Microbiologia Mdica 2006/2007

Aula Prtica n. 6 Outros mtodos de diagnstico directo: deteco de toxinas; pesquisa de antignios; biologia molecular. Diagnstico indirecto: vantagens e dificuldades.
PROCESSOS IMUNOLGICOS E BIOLOGIA MOLECULAR Compreender os conceitos diagnstico directo e indirecto Compreender os conceitos de antignio e anticorpo Compreender o conceito de anti-soro e descrever modos de produo Descrever o conceito e procedimento geral para a identificao de antignios/anticorpos Compreender tcnicas e procedimentos para deteco de microrganismos por biologia molecular.

SEROLOGIA TEXTO DE APOIO: Introduo Considera-se diagnstico directo aquele em que pesquisado o organismo ou os seus determinantes antignicos ou componentes estruturais (exs: exotoxinas, cpsula polissacardica, cidos nucleicos, etc), constituindo diagnstico indirecto a verificao da resposta imunolgica do hospedeiro. No sentido estrito serologia refere-se determinao de anticorpos no soro do doente, mas num sentido mais lato envolve a determinao quer de antignios quer de anticorpos, tanto no soro como em outros produtos biolgicos, quer at directamente nas culturas. As provas serolgicas baseiam-se, na deteco de reaces antignio-anticorpo. Em relao quantificao de anticorpos sricos para uma determinada substncia (ou microrganismo) dada sob a forma de ttulo, que corresponde ao inverso da maior diluio para a qual a reaco ainda positiva. O ttulo determina-se efectuando diluies seriadas do soro em diferentes tubos (por exemplo a 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32 e assim sucessivamente), e fazendo-os a todos reagir com uma soluo contendo o antignio conhecido. Se, por exemplo, na diluio de 1/16 houve reaco (e em todas as anteriores) e j no houve na de 1/32, diz-se que o ttulo 16. O significado clnico dum determinado ttulo controverso, dependendo do anticorpo em questo (e da sua relao ou no com doena), do estado imunolgico do hospedeiro, do tipo de reaco efectuada e do mtodo utilizado para a sua deteco. Os vrios laboratrios tm valores de referncia ditos "normais" (conceito estatstico), a partir dos quais se considera a prova positiva. Pensa-se que, mais importante do que a constatao isolada de um ttulo elevado, uma subida do ttulo de, pelo menos, quatro vezes entre duas determinaes consecutivas e intervaladas.

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Provas Serolgicas So muito diversificados os mtodos de que actualmente dispomos para detectar as reaces antignio-anticorpo, havendo ainda mtodos no imunolgicos com grande interesse em Microbiologia.

Pela sua importncia, salientam-se as seguintes provas: precipitao; precipitao em gel (imunodifuso radial simples, imunodifuso dupla, imunoelectroforese, contra-imunoelectroforese, electroforese rocket); - aglutinao (aglutinao de partculas de ltex, hemaglutinao); coaglutinao; floculao; - fixao do complemento (em desuso); - IF - imunofluorescncia; - ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay); - RIA (radioimmunoassay) - LAL (teste lisado de Limulus) (em desuso); - neutralizao; efeitos na actividade microbiana; - immunoblotting Precipitao Trata-se de uma reaco em que o antignio e o anticorpo so solveis. A reaco de precipitao indicada pela formao de um precipitado visvel, quando as duas solues se encontram. No entanto, a formao do precipitado pode ser inibida pelo excesso do anticorpo ou do antignio. Este tipo de reaco pode ser usada para a determinao da protena C reactiva. A protena C reactiva uma protena de fase aguda, que se encontra aumentada no soro do doente em vrias patologias inflamatrias, de natureza infecciosa ou no, e que tem a particularidade de reagir com um cido teicico da parede celular do Streptococcus pneumoniae (substncia C). Assim sendo, a sua pesquisa pode fazer-se adicionando ao soro problema essa substncia (a partir de uma cultura de Streptococcus pneumoniae) ou, em alternativa, um anticorpo j preparado anti-protena C reactiva, e observando se h ou no precipitao. As reaces de precipitao so mais sensveis e podem ser melhor observadas se o antignio e o anticorpo difundirem um em direco ao outro num gel de agar, o que constitui a base de diferentes mtodos. Na imunodifuso radial simples, colocam-se concentraes definidas de antignio (ou anticorpo) em pequenos poos abertos numa placa de agar embebido no anticorpo respectivo (ou antignio)formando-se um anel de precipitao cuja rea pode ser determinada. Na imunodifuso dupla, o gel de agar no possui antignio ou anticorpo dissolvidos, estes so colocados em poos abertos na placa. Ambas as substncias, ao difundirem, acabam por se encontrarem e reagirem, observando-se bandas de precipitao.

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Na imunoelectroforese, podem colocar-se os antignios em poos e o anticorpo ao longo de um sulco central no gel de agar, fazendo actuar sobre o conjunto um campo elctrico, o que tambm d origem a bandas de precipitao que podem ser estudadas. A contra-imunoelectroforese efectuada em gel em que o pH escolhido de forma a que o anticorpo est carregado positivamente e antignio negativamente. Aplica-se um campo elctrico ao longo da placa, e forma-se um arco de precipitao. O princpio semelhante ao da imunodifuso dupla, embora a sensibilidade seja 10 a 20 vezes superior. Na electroforese-rocket, aplica-se um campo elctrico a um gel que contm um anticorpo, ao longo do qual se vo deslocar os antignios, que devem ter carga elctrica diferente. Formam-se, assim, colunas de precipitao, de dimenses diferentes de acordo com a concentrao. Aglutinao As reaces de aglutinao tm por base a adsoro de antignios conhecidos a partculas grandes em suspenso (partculas de ltex, bactrias, glbulos rubros, etc.). Colocando essa suspenso em contacto com o soro do doente, verifica-se se este possui o anticorpo em questo, o que se traduz pela aglutinao das partculas, facilmente visvel a olho nu. So exemplos de reaces de aglutinao as reaces de Widal (para Salmonellae), de Wright (para Brucellae) e de Weil-Felix (para Rickettsiae). Nesta ltima no se usam antignios de Rickettsiae pela dificuldade na sua obteno, mas as estirpes OX-2, OX-19, OX-K de Proteus vulgaris, uma vez que se verificou que estas do reaco cruzada com os anticorpos antiRicketsiae. Para alm dos agentes referidos, podem usar-se reaces de aglutinao no diagnstico de diversas outras doenas, bem como na identificao de anticorpos contra parasitas (Plasmodium, Leishmania, Toxoplasma gondii). A aglutinao de partculas de ltex eficaz na deteco de antignios de Streptococci, Cryptococcus neoformans e agentes de meningite bacteriana, sendo ainda usada na pesquisa de anticorpos contra o vrus citomeglico e o vrus da rubola. Na co-aglutinao, h duas reaces de aglutinao em simultneo. Como exemplo, refira-se o uso de estirpes de Staphylococcus aureus como transportadores inespecficos de imunoglobulinas (anticorpos) contra determinados antignios. A maioria das bactrias desta espcie possui uma protena de superfcie (protena A), que tem elevada afinidade para o segmento Fc das imunoglobulinas IgG1, IgG2, IgG4, anticorpos que, por sua vez, se ligam especificamente ao antignio a pesquisar (co-aglutinao). As reaces de floculao so um caso particular de aglutinao, em que as partculas so muito pequenas e, por vezes, apenas visveis ao microscpio. So exemplos de utilizao da floculao (com partculas visveis macroscopicamente) algumas provas serolgicas da sfilis, que se revestem de grande importncia quando no possvel visualizar directamente o agente.

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Fixao do Complemento Nesta reaco, pesquisa-se a presena de anticorpos no soro do doente, colocando-o em contacto com uma soluo conhecida de antignios. Se o doente possuir anticorpos formam-se complexos antignioanticorpo. Adiciona-se depois o complemento, que pode ser fixado (se houver complexos antignio-anticorpo) ou no. Um sistema indicador (por exemplo, eritrcitos sensibilizados ao complemento) diz-nos se houve ou no consumo de complemento. Se houve, no se observam alteraes nos glbulos (reaco positiva); se no houve fixao do complemento, ele vai fixar-se aos glbulos rubros sensibilizados, lisando-os (reaco negativa). Os testes de fixao do complemento, feitos sobretudo em laboratrios de referncia, so teis para o diagnstico de infeces por alguns vrus respiratrios, Influenza A e B, Parainfluenza, Adenovrus e Arbovrus, bem como em algumas doenas fngicas e na febre Q. Imunofluorescncia A imunofluorescncia pode usar-se para pesquisar a existncia de antignios em clulas (eucariotas e procariotas) ou tecidos (imunohistologia). Pode ser directa ou indirecta. Na directa, adiciona-se amostra a estudar uma soluo de anticorpo fluoresceinado (ligado a uma substncia fluorescente). Depois de incubar e lavar, observa-se ao microscpio de fluorescncia, cuja fonte luminosa a luz ultravioleta. A observao de fluorescncia revela a presena do antignio. Na imunofluorescncia indirecta, adiciona-se primeiro um anticorpo especfico para o antignio a pesquisar, visualizando-se depois a reaco atravs da adio de uma anti imunoglobulina fluoresceinada, seguida de incubao, lavagem e observao ao microscpio de fluorescncia. H testes de imunofluorescncia disponveis comercialmente para detectar anticorpos contra Legionellae, Borrellia burgdorferi, Toxoplasma gondii, vrus Varicella zoster, vrus citomeglico, diversos antignios do vrus Epstein-Barr, vrus Herpes simplex I e II, vrus da rubola, Mycoplasma pneumoniae, Treponema pallidum pallidum (FTA-ABS) e vrias Rickettsiae. ELISA O ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) um mtodo semelhante imunofluorescncia, com boa sensibilidade, que usa uma enzima (por exemplo a peroxdase) em vez da substncia fluorescente. Em seguida, adicionado um substracto que muda de cor sob a aco da enzima, fazendo-se a leitura visualmente ou com o auxlio dum espectrofotmetro. Hoje em dia, os sistemas ELISA so largamente usados nos laboratrios de Microbiologia, permitindo a deteco de antignios ou anticorpos em relao a um vasto nmero de agentes infecciosos (bacterianos, fngicos, parasitrios e vricos).

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RIA O RIA (radioimmunoassay) usado essencialmente para pesquisar antignios em amostras sricas (nomeadamente hormonas ou protenas), mas tambm pode ser usado para determinar anticorpos. No diagnstico de doenas infecciosas, usado essencialmente na deteco de antignios ou anticorpos dos vrus de hepatite, enterovrus e Legionella. Os anticorpos do doente (no marcados) competem com anticorpos marcados radioactivamente para os mesmos locais de ligao em quantidades definidas de antignio. A quantificao de anticorpos do doente feita atravs da reduo da radioactividade do complexo antignioanticorpo, quando comparado com um controle em que s existia anticorpo marcado (sem o soro do doente), fazendo-se a leitura da radioactividade numa gama-cmara. O desenvolvimento da imunofluorescncia e dos testes imunoenzimticos (ELISA) vem relegar para segundo plano o RIA, uma vez que torna disponveis testes to sensveis como este ltimo sem os riscos inerentes radioactividade. Teste do lisado de Limulus Em 1964 foi descoberto que a hemolinfa de uma espcie de caranguejo (do gnero Limulus) gelificava na presena de endotoxina, devido existncia de clulas especiais (amebcitos). A partir da desenvolveu-se o teste LAL (Limulus amebocyte Iysate), que identifica endotoxina de bactrias Gram negativas presente nos fludos corporais, sendo altamente sensvel. Efeitos na actividade microbiana H um conjunto de testes que se baseiam na capacidade dos anticorpos inibirem determinada propriedade biolgica dos microrganismos em questo. So exemplos destas tcnicas a neutralizao de toxinas ou enzimas, atravs da anulao da actividade dessas substncias pela reaco antignio-anticorpo, o bloqueio da actividade metablica de microrganismos em cultura, a imobilizao de bactrias flageladas e outras situaes anlogas. No caso particular de vrus citopticos, podem ser pesquisados anticorpos que reduzam a infecciosidade vrica atravs da diminuio da morte celular em culturas de clulas infectadas pelo vrus. A pesquisa do ttulo de anti-estreptolisina O no soro do doente um exemplo de reaco de neutralizao. A estreptolisina O uma das hemolisinas produzidas pelos Streptococci, que induz, no indivduo infectado, a produo de anticorpos (anti-estreptolisina O). A pesquisa fazse colocando o soro do doente (em diluies seriadas, para determinar o ttulo) em contacto com uma quantidade fixa de estreptolisina O e glbulos rubros de carneiro (indicador). A observao de hemlise corresponde primeira diluio em que a quantidade de anticorpos do soro do doente, presentes no tubo, no capaz de neutralizar toda a estreptolisina O, logo, esta vai manifestar-se, da em diante, hemolisando os glbulos.

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Immunoblotting No immunoblotting, as protenas das amostras (antignios) so submetidas a electroforese num gel de poliacrilamida e aps a sua separao so transferidas para uma membrana de nitrocelulose. Esta tratada com o anticorpo marcada com sonda radioactiva. As bandas antignicas que tenham fixado anticorpo so ento visualizadas por auto-radiografia. A tcnica pode ser modificada para que a deteco seja feita por mtodos imuno-enzimticos. BIOLOGIA MOLECULAR A Biologia molecular veio revolucionar o diagnstico em Microbiologia. So objectivos desta aula o domnio de uma linguagem prpria da Biologia molecular anexando-se por isso um glossrio; compreender as vantagens e os inconvenientes desta tecnologia comparativamente metodologia clssica e ainda as suas aplicaes microbiologia. Pretende-se um conhecimento, ainda que superficial, de algumas estratgias utilizadas no diagnstico por biologia molecular Texto de apoio Glossrio DNA sequncia repetitiva de quatro nucleotdeos (adenina, guanina, citosina e timina) dispostas em dupla hlix ligada por pontes de hidrognio (dsDNA); Single strand de DNA (ssDNA) RNA sequncia repetitiva de quatro nucleotdeos (adenina, guanina, citosina e uracilo) dispostas em cadeia simples Desnaturao separao de duplas cadeias por destruio das pontes de hidrognio por calor, pH alcalino Hibridizao processo de reannealing ligao de cadeias de diferentes origens ex: RNA-RNA, RNA-ssDNA, DsDNA-ds-DNA Probe Sonda ou Primer Curta sequncia de cidos nucleicos complementar de regies especficas do alvo resultando numa hibridizao estvel Probe array gene chip coleco de numerosos oligonucleotdos presos a uma superfcie de silicone Extraco mtodo qumico de isolamento de cidos nucleicos Amplicon produto amplificado Genotipagem anlise sequencial dos nucleotdeos Deteco processo de visualizao da reaco

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Escolha do alvo depende do objectivo. Pode detectar gnero, espcie ou at estirpe Alvos de DNA so os mais especficos porque contm regies nicas Alvos de RNA tambm so usados porque h mais cpias de RNA que de DNA o que aumenta a sensibilidade da deteco. RNAm pode tambm ser utilizado com a vantagem de distinguir clulas dormentes de clulas em crescimento activo. RNAr o alvo mais usado em provas de screening. RNAr muito mais conservado (menor variabilidade) que RNAm e h mais cpias que de DNA; excepto nos vrus que no tm RNAr. DNA plasmdico, DNA extracromossmico tambm pode ser usado como alvo; as limitaes que os plasmdeos podem estar presentes em clulas no alvo. Seja DNA ou RNA, o melhor alvo a sequncia de nucleotdeos s presente em clulas alvo - especificidade. Especificidade o alvo deve ser nico e a sonda deve hibridizar especificamente com ele e no consigo prpria ou com locais fora do alvo. No preciso saber as funes da sequncia. Seleco da Probe ou sonda a sua produo muito fcil desde que se conhea o alvo. Probe ideal sequncia de cadeia simples, DNA ou RNA que possa hibridizar com o alvo pretendido isolamento da mesma reproduo em grandes quantidades ligao a compostos de modo a ser detectada Tamanho da probe (sonda): de 10 bases a 10000, o mais frequente de 14 a 40 pares de bases. necessrio o mnimo de 20 nucleotdeos. Sequncias curtas - hibridizao mais rpida, risco de menor especificidade, mais difceis de marcar Sequncias longas - hibridizao mais estvel a altas temperaturas e baixa concentrao de sais Kits comerciais preferem sondas pequenas de rpida hibridizao, longa estabilidade, facilidade de preparao e capacidade de deteco de alteraes menores no alvo Marcao da sonda fundamental que a existncia de hibridizao seja revelada. Os marcadores podem ser incorporados ou ligados sonda: 32P, 35 S, 125I; fosfatase alcalina, peroxidase, biotina revelada por enzimas ligadas avidina, ou ainda a fluorocromo . A marcao radioactiva normalmente mais sensvel mas com mais falsos positivos e com os inconvenientes da radioactividade. Vantagens em relao a outros mtodos

mtodos culturais necessitam manuteno da viabilidade dos microrganismos; dependem da velocidade de crescimento dos mesmos mtodos de deteco antignica menor especificidade

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mtodos serolgicos dependem da resposta imunolgica do hospedeiro; RN /me mtodos de Biologia molecular mais rpidos, mais sensveis, mais especficos

Aplicaes em Bacteriologia, Micologia, Parasitologia e Virologia

Aplicaes nas diversas reas Epidemiologia Diagnstico Follow-up Resistncias a frmacos

Em cada caso comparar com outras tcnicas Estratgias de Hibridizao calor/alto pH dsDNA--------------------------ssDNA " reanneal" RNA-------------------------------RNA Lquida Slida: dot ou blot mais usada

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Mtodos de Amplificao - processo pelo qual mltiplas cpias de cidos nucleicos so produzidos o que aumenta enormemente a sensibilidade da deteco PCR Mullis, 1983; o mtodo de amplificao de cidos nucleicos mais frequentente usado, principalmente de DNA. Trs fases fundamentais :

desnaturao dsDNA em ssDNA primers annealing" ao ssDNA extenso da sntese da cadeia complementar a ssDNA para formar cDNA

necessrio fornecer nucleotdeos e enzimas para a reaco

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LCR Enquanto no PCR se sintetiza molculas de DNA a partir de oligonucleotdeos individuais, aqui usada uma enzima termoestvel que liga 2 oligonucleotdeos imediatamente adjacentes. Desnaturao, annealing e ligao. 20 a 30 ciclos amplifica 10 6 vezes o alvo original variedade: G-PCR gapped-LCR envolve o uso de Taq e Ligase; 2 oligonucleotdeos primers que so anneled ao alvo mas ficam com um espao entre eles que preenchido com a ajuda da Taq.

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Amplificao do sinal bDNA deteco por quemiluminescncia da ligao do alvo ao DNA ramificado; promissora quanto possibilidade de quantificao

DIAGNSTICO INDIRECTO (SEROLOGIA) Objectivos e o texto de apoio consultar a aula n 14 (pg. 45 e seguintes) Execuo prtica Realizar provas de aglutinao para pesquisa e quantificao de anticorpos reaco de Wright, Widal e Weil-Flix Realizar (se possvel) ou apenas observar resultados obtidos com outras tcnicas serolgicas

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