (1898-1961), discpulo de Lawrence Bragg, o primeiro a estudar o DNA pela cristalografia por raio X e a estabelecer que sua estrutura apresenta a forma de um longo filamento

William T. Atsbury

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Incio da dcada de 1950 Alexander Robertus Todd, qumico orgnico (Cambridge), determinou como eram constitudos os nucleotdeos Os nucleotdeos que compe o DNA tem como arcabouo um accar: A RIBOSE constituda de cinco carbonos que so numerados, por conveno no sentido anti-horrio da molcula de O presente em seu anel
Alexander Robertus Todd

Nobel 1957

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Pentose acar que possui um anel com 5 tomos. Ligado ao anel h um grupo fosfato, composto de um tomo de fsforo ligado covalentemente a 4 tomos de oxignio

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Os nucleotdeos possuem: Uma base nitrogenada ligada quimicamente a um acar (pentose) e este a um grupo fosfato.

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

As bases nitrogenadas que compe os nucleotdeos possuem anis formados por C-N. Entretanto tamanhos distintos. Pirimidinas possuem um anel enquanto as purinas ocorre um anel fusionado outro.

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Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos Uma diferena entre DNA e RNA ... RNA DNA

Ribose

Desoxiibose

OH

OH

OH

Os carbonos com maior importncia estrutural so:


C1 - Se liga a base nitrogenada C3 OH deste carbono utilizado na ligao fosfodiester

C5 - Se liga o grupamento fosfato

ERRADO!!!!!

Bases Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos Outra diferena entre DNA e RNA ...

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos A.Todd tambm concluiu que estes estavam unidos a grupos fosfatos nas posies 3`e 5` das molculas de desoxirribose, o acar do DNA. Essas ligaes recebiam a denominao de ligaes fosfodister.
Totalmente diferente do modelo anterior ...

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos Em uma A ligao extremidade fosfodiester ela termina tambm com o grupo ocasiona uma P ligado ao carbono 5 polarizao da

molcula DNA.

de

Na outra extremidade termina com OH (ligado do carbono 3 )

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Em 1949 Erwin Chargaff fez uma descoberta espetacular Trabalhando hidrlise de DNA com cromatografia em papel ele determinou que existia uma relao na proporo de purinas e pirimidinas
Erwin Chargaff

Hidrlise DNA

Cromatografia Nucleotdeos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Feita a cromatografia e possvel quantificar a quantidade de cada base 1) Os nucleotdeos no esto presentes em quantidades equivalentes (ex: 25% A, 25% C,...) 2) A propores aleatrias.... relativas no so

A C G T

Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T% Qual a importncia destes dados?

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Ex: em humanos 31% A, 20%C, 20%G e 29T%. 1) A quantidade de bases pricas e pirimdicas so equivalentes: A (31%) + G (20%) ~ 50% T (29%) + C (20%) ~ 50% 2) Existem uma razo entre determinadas purinas e pirimidinas: A (31%) T (29%) ~1 C (20%) G (20%) =1

Portanto existia uma razo 1 entre purinas e pirimidinas Como tambm razo 1 entre A/T e G/C

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos A propores eram verdadeiras somente para espcie humana? Chargaff investigou a proporo para diversas espcies.

A razo 1 entre purinas e pirimidinas Como tambm razo 1 entre A/T e G/C ficaram conhecidas como Regras de Chargaff

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Uma vez que sua importncia foi reconhecida, alm da valorizao e reconhecimento dos trabalhos mencionados, comeou uma corrida para se a investigar como a molcula de DNA estruturada.
A corrida teve envolvimento de vrios grupos extremamente respeitados L. Pauling e Robert Corey CalTech M. Wilkins e R. Franklin Kings College J. Watson e F. Crick Cambrige

Linus Carl Pauling

Nobel 1954 e 1962


Qumica 1954 -Pesquisa sobre a natureza da ligao qumica e sua aplicao elucidao da estrutura das substncias complexas. Paz 1962 - por tentar proibir o uso das armas nucleares

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Em 1953 Pauling publicou um artigo em que proponha a estrutura do DNA com base em dados cristalogrficos No artigo o DNA possua uma tripla hlice!!!!! Pauling... Duas vezes prmio Nobel, descobriu a ordenao de orbitais qumicos, a alfa hlice de protenas... At os gnios erram ...

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Enquanto isso no Kings College

R. Franklin, sob orientao de M. Wilkins, obtinha o padro de difrao de cristais de DNA


Maurice Wilkins e R. Franklin

Gerador de raios X

Cristal de DNA (fibras)

Padro de difrao

Feixe de raios X

Difrao de raios X de fibras de DNA

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Geradores de raios-X

Ou maiores

Equipamentos do tamanho de prdios

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Voltando a Rosalind Franklin e ao padro de difrao obtido

R. Franklin

Difrao de raios X de fibras de DNA

Padro sugeria uma molcula helicoidal

Mas nem R. Franklin nem seu orientador M. Wilkins souberam interpretar os resultados...

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Neste mesmo ano (1953) James Watson e Francis Crick visitaram o laboratrio de M. Wilkins e R. Franklin...

Analisaram os difratogramas
James Dewey Watson e Francis Crick

E proporam uma teoria utilizando os dados de Franklin....

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A interpretao

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

James Dewey Watson e Francis Crick

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Algumas unidades de medida trabalhos de biologia molecular Micro () = 10-6 Nano (n)= 10-9 Angstrons () = 10-10 Pico (p)= 10-12 Femto (f)= 10-15 Atto (a)= 10-18 Zepto (z)= 10-21

utilizadas

em

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

A dupla hlice apresenta raio de 1nm. Distncia entre as bases de 0.34nm.


As bases nitrogenadas pareadas no

centro da molcula e unidas por pontes Pares de bases em posies de H. Sendo que o pareamento A/T equivalentes ocorrem a cada 34nm. possui 2 pontes H e G/C trs. A conformao helicoidal tpica Grupamentos fosfato-acar do produz dois tipos cavidades: menor esqueleto esto posicionados para o (12 ) e maior (22 ) exterior da dupla hlice

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Outro observao de Watson e Crick que as fitas so antiparalelas A extremidades 3 (hidroxila-OH) 5 (fosfato-P) so invertidas nas duas fitas
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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

O modelo prope o pareamento entre purinas e pirimidinas (A/T e C/G)

O pareamento de nucleotdeos semelhantes no se adequa ao dimetro uniforme da hlice de DNA indicado pelos Dimetro da mol. dados de difrao de DNA (2nm/20 A)

Purina + Purina: muito grandes

Pirimidina + Pirimidina: muito pequenas

Purina + Pirimidina: distncia consistente com os dados de difrao de raios-X

Pareamento A/T e C/G): explica as regras de Chargaff!!!!

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Principais caractersticas do DNA descritas por Watson e Crick.

Space Filling Model= Leva em conta o raio atmico= mais prximo do real

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos


"We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest... ...It has not escaped our notice that the specific pairing we have postulated immediately suggests a possible copying mechanism for the genetic material." -James Watson Francis Crick

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Um ms depois...
... Now our model for deoxyribonucleic acid is, in effect, a pair of templates, each of which is complementary to other . We imagine that prior to duplication the hydrogen bonds are broken, and the two chains unwind and separated. Each chain hen acts as a template for the formation on to itself of a new companion chain, so that eventually have two pairs of chains, where we only have one before. Moreover, the sequence of the pairs of bases will have been duplicated exactly.....

Implicaes sem precedentes na histria da gentica!!!! Explicaria como a informao gentica perpetuada

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Neste trabalho Watson e Crick prope que a replicao SEMICONSERVATIVA do DNA Replicao = construo de rplicas de uma molcula

Replicao semiconservativa?

Na dupla fita de DNA, uma fita o exato complemento da outra

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

No momento da diviso celular as fita me serviria de molde para a sntese de uma nova fita dupla A nova dupla fita conteria uma fita recm formada (filha) e uma fita velha (me) Metade dupla fita = velha/Metade dupla fita = nova semiconservativa (sempre conservada uma das fitas me a cada diviso celular)

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Regio do DNA parental

Regio de replicao do DNA: parental. Novos nucleotdeos so pareados com os das fitas parentais

Explica como a informao gentica mantida de gerao para gerao

Regio replicada DNA

do

Fita Me

Fita Filha

Fita Me

Fita Filha

A gentica passaria a tratar as entitades genticas (A/a) como constituintes fsicos

MOLCULA FILHA

MOLCULA FILHA

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Apesar das teorias existiam cticos que questionavam dois pontos bsicos:

1) Seria realmente necessria uma fita molde para a sntese de uma nova molcula de DNA? 2) A replicao do DNA semiconservativa? Arthur Kornberg comeou a trabalhar com extratos bacterianos (E. coli) livres de clulas foi capaz de responder a primeira pergunta

Em 1954 conseguiu isolar uma nova protena que era capaz de replicar o DNA na presena de precursores de alta energia. A esta enzima se deu o nome de DNA polimerase

Arthur Kornberg

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

O experimento de A. Kornberg
Desoxinucleotdeos tri-fosfatados (dATP, dCTP, dTTP e dCTP)

Fita Molde

+
DNA polimerase I

Incubao em tubo de ensaio (replicao in vitro)

Replicas da molcula de DNA

A enzima s conseguia sintetizar novas fitas de DNA na presena de fitas velhas... Demonstra a necessidade de fitas me como molde para a sntese de novas fitas

Arthur Kornberg

Nobel Medicina 1959

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos


E a replicao semiconservativa???

Muitos no acreditavam que a replicao pudesse acontecer como descrito por Watson e Crick. Trs modelos tentavam explicar a replicao do DNA
Modelo Conservativo Clula Parental Primeira Replicao Segunda Replicao As fitas parentais permanecem inalteradas e ambas as duplas fitas filhas so novas As fitas parentais se separam e cada uma serve como molde para uma nova fita complementar Cada dupla fita nova contm uma mistura de partes velhase novas Modelo Semi-conservativo Modelo Dispersivo

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Em 1958 Matthew Meselson e Franklin Stahl descobriram como o DNA se replicava utilizando E. coli. Como todas as bactrias E. coli possui um nico cromossomo (principal) circular Em condies timas E. coli se divide a cada 20 minutos
Matthew Meselson e Franklin Stahl

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Cultura em meio contendo 14N

Cultura em meio contendo 15N

-Denso

Centrifugao do DNA em CsCl 50.000g por 2-3 dias


+ Denso

DNA leve (contendo 14N)

DNA pesado (contendo 15N)

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Cultura em meio contendo 15N

Transferncia para meio contendo 14N

20 min. de cultura

40 min. de cultura

Extrao do DNA

Centrifugao

20 min. de cultura apresentava um DNA de massa intermediria, uma mistura de 14N e 15N

40 min. de cultura apresentava um DNA de massa intermediria , uma mistura de 14N e 15N e outro com somente 14N

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos


Modelo Conservativo Clula Parental Primeira Replicao Segunda Replicao Modelo Semi-conservativo Modelo Dispersivo

Resultado da centrifugao de DNA aps 20min de cultura em 14N Resultado da centrifugao de DNA aps 40min de cultura em 14N

X X

OK!

OK!

OK!

Os resultados de Meselson e Stahl comprovam que a replicao do DNA semi-conservativa

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Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

Graas descobertas efetudas pela descoberta da estrutura do DNA e suas implicaes o pmio Nobel de fisiologia e medicina de 1962 foi para
Interprertao da estrutura do DNA e suas implicaes biolgicas Obteno dos cristais e padro de difrao

James Watson

Francis Crick

Maurice Wilkins

DESCRIMINAO SEXUAL!!!!!!

X
Rosalind Franklin

Caractersticas Bioqumicas e Estruturais dos cidos Nuclicos

E R. Franklin? Afirmou nunca ter entregue seus dados para Watson e Crick... Entretanto o trabalho deles se baseou em seus difratogramas.. Wilkins ou Bragg passaram os dados

Prmio Nobel no pstumo Morreu em 1958 vtima da radiao-X que utilizava em seus trabalhos...

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Aps todos os estudos a comunidade ainda no havia compreendido como a informao gentica poderia estar contida em um alfabeto de apenas quatro letras:

Mesmo com apenas quatro letras, as posies possveis vo depender do tamanho do genoma (4N)- onde N o nmero de letras da seqncia)

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Apesar do DNA conter as informaes para a construo de uma protena estava claro que no era o DNA que construa Diversos trabalhos mostravam a sntese de protenas em locais onde no ocorria o DNA Sntese protica de eucariotos ocorre no citoplasma* enquanto o DNA se encontra isolado no ncleo Deveria haver alguma molcula capaz de transferir a informao existente no DNA para o citoplasma...

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


As atenes foram concentradas para uma segunda molcula de cido nuclico ainda pouco estudada... O RNA Torbjrn Casperson e Jean Brachet, demonstraram que o RNA esta presente em altas quantidades no citoplasma

Clula de Tetrahimena cultivada com Citidina radioativa, todo o RNA sintetizado se encontra no ncleo (partculas negras)

Clula aps doze minutos de transferncia para meio contendo citidina no radioativa, o RNA se encontra no citoplasma

Demonstra que o RNA sintetizado no ncleo e migra para o citoplasma

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


O RNA uma molcula linear, no ramificada, tambm com quatro tipos de nucleotdeos unidos por ligaes fosfodister 3 5 Possui duas diferenas quanto a molcula de DNA 1) O acar uma ribose que difere unicamente por possuir uma hidroxila no C 2

DNA

RNA

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


2) Enquanto o DNA possui a pirmidina Timina no RNA existe a substituio desta base por uma Uracila, a qual tem ausncia de um grupo metila no carbono 5 da base nitrogenada.

Os polirribonucleotdeos assim como os desoxipolirribonucleotdeos podem formar molculas dupla fita


No so usuais, normalmente ocorrem entre duas partes da mesma molcula de RNA fita simples* (muitas vezes possuem carter regulatrio)

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Fcil imaginar uma molcula de RNA como a detentora da mensagem gentica para o citoplasma Em 1958 era de credo geral que a informao presente no DNA cromossmico, servia de molde para a sntese do RNA que se deslocavam para o citoplasma e serviam de informao para a sntese de protena

F. Crick se referiu a este processo como o DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


DOGMA CENTRAL DA BIOLOGIA MOLECULAR
DNA
REPLICAO

Transcrio Transcrio reversa

RNA
REPLICAO

Traduo

Filme
Protena

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Como a informao era passada do RNA Protena? Havia uma teoria simplista que de alguma maneira a molcula de RNA formava invaginaes que reconheceria o aminocido e, de maneira tambm inexplicvel, ligaria uma aminocido outro at formar a protena... F. Crick de incio concordou, mas Como uma molcula muito hidroflica como o RNA poderia interagir com aminocidos altamente hidrofbicos (Gli, Ala, Val, etc..)

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Como distinguiria amino cidos que diferiam por somente uma grupo metila (Gli/Ala, Val/Leu, e Leu/Iso)

Gly

Ala

Val

Leu

Iso

Leu

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


F. Crick props que deveria existir uma molcula adaptadora que era capaz de se ligar ao aminocido e tambm reconhecer as bases no molde de RNA Anos mais tarde trabalhando com extratos proteicos livres foi identificada uma molcula que era capaz de se ligar aos aminocidos antes que estes fossem incorporados a protena A molcula tambm era composta por RNA e foi denominada de RNA Transportador (tRNA ou RNAt) AMINOCIDOTransferido para tRNA por uma classe de enzimas aminoacil sintetase Representa cerca de 10% de todo o RNA da clula

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


RNA transportadores so pequenas molculas de RNA, em a prpria seqncia dos nucleotdeos so capazes de formar pontes de hidrognio intramoleculares resultando em um arranjo espacial complexo com estrutura Brao secundria aceptor
de AA

Representao linear de um RNA transportador. As pontes de H esto em vermelho

Estrtutura tridimensional do RNA transportados de Phe

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Se o RNA somente um transportador de AA onde estava a informo vinda do ncleo que especificava a sntese de protenas? Neste momento as suspeitas da molcula que carregam a informao recaram em outra classe de RNA o RNA ribossomal (rRNA ou RNAr) Constitui aproximadamente 85 % de todo o RNA presnte na clula Entretanto a anlise de ribossomos de E. coli e dados de outros organismos sugeriam que no era o caso

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


As molculas de RNA ribossomomal tambm formam estruturas secundrias atravs de pontes H

rRNA16S (E. coli)

rRNA23S de (E. coli)

Entretanto muito mais complicadas ...

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA

Formando estruturas tridimensionais de grande complexidade ....

Subunidade 16S e 23S do ribossomo de E. coli

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Entretanto a anlise de ribossomos de E. coli e dados de outros organismos sugeriam que no era o caso
1) Os rRNA de E. coli e diversos organismos so compostos por duas subunidades diferentes que podem estar juntas ou separadas no citoplasma. Todas as cadeias de rRNA das subunidades menores apresentam tamanho ~de 1500bases Muito uniformes sabendo que protenas variam muito em tamanho era de se esperar s tamanhos de RNA 2) As subunidades maiores cerca de 3000 bases Muito uniformes 3) As cadeias de rRNA apresentam contedo de G + C muito alto Se sabia que no genoma existia grandes variaes na quantidade de AT/GC o que no se refletia nos rRNAs

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Finalmente clulas de E. coli infectadas com o fago T4 forneceram o sistema para a descoberta da molcula que continha a informao para sntese de protenas Ao infectar as clulas o T4 as clulas de E. coli cessam a sntese de RNA endgeno Sintetizam somente o RNA do T4 Foi constatado que os RNAs de T4 se ligavam a ribossomos e se posicionavam para se ligar aos tRNAs O RNA do fago ento se desloca na superfcie do ribossomo posicionando suas bases para ligao de tRNAs

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Aps demonstrado que este RNA dirigia a sntese de protenas foi detectado representantes da molcula em diversos organismos Por conta de trazer a informao gentica contida no DNA ele foi denominado de RNA mensageiro (mRNA ou RNAm)

mRNA reponde por somente 4-5% de todo o RNA presente na clula Apresenta grandes variaes de tamanho o que condizente com a variao de tamanho existente entre protenas

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Forma estruturas helicoidais, mas raramente estruturas secundrias Foi negligenciado por sua baixa abundncia. Entretanto um RNA pode ser lido por diversos ribossomos

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Desta forma os papeis do diversos tipos de RNA foram elucidados A informao da molcula de DNA segue o seguinte fluxo:

A transferncia da informao RNA protena ocorre no ribossomo

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Ainda restavam perguntas: como a informao gentica presente no DNA e passada para o mRNA traduzida? Francis Crick, Sidney Brenner e Charles Yanosfsky fizeram as primeiras teorias Deveria haver colinearidade entres as molculas de mRNA e as protenas codificadas por estas Grupos de nucleotdeos sucessivos ao longo de uma cadeia de DNA codificavam AA sucessivos na protena

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Como apenas aminocidos ? quatro nucleotdeos especificam 20

Atravs de combinaes especficas Caso dois nucleotdeos = 4 X 4 = 16 possveis combinaes =16 aminocidos ? Caso trs nucleotdeos = 4 X 4 X 4 = 64 possveis combinaes =64 aminocidos ? Quatro nucleotdeos = 4 X 4 X 4 X 4 = 256 possveis combinaes =254 aminocidos / O consenso foi que o mais provvel seria uma trinca de nucleotdeos. 64 aminocidos? Algumas trincas deveriam especificar para o mesmo aminocido...

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Marshal Niremberg e Heinrich Matthei trabalhando com transcrio in vitro comearam a responder as perguntas

Heinrich Matthei e Marshal Niremberg

rRNA (16 e 23S) UUUUUUUU....3)

tRNAs

poli

Uracila

(5

Sintetizava peptdeo Phe-Phe-Phe-...

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Logo aps este experimento o qumico orgnico, Har Gobin Kohrana sintetizou o mRNA 5 AGUAGUAGUAGU 3 O poli mRNA AGU resultava em um peptdeo poliCys Kohrana fez diversos mRNAs sintticos com todas as possibilidades existentes para as trincas
Har Gobin Kohrana

Provou que a trinca de nucleotdeos levava a informao para os 20 AA constituintes da protena 61 dos 64 grupos de trincas possveis codificam AA sendo que a maioria codificada por mais de uma trinca

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Trs trincas polipeptdeos no produziam

Se adicionadas em alguma combinao que gerava polipeptdios fim da cadeia C


Nobel Medicina 1968

As trincas ficaram denomidas de cdons

Cdons que determinavam o fim da cadeia = cdons de terminao

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Quem responde transcrio DNA RNA pela

Hurwitiz e Samuel B. Weiss isolaram uma enzima que era capaz de sinetizar in vitro fitas de DNA utilizando um molde de DNA e nucleotdeos trifosfatados (ATP, CTPG, GTP e UTP) como precursores

Samuel B. Weiss e Jerard Hurwitiz

Aps a sntese a razo AU/GC da fita de RNA era ~igual razo AT/GC ao trecho de DNA utilizado

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA Enzimas capazes de sintetizar molculas de RNA a partir de molculas de DNA so denominadas de RNA polimerases Em bactrias somente uma RNApol sintetiza as trs classe de RNA. Em eucariotos.... Mais complicado!!!!!

A sntese de RNA ocorre sempre em uma direo fixa iniciando na extremidade 5 com trmino em um nucleotdeo 3 (5 3)

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Existe uma polaridade 5 3 na sntese de molculas do RNA (e tambm na replicao do DNA)

Existe polaridade na sntese de protena ???


Carboxi terminal (C-terminal) Amino terminal (Nterminal) ou vice versa?

Esta pergunta foi respondida utilizando uma tcnica de marcao radioativa denominada de pulso ou marcao pulsada

Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA Cultura de reticulcitos de coelho (eritrcitos imaturos) produzindo grande quantidade de e - globina

Tratados com Cys (35S) por alguns segundos

Somente Globinas com cadeias completas foram isoladas e digeridas com Tripsina (K-R) Deteo de radiao dos fragmentos tripticos

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Fluxo da Informao Gentica Contida no DNA


Azulr adioativo

Setas= stios de tripsina

Regio Nterminal baixo teor de radiotividade

Vermelhosem radio

Regio Cterminal alto teor de radiotividade

Sntese proteca N-terminal Carboxi terminal

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