INSTITUTO DE EDUCACIN SUPERIOR TECNOLGICO PBLICO TRUJILLO

LABORATORIO CLNICO III MTODOS Y TCNICAS DE ESTUDIO MICROBIOLGICO I PROFESOR: BLGO. MBLGO. FREDDY VALLEJO LEN ALUMNO (A):

TEMA:

MTODOS DE ESTUDIO DE LOS HONGOS Y OBSERVACIN DE LEUCOCITOS EN SANGRE PERIFRICA TRUJILLO PER 2011

I.

INTRODUCCIN: Los hongos constituyen un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan mediante la absorcin directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que secretan los hongos; despus se absorben a travs de la fina pared de la clula y se distribuyen por difusin simple en el protoplasma. Junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefaccin y descomposicin de toda la materia orgnica. Hay hongos en cualquier parte en que existan otras formas de vida. Algunos son parsitos de organismos vivos y producen graves enfermedades en plantas y animales. La disciplina cientfica que estudia los hongos se llama Micologa. Los hongos figuraban en las antiguas clasificaciones como una divisin del reino Plantas (Plantae). Se pensaba que eran plantas carentes de tallos y de hojas que, en el trascurso de su transformacin en organismos capaces de absorber su alimento, haban perdido la clorofila, y con ello, su capacidad para realizar la fotosntesis. Sin embargo, en la actualidad los cientficos los consideran un grupo completamente separado, que evolucion a partir de flagelados sin pigmentos. Ambos grupos se incluyen dentro del reino Protistas, o bien se coloca a los hongos como un reino aparte, debido a la complejidad de su organizacin. Hay unas cien mil especies conocidas de hongos. Se cree que los grupos ms complejos derivan de los tipos ms primitivos, los cuales tienen clulas flageladas en alguna etapa de su ciclo vital. Las micosis son enfermedades producidas por el crecimiento de un hongo en el organismo o sobre la superficie corporal. En la mayora de la gente sana las infecciones por hongos son leves, afectan slo a la piel, el cabello, las uas, u otras zonas superficiales, y se resuelven espontneamente. Comprenden la tia y el pie de atleta. Sin embargo, en las personas con un sistema inmunolgico deteriorado, este tipo de infecciones, denominadas dermatofitosis, pueden persistir durante largo tiempo. Los organismos responsables de las dermatofitosis pertenecen al gnero Microsporum, Epidermophyton y Trichophyton. Los hongos tambin pueden invadir los rganos internos del organismo, en especial los pulmones, donde las infecciones se parecen a la neumona o a la tuberculosis pulmonar. Son tpicas de enfermos cuyo sistema inmune ha quedado deprimido por procesos como el sndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), frmacos antitumorales, o radiacin. Tambin aparecen en pacientes tratados con hormonas esteroideas, como el cortisol, en sujetos con diabetes y en quienes han seguido tratamiento antibitico durante mucho tiempo. Los dos hongos que se suelen aislar en estos casos son Cryptococcus y Aspergillus, los cuales reciben el nombre de patgenos oportunistas. Los hongos que pertenecen al gnero Candida, en especial Candida albicans (el cual produce candidiasis), pueden infectar los rganos internos y las membranas mucosas de la boca, garganta y tracto genital. En las personas con inmunidad deteriorada, este organismo puede originar una infeccin crnica. Hay muchos frmacos para tratar las infecciones por hongos, entre los que se incluyen medicamentos orales e intravenosos, as como muchos agentes de aplicacin tpica (local). Los individuos con una infeccin crnica por Candida, Histoplasma o Cryptococcus pueden necesitar tratamiento a largo plazo con un frmaco oral o intravenoso. Entre los principales mtodos de estudio de los hongos tenemos los mtodos directos como la observacin macroscpica de la muestra y la observacin microscpica que son el examen en fresco (con hidrxido de potasio, lactofenol, tinta

china o cinta de celulosa), la coloracin diferencial (Gram, Ziehl Neelsen o Giemsa). Tambin se emplean los cultivos (en medios comunes como el agar Sabouraud o en medios mejorados como agar sangre o BHI), inoculaciones en animales (ratones, cobayos, conejos, ratas) y el estudio anatomopatolgico (con coloraciones para tejidos como hematoxilina eosina, cido para amino saliclico). Entre los mtodos indirectos se emplean las intrademoreacciones, reacciones serolgicas (aglutinacin, precipitacin, fijacin de complemento) e inmunofluorescencia. La sangre es sustancia lquida que circula por las arterias y las venas del organismo. La sangre es roja brillante o escarlata cuando ha sido oxigenada en los pulmones y pasa a las arterias; adquiere una tonalidad ms azulada cuando ha cedido su oxgeno para nutrir los tejidos del organismo y regresa a los pulmones a travs de las venas y de los pequeos vasos denominados capilares. En los pulmones, la sangre cede el dixido de carbono que ha captado procedente de los tejidos, recibe un nuevo aporte de oxgeno e inicia un nuevo ciclo. Este movimiento circulatorio de sangre tiene lugar gracias a la actividad coordinada del corazn, los pulmones y las paredes de los vasos sanguneos. La sangre est formada por un lquido amarillento denominado plasma, en el que se encuentran en suspensin millones de clulas que suponen cerca del 45% del volumen de sangre total. Tiene un olor caracterstico y una densidad relativa que oscila entre 1,056 y 1,066. En el adulto sano el volumen de la sangre es una onceava parte del peso corporal, de 4,5 a 6 litros. Una gran parte del plasma es agua, medio que facilita la circulacin de muchos factores indispensables que forman la sangre. Un milmetro cbico de sangre humana contiene unos cinco millones de corpsculos o glbulos rojos, llamados eritrocitos o hemates; entre 5.000 y 10.000 corpsculos o glbulos blancos que reciben el nombre de leucocitos, y entre 200.000 y 300.000 plaquetas, denominadas trombocitos. La sangre tambin transporta muchas sales y sustancias orgnicas disueltas. Las clulas o glbulos blancos de la sangre son de dos tipos principales: los granulosos, con ncleo multilobulado, y los no granulosos, que tienen un ncleo redondeado. Los leucocitos granulosos o granulocitos incluyen los neutrfilos, que fagocitan y destruyen bacterias; los eosinfilos, que aumentan su nmero y se activan en presencia de ciertas infecciones y alergias, y los basfilos, que segregan sustancias como la heparina, de propiedades anticoagulantes, y la histamina que estimula el proceso de la inflamacin. Los leucocitos no granulosos estn formados por linfocitos y un nmero ms reducido de monocitos, asociados con el sistema inmunolgico. Los linfocitos desempean un papel importante en la produccin de anticuerpos y en la inmunidad celular. Los monocitos digieren sustancias extraas no bacterianas, por lo general durante el transcurso de infecciones crnicas. Los objetivos de la presente prctica son: 1. Demostrar la existencia de hongos ambientales. 2. Aislar e identificar algunos hongos ambientales. 3. Familiarizar al estudiante con las principales estructuras fngicas. 4. Aislar e identificar algunos hongos causantes de micosis. 5. Adiestrarse en el diagnstico de laboratorio de algunas micosis. 6. Realizar una coloracin de una muestra de sangre. 7. Conocer las principales caractersticas de los glbulos blancos.

II.

MATERIAL Y MTODOS: A) Materiales: 1. Material Biolgico: Muestras de secreciones, raspados de piel, pelo o cualquier otro fluido biolgico. Muestras de frutas, pan u otro alimento hongueados. Bebida fermentada naturalmente (chicha de jora, vino, etc). Muestras de sangre perifrica. 2. Material de Laboratorio: Placas de Petri. Asa de bacteriolgica. Hisopos estriles. Mechero. Alcohol. Agar Sabouraud. Hidrxido de Potasio al 10%. Solucin salina fisiolgica. Azul de metileno al 1%. Glicerina al 50%. Lminas portaobjeto. B) Procedimiento: 1. Aislamiento de Hongos ambientales: En placas de agar Sabouraud, exponerlas a diferentes ambientes (bao, jardn, laboratorio, etc). Incubar dichas placas a temperatura ambiente por 5 a 7 das. Observar el crecimiento de las colonias anotando sus caractersticas. Realizar observaciones microscpicas de las colonias para identificar el gnero al que pertenecen. 2. Aislamiento de hongos causantes de micosis: Realizar una observacin microscpica de la muestra. Si es secrecin vaginal u otro fludo biolgico se pueden realizar coloraciones Gram o exmenes en fresco, en el caso de raspados de piel o pelo se observan con KOH al 10% (dejar que acte por 20 o calentarlo a la llama del mechero). Hay que tener presente que las levaduras son Gram positivas y que en los dermatofitos se observan hifas artrosporadas. Si alguna observacin es positiva realizar el aislamiento en agar Sabouraud. Los raspados de pelo son colocados en el agar y se incuban a temperatura ambiente observando el crecimiento a los 5 a 7 das y si es una levadura proceder al aislamiento en siembra como en el caso de Laminas cubreobjeto. Azul de lactofenol. Blsamo de canada. Esmalte. Microscopio. Incubadora. Barra de coloracin. Aguja N 21 o lanceta. Algodn. Tubo de microhematocrito. Colorante Wright.

bacterias incubando a 37C por 1 a 2 das o a temperatura ambiente por 2 a 3 das. Realizar observaciones macroscpicas y microscpicas de las colonias para identificar el gnero al que pertenecen. 3. Microcultivo: En placas Petri estriles colocar un recipiente sobre el cual se sostenga una lmina portaobjeto conteniendo una pequea porcin de agar Sabouraud. Luego agregar un inculo de la colonia de un hongo y cubrir con un cubreobjeto. En la placa Petri agregar algodn conteniendo glicerina al 50% para la conservacin de la humedad. Dejar incubar a temperatura ambiental (hongos ambientales). Llevar a la incubadora a 37C, previa eliminacin de algodn con glicerina al 50%, hasta que se sequen las hifas y se adhieran al portaobjeto y cubreobjeto. Observar las lminas al microscopio con azul de lactofenol. Si se desea conservar los preparados se puede agregar blsamo de canada se sellan las lmina cubre y portaobjeto con esmalte. 4. Coloracin de un frotis sanguneo: Realizar una puncin con la aguja N 21 o lanceta en la yema de un dedo previo masaje. Descartar la primera gota de sangre y llenar el tubo de microhametocrito. Colocar una gota de sangre del microhematocrito en uno de los extremos de la lmina de un portaobjetos limpio. Luego colocar sobre la gota la lamina extensora en un ngulo de 30 45, desplazar la lamina extensora hacia atrs permitiendo que la gota se extienda hacia el borde del extensor. Realizar el extendido sobre el portaobjetos en una capa delgada. Dejar secar el frotis al medio ambiente y rotular. Colocar la lamina sobre la barra de coloracin y cubrir completamente con el colorante Wright, agregando la misma cantidad de agua destilada. Mezclar uniformemente por medio de soplos. Dejar reposar el reactivo de 5 a 10 minutos. Lavar con agua corriente. Dejar secar al medio ambiente en forma vertical. 5. Lectura del frotis sanguneo: Se realiza el recuento del frotis en los bordes de la lmina en campo de zigzag. El recuento se hace en base a 100 clulas y se expresa en su valor relativo. Valores normales: Neutrfilos: Abastonados : 2 7% Segmentados : 45 65% Eosinfilos : 1 4%

Basfilos Linfocitos Monocitos III. RESULTADOS:

: : :

0 1% 20 45% 4 8%

IV.

DISCUSIN:

V.

CONCLUSIONES:

VI.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS: BALCELLS, A. 1984. La Clnica y el Laboratorio 13va. Edicin Zaragoza. Espaa. Editorial Marin S.A. CIRSAT, F. 1987. Diagnostico Hematolgico de Laboratorio Clnico 2da. Edicin. Tomo II. GUERCI, A. 1989. Laboratorio Mtodos de Anlisis Clnicos y su Interpretacin. 4ta. Edicin Editorial El Ateneo. Buenas Aires Argentina. INGRAHAM, J. y cols. 1998. Introduccin a la Microbiologa. Tomo I. Edit. Revert, S.A. Barcelona. Espaa. Pgs. 63-73. JAWETZ, E. y cols. 1996. Microbiologa Mdica. 15 edicin. Edit. El Ateneo. Buenos Aires. Argentina. Pgs. 63-71. LYNCH, M. 1987 Mtodos de Laboratorio. Vol. 1era y 2da Edicin. Mxico D.F. Editorial Interamericana S.A. RAMIREZ, R. 1988. Mtodos Prcticos de Laboratorio Clnico Bsico 2da. Edicin. Lima UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA Y PARASITOLOGA.1982. Gua de prcticas. UNT. Trujillo. Per. Pgs.26-29. UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS. FACULTAD DE MEDICINA. 1986. Microbiologa. UNMSM. Lima. Per. Pgs. 8-10. TORTORA, G. y cols. 1993. Introduccin a la Microbiologa. 3 edicin. Edit. Acribia. Zaragoza. Espaa.

VII.

CUESTIONARIO: 1. Seale qu elementos estructurales permiten diferenciar un hongo de una bacteria. 2. Cmo es la observacin microscpica de las hifas y esporas de los siguientes hongos ambientales: Penicillium, Alternaria, Rhizopus y Aspergilus. 3. Seale algunas de las aplicaciones industriales de los hongos. 4. Cul es el mtodo de eleccin rpido y prctico para el diagnstico de ptiriasis versicolor? 5. Qu funcin tiene el hidrxido de potasio al 10% para la observacin de estructuras fngicas en algunas muestras clnicas? 6. Qu estructura permite dar un diagnstico de micosis causad a por Microsporum canis? 7. Qu hongo causante de dermatofitosis produce una pigmentacin roja en el reverso de la colonia? 8. Cul es el procedimiento de trabajo ms til para el diagnstico de esporotricosis? 9. Cul es la importancia del estudio anatomopatolgico en la cromomicosis? 10. Seale las caractersticas macroscpicas y microscpicas de los grnulos maduromicticos. 11. Qu hongo dimorficos patgenos conoce? 12. Cul es el significado del hallazgo en un examen en fresco de la estructura caracterstica de Paracoccidioides brasiliensis? 13. Para el diagnstico de histoplasmosis recomendara ud la inoculacin en ratones Por qu? 14. Qu estructuras microscpicas se observan en una candidiasis? 15. Qu estructura histolgica hace el diagnstico de ficomicosis? 16. Qu ventajas y desventajas existen entre la obtencin de sangre venosa y sangre capilar para los exmenes de sangre? 17. Para realiza un hemograma es necesario que el paciente este en ayunas, fundamente su respuesta? 18. Cules son las partes de un extendido sanguneo, y en qu parte se recomienda realizar la lectura de los tipos de leucocitos, por qu? 19. Qu otros colorantes sirven para colorear un frotis sanguneo para recuento diferencial de leucocitos? 20. Realice un dibujo de las caractersticas morfolgicas y tintreas de los leucocitos?