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1.

INTRODUÇÃO
Existem vários métodos para a quantificação da massa de células e para a
determinação do número de células presentes em uma suspensão. Estes métodos podem ser
diretos ou indiretos.
Entre os métodos diretos podemos citar:
1.1. Gravimetria: Técnica que efetua a secagem e a pesagem de um determinado volume
de suspensão até a obtenção de peso constante.

1.2. Contagem com câmara de Neubauer: Procede-se a contagem de cada célula presente
em uma lamínula com o auxílio de um microscópio, e posteriormente, realiza-se uma
estimativa do número total de células.

Figura 1 – Câmara de Neubauer

Figura 2 – Esquema da Câmara de Neubauer

Já entre os métodos indiretos:


1.3. Turbidimetria: Este método é uma adaptação da espectrofotometria da química analítica
para a utilização na quantificação de células. Ele utiliza os princípios da absorção e da
transmissão de luz, para relacionar o valor absorvido com a concentração de células.

Neste estudo, fizemos uso da Saccharomyces cerevisiae (Figura 3), que é um fungo
eucariote unicelular muito utilizado na fermentação de pães e de cerveja, além de ser usada
para a produção de etanol.

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Figura 3 - Saccharomyces cerevisiae

Esse fungo é utilizado como fermento biológico, por liberar dióxido de carbono, por
exemplo, na massa de pão, fazendo-a crescer. No caso das bebidas alcoólicas produzidas pelo
processo de fermentação, como os vinhos e a cerveja, o Saccharomyces cerevisiae auxilia na
transformação do açúcar em álcool etílico.
É um organismo utilizado como modelo no estudo da Bioquímica, Genética e Biologia
Celular de eucariotas, pois é de fácil manutenção em laboratório e não representa risco a quem
o esta utilizando.

PRÁTICA 1 – QUANTIFICAÇÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA POR GRAVIMETRIA

1. OBJETIVO
Utilizar a técnica da gravimetria para determinar a massa de levedura presente em uma
suspensão.

2. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES


2.1. Pipeta graduada de 10,0 mL;
2.2. Balança Analítica FA – 2104N da BIOPRECISA;
2.3. Pesa – Filtro de forma baixa;
2.4. Erlenmeyer de 125 mL;
2.5. Estufa Quimis;
2.6. Suspensão de levedura (Saccharomyces Cerevisiae) 2% p/v.

3. METODOLOGIA
3.1. Pipetou-se 10,0 mL de uma suspensão de levedura para um pesa – filtro de forma
baixa, previamente tarado.

3.2. Em seguida, efetuou-se a pesagem da suspensão pipetada, e anotou-se o valor


encontrado (1ª Pesagem).

3.3. Levou-se este pesa – filtro para uma estufa, pré-aquecida a 105°C para a secagem da
suspensão.

3.4. Após um determinado tempo dentro da estufa, procedeu-se o resfriamento do pesa –


filtro em um dessecador.

3.5. Realizou-se uma nova pesagem (2ª Pesagem).

3.6. Estes procedimentos foram realizados em triplicata.

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4. RESULTADOS
As massas referentes às pesagens realizadas em cada uma das triplicatas encontram-
se na tabela a seguir:

Tabela 1 – Massas das Pesagens


Tara do Pesa – Filtro 1ª Pesagem 2ª Pesagem
P2 61,9695 g 71,7435 g 62,1448 g
P3 60,4487g 70,3022 g 60,6259 g
P4 58,8677 g 68,6748 g 59,0392 g

4.1. Massa inicial:


m0=1ª Pesagem-TaraPesa-Filtro

P2: m0=71,7435-61,9695=9,7740 g
P3: m0=70,3022-60,4487=9,8535 g
P4: m0=68,6748-58,8677=9,8071 g

4.2. Média da massa inicial:


x=i=13xin
x=9,7740+9,8535+9,80713=9,8115 g

4.3. Massa Seca:


m=2ª Pesagem-TaraPesa-Filtro

P2: m=62,1448-61,9695=0,1753 g
P3: m=60,6259-60,4487=0,1772 g
P4: m=59,0392-58,8677=0,1715 g

4.4. Média da massa seca:


x=i=13xin
x=0,1753+0,1772+0,17153=0,1747 g

4.5. Percentual de massa seca:


% massa seca=mm0×100
% massa seca= 0,17479,8115×100=1,78 %

4.6. Percentual de umidade:


% umidade=m0-mm0×100
% umidade= 9,8115-0,17479,8115×100=98,22 %

5. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS


A amostra utilizada nesta prática foi uma suspensão de levedura, que tende a formar
uma deposição no fundo do recipiente ao qual está armazenado, no caso um erlenmeyer. Para
diminuir o erro causado por este fato, realizou-se a análise em triplicata, para assim obter-se
uma média que foi utilizada nos cálculos de percentual de massa seca e de umidade. Também
procedeu a agitação da amostra antes da retirada das alíquotas, para que houvesse a
ressuspensão da levedura depositada ao fundo.
Através dos resultados apresentados acima, podemos perceber que da alíquota de
10,0 mL da amostra que tem massa total de 9,8115 g apenas 0,1747 g são provenientes de
leveduras, ou de algum outro material que esteja ali presente, tais como, polissacarídeos e
proteínas, o que representa um percentual de 1,78 % de massa seca e de 98,22 % de água
presente na suspensão.
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Este método apresenta algumas limitações que o torna pouco operacional, como por
exemplo: O tempo de demora para a obtenção do resultado que corresponde ao tempo de
secagem do material na estufa; a incapacidade de diferenciar as células viáveis das células
mortas e o fato de quantificar em sua massa seca qualquer outro material que esteja ali
presente como citado posteriormente.

6. CONCLUSÃO
Em virtude do exposto, podemos concluir que apesar de ser um método de simples
realização, ele não fornece resultados com uma grande confiabilidade e tão pouco atende a
demanda de uma grande indústria que requer resultados cada vez mais rápidos, porém,
dependendo do uso que se dê ele atende com satisfação a uma rotina em laboratório.

PRÁTICA 2 – QUANTIFICAÇÃO DA SUSPENSÃO DE LEVEDURA POR TURBIDIMETRIA

2. OBJETIVO
Determinar a massa de levedura presente em uma suspensão de concentração
desconhecida através da utilização do espectrofotômetro.

3. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES


3.1. Pipeta graduada de 2,0 mL;
3.2. Balões volumétricos de 25, 50, 100, 200, 250 e 500 mL;
3.3. Pró-pipete;
3.4. Tubos de ensaio com tampa;
3.5. Espectrofotômetro Unicam 5625 UV/VIS Spectrometer;
3.6. Suspensão de levedura 2% p/v.

4. METODOLOGIA
4.1. De acordo com a tabela a seguir, com o auxílio de uma pipeta graduada prepararam-se
padrões de diferentes concentrações a partir de uma suspensão – mãe de levedura a
2% p/v (base úmida).

Tabela 2 – Preparo dos Padrões


Tubo Diluição Preparo Concentração (Base Úmida)
1 1/25 1 mL em Balão Volumétrico de 25 mL 800 ppm
2 1/50 1 mL em Balão Volumétrico de 50 mL 400 ppm
3 1/100 1 mL em Balão Volumétrico de 100 mL 200 ppm
4 1/200 1 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 100 ppm
5 1/400 0,5 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 50 ppm
6 1/800 0,25 mL em Balão Volumétrico de 200 mL 25 ppm
7 1/1000 0,5 mL em Balão Volumétrico de 500 mL 20 ppm

4.2. Com o auxílio de uma pipeta graduada, diluiu-se a amostra (suspensão de levedura) de
concentração desconhecida a 1/250 mL.

4.3. Após uma intensa homogeneização, transferiu-se cerca de 10 mL de cada uma das
soluções preparadas, incluindo a amostra, para tubos de ensaio com tampa,
previamente identificados.

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4.4. Mantendo-se a agitação de cada tubo, procedeu-se a leitura das absorbâncias dos
padrões e da amostra no comprimento de onda de 570 nm, com a utilização de água
como branco.

5. RESULTADOS
5.1. Cálculo da concentração, em ppm, de levedura em base seca: Para realizar estes
cálculos, foi utilizado o valor de 0,1747 g referente a massa seca de levedura em 10,0
mL de suspensão.

Diluição 1/25:
0,1747 g-10,0 mLx-1,0 mL
x=0,1747×1,010,0=0,01747 g=17,5 mg

17,5 mg-25,00 mLy-1000,00 mL


y=17,5×1000,0025,00=700,0 ppm

Diluição 1/50:
0,1747 g-10,0 mLx-1,0 mL
x=0,1747×1,010,0=0,01747 g=17,5 mg

17,5 mg-50,00 mLy-1000,00 mL


y=17,5×1000,0050,00=350,0 ppm

Diluição 1/100:
0,1747 g-10,0 mLx-1,0 mL
x=0,1747×1,010,0=0,01747 g=17,5 mg

17,5 mg-100,00 mLy-1000,00 mL


y=17,5×1000,00100,00=175,0 ppm

Diluição 1/200:
0,1747 g-10,0 mLx-1,0 mL
x=0,1747×1,010,0=0,01747 g=17,5 mg

17,5 mg-200,00 mLy-1000,00 mL


y=17,5×1000,00200,00=87,5 ppm

Diluição 1/400:
0,1747 g-10,0 mLx-0,5 mL
x=0,1747×0,510,0=0,0087 g=8,7 mg

8,7 mg-200,00 mLy-1000,00 mL


y=8,7×1000,00200,00=43,5 ppm

Diluição 1/800:
0,1747 g-10,0 mLx-0,25 mL
x=0,1747×0,2510,0=0,0087 g=4,4 mg

4,4 mg-200,00 mLy-1000,00 mL


y=4,4×1000,00200,00=22,0 ppm
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Diluição 1/1000:
0,1747 g-10,0 mLx-0,5 mL
x=0,1747×0,510,0=0,0087 g=8,7 mg

8,7 mg-500,00 mLy-1000,00 mL


y=8,7×1000,00500,00=17,4 ppm

Resumindo:

Tabela 3 – Resumo dos Resultados das Concentrações em Base Seca


Tubo Diluição Concentração (Base Seca)
1 1/25 700,0 ppm
2 1/50 350,0 ppm
3 1/100 175,0 ppm
4 1/200 87,5 ppm
5 1/400 43,5 ppm
6 1/800 22,0 ppm
7 1/1000 17,4 ppm

5.2. Curvas Padrões:

Tabela 4 – Dados da Curva Padrão


Tubo Concentração (Base Seca) Absorbância (570 nm)
1 700,0 ppm 1,268
2 350,0 ppm 0,907
3 175,0 ppm 0,489
4 87,5 ppm 0,297
5 43,5 ppm 0,153
6 22,0 ppm 0,084
7 17,4 ppm 0,069

Gráfico 1 – Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura: Este gráfico apresenta o
padrão com diluição 1/25, colocado somente para estudo.

Aplicando-se as fórmulas do Coeficiente Angular e do Coeficiente Linear, pode-se


verificar que estes valores para o gráfico 1, são:

Coef. Ang.= 0,001798744


Coef. Linear = 0,108147607

Gráfico 2 – Curva Padrão de Absorbância contra a Concentração de Levedura: Gráfico utilizado para a
quantificação, pois não apresenta o padrão com diluição 1/25.

Aplicando-se as mesmas fórmulas do Coeficiente Angular e do Coeficiente Linear,


pode-se verificar que estes valores para o gráfico 2, são:

Coef. Ang.= 0,002498479


Coef. Linear = 0,043592901

5.3. Concentração de levedura na Amostra: A absorbância da amostra foi 0,222.


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yA=aε×b×xC
0,222=0,002498479×C+0,043592901
C=71,41 ppm

6. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS


Com a utilização dos resultados obtidos na prática apresentada anteriormente, pode-se
calcular a concentração de levedura em base seca e assim construir uma curva padrão que
atendesse ao objetivo desta prática.
Através da equação da reta desta curva, chegamos ao resultado da concentração de
levedura que foi de 71,41 ppm, um valor que, como o esperado, sem encontra dentro da curva,
o que nos permite ter uma maior confiança nesse valor encontrado.
Foram colocados acima dois gráficos, um contendo um ponto que representa uma
diluição de 1/25 (Gráfico 1) e outro que efetivamente foi utilizado nos cálculos que não
apresenta este ponto (Gráfico 2). Estes gráficos foram colocados para realizar uma
comparação e exemplificar uma das limitações deste método, que é a falta de linearidade que
ocorre em soluções pouco diluídas, devido a um desvio que ocorre na Lei de Beer. Em
soluções muito concentradas passam a ocorrer aglutinações entre as células, isto acaba
alterando a absortividade e conseqüentemente, aumentando o valor da absorbância lida,
levando este valor para a parte do gráfico que não corresponde à faixa linear do mesmo,
causando assim erros grosseiros na leitura e nos cálculos.
Este método possui algumas limitações, como, não ser muito eficiente para soluções
muito concentradas, como foi explicado acima, e não conseguir distinguir células viáveis de
células não-viáveis e tão pouco de outros materiais que possam estar presentes junto das
células.

7. CONCLUSÃO
Podemos concluir que este método de quantificação é de grande rapidez e de fácil
utilização, pois não requer nada além de simples diluições para a preparação dos padrões e da
amostra, e de um espectrofotômetro. É um método que apresenta resultados satisfatórios,
mesmo com as suas limitações.

PRÁTICA 3 – CONTAGEM DE CÉLULAS DE LEVEDURA EM CÂMARA DE NEUBAUER

8. OBJETIVO
Através de um instrumento chamado Câmara de Neubauer, proceder à contagem e
realizar uma estimativa do número de células presentes na suspensão.

9. EQUIPAMENTOS, MATERIAIS E REAGENTES


9.1. Câmara de Neubauer;
9.2. Microscópio;
9.3. Pipeta de 1,0 mL;
9.4. Balão Volumétrico de 250,00 mL;
9.5. Suspensão de Levedura 5% p/v.

10. METODOLOGIA
10.1.Pipetou-se 1,0 mL de uma suspensão de levedura previamente preparada, para um
balão volumétrico de 250,00 mL, completando o seu volume com água destilada até o
traço de aferição.

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10.2.Transferiram-se algumas gotas desta solução para uma Câmara de Neubauer.

10.3.Colocou-se a Câmara de Neubauer em um microscópio e com a utilização do mesmo,


procedeu-se a contagem do número de células presentes na suspensão.

11. RESULTADOS
11.1.Quantidade de células encontradas nas quadrículas:
Quadrícula A1: 33, 33, 34 →x=33+33+343=33,33
Quadrícula A5: 24, 24, 24 →x=24+24+243=24
Quadrícula C3: 26, 22, 22 →x=26+22+223=23,33
Quadrícula D4: 18, 18, 18 →x=18+18+183=18
Quadrícula E1: 27, 27 →x=27+272=27

11.2.Estimativa do número de células de levedura:


nº de células/mL=x×25×FD×104
Onde:
• x é a o somatório do número de células contadas dividas pelo número de quadrados
contados (i=15xin);
• 25 é o número total de quadrados no centro da câmara;
• FD é o fator de diluição usado na preparação da amostra;
• 104 é o fator de conversão de cm3 para mL.

nº de células/mL=33,33+24+23,33+18+275×25×250×104
nº decélulasmL=1,57×109células/mL

12. DISCUSSÃO DOS RESULTADOS


Através do método da contagem com o uso da câmara de Neubauer, determinou-se a
presença de 1,57x109 células por mL de suspensão. Para padronizar esta contagem utilizou-se
da regra do “L”, que convenciona a contagem das células que estão sob a linha tripla, como na
forma de um L, assim quando as células estão naquela região pertencem ao quadrado a que
se está contando e quando as células estão sob o L invertido (outro lado do quadrado)
pertence ao quadrado subseqüente.
Devido à falta de agitação em um equipamento específico, pode-se perceber a
formação de grumos, ou seja, aglutinações entre as células de leveduras, causando assim
alguns equívocos na contagem de quadrículas. Este fato pode ser encarado como uma das
limitações deste método.
Como nos outros métodos, as limitações de não distinguir células viáveis de células
não-viáveis e de outros materiais que possam estar presentes junto das células também se
aplicam neste método. Porém o problema das células viáveis e das não-viáveis pode ser
resolvido com a adição de azul de metileno. Esta técnica consiste em se misturar partes iguais
da suspensão de levedura (amostra), adequadamente diluída, e da solução corante (azul de
metileno). As células com alta atividade fisiológica não se colorem, enquanto as células inativas
(mortas) ficaram coloridas de azul (Figura 3).

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Figura 4 – Determinação da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno.
13. CONCLUSÃO
A partir do que foi apresentado acima, concluímos que este método apresenta ótimos
resultados na determinação do número de células, porém, apresenta um grau de dificuldade
mais elevado que os métodos anteriores, devido ao uso do microscópio e da dificuldade de
contagem das células.

14. REFERÊNCIAS
CONTAGEM DE CÉLULAS EM CÂMARA DE NEUBAUER. Disponível em:
<http://www.icb.usp.br/~bmm/materiais/P3a%20%20Contagem%20de%20celulas%20em%20c
amara%20de%20Neubauer.pdf>. Acessado em: 26/03/2009 às 14h23min.

MÉTODOS DE ANÁLISES E MONITORAMENTO MICROBIOLÓGICO EM LABORATÓRIO DE


DESTILARIA. UNIVERSIDADE FEDERAL DE SÃO CARLOS. AUTORA: SANDRA REGINA
CECCATO ANTONINI. Disponível em: <http://www.cca.ufscar.br/lamam/download/apostila_mo
nitoramento_microbiologico.pdf>. Acessado em: 26/03/2009 às 15h07min.

A. OLIVEIRA LIMA, J. BENJAMIM SOARES, J. B. GRECO, J. GALIZZI, J. ROMEU CANÇADO.


MÉTODOS DE LABORATÓRIO APLICADOS À CLÍNICA. 5ª Ed. – 1977. Editora Guanabara
Koogan.