POLIMORFISMO DEL ADN AMPLIFICADO AL AZAR (RAPD)

Un marcador molecular ampliamente utilizado y conocido es el RAPD, ya que es una tcnica fcil de implementar y de bajo costo en comparacin a otros sistemas de marcadores moleculares. Para la implementacin de la tcnica se tuvo en cuenta algunos conceptos bsicos y conocidos, para la reaccin de cadena de la Polimerasa (PCR). Se utiliz la enzima Taq polimerasa PROMEGA y un termociclador PERKIN ELMER 2400. Para la oportunidad de los parmetros de amplificacin se realizaron ensayos con diferentes concentraciones de enzima, primers, dinucletidos y buffer y magnesio variando tambin los tiempos de annealing, extensin, temperaturas y el nmero de ciclos. (En algunos casos el uso de temperaturas altas en el annealing y la extensin o deanturacin pueden perfaccionar a especificidad de amplificacin de las bandas). PROTOCOLO 1. Preparar las soluciones de trabajo: 2. Preparar la mezcla de reaccin para el nmero de reacciones que se deseen correr para un volumen final de 25 ul.

Reactivos Stocks
Taq Polimerasa 5 u/ul 15 uM primer 100 mM dNTP 25 mM MgCl2 10 x buffer de reaccin

Stocks de Trabajo
0.5 u/ul Taq Polimerasa 3 uM primer 2.5 mM dNTP 25 mM MgCl2 10 x buffer ADN (cc opcional)

dNTP MgCl2 Buffer 10 x Agua bidestilada para PCR Taq Polimerasa El el ADN Primer

2 ul c/u 2 ul 2.5 ul 2 ul 3 ul 3.3 ul 4.2 ul ADN y Primer

sern los ltimos en ser adicionados a cada tubo de reaccin. 3. Mezclar bien y dispensar en cantidades iguales en tubos de reaccin para PCR.

4. Colocar los tubos en el termociclador e iniciar el programa PCR para 45 ciclos.

Es necesario trabajar lo ms rpido que se pueda y en envases que contengan hielo. Pre-PCR PCR 94 C x 2 minutos 94 C x 1 minuto 36 C x 1 minuto 72 C x 1 minuto Post - PCR 72 C x 1 minuto 4 C x 5. Terminada la amplificacin retirar los tubos y adicionar 5ul de buffer azul muestra. (tampn de carga) 6. Preparar un gel de agarosa al 1.5 % y cagar las muestras.

7. Terminada la corrida electrofortica colorear con Bromuro de etidio y visualizar las bandas amplificadas en un trans-iluminador de luz UV.

ELECTROFORESIS DEL ADN EN GEL DE AGAROSA

Generalmente los geles contienen 1 y 1.5 % de agar en 0.5X o 1X TAE o TBE para cuantificar ADN o visualizar segmentos de ADN luego del RAPD`s. PREPARACION: 1. Pesar 0.5 gramos de garosa (Sigma) en un matraz de 100 ml. 2. Adicionar 50 ml de 1X TAE o TBE y llevarlo a hervir hasta que se disuelva totalmente, retirar del fuego y dejar enfriar. 3. Verter sobre un molde para una cmara de electroforesis submarina. 4. Insertar el o los peines. 5. Dejar gelificar la agarosa, remover los peines y cubrir el gel con buffer de corrida 0.5X o 1X. 6. Par a faci Precaucin: El Bromuro de Etidio es altamente cancergeno. Debe utilizarse un envase exclusivo, guantes y mandil cuando trabaje con l.

litar la visualizacin de los fragmentos de ADN, puede agregarse 0.5 ug/ml de Bromuro de Etidio al gel.

7. Colocar las muestras para ser sometidas a electroforesis. 8. Prender la fuente de poder y programar con las siguientes condiciones de corrida: 100V, 90 mA y 5 Watts. 9. Dejar correr 2 horas aproximadamente y luego visualizar en un transiluminador de luz UV. 10. Fotografiar.

AISLAMIENTO DE ARN TOTAL DE BACTERIAS (John Heptinstall)

1. INTRODUCCIN La susceptibilidad a la degradacin del ARN por la actividad RNasa exgena y endgena tras la lisis celular ha sido bien documentada (1,2). Por otra parte ARN ocurre generalmente complejos con la protena de la que debe ser puesto en libertad. Precauciones que deben adoptarse contra RNasa exgenos incluyen el uso de guantes de plstico, autoclave soluciones despus de agregar 0.1% (v / v) pirocarbonato dietlico (DEPC, a excepcin de Tris, que reacciona), y manufacturas de vidrio para hornear, esptulas, etc a 180 C noche a la maana (3). El nivel de RNasa endgeno vara segn el tipo de clulas, por lo tanto las precauciones necesarias puede variar. Estos pueden incluir el uso de tiocianato de guanidinio (GuSCN), el fenol, un reactivo tiol (B-mercaptoetanol, ditiotreitol), proteinasa K, un detergente (dodecil sulfato de sodio [lauril], sarkosine N-dodecil [Sarkosyl]), la placenta inhibidor de RNasa (una protena que se encuentra en la placenta [4] y otros tejidos, y se vende bajo diversos nombres comerciales), y complejos de vanadilo ribonuclesidos (5). Algunos de los reactivos (fenoles, detergentes, proteinasa K, GuSCN) tambin simultneamente deproteinize ARN. Para liberar el cido nucleico de una clula bacteriana, las membranas y el peptidoglicano de la dotacin debe ser interrumpido. Normalmente esto es causado por la lisozima o tratamiento con EDTA (6), con EDTA que conduce a una prdida de lipopolisacrido de la membrana externa de bacterias Gram-negativas para permitir el acceso de la lisozima de peptidoglicano. Las condiciones no son siempre de una duracin suficiente para producir esferoplastos, que por completo lisis de las soluciones hipotnicas empleados, a menos que el ADN genmico se requiere. SDS se agrega posteriormente, para inhibir la RNasa, para quitar la membrana citoplasmtica, y tambin la protena que forma un complejo con el ARN. GuSCN se puede agregar en esta etapa, especialmente si la actividad RNasa es alta (7). Tras la adicin de GuSCN, el ARN se pueden separar de las protenas y el ADN con fenol antes de la precipitacin con etanol o isopropanol, aunque en la extraccin del rRNA no hemos encontrado el tratamiento de fenol que es necesario. El pH no debe ser alcalina en vista de la inestabilidad del

ARN, y normalmente es de 7,0 0,2. El fenol puede ser el tratamiento con fenol saturado de bfer solo, o con alcohol, fenol-cloroformo-isoamlico (25:24:1) en el que la separacin de fases posteriores es ms fcil, pero tanto la produccin de ARN en la capa superior y acuosa. Cloroformo solo, sin fenol, se ha recomendado para la extraccin de ARN bacteriana (8). Hemos encontrado esto para dar razonablemente pura ARN, a juzgar por A260/A280, pero muy variable de los rendimientos. El ARN se precipita de la solucin por adicin de 0,1 vol de acetato de amonio 3 M, pH 5.2, y ya sea 2.5 vol de etanol o 1.0 vol isopropanol a -20 C. Por lo general, despus de la lisis celular, en particular lisis si es prolongada o vigorosa, no habr contaminacin por ADN que tambin se precipit en esta etapa. La eliminacin se realizar con RNasa libre de DNasa 1 (ver Nota 1) despus de que el tratamiento de fenol pueden ser necesarias para eliminar la DNasa. Si la lisozima fue utilizado para la lisis celular que se inactiva en presencia de SDS, sin embargo proteinasa K no es, ni siquiera a 50 C. Por lo tanto un mtodo rpido de perturbar los sobres de las clulas bacterianas, inactivacin de RNasa, y la liberacin de ARN, es el uso de proteinasa K y SDS al mismo tiempo (9). Este tratamiento puede ser seguido por GuSCN, si RNasa residuales es un problema, o el tratamiento de fenol, o ambos. Si el tratamiento de fenol se utiliza, proteinasa K se traducir en una reduccin de la precipitacin de protenas blanco en la interfase acuosa / orgnica y rendimientos ms altos de ARN (10). El cido de un solo paso GuSCN mtodo de fenol cloroformo para las clulas eucariotas (11) utiliza GuSCN y mercaptoetanol y Sarkosyl para la lisis celular a un pH de 7.0, seguido de acetato de sodio a pH 4.0 (a Q.2M) y saturado de agua (es decir, cido) fenol . Hemos encontrado con las clulas bacterianas que la ruptura celular se puede llevar a cabo directamente por sonicacin en solucin GuSCN. Esta es rpida, pero no aplicable a los lotes de muestras de forma simultnea y puede dar lugar al corte de alta masa mol-ARN. Polietilenglicol se utiliza para precipitar las partculas intactas del virus (12) y el ADN del plsmido (13) durante la preparacin de ADN plasmdico o viral. Se ha encontrado que, tras la ruptura celular, los restos celulares y el ADN puede ser eliminado mediante la adicin de polietilenglicol y la sal, dejando al ARN en solucin (14). Posteriormente, un sistema acuoso bifsico (15) puede ser producido por la adicin de ms sal (ver Nota 2), en los que el ARN de forma selectiva las particiones en la fase ms baja de sal,. Si esto se hace o no, el ARN puede entonces ser precipitado con o sin tratamiento previo fenol. 2. MATERIALES

Todas las soluciones se preparan en el agua que ha sido previamente esterilizado con 0,1% (v / v) de DEPC. Este ltimo es sospechoso de ser un carcingeno y debe ser manejado con cuidado. Nota: Se debe tener cuidado al manipular GuSCN y SDS, en particular en el estado slido. 1) 5% (w / v) dodecilsulfato sdico (SDS). 2) 6M Guanidinium tiocianato (GuSCN). Filtrar y almacenar hasta tu 1 mes a temperatura ambiente.

3) 4M Guanidinium tiocianato, citrato de sodio 25 mM, pH 7.0, 0, l M B-mercaptoetanol. Filtrar y almacenar hasta mo l a temperatura ambiente. 4) Proteinasa K: 0,5 mg / ml. Alcuotas y almacenar a -20 C 5) Solucin salina fisiolgica, 0,85% (w / v) de NaCl. Autoclave. 6) El polietilenglicol 6000 (PEG) 20% (w / v), 0,75% SDS (w / v) en el 7,5% (w / v) de fosfato de potasio, pH 7,2. Autoclave. 7) Polietilenglicol 6000 (PEG): 12.5% (w / v) en el 1% (w / v) de fosfato de potasio, pH 7,2. Autoclave. 8) 0,12 M de tampn fosfato de sodio, pH 7,2. Autoclave. 9) El fenol, saturado con tampn Q.12M fosfato, pH 7,2. Al fenol (ya sea recin destilada a 165180 C, o para su uso en biologa molecular) en una botella sin abrir, aadir tampn fosfato hasta que la botella este llena. Mezclar suavemente. Aadir 0,05% (w / w de fenol) 8hidroxyquinolina es un antioxidante y permitir la separacin de fases a 4 C. Retire y deseche la capa superior, acuosa y repetir la adicin de amortiguamiento, mezclado y decantacin. Guarde el fenol a-2O C. Nota: El fenol se quema la piel. Si esto ocurre, lavar con 20% (w / v) PEG en el 50% (v / v) industriales alcohol de quemar. 10) Cloroformo (grado AnalaR). 11) 3M de acetato de sodio, pH 5,2. Autoclave. 12) TBE tampn: Tris buffer borato EDTA. 90 mM Tris (hidroximetil)-aminometano, 90 mM de cido brico, 2,5 mM EDTA, pH 8,3. Prepare una solucin stock 10 veces disolviendo 108 g

de base TRIZMA, 55 g de cido brico, y 9,5 g de EDTA disdico en agua, para f L. autoclave. Diluir 10 veces para su uso. 13) Agarosa, el 1,1% (w / v) en TBE. Autoclave. Agarosa se electroendsmosis bajo o medio (EEO). 14) TE bfer: 10 mM Tris-HCl, p H 8.0, 1 mM EDTA. Autoclave. 15) 10% (w / v) sarcosinato sodio dodecil (Sarkosyl). Autoclave. 16) L-caldo. 10 g / L de triptona, 5 g / L de extracto de levadura, 5 g / l de NaCl, 1 g / L de glucosa. Autoclave de glucosa por separado. 3. MTODOS 3.1. Cultivo bacteriano 1) El protocolo est escrito para E. coli B, pero es aplicable a todas las cepas de E. coli probados. Las modificaciones que sean necesarias para otras bacterias (ver Nota 3). 2) Inocular 50 ml de L-caldo de una pendiente y crecer durante la noche, 37 C. Utilice 5 mL de este cultivo para inocular 50 ml de L-caldo y crecer durante 2,5 horas a 37 C, a una absorbancia (600 nm) de 0,45-0,60.

3) Centrifugar una muestra de 1,5 ml en una baera de Eppendorf comer 12.000 g durante l0 minutos. Descartar el sobrenadante. 4) Lavar con solucin salina por resuspender el precipitado en 300 uL de solucin salina, centrifugar a 12.000 g durante 10 minutos y descartar el sobrenadante. 5) Resuspender el precipitado en 400 uL de 0. 1 2 M de tampn fosfato de sodio, pH 7,2. 3.2. Lisis y extraccin con PEG 6000 1) Para el precipitado resuspendido aadir uL de 5% SDS 50 y uL de proteinasa K (0.5 mg / ml) 50. Agitar e incubar a 37 C durante 20 min.

2) Aadir uL de PEG 6000 (12,5% w / v) en fosfato de potasio un 500%, pH 7,2. Vortex y centrifugar a 12.000 g durante 10 min. 3) Cuidadosamente eliminar la mayor parte del sobrenadante, medir el volumen, en un tubo estril para la precipitacin del ARN (vase la nota 2). Si fuere necesario, el fenol puede llevarse a cabo en esta fase (ver subttulo 3.2.7.). 4) Aadir 0,1 vol de acetato de sodio 3M, pH 5,2, seguido por el etanol vol 2.5 (o un volumen de isopropanol) a -20 C para precipitar el ARN. Deja por lo menos durante 1 h. 5) Centrifugar a 12.000 g durante 15 minutos, descartar el sobrenadante, escurrir el tubo cuidadosamente invertir en papel de seda. Lavar el sedimento (que pueden no ser visibles) con el 70% de etanol por resuspensin y centrifugacin a 12.000 g durante 10 minutos. Decantar y secar como se hizo anteriormente 6) Disolver el precipitado en el TE a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos. El rendimiento es de 15 ug de ARN total / mL de cultivo (Fig. 1). La relacin aA260/A280 est en el rango de 1 0.90 a 2.05. 7) En caso de eliminacin de protenas con fenol se requiere (Subttulo 3.2.3.), Aadir de forma secuencial, 0,1 vol de acetato de sodio 3 M, pH 5.2 y un buffer de vol-fenol saturado. Vortex y centrifugar a 12.000 g durante 10 minutos. Quitar la capa superior, acuosa, repetir la extraccin de esta capa con un volumen de fenol, vrtice, centrfuga y retener la capa superior. El ARN puede ser precipitado (Subttulo 3.2.4.) Sin necesidad de aadir ms acetato de sodio (ver Nota 4). No hemos encontrado RNasa endgena de un problema con E. coli y algunos otros organismos (Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella aerogenes), sin embargo, se debe eliminar la actividad deseada, GuSCN debe ser incorporado en la extraccin, ya sea antes o despus de la clula lisis (ver nota 5).

3.3. Lisis y extraccin con GuSCN 3.3.1. Adicin despus de la lisis de la clula

1) Las clulas se preparan y lisis, como en el subttulo 3.2.1. 2) Aadir 750 uL de 6 millones de GuSCN y agitar y centrifugar a un 2000 g durante 10 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. 3) ARN puede ser precipitado directamente en esta etapa, sin contaminacin significativa de protenas, mediante la adicin de 0,1 vol de acetato de sodio y 2,5 vol de etanol fro, como Subttulo 3.2.4. (Fig. 1). 4) Por otra parte, la extraccin de fenol puede llevarse a cabo antes de la precipitacin (Subttulo 3. 2.7.).

Fig. 1. Geles de agarosa del total de los extractos de ARN de E. coli B. precipitado con etanol, pero no fenol-tratados. (A) 1.1% agarosa, alrededor de 2 ug de cido nucleico por carril, carril 1, PEG, calle 2, GuSCN agreg antes de la lisis. (B) 0,7% de agarosa, cerca de 6 ug de cido nucleico por carril, carril 1, 23S ARNr 16S y estndar; carril 2, PEG, calle 3, GuSCN agreg despus de la lisis. Una banda de ADN (no sensible a la RNasa) se puede comprobar entre el ARNr 23S y el pozo en todos los casos se muestran. 3.3.2. Adicin antes de la lisis de la clula. Las bacterias pueden ser lisadas por sonicacin breve en la presencia de GuSCN. El procedimiento posteriormente es entonces el mtodo del cido de un solo paso GuSCN-fenol (11), excepto que se agrega el detergente despus de ultrasonidos para evitar la formacin de espuma. 1) Resuspender el precipitado bacteriano (Subttulo 3.1.4.) En 1 ml de citrato de sodio 4M GuSCN + + B-mercaptoetanol y djelos en remojo durante 20 s. 2) Aadir uL del 10% Sarkosyl y agitar y centrifugar a 12.000 g durante 10 min 50.

3) El ARN puede ser precipitado en esta etapa por la adicin de 0,1 vol de acetato de sodio 2M, pH 4.0 y 2.5 o etanol vol 1 vol de isopropanol a -20 C, seguida por centrifugacin a 12.000 g durante 10 minutos (Fig. 1), o fenol-extrada en presencia de acetato de sodio y cido fenol cido (U) 4) Aadir, secuencialmente, 0.1 vol 2 M de acetato de sodio, pH 4.0, un volumen de fenol saturado en agua y 0,2 vol cloroformo alcohol isoamlico (49:1, v / v) y agitar y centrifugar a 12.000 g durante 10 minutos. 5) El ARN en la fase superior, acuosa se precipit por la adicin de 2,5 vol de etanol o un volumen de isopropanol a -20 C (ver subttulo 3.2.4.). 4. NOTAS 1) DNasa libre de RNasa de algunos proveedores comerciales pueden ser menos que perfecto (16). Alternativamente, varios mtodos de precipitacin selectiva se han descrito para el ARN, incluyendo acetato de sodio 3M (10), 2M LiCl (10), o el 0,5 vol de etanol (7). 2) En esta etapa, con el ARN en PEG / solucin salina, ms PEG y la sal se puede aadir a producir un sistema acuoso bifsico (15), con el ARN sobre todo en la fase de sal ms baja. Por lo tanto, aadir un volumen equivalente de 20% de PEG 6000 + SDS 0,75% en fosfato de potasio 7,5%, pH 7.2, la mezcla durante 30 s, y centrifugar durante 5 min a 12 000 g. La fase superior, el PEG-ricos ocupan alrededor del 80% del volumen total y la sal-rica, la fase ms baja del 20%, pero este ltimo contiene aproximadamente el 80% del total del ARN. 3) Algunos organismos (P. aeruginosa, K. aerogenes) se pueden extraer en las condiciones dadas, mientras que otros que han sido juzgados (Salmonella typyhimiirium. Proteus mirabilis, Serratia marcescens) se requieren cambios en algunas concentraciones de los reactivos, en particular, SDS y / o PEG puede ser mayor. 4) Si el ARN es no precipitarse y se lav, y deben pequeas cantidades de fenol interferir con el tratamiento posterior de la ARN, a continuacin, el fenol puede ser eliminado mediante el lavado con cloroformo. Aadir alrededor de un volumen igual de cloroformo, mezclar y centrifugar muy brevemente, deseche la parte inferior, la capa de cloroformo. Repita por lo menos cuatro veces. El fenol puede afectar la actividad enzimtica y, ciertamente, dar razones A260/A280 falsamente elevados, ya que da un pico a 270 nm (vase el Captulo 12).

5) La eficacia de GuSCN como un inhibidor de RNasa depende de las concentraciones de ambos inhibidor y la enzima. caotrpico efectos no son evidentes a continuacin 3M GuSCN, en algunos casos 5M puede ser necesaria para la inhibicin suficiente (17).