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Microbiologia Aplicada

Darlene Ana de Paula Vieira Nayara Cludia de Assuno Queiroz Fernandes

INSTITUTO FEDERAL DE EDUCAO, CINCIA E TECNOLOGIA GOIS


Campus Inhumas

Inhumas - GO 2012

Presidncia da Repblica Federativa do Brasil Ministrio da Educao Secretaria de Educao Profissional e Tecnolgica Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois Este caderno foi elaborado em parceria entre o Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois/IFG-Inhumas e a Universidade Federal de Santa Maria para o Sistema Escola Tcnica Aberta do Brasil Rede e-Tec Brasil.
Equipe de Elaborao Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois/ IFG-Inhumas Reitor Paulo Csar Pereira/IFG-Inhumas Diretor Geral Cleiton Jos da Silva/IFG-Inhumas Coordenao Institucional Daniel Aldo Soares/IFG-Inhumas Coordenador de Curso Rodrigo Cndido Borges/IFG-Inhumas Professor-autor Darlene Ana de Paula Vieira/IFG-Inhumas Nayara Cludia de A. Queiroz Fernandes/IFG-Inhumas Equipe Tcnica Renata Luiza da Costa/IFG-Inhumas Shirley Carmem da Silva/IFG-Inhumas Viviane Margarida Gomes/ IFG-Inhumas Comisso de Acompanhamento e Validao Colgio Tcnico Industrial de Santa Maria/CTISM Coordenador Institucional Paulo Roberto Colusso/CTISM Coordenao Tcnica Iza Neuza Teixeira Bohrer/CTISM Coordenao de Design Erika Goellner/CTISM Reviso Pedaggica Andressa Rosemrie de Menezes Costa/CTISM Francine Netto Martins Tadielo/CTISM Marcia Migliore Freo/CTISM Reviso Textual Eduardo Lehnhart Vargas/CTISM Lourdes Maria Grotto de Moura/CTISM Vera Maria Oliveira/CTISM Reviso Tcnica Josiane Pacheco Menezes/CTISM Ilustrao Marcel Santos Jacques/CTISM Rafael Cavalli Viapiana/CTISM Ricardo Antunes Machado/CTISM Diagramao Gustavo Schwendler/CTISM Leandro Felipe Aguilar Freitas/CTISM Muren Fernandes Massia/CTISM

Ficha catalogrfica elaborada por Maria Aparecida Rodrigues de Souza CRB 1/1497 bibliotecria do IFG Campus Inhumas
Vieira, Darlene Ana de Paula V658m Microbiologia Aplicada / Darlene Ana de Paula Veira, Nayara Cludia de Assuno Queiroz Fernandes. Inhumas: IFG; Santa Maria: Universidade Federal de Santa Maria, 2012. 90 p. : il. Bibliografia. Caderno elaborado em parceria entre o Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois/IFG-Inhumas e a Universidade Federal de Santa Maria para o Sistema Escola Tcnica Aberta do Brasil e-Tec Brasil. 1. Microbiologia Aplicada. 2. Acar Processo de Produo. 3. lcool Processo de Produo. 4. Fernandes, Nayara Cludia de Assuno Queiroz. I. Ttulo. CDD 660.62

Apresentao e-Tec Brasil


Prezado estudante, Bem-vindo ao e-Tec Brasil! Voc faz parte de uma rede nacional pblica de ensino, a Escola Tcnica Aberta do Brasil, instituda pelo Decreto n 6.301, de 12 de dezembro 2007, com o objetivo de democratizar o acesso ao ensino tcnico pblico, na modalidade a distncia. O programa resultado de uma parceria entre o Ministrio da Educao, por meio das Secretarias de Educao a Distncia (SEED) e de Educao Profissional e Tecnolgica (SETEC), as universidades e escolas tcnicas estaduais e federais. A educao a distncia no nosso pas, de dimenses continentais e grande diversidade regional e cultural, longe de distanciar, aproxima as pessoas ao garantir acesso educao de qualidade e ao promover o fortalecimento da formao de jovens moradores de regies distantes dos grandes centros geograficamente ou economicamente. O e-Tec Brasil leva os cursos tcnicos a locais distantes das instituies de ensino e para a periferia das grandes cidades, incentivando os jovens a concluir o ensino mdio. Os cursos so ofertados pelas instituies pblicas de ensino, e o atendimento ao estudante realizado em escolas-polo integrantes das redes pblicas municipais e estaduais. O Ministrio da Educao, as instituies pblicas de ensino tcnico, seus servidores tcnicos e professores acreditam que uma educao profissional qualificada integradora do ensino mdio e educao tcnica, capaz de promover o cidado com capacidades para produzir, mas tambm com autonomia diante das diferentes dimenses da realidade: cultural, social, familiar, esportiva, poltica e tica. Ns acreditamos em voc! Desejamos sucesso na sua formao profissional! Ministrio da Educao Janeiro de 2010
Nosso contato etecbrasil@mec.gov.br

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Indicao de cones
Os cones so elementos grficos utilizados para ampliar as formas de linguagem e facilitar a organizao e a leitura hipertextual. Ateno: indica pontos de maior relevncia no texto.

Saiba mais: oferece novas informaes que enriquecem o assunto ou curiosidades e notcias recentes relacionadas ao tema estudado. Glossrio: indica a definio de um termo, palavra ou expresso utilizada no texto. Mdias integradas: sempre que se desejar que os estudantes desenvolvam atividades empregando diferentes mdias: vdeos, filmes, jornais, ambiente AVEA e outras. Atividades de aprendizagem: apresenta atividades em diferentes nveis de aprendizagem para que o estudante possa realiz-las e conferir o seu domnio do tema estudado.

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Tecnologia da Informtica

Sumrio
Palavra do professor-autor Apresentao da disciplina Projeto instrucional Aula 1 Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia 1.1 Normas de segurana e de conduta em laboratrio 9 11 13 15 15

1.2 Materiais e equipamentos usados em laboratrio de microbiologia 17 1.3 Tcnicas de esterilizao e desinfeco de materiais 20

Aula 2 Importncia da microbiologia no processo de produo 23 2.1 Microbiologia na indstria de acar e lcool 23 2.2 Etapas do processamento industrial da cana-de-acar 24 2.3 Anlises rotineiras durante o processamento 27

Aula 3 Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool 31 3.1 Leveduras Saccharomyces 31 3.2 Microrganismos contaminantes 3.3 Antibiticos e bactericidas Aula 4 Meios de cultura 4.1 Classificao dos meios de cultura 4.2 Preparo de meios de cultivo 32 35 39 39 41

Aula 5 Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica 47 5.1 Tcnicas de colorao de microrganismos 47 5.2 Tcnicas bsicas de contagem microbiolgica 49

Aula 6 Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool 55 6.1 Leveduras 55 6.2 Bactrias 60 6.3 Dextrana em caldo 65 6.4 Delta pH 67

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6.5 Acidez sulfrica 6.6 Nvel de floculao 6.7 Teste de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos Aula 7 Microbiologia do acar 7.1 A importncia da microbiologia do acar

67 67 68 73 73

7.2 Principais microrganismos relacionados ao processo de fabricao do acar 74 7.3 Anlises microbiolgicas 79 7.4 Padres internacionais para o controle microbiolgico do acar 85 Referncias Currculo do professor-autor 87 89

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Palavra do professor-autor
Caro aluno! O processo de ensinar e aprender na modalidade de ensino distncia apresenta suas prprias peculiaridades, pressupondo-se uma relao de reciprocidade, na qual o aluno deve participar de forma ativa e dinmica. Este material de estudo representa, portanto, um canal de comunicao elaborado com a finalidade de auxiliar e apontar caminhos para que voc, estudante, possa conduzir seus prprios estudos e construir novos conhecimentos. Nele foram apresentadas informaes bsicas sobre Microbiologia Aplicada e as principais tcnicas voltadas produo de acar e lcool, visando fornecer subsdios para o seu aprendizado e atuao profissional. Cabe voc, como protagonista na construo do seu prprio conhecimento, se empenhar na busca incessante e atualizao das informaes adquiridas, no se atendo somente ao contedo e atividades propostas, mas interagindo e ampliando as idias e conceitos formados. Para isso, voc poder explorar as diferentes mdias propostas no ambiente virtual. Aproveite bem e bons estudos! Um forte abrao. As autoras.

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Apresentao da disciplina
Este caderno de estudos foi elaborado com o intuito de fornecer a voc, estudante, conceitos e tcnicas importantes na rea da Microbiologia Aplicada produo de acar e lcool. Para tornar a exposio dos contedos mais clara e organizada, o material foi dividido em aulas, tratando inicialmente dos princpios bsicos da microbiologia em laboratrio e em seguida das tcnicas especficas aplicadas indstria sucroalcooleira, facilitando assim os seus estudos. A aula 01 fornece noes e regras bsicas de segurana em laboratrio. Apresenta os principais materiais e equipamentos utilizados nesse ambiente de trabalho e as formas de limpeza e desinfeco. Na aula 02 foram apresentadas, resumidamente, as principais etapas do processamento da cana-de-acar. Assim, o estudante poder compreender como a microbiologia pode ser aplicada nos processos de produo de acar e lcool. A aula 03 apresenta os microrganismos comuns ao processo fermentativo e os seus contaminantes. Nela tambm falamos sobre antibiticos e bactericidas, que so utilizados para tratamento das infeces na fermentao. Para que o aluno possa entender melhor cada tcnica a ser utilizada, as aulas 04 e 05 falam sobre meios de cultivo, formas de visualizao e mtodos de contagem de microrganismos, respectivamente. Para concluir, as aulas 06 e 07 tratam especificamente das tcnicas utilizadas para o monitoramento microbiolgico na indstria de acar e lcool, visando garantir a qualidade dos produtos finais.

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Palavra instrucional Projeto do professor-autor


Disciplina: Microbiologia Aplicada (carga horria: 60h). Ementa: Procedimentos bsicos de anlises microbiolgicas aplicadas ao processo de acar e lcool. Testes de seleo de antibiticos e bactericidas. Tcnicas de verificao das reas do processo.

AULA

OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM
Compreender a importncia das normas de segurana em laboratrio e identific-las. Conhecer os principais materiais utilizados em laboratrio de microbiologia. Compreender a importncia da utilizao de medidas de higiene e limpeza em laboratrio, reconhecendo as principais tcnicas utilizadas. Apresentar noes do processo de produo de acar e lcool. Compreender a importncia e aplicao da microbiologia nas diversas etapas de produo de acar e lcool. Apresentar os microrganismos presentes nos processos de produo de lcool. Identificar os principais contaminantes dos processos fermentativos. Apresentar o uso de antibiticos e bactericidas na fermentao. Definir meios de cultivo e apresentar noes dos principais tipos existentes. Caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um. Apresentar o preparo de meios de cultivo importantes utilizados nos processos industriais de produo de lcool e suas aplicaes. Conhecer as principais tcnicas de colorao de microrganismos. Conhecer a tcnica de colorao de Gram e sua aplicao. Conhecer as tcnicas bsicas de contagem microbiolgica.

MATERIAIS

CARGA HORRIA (horas)

1. Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios.

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2. Importncia da microbiologia no processo de produo 3. Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool

Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios. Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios.

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4. Meios de cultura

Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios.

05

5. Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica

Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios.

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AULA

OBJETIVOS DE APRENDIZAGEM
Conhecer as principais tcnicas de monitoramento microbiolgico no processo industrial de produo de lcool, seus objetivos e aplicaes. Apresentar os principais testes de deteco de bactrias e leveduras contaminantes, testes de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos, caracterizao de Bacillus e Lactobacillus, entre outros procedimentos. Conhecer os principais microrganismos contaminantes do acar, suas caractersticas e importncia. Conhecer as principais tcnicas de anlises de bactrias, leveduras e bolores em acar. Apresentar os padres microbiolgicos nacionais e internacionais para qualidade do acar.

MATERIAIS

CARGA HORRIA (horas)

6. Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool

Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios.

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7. Microbiologia do acar

Ambiente virtual: plataforma moodle. Apostila didtica. Recursos de apoio: links, exerccios.

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Aula 1 Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia


Objetivos
Compreender a importncia das normas de segurana em laboratrio e identific-las. Conhecer os principais materiais utilizados em laboratrio de microbiologia. Compreender a importncia da utilizao de medidas de higiene e limpeza em laboratrio, reconhecendo as principais tcnicas utilizadas.

1.1 Normas de segurana e de conduta em laboratrio


O laboratrio de microbiologia deve ser considerado como um local sujeito a possveis fontes de contaminao, bem como aos mais variados tipos de acidentes envolvendo materiais, substncias qumicas e microrganismos, representando, portanto, um risco em potencial para todos os envolvidos no trabalho e manuseio. Para minimizar tais riscos fundamental que se tomem medidas preventivas e que se conhea bem o ambiente de trabalho, para que os acidentes possam ser evitados ou controlados. Portanto, comearemos os nossos estudos apresentando as principais normas de segurana, os materiais mais frequentemente usados em laboratrio de microbiologia e as formas de limpeza e desinfeco. Algumas regras importantes devem ser observadas no exerccio do trabalho em laboratrio: a) No consumir alimentos e bebidas no laboratrio. b) No fumar no laboratrio. c) O laboratrio deve ser mantido limpo e em ordem, devendo ser dele retirados quaisquer materiais que no tenham relao com o trabalho. Livros e outros objetos nunca devem ser deixados sobre a bancada de trabalho.

Aula 1 - Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

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d) Usar obrigatoriamente jaleco no laboratrio, abotoado ou fechado, de maneira a cobrir a maior parte do corpo. e) Lavar cuidadosamente as mos antes e depois do trabalho prtico. f) No levar boca o material de trabalho (lpis, canetas, etc.) e evitar colocar as mos na boca, nos olhos e no nariz. g) Limpar as bancadas de trabalho com lcool a 70% antes e depois do trabalho prtico. h) Usar os equipamentos do laboratrio apenas para seu propsito designado. i) Proteger o cabelo da chama do bico de Bunsen e de contaminao microbiana. j) Nunca pipetar ou sugar diretamente com a boca materiais perigosos, biolgicos, custicos, txicos, radioativos ou cancergenos. Para pipetar, usar pipetadores de borracha ou automticos. k) Transportar os meios de cultura nos suportes prprios. l) Colocar o material contaminado (pipetas, esptulas, lminas e lamnulas) aps a sua utilizao em recipientes prprios contendo desinfetante, para depois ser efetuada a lavagem e esterilizao dos mesmos. m) Relatar imediatamente ao responsvel pelo laboratrio qualquer acidente que provoque leso corporal ou que origine derrame dos microrganismos para fora dos respectivos meios de cultura. n) Aps a quebra de qualquer recipiente contendo microrganismos, cobrir imediatamente o local com soluo desinfetante e toalhas de papel, deixando agir, por no mnimo, 15 minutos. o) No final da atividade, o local de trabalho deve ficar devidamente limpo e arrumado.

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1.2 Materiais e equipamentos usados em laboratrio de microbiologia


Autoclave aparelho usado para esterilizao de meios de cultura, lquidos, etc., atravs do calor mido. Cmara de fluxo laminar remove as impurezas do ar por meio de um filtro absoluto. Aps filtrado e puro, o ar dirigido sobre a rea de trabalho em fluxo direto, mantendo as condies de esterilidade. Banho-maria forma geralmente usada para aquecimento brando (at 100C), em que se utiliza um lquido em ebulio. Estufa de incubao cmara de incubao para colnias de microrganismos. Estufa de esterilizao tipo de forno utilizado para esterilizao, dessecao ou secagem. Balana analtica usada para se obter massas de slidos e lquidos com alta exatido. Bico de Bunsen um bico de gs, alimentado por um tubo de borracha, fixado em uma base metlica com entrada de ar, cuja chama utilizada para tcnicas de flambagem e esterilizao de materiais contaminados. Vidrarias Erlenmeyer, proveta, balo volumtrico, bquer, pipetas graduadas, bureta, placas de Petri, tubos de ensaio, lminas e lamnulas. Outros agitador para tubos; contador de colnias; exaustor; centrfuga; destilador de gua; lavador de pipetas; potencimetro; refrigerador; ala de Drigalski; etc. Microscpio ptico utilizado em observao de imagem ampliada at centenas de vezes por meio de dois conjuntos de lentes: as objetivas, que ficam prximas do objeto, e ampliam a imagem real; e as oculares, prximas do olho do observador, que ampliam a imagem novamente. constitudo por duas partes uma parte mecnica e uma parte ptica. Cada parte engloba uma srie de componentes constituintes do microscpio. A parte mecnica (Figura 1.1) serve para dar estabilidade e suportar a parte ptica. constituda por base ou p, parafusos macro e micromtricos, haste ou brao, mesa ou platina, charriot, presilha, tambor ou revlver das objetivas

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e canho. A parte ptica (Figura 1.1) constituda por fonte de iluminao, lente condensadora ou condensador, boto do condensador, diafragma e pelas lentes oculares e objetivas o conjunto de lentes que permitem a ampliao do objeto. A ampliao dada ao microscpio igual ao produto da ampliao da objetiva pela ampliao da ocular. Devido a estes componentes serem de alta preciso e porque o microscpio um instrumento caro, requer cuidados especiais de transporte, utilizao e manuteno.

Figura 1.1: Partes do microscpio ptico


Fonte: CTISM

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Cmara de Neubauer em microbiologia, comum o uso da cmara de Neubauer, tambm conhecida por lmina hematimtrica ou hemacitmetro. utilizada na contagem de microrganismos visveis ao microscpio ptico, de forma precisa e rpida na quantificao de clulas de leveduras, esporos, bactrias e outras partculas. uma lmina especial de microscopia, mais espessa que uma lmina normal, com marcaes em quadrantes, precisamente divididos em 9 quadrados de 1 mm2 de rea. Como a rea de cada quadrado de 1 mm2, a rea total compreendida pelos 9 quadrados de 9 mm2. Ao se cobrir a lmina com uma lamnula, formado um volume sobre cada quadrado, de 0,1 mm3. O quadrado central dividido em 25 quadrculos de 0,2 mm de lado ou superfcie 0,04 mm2. Estes quadrculos esto subdivididos em 16 retculos de 0,0025 mm2 de superfcie, sendo os quadrculos separados por linhas trplices, chegando-se assim aos 400 retculos. Observando-se ao microscpio, percebe-se que existem trs tipos de quadrantes, com subdivises de tamanhos diferentes, denominados A, B e C, e que juntos formam um quadrado maior (Figura 1.2). O critrio utilizado na escolha do quadrante a ser utilizado na contagem, deve ser o tamanho dos microrganismos que sero quantificados. Assim, microrganismos muito pequenos so contados no quadrante C, os de tamanho intermedirio no quadrante B, enquanto os grandes so contados no quadrante A.

Para saber mais sobre contagem de clulas em cmara de Neubauer, acesse: http://bervieira.sites.uol.com.br/ neubauer.htm

Figura 1.2: Lmina hematimtrica ou cmara de Neubauer


Fonte: CTISM

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1.3 Tcnicas de esterilizao e desinfeco de materiais


Em microbiologia importante a esterilizao de meios, solues e material de vidro ou metal que se utiliza. Um produto microbiologicamente estril quando no contm nenhuma forma de microrganismo vivo. Para tal objetivo podem ser utilizados tanto meios fsicos (como calor, radiaes ionizantes e filtrao), como agentes qumicos, (como gs, xido de etileno, lcool etlico a 70%, etc.). O calor um dos agentes fsicos mais prticos e eficientes utilizados em tcnicas de esterilizao e/ou desinfeco. O calor pode ser empregado por meio do controle do tempo e da temperatura, sob duas formas: seco e mido.

esterilizao Destruio ou remoo de todas as formas de vida, inclusive esporos, atravs de agentes fsicos ou qumicos. desinfeco Processo que promove a inibio, morte ou remoo de vrios microrganismos, na forma vegetativa, (patognicos ou no) em objetos inanimados, sem eliminar todas as formas de vida.

1.3.1 Calor seco


Incinerao processo drstico de eliminao de microrganismos, que destri o produto. Ao rubro processo onde os materiais so levados incandescncia, promovendo a destruio de todos os microrganismos. Flambagem processo onde o material submetido diretamente ao fogo, seja seco ou embebido em lcool. Bastante utilizado na desinfeco de alas de vidro. Estufa esterilizante amplamente utilizado para vidrarias e outros materiais, submetidos determinada temperatura. Por meio da utilizao do bico de Bunsen, atravs do calor seco, pode-se proceder esterilizao mantendo-se a pea na chama at se tornar incandescente. As bocas de frascos de vidro contendo os meios de cultura, devem sempre que destapados ser chamuscados chama do Bunsen, por meio da tcnica de flambagem, sem deixar que se tornem rubros. A esterilizao por calor seco pode se dar ainda por exposio prolongada numa estufa a 160C por no mnimo 45 minutos, a 170C por 18 minutos ou 180C por 7 minutos e meio. Este tipo de esterilizao utilizada para vidrarias, metais, placas de Petri, etc., mas no muito efetivo contra bactrias e fungos que produzem esporos resistentes secura.

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1.3.2 Calor mido


Outra forma de esterilizao pode-se dar atravs do uso da autoclave, para meios contaminados com culturas de bactrias. Utiliza-se este tipo de esterilizao pelo calor mido para meios de cultura e diversas solues. Seu funcionamento se d semelhantemente ao da panela de presso, no qual a gua ferve sob presso de 1,0 atm, sendo a temperatura necessria para esterilizao de 121C, e o tempo de esterilizao de cerca de 15 a 30 minutos. O calor mido inativa as bactrias por desnaturao das protenas e cidos nuclicos, enquanto o calor seco provoca a oxidao destas. O vapor dgua tem maior poder de penetrao do que o ar, tendo maior capacidade de rompimento das pontes de hidrognio. Devido a isso, o calor mido pode ser considerado um processo mais eficiente do que o calor seco. Placas de Petri de plstico com culturas, bem como outro material de plstico utilizado, aps autoclavagem devem ser colocados em sacos de plstico e enviados para incinerao. Vidrarias contaminadas, por sua vez, aps autoclavagem devem ser lavadas com detergente neutro, rigorosamente enxaguadas, passando por gua destilada e secadas em estufa. Para limpeza de materiais de vidros difceis de serem limpos com solventes orgnicos, utiliza-se soluo sulfocrmica (soluo de bicromato de potssio a 3% + cido sulfrico concentrado). As pipetas de vidro utilizadas no laboratrio devero ser imersas em lquido desinfetante e posteriormente lavadas e autoclavadas. Alguns instrumentos como tesouras, pinas, etc., podem ser desinfetados mergulhando-os em lcool a 70% (70 ml de etanol absoluto e 30 ml de gua destilada). As bancadas tambm podem ser desinfetadas utilizando-se este produto. Em condies ideais, o laboratrio deve ser isolado, ou ento o trabalho dever ser realizado dentro de uma cmara de fluxo laminar.
Para saber mais sobre materiais e equipamentos de laboratrio, sua limpeza e desinfeco, acesse: http://recife.ifpe.edu.br/recife/ manual_microbiologia_5_ ed_2007_final.pdf

Resumo
Nessa aula, estudamos alguns aspectos bsicos envolvidos em um laboratrio de microbiologia, como: as principais normas de conduta e regras de segurana, os materiais e equipamentos utilizados nesse ambiente e as formas de limpeza e desinfeco de materiais. A fixao desses conceitos

Aula 1 - Tcnicas bsicas utilizadas em microbiologia

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importante para o desenvolvimento de um bom trabalho no laboratrio, minimizando assim os riscos de acidentes e garantindo a eficincia das prticas e de seus resultados.

Atividades de aprendizagem
1. Fale sobre a importncia de se observar normas de conduta no ambiente de trabalho do laboratrio de microbiologia. 2. Cite cinco medidas de segurana a serem seguidas em laboratrio. 3. Cite cinco materiais utilizados em laboratrio e descreva suas aplicaes. 4. Diferencie esterilizao e desinfeco. 5. Quais as formas que o calor pode ser utilizado para esterilizao e desinfeco de materiais? Exemplifique. 6. Qual forma de utilizao do calor pode ser considerada mais eficiente? Explique.

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Aula 2 Importncia da microbiologia no processo de produo


Objetivos
Apresentar noes do processo de produo de acar e lcool. Compreender a importncia e aplicao da microbiologia nas diversas etapas de produo de acar e lcool.

2.1 Microbiologia na indstria de acar e lcool


O caldo de cana utilizado como matria-prima na produo de acar e lcool normalmente apresenta uma ampla e variada microbiota, devido associao de caractersticas consideradas fundamentais para o desenvolvimento da maioria dos microrganismos, como: alto teor de nutrientes orgnicos e inorgnicos, gua, pH e temperatura favorveis. No entanto, no decorrer de todas as etapas do processamento da cana o nmero de bactrias no caldo pode aumentar significativamente. Vrios fatores podem influenciar nesse processo como: a qualidade da matria-prima (cana), o tempo prolongado entre o corte e a moagem, o tempo de queima, a forma de colheita, que pode ser manual ou mecanizada, determinando a quantidade de terra agregada, o armazenamento, as condies e variaes climticas, e at mesmo a falta de higienizao nos equipamentos que ficam em contato com o caldo. Durante essas etapas, a cana pode sofrer leses que favorecem a penetrao de microrganismos nos colmos, agravando o problema. Essa contaminao do mosto, embora muito comum, consiste em um problema srio nas usinas de acar e lcool, que pode representar reduo no rendimento e na produtividade da fermentao. Isso ocorre devido formao de diversos compostos indesejveis provenientes do metabolismo desses microrganismos, com degradao da sacarose e formao de cidos orgnicos que ocasionam perda de acar e intoxicao das leveduras, alm da perda do rendimento do lcool produzido, representando prejuzos importantes para a indstria.

mosto Lquido apto a ser fermentado. sacarose Dissacardeo (acar) composto por duas molculas de acar simples (glicose + frutose). Basicamente, a sacarose o principal componente da cana-de acar.

Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo

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sanitizao Processo que leva reduo dos microrganismos, a nveis seguros, de acordo com os padres de sade pblica (elimina 99,9% das formas vegetativas).

O laboratrio de microbiologia dentro da usina de acar e lcool tem, portanto, um papel fundamental no controle de qualidade, desde a matria-prima at o produto final. Por meio de tcnicas adequadas, possvel minimizar perdas, prever e solucionar eventuais acidentes no processo de fermentao (infeco, morte de leveduras, floculao, etc.), avaliar as caractersticas do fermento utilizado nas dornas, manter a limpeza e sanitizao durante todas as fases de processamento, realizar testes microbiolgicos nos produtos finais (acar e lcool), contribuindo assim para o aumento na qualidade e rendimento do processo industrial.

2.2 Etapas do processamento industrial da cana-de-acar


Atualmente predomina no Brasil, entre as usinas mais avanadas, um modelo de produo simultnea de etanol e acar, a partir da mesma matria-prima: a cana-de-acar.

Figura 2.1: Fluxograma de produo de acar e lcool


Fonte: CTISM

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2.2.1 Produo do acar


O processo de industrializao de acar dividido basicamente em trs etapas. Primeiro: a cana-de-acar processada para extrao do caldo. Segundo: o caldo filtrado para remover qualquer impureza e fervido at o acar cristalizar, formando um xarope espesso. Terceiro: o xarope passado em uma centrfuga que produz acar bruto e melao. O acar bruto refinado, seco e embalado. A partir da, o melao pode seguir a via de produo de etanol. Seguem abaixo as principais etapas do processamento industrial da canade-acar: Lavagem da cana lavagem da cana antes do processamento para retirar impurezas. Extrao do caldo moagem ou difuso para extrao do caldo da cana atravs do esmagamento por cilindros compressores. Peneiramento do caldo separao de slidos insolveis existentes no caldo. Tratamento trmico processo de aumento da temperatura do caldo para promover a floculao de impurezas. Evaporao constitui o primeiro estgio de concentrao do caldo proveniente da etapa de tratamento, que contm cerca de 85% de gua. A evaporao tem como objetivo reduzir essa porcentagem para aproximadamente 40%. O caldo concentrado chamado de xarope. Cozimento uma nova etapa de concentrao do xarope, em que h a formao de cristais em virtude da precipitao da sacarose dissolvida na gua. O produto final, cristais de acar envolvidos em mel (soluo aucarada), chamado de massa cozida. Cristalizao a massa cozida enviada a cristalizadores que a resfriam lentamente com o auxlio de gua. Dessa maneira, consegue-se recuperar parte da sacarose, que ainda estava contida no mel, por sua deposio nos cristais j existentes, gerando o consequente aumento dos mesmos.

Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo

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Centrifugao a massa cozida segue s centrfugas para a separao do acar. O mel removido coletado e retorna aos cozedores para um maior esgotamento. O acar descarregado das centrfugas apresenta alto teor de umidade (0,5 a 2%) e temperatura elevada (65 a 95C). Secagem os cristais de acar seguem para a secagem por meio de ar quente. Este acar pode ser comercializado desta forma como acar cristal, ou ento, utilizado para a fabricao de outros produtos como o acar invertido, o acar refinado ou o acar lquido.

2.2.2 Produo do etanol


O etanol pode ser obtido por meio de um processo qumico denominado fermentao, ou seja, um processo de transformao dos acares contidos no caldo da cana-de-acar e melao. O melao resultante misturado ao caldo da cana-de-acar e levedura em tanques. O subproduto resultante do processo de fermentao, denominado mosto fermentado, contm um teor alcolico de aproximadamente 7,0% a 9,0%. Depois do processo de fermentao, de aproximadamente 10 horas, o mosto fermentado centrifugado, de forma que a levedura possa ser separada do lquido e reaproveitada posteriormente. O mosto fermentado ento fervido a diferentes temperaturas, separando o etanol dos outros lquidos. Seguem abaixo as principais etapas da produo de etanol: Lavagem da cana lavagem da cana antes do processamento para retirar impurezas. Essa etapa importante, pois possibilita a remoo parcial dos contaminantes, dependendo da qualidade da gua. Se a mesma no apresentar condies microbiolgicas saudveis, pode levar, no entanto, ao aumento drstico desses contaminantes. Extrao do caldo moagem ou difuso para extrao do caldo da cana atravs do esmagamento por cilindros compressores. Peneiramento do caldo separao de slidos insolveis existentes no caldo. Tratamento trmico processo de aumento da temperatura do caldo para promover a floculao de impurezas.

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Microbiologia Aplicada

Resfriamento processo que visa adequar o caldo tratado ao processo fermentativo por meio da diminuio da sua temperatura. Preparao do caldo a fermentao realizada com o caldo composto de aproximadamente 20% de acar, preparado com caldo (do tratamento), melao (da produo de acar) e gua. Esse caldo deve ser mantido a uma temperatura de, aproximadamente, 30C. Fermentao a fermentao do caldo resultado da ao da levedura, que primeiramente inverte a sacarose em glicose e frutose (monossacardeo) e posteriormente converte o monossacardeo em etanol e dixido de carbono. Essa reao ocorre em uma dorna de fermentao, juntamente com o caldo e a levedura. Centrifugao posteriormente fermentao, o produto resultante centrifugado para separar a levedura do mosto fermentado (vinho), uma soluo de aproximadamente 9% v/v (GL) de etanol. Tratamento da levedura a levedura resultante da centrifugao tratada com cido sulfrico e devolvida s dornas de fermentao para ser novamente utilizada. Destilao o mosto fermentado (vinho) destilado em uma sequncia de colunas de destilao, separando a gua do etanol. Esse processo ocorre basicamente devido s diferenas das temperaturas de ebulio do etanol e da gua.

Assista ao vdeo Acar e lcool (A produo do lcool) em: http://www.unica.com.br/ multimedia/videocast/default. asp?mmdcode=9a64fc42-5ca74d66-95d3-ab2540184a38

2.3 Anlises rotineiras durante o processamento


As principais anlises feitas durante o processamento encontram-se listadas abaixo e elencadas no Quadro 2.1.

2.3.1 Lavagem da cana


Na sada das caixas de tratamento de gua, feita a coleta para quantificar a populao bacteriana na gua de retorno do decantador, medindo o pH para correlao pH-nvel bacteriano. A gua de lavagem da cana deve manter o pH entre 10 e 11. Mtodos plaqueamento, bactrias totais, pH.

Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo

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2.3.2 Moagem
As amostras de caldo so coletadas na sada da primeira unidade de caldo e na sada da tubulao do caldo misto na moenda, para avaliao da alterao da carga microbiana durante a permanncia no ptio e tambm na moenda. Mtodos plaqueamento, bactrias totais, microscopia para bastonetes, delta pH.

2.3.3 Tratamento trmico (caldo tratado)


A amostra de caldo coletada aps a floculao das impurezas, na sada do decantador, a fim de se avaliar a eficincia do tratamento trmico no controle microbiolgico. Mtodos plaqueamento, bactrias totais.

2.3.4 Resfriamento
A amostra de caldo coletada na tubulao de entrada e sada do trocador de calor caldo/mosto para avaliao da recontaminao do caldo resfriado e mosto. Mtodos plaqueamento, bactrias totais, leveduras totais (sada do trocador de calor).

2.3.5 Preparao do caldo


A amostra coletada nessa fase na tubulao de sada da gua para avaliar a qualidade microbiolgica da gua usada na diluio do mosto, na entrada do diluidor do mosto, para avaliar a qualidade microbiolgica do mosto aps a adio do mel e na alimentao da dorna, para detectar a presena de contaminantes no mosto. Mtodos plaqueamento, bactrias totais, leveduras totais.

2.3.6 Fermentao
A amostra pode ser coletada antes da centrifugao para quantificar bactrias e leveduras e avaliar a necessidade da utilizao de produtos para contribuir no controle microbiolgico. Mtodos microscopia para bastonetes, viabilidade celular, brotamento, concentrao celular de leveduras, nvel de floculao.

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Microbiologia Aplicada

2.3.7 Tratamento da levedura


A amostra coletada para conhecer a viabilidade celular e a carga microbiana de contaminantes que entram na fermentao atravs do p-de-cuba. Nos processos de batelada, a coleta feita no momento de envio para a dorna e no processo contnuo, na penltima caixa. Mtodos microscopia para bastonetes, viabilidade celular, brotamento, concentrao celular de leveduras.
Quadro 2.1: Anlises microbiolgicas
Pontos de amostragem Anlise de rotina Anlise Plaqueamento Bactrias totais pH Plaqueamento Bactrias totais Microscopia p/ bastonetes Delta pH Plaqueamento Bactrias totais Plaqueamento Bactrias totais Leveduras totais Frequncia 2 vezes/semana 2 vezes/semana 2 vezes/semana 2 vezes/semana 1 vez/dia 1 vez/dia 1 vez/dia 1 vez/dia 1 vez/dia 1 vez/dia 1 vez/dia Anlise complementar Leveduras totais

p-de-cuba Suspenso de clulas de leveduras obtidas aps a centrifugao do vinho.

1. Lavagem da cana

2. Moagem

Bactrias formadoras de cido Bactrias formadoras de goma Leveduras totais

3. Tratamento trmico

4. Resfriamento 5. Preparao do caldo 5.1. gua de diluio

Plaqueamento Bactrias totais Plaqueamento Bactrias totais Leveduras totais Plaqueamento Bactrias totais Leveduras totais Microscopia p/ bastonetes Viabilidade celular Brotamento Concentr. celular leveduras Nvel de floculao Microscopia p/ bastonetes Viabilidade celular Brotamento Concentr. celular leveduras

2 vezes/semana 2 vezes/semana 2 vezes/semana 2 vezes/semana 2 vezes/semana 1 vez/dia 1 vez/dia 1 vez/dia 25% dornas processadas/dia 1 vez/dia 10% cubas tratadas/dia Delta pH Microscopia p/ bastonetes Bactrias totais Bactrias formadoras de cido Bactrias formadoras de goma Leveduras totais Colorao de Gram

5.2. Mel

5.3. Mosto

gua de diluio gua utilizada para diluir a suspenso de clulas de leveduras obtida por centrifugao.

6. Fermentao

7. Tratamento do fermento

Fonte: Adaptado de Faria, 2005

Aula 2 - Importncia da microbiologia no processo de produo

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Resumo
Nessa aula, vimos as principais etapas do processamento da cana-de-acar, relacionadas produo de acar e de lcool. A partir desse conhecimento, entendemos como a microbiologia pode ser aplicada nas diferentes etapas dos processos de produo de acar e lcool, por meio da utilizao de anlises rotineiras no decorrer do processamento. Assim, compreendemos a importncia da microbiologia para a produo de acar e lcool, atravs do controle e monitoramento desde a matria-prima at o produto final.

Atividades de aprendizagem
1. Faa um fluxograma da produo de acar e lcool. 2. Fale sobre a importncia da microbiologia aplicada produo de acar e lcool. 3. Cite trs etapas de produo em que podem ser feitas anlises microbiolgicas e descreva seus objetivos.

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Microbiologia Aplicada

Aula 3 Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool


Objetivos
Apresentar os microrganismos presentes nos processos de produo de lcool. Identificar os principais contaminantes dos processos fermentativos. Apresentar o uso de antibiticos e bactericidas na fermentao.

3.1 Leveduras Saccharomyces


Durante os processos fermentativos em usina sucroalcooleira, comum a presena de microrganismos, que so habitantes naturais do caldo. Em processos industriais nas usinas de acar e lcool, as leveduras do gnero Saccharomyces tem sido amplamente utilizadas, por se tratarem de microrganismos que apresentam os principais atributos desejveis para uma cepa de uso industrial, como: rpida transformao de acares em lcool, atividade celular em ambiente cido e alta tolerncia s condies drsticas (produto formado, osmotolerncia e grandes variaes de temperatura). Devido a essas caractersticas, as leveduras tm larga aplicao na indstria de biotecnologia, sendo utilizadas tambm na produo de bebidas, indstria de panificao, enzimas, entre outros. O processo fermentativo nas indstrias geralmente inicia-se com a introduo de uma determinada levedura, previamente selecionada para a conduo de toda a produo, mais comumente a Saccharomyces cerevisiae. Os teores alcolicos nas dornas de fermentao, em condies normais de processo, no permitem a sobrevivncia de linhagens no Saccharomyces. Mas ao longo do processo elas podem ser substitudas por microrganismos contaminantes, como bactrias e leveduras selvagens, gerando perdas na transformao final do substrato em lcool.

Aula 3 - Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool

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Figura 3.1: Levedura Saccharomyces cerevisiae


Fonte: http://visualsunlimited.photoshelter.com

3.2 Microrganismos contaminantes


3.2.1 Leveduras selvagens
Cabrini; Gallo (1999) apud Camolez; Mutton (2005), definiram levedura contaminante como qualquer levedura presente no processo fermentativo que no seja aquela selecionada para a conduo da produo de lcool, que atuam prejudicando a fermentao, causando problemas operacionais e aumentando o tempo de fermentao. A cana-de-acar utilizada como matria-prima nas usinas sucroalcoolei3 4 ras, segundo estudos, contm inicialmente nveis de 10 a 10 de fungos por grama de planta. Embora essas leveduras sejam habitantes naturais do caldo, entre elas esto leveduras que no apresentam caractersticas favorveis sua permanncia no ambiente hostil das dornas. Elas so eliminadas naturalmente e na maioria das vezes no acarretam danos ao processo. No entanto, as leveduras utilizadas como inculo no incio da fermentao podem ser completamente substitudas por leveduras contaminantes no decorrer da safra, tambm chamadas de leveduras selvagens. Isso causa srios prejuzos como a queda no rendimento, maior tempo de fermentao no processo, problemas operacionais, formao de espumas pelo aumento

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Microbiologia Aplicada

da viscosidade, etc. Contudo, alguns contaminantes podem apresentar efeito contrrio, com bom desempenho fermentativo, podendo ser selecionados para atuarem como as leveduras do processo numa safra posterior. Caso uma levedura isolada no final da safra seja diferente do inculo introduzido no incio, deve-se analisar seus aspectos bioqumicos e microbiolgicos e verificar as caractersticas que permitiram seu predomnio sobre outras populaes.

3.2.2 Leveduras floculantes


Na fermentao alcolica industrial ocorre outro fenmeno importante envolvendo as leveduras, conhecido como floculao, que um mecanismo natural e reversvel de agregao de clulas. Esse fenmeno pode ser induzido por vrios fatores, como agentes qumicos, microbiolgicos e fatores genticos inerentes prpria clula. As leveduras floculantes so consideradas como contaminantes do processo, pois causam sedimentao das clulas de leveduras nas dornas, levando a grandes dificuldades na fase de centrifugao, com perdas excessivas de fermento. O mecanismo exato da floculao ainda no conhecido, mas sabe-se que o meio de cultivo interfere no processo. Em anaerobiose, a floculao inibida e em aerobiose, induzida. Atravs de microscopia eletrnica, sabe-se que as clulas floculantes apresentam superfcie fimbriada ou ciliada e as no floculantes, relativamente lisa.

3.2.3 Bactrias contaminantes


Um processo de fermentao considerado sadio trabalha com nveis de bac5 trias nunca menores que 10 clulas/ml. Assim como as leveduras nativas, essas bactrias so provenientes da matria-prima. Por meio de tcnicas adequadas de controle tanto da matria-prima, como da gua de lavagem e extrao possvel obter um caldo misto com nmero de contaminantes 7 inferiores a 10 UFC/ml e cuja faixa de pH esteja em 5,5. Como j vimos, se esses cuidados no forem observados, o nvel de contaminantes pode aumentar drasticamente. Um dos maiores problemas causados pela contaminao bacteriana o consumo do acar existente (sacarose) por esses microrganismos, gerando perdas na transformao final em lcool e promovendo a formao de cidos orgnicos, que ocasionam perda de acar e intoxicao das leveduras. As

UFC Unidades Formadoras de Colnia, que corresponde ao nmero de clulas viveis.

Aula 3 - Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool

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bactrias contaminantes presentes no mosto ou nas dornas podem causar fermentaes secundrias, que levam a metablitos que inibem a atividade das leveduras, como os cidos, entre eles o actico, o frmico e o ltico. As bactrias contaminantes alm de serem capazes de competir com a levedura do processo, tm que apresentar caractersticas que lhes permitam crescer em condies de altos teores alcolicos e alta acidez. Entre as espcies de bactrias contaminantes nos processos fermentativos as predominantes so as Gram-positivas, dos gneros Bacillus, Lactobacillus e Leuconostoc. Em determinadas concentraes, essas bactrias levam a uma significativa queda no rendimento alcolico. O gnero Leuconostoc tem um papel importante como contaminante, principalmente na produo do acar. Essa bactria utiliza o acar do caldo para a produo de goma, prejudicando a produo. Algumas bactrias contaminantes do gnero Lactobacillus podem provocar a floculao de leveduras, como, por exemplo, Lactobacillus fermentum, levando a srios problemas operacionais. Isso acontece provavelmente devido presena de uma capa proteica de natureza gelatinosa sobre as bactrias, que possibilitam sua fixao nas clulas de leveduras. Segundo Rosales (1989), apud Angelis (2010), em seu estudo identificou 222 linhagens que foram isoladas na fermentao alcolica, assim distribudas: Grampositivas (75,68%) e Gram-negativas (24,32%). Entre as Gram-positivas esto bastonetes (76,78%): Lactobacillus fermentum, L. brevis, L. canfusus, L. plantarum, entre outros; Bacillus subtilis, B. coagulans, B. megaterium, B. firmus; e Sporolactobacilluscocos sp; e cocos (23,21%): Leuconostoc, Micrococos e Staphylococcus. Entre as Gram-negativas esto Acetobacter, Xantobacter, Pseudomonas, Acinetobacter e Enterobacter.

Figura 3.2: Leveduras sadias (do lado direito) e leveduras com bactrias contaminantes (do lado esquerdo)
Fonte: http://microbio-vocesabia.blogspot.com/2009_12_01_archive.html

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Microbiologia Aplicada

3.3 Antibiticos e bactericidas


Como j vimos, o controle de contaminaes microbianas em processos fermentativos de suma importncia, visto que a presena de contaminantes durante a fermentao causam uma srie de problemas, interferindo na produo, rendimento e produtividade. Dentre as principais substncias conhecidas para a desinfeco do mosto de fermentao esto antisspticos, como cido sulfrico, compostos fenlicos, compostos clorados, quaternrio de amnio, aldedos, e os antibiticos. Estes ltimos, alm do emprego teraputico, tem sido utilizados com sucesso em indstrias de fermentao na inibio do crescimento de bactrias, sem, no entanto, interferir na atuao das leveduras. Entre os antibiticos mais utilizados esto penicilina, virginiamicina, tetraciclina, cloranfenicol, alm de outros como Kamoran HJ, Kamoran WP e Corstan. Os antibiticos podem ser definidos como agentes quimioterpicos, obtidos sinteticamente ou a partir de metablitos de microrganismos, capazes de matar ou inibir o crescimento dos mesmos. Podem ser bactericidas, quando provocam a morte das bactrias, ou bacteriostticos, quando apenas inibem seu crescimento. A concentrao inibitria mnima (CIM) a menor concentrao capaz de inibir o crescimento do microrganismo. Um dos fatores de maior limitao da utilizao dessas substncias na indstria est na seletividade adquirida pelas bactrias, que podem se tornar resistentes e menos sensveis sua ao. Devido a isso, deve se buscar o uso racional dos antibiticos, selecionando o tipo e a dosagem mais adequada para cada populao de bactrias. Para evitar a resistncia adquirida por bactrias a determinados antibiticos podem ser feitos em laboratrio, testes para detectar a sensibilidade das bactrias aos antimicrobianos. Por meio dessas avaliaes possvel escolher quais so os mais adequados para serem aplicados na indstria sucroalcooleira. Mas isso ns estudaremos mais adiante. Antisspticos e antibiticos No Brasil, no usual a esterilizao do mosto para produo de lcool. Logo, o mosto apresenta uma populao natural que compete com a levedura pelo substrato, diminuindo o rendimento alcolico. Quando se faz a clarificao do caldo por aquecimento, h uma reduo dos microrganismos, mas, no uma esterilizao. Aps a clarificao, o mosto resfriado

antissptico Produto que promove a desinfeco em tecidos vivos seja inibindo ou matando os microrganismos.

Aula 3 - Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool

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e colocado em dornas sem cuidados para manter o ambiente livre de microrganismos. Os antisspticos e antibiticos so utilizados para o controle da contaminao, criando ambiente favorvel ao desenvolvimento das leveduras. O cido sulfrico que se adiciona aos mostos o antissptico mais utilizado. Os bactericidas so empregados, em muitos casos, preventivamente. Os antibiticos, especialmente penicilinas, devido ao preo mais elevado, so aplicados em algumas usinas, de maneira corretiva. A penicilina um bom inibidor de contaminaes, devido s suas propriedades bacteriostticas. Ela um bom inibidor de contaminaes, com emprego de 500 a 1000 U.I. por litro de mosto, normalmente implicando em aumento de rendimento em lcool. Cada processo apresenta necessidades especficas, existem tambm culturas e hbitos diferenciados, que definem o uso, ou no de determinado produto. Segundo Lima et al. (2001), antisspticos (exceto o cido sulfrico) tm uso restrito, pois existe possibilidade de deixar resduos nos destilados. Observaes O uso do processo Melle-Boinot, com tratamento cido do fermento, centrfugas eficientes, caldo tratado termicamente, alm de resfriamento mais eficiente de dornas leva a uma substancial reduo na relao contaminante/ levedura. Nestas condies, embora possa haver acidente de fermentao, difcil em termos tcnicos e econmicos, justificar o uso continuado de antibiticos. Leveduras < 108 cel/mL e contaminantes > 106, pode-se usar antibitico.
Fonte: http://www.scribd.com/doc/22805555/Unidade-VII-Fermentacao-Alcoolica

Resumo
Vimos nesta aula os microrganismos que so comuns ao processo fermentativo, como as leveduras do gnero Saccharomyces. Aprendemos sobre os principais contaminantes envolvidos, entre os quais temos leveduras selvagens e bactrias. Vimos que a presena desses contaminantes durante a fermentao bastante prejudicial ao processo, j que eles interferem na produo, rendimento e produtividade. Diante desse problema, aprendemos que o uso de antibiticos e bactericidas tem se mostrado uma alternativa eficiente para o tratamento das infeces na fermentao.

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Microbiologia Aplicada

Atividades de aprendizagem
1. Quais so os microrganismos geralmente introduzidos em usinas de produo de lcool para iniciar o processo fermentativo? Quais so as vantagens apresentadas por esses microrganismos? 2. O que so microrganismos contaminantes? 3. Cite os principais microrganismos contaminantes e as consequncias para o processo fermentativo. 4. Como podem ser combatidos os microrganismos contaminantes?

Aula 3 - Microrganismos relevantes em processos industriais de produo de acar e lcool

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Aula 4 Meios de cultura


Objetivos
Definir meios de cultivo e apresentar noes dos principais tipos existentes. Caracterizar os diferentes meios de cultura e a finalidade de cada um. Apresentar o preparo de meios de cultivo importantes utilizados nos processos industriais de produo de lcool e suas aplicaes.

4.1 Classificao dos meios de cultura


O estudo de bactrias e leveduras exige o prvio isolamento e identificao dos mesmos, e para tanto, so utilizados diversos meios de cultura diferentes. O cultivo de microrganismos, em condies laboratoriais, se d pela utilizao de meios de cultura. Esses podem ser definidos como o conjunto de nutrientes necessrios para haver multiplicao ou manuteno dos microrganismos. Existe uma grande variedade de procedimentos e preparaes nutricionais utilizadas para induzir tal crescimento, de acordo com as exigncias nutritivas e das condies fsicas requeridas pelos diversos tipos de fungos e bactrias. Devido s grandes variaes das necessidades nutritivas dos microrganismos, os meios de cultura so bastante diferentes em sua composio. Quanto ao estado fsico, podem ser: Lquidos so desprovidos de gar. Slidos apresentam em sua composio de 1,5 a 2,5% de gar. Semi-slidos apresentam em sua composio at 1% de gar. De acordo com a sua composio e os objetivos a que se destinam, os meios de cultura podem ainda ser classificados em:
gar Um polissacardeo extrado de algas, responsvel pelo aspecto gelatinoso do meio slido. O gar mais usado que a gelatina, pois, alm de no ser atacado pela grande maioria dos microrganismos, no liquefeito em temperaturas normalmente usadas para o crescimento dos microrganismos (em torno de 30 a 35C).

Aula 4 - Meios de cultura

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Basal s possui os nutrientes bsicos para o crescimento dos microrganismos em geral. De enriquecimento suplementado com nutrientes especficos para o microrganismo que se deseja pesquisar. Alm disso, pode apresentar agentes inibidores de determinados microrganismos, mas no permite o seu isolamento, pois um meio lquido. Seletivo possui agentes inibidores de determinados microrganismos. Permite a identificao e isolamento, pois um meio slido (permite a visualizao de UFCs). Diferencial permite a diferenciao de uma espcie e outra pelo aspecto macroscpico de seu crescimento, como cor, textura, halo de hemlise, etc. Sinttico ou quimicamente definido so aqueles fabricados em laboratrio, cuja composio qumica pode ser absolutamente conhecida, at mesmo em relao aos micronutrientes. Complexo quando a composio no pode ser quimicamente conhecida, os meios de cultura so chamados complexos. De transporte so aqueles utilizados para o armazenamento e manuteno temporria de determinado material, cuja principal funo manter a viabilidade dos possveis microrganismos presentes. Inoculao a transferncia de um determinado nmero de microrganismos para um meio de cultura a fim de que estes se desenvolvam e permitam a sua identificao. A inoculao em diferentes meios envolve vrias tcnicas de semeadura.
Assista as animaes e saiba mais sobre tcnicas asspticas de inoculao de microrganismos e obteno de culturas puras em: http://www.e-escola.pt/pagina_ popup.asp?id=913 http://www.e-escola.pt/topico. asp?id=310

Para saber mais sobre meios de cultura, acesse: http://www.e-escola.pt/topico. asp?id=312

As tcnicas de semeadura so o mtodo pelo qual se transfere inculos de um meio de cultura ou material a ser analisado para um outro meio de cultura. Para garantir que apenas o microrganismo desejado seja semeado, so utilizadas as tcnicas asspticas (procedimentos que devem ser adotados visando a no contaminao de materiais, meios e culturas, para obteno de culturas puras).

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Microbiologia Aplicada

Para a contagem de bactrias em geral, vrios meios de cultivos podem ser utilizados, como: gar-nutriente, dextrose-triptona gar, gar-leite desnatado, gar-suco de tomate, MRS-gar, etc. J para a contagem de leveduras, os meios mais comumente utilizados so: extrato de levedura-peptona-dextrose-gar, extrato de malte e gar-batata-dextrose. A maior parte dos meios de cultura est disponvel comercialmente na forma desidratada e para seu uso, faz-se a dissoluo em gua e esterilizao. Os meios de cultura diferenciais ou seletivos para isolamento e quantificao de populaes de leveduras contaminantes baseiam-se em caractersticas fisiolgicas comuns s leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens iniciadoras do processo da fermentao. Dentre essas, destacam-se as nutricionais (variaes nas fontes de carbono, nitrognio e nos fatores de crescimento) e resistncia a certos compostos como antibiticos e corantes. Entretanto, um nico meio no totalmente satisfatrio para a avaliao de todas as leveduras presentes, sendo, portanto necessrio o emprego de vrios tipos de meios quando se pretende detectar a maioria das leveduras presentes.

4.2 Preparo de meios de cultivo


Apresentaremos aqui uma breve noo dos meios de cultura mais utilizados para anlises microbiolgicas em processos fermentativos e o seu preparo. Na contagem de bactrias totais, recomenda-se a utilizao de meio de cultivo base de extrato de levedura triptoma-dextrose-gar (Tabela 4.1).
Tabela 4.1: Extrato de levedura triptona-dextrose-gar (PCA Plate Count Agar)
Extrato de levedura Triptona Dextrose gar gua destilada Fonte: Amorin, 2000 2,5 g 5,0 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml

Na contagem de leveduras totais, o meio WLN (Tabela 4.2) um dos meios de cultivo mais indicados, porm importante considerar que os ingredientes assinalados com asterisco devem ser incorporados ao meio na forma de solues previamente preparadas.

Aula 4 - Meios de cultura

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Tabela 4.2: WLN (WL Nutrient Medium)


Extrato de levedura Casena hidrolisada Glicose Fosfato monopotssico* Cloreto de potssio* Cloreto de clcio* Sulfato de magnsio* Cloreto frrico* Sulfato de mangans* Verde de bromocresol cido nalidxico* gar Ampicilina* gua destilada q.s.q. Fonte: Ceccato-Antonini, 2004 0,4 g 0,5 g 5,0 g 55,0 mg 42,5 mg 12,5 mg 12,5 mg 0,25 g 0,25 g 2,2 mg 5,0 mg 2,0 g 5,0 mg 100 ml

Para a enumerao e o isolamento de leveduras resistentes cicloheximida, recomenda-se o meio de cultivo WLD (WL Differential Agar) que obtido por adio do agente antifngico cicloheximida, na forma de soluo, ao meio WLN, para uma concentrao final de 5 ppm. Para a enumerao e o isolamento de bactrias produtoras de cido (Pour Plate) recomenda-se o meio de cultivo para Lactobacillus (Tabela 4.3).
Tabela 4.3: Meio para Lactobacillus MRS (seg. Man. Rogosa y Sharpe) modificado
Peptona universal Extrato de carne Extrato de levedura D glucose
+

10,0 g 5,0 g 5,0 g 20,0 g 2,0 g 1,0 g 5,0 g 0,1 g 0,05 g 12,0 g 1000 ml

Di-potssio hidrogenado fosfato Polioxietilensorbitan monooleato (Tween 80) Acetato sdio Sulfato magnsio Sulfato mangans gar gua destilada Fonte: Mello, 2004

Para a enumerao e o isolamento de bactrias produtoras de goma (por superfcie), recomenda-se o meio de cultivo para Leuconostoc (Tabela 4.4).

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Microbiologia Aplicada

Tabela 4.4: Meio para Leuconostoc (Mayeux e Colmer, 1961)


Extrato de levedura Proteose-peptona Dextrose Fosfato de potssio monobsico gar gua destilada Fonte: Amorim, 2000 20,0 g 5,0 g 10,0 g 2,0 g 15,0 g 1000 ml

Para a enumerao e o isolamento de leveduras no pertencente ao gnero Saccharomyces, recomenda-se o meio de cultivo de Lisina (Tabela 4.5).
Tabela 4.5: Meio de Lisina
Bacto yeast carbon base Lisina gar cido nalidxico Ampicilina gua destilada q.s.q. Fonte: Ceccato-Antonini, 2004 1,17 mg 0,10 g 2,0 g 5,0 mg 5,0 mg 100 ml

Observao Os antibiticos sero incorporados ao meio na forma de solues. Para a enumerao e o isolamento de leveduras selvagens do gnero Saccharomyces, recomenda-se o meio de cultivo LWYN (Tabela 4.6).
Tabela 4.6: LWYN (Lin Wild Yeast Medium)
Extrato de malte Extrato de levedura Peptona Glicose Fosfato de potssio bibsico Cloreto de amnio gar Violeta cristal* Mistura fucsina-sulfito cido nalidxico* Ampicilina* gua destilada q.s.q. Fonte: Ceccato-Antonini, 2004 0,20 g 0,40 g 0,20 g 1,00 g 0,10 g 0,05 g 2,00 g 0,6 mg 0,01 g 5,0 mg 5,0 mg 100 ml

Aula 4 - Meios de cultura

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e-Tec Brasil

Observao Os ingredientes assinalados com asterisco sero incorporados ao meio na forma de solues. A mistura fucsina-sulfito composta de 1 parte, em peso, de dextrina, 4 partes de fucsina bsica e 25 partes de sulfito de sdio anidro. Para a enumerao e o isolamento de bactrias recomenda-se o meio de cultivo gar nutriente (Tabela 4.7).
Tabela 4.7: gar nutriente
Peptona Extrato de carne Cloreto de sdio gar gua destilada q.s.q. Fonte: Ceccato-Antonini, 2004 5g 3g 1g 20 g 1000 ml

Para a contagem de bactrias totais na fermentao (Pour Plate) recomenda-se o meio de cultura MSS (Tabela 4.8).
Tabela 4.8: MSS (meio de melao-sacarose-extrato de levedura)
Melao Sacarose Peptona Extrato de levedura K2HPO4 9(NH4)2SO4 Agar gua destilada Fonte: Mello, 2004 50,0 g 75,0 g 1,0 g 1,0 g 1,0 g 1,0 g 15,0 g 1000 ml

Importante Todos os meios de cultura devem ser esterilizados em autoclave a 120C por 20 minutos, a 1 atm.

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Microbiologia Aplicada

Resumo
Nessa aula, aprendemos sobre meios de cultura. Vimos que estes podem apresentar uma grande variao, quanto ao estado fsico e quanto sua composio, de acordo com a necessidade dos microrganismos e os objetivos a que se destinam. Para se obter resultados seguros e eficientes quando se trabalha com meios de cultura importante observar tcnicas asspticas de inoculao e semeadura. Por fim, estudamos o preparo de meios de cultivo importantes utilizados nos processos industriais de produo de lcool e suas respectivas aplicaes.

Atividades de aprendizagem
1. O que so meios de cultivo? 2. Quanto ao estado fsico, como os meios de cultura podem ser divididos? 3. Quanto composio e aos objetivos a que se destinam, cite trs exemplos de meios de cultura. 4. Preencha as lacunas de acordo com o meio de cultivo adequado: a) Meio de Lisina. b) PCA Plate Count Agar. c) Meio para Leuconostoc. d) WLN. (__) Meio de cultivo para isolamento de leveduras no pertencentes ao gnero Saccharomyces. (__) Meio de cultivo para contagem de leveduras totais. (__) Meio de cultivo para bactrias produtoras de goma (por superfcie). (__) Meio de cultivo utilizado na contagem de bactrias totais.

Aula 4 - Meios de cultura

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Aula 5 Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica


Objetivos
Conhecer as principais tcnicas de colorao de microrganismos. Conhecer a tcnica de colorao de Gram e sua aplicao. Conhecer as tcnicas bsicas de contagem microbiolgica.

5.1 Tcnicas de colorao de microrganismos


A observao de microrganismos apresenta alguns fatores limitantes, como o fato de possurem tamanhos reduzidos e serem praticamente incolores. Por isso, a maioria dos microrganismos para serem visualizados ao microscpio ptico devem ser previamente corados. Antes disso, o microrganismo deve ser fixado lmina, realizando-se a secagem por simples exposio ao ar e, em seguida, rpida passagem da lmina pela chama do bico de Bunsen. Os corantes podem ser cidos ou bsicos. A clula bacteriana atrai corantes bsicos. Os corantes bsicos mais comuns so: cristal violeta, azul de metileno, fucsina e safranina. Quanto aos tipos de colorao temos: a) Coloraes simples promovem a colorao indistinta das bactrias, facilitando a visualizao da forma das clulas bacterianas. Exemplo: colorao com azul de metileno. b) Coloraes diferenciais as clulas bacterianas so expostas a alguns corantes, em uma determinada sequncia, interagindo diferentemente com as estruturas presentes nas diferentes bactrias, permitindo a diferenciao de grupos bacterianos. Exemplo: colorao de Gram; colorao de Ziehl-Neelsen (BAAR).

Aula 5 - Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica

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c) Coloraes especiais so aquelas utilizadas para corar e identificar partes ou estruturas especficas das bactrias, como: esporo, cpsula, flagelo, grnulos, e outras estruturas. Exemplo: na colorao de Fontana-Tribondeau emprega-se o espessamento de bactrias espiraladas com prata.

5.1.1 Colorao de Gram


Para saber mais sobre tcnicas de colorao Gram, acesse: http://www.biomedicina3l. com/2009/08/coloracao-degram.html Para saber mais sobre contagem de clulas totais pela cmara de Neubauer, acesse: http://www.e-escola.pt/topico. asp?id=235&ordem=2

A colorao de Gram um mtodo muito utilizado na identificao de bactrias, separando-as em dois grandes grupos: bactrias Gram-positivas (+) e bactrias Gram-negativas (-). Estas podem ser diferenciadas por variaes na estrutura da parede celular. Assim a parede celular de bactrias ditas Gram (+) formada por um camada espessa de peptidoglicano, enquanto que a parede celular de bactrias Gram (-) formada por uma camada fina de peptidoglicano, rodeada por uma camada externa de lipopolissacardeo e protena. um mtodo de colorao diferencial, baseado nas diferenas de permeabilidade destas membranas aos reagentes qumicos. Nessa tcnica so utilizados um corante primrio (cristal violeta), um contracorante (safranina) e uma soluo de lugol, denominada de mordente, pois se combina com o cristal-violeta para formar um composto colorido insolvel. O mordente intensifica a cor por ser capaz de aumentar a afinidade do corante com a molcula alvo. Aps a formao do complexo cristal-violeta-lugol feita a descolorizao com lcool. Em seguida, aplica-se o contracorante safranina. As clulas que resistem descolorizao e retm o complexo cristal-violetalugol, apresentam-se coradas de azul-violeta forte e so chamadas Grampositivas (+). Aquelas que se descolorizam pela perda do complexo, aceitam o corante safranina e ficam vermelhas, so as denominadas Gram-negativas (-).

Figura 5.1: Mtodo de colorao Gram


Fonte: Adaptado de http://pathmicro.med.sc.edu/fox/gram-st.jpg

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Microbiologia Aplicada

5.2 Tcnicas bsicas de contagem microbiolgica


Para acompanhar o crescimento de uma populao microbiana e poder quantific-la podem ser utilizadas algumas tcnicas de contagem de microrganismos. A contagem de microrganismos em uma determinada amostra pode ser realizada por meio de diferentes mtodos. a) Contagem direta ou microscpica tcnica de contagem utilizada para quantificar o nmero total de clulas em uma populao de microrganismos. A vantagem desse mtodo a rapidez, no entanto no permite a diferenciao de clulas vivas e mortas. Alm disso, s possvel contar partculas que estejam em valores superiores a 104/ml, enquanto a contagem em placas pode avaliar nmeros bem inferiores (at 30/ ml). Pode ser feita atravs de cmaras de contagem por observao em microscpio ou ainda por contagem eletrnica. b) Contagem de microrganismos viveis em placa tcnica de contagem por meio da semeadura de bactrias e/ou leveduras em placas (Pour Plate ou superfcie), para estimar o nmero de clulas viveis, isto , capazes de se reproduzir, em um meio de cultura adequado. Cada colnia crescida numa placa corresponde a uma unidade formadora de colnia (UFC) proveniente do material. Devido grande variao do nmero de microrganismos em uma amostra, a sua contagem torna-se muitas vezes impossvel. Para reduzir o nmero de clulas na amostra e possibilitar a contagem so usadas tcnicas de diluio (Figura 5.2). Para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas as placas com nmero de colnias entre 30 e 300.

Aula 5 - Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica

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Assista a animao e saiba mais sobre a tcnica de contagem de viveis utilizando o mtodo das diluies sucessivas em: http://www.e-escola.pt/topico. asp?id=235&ordem=3

Figura 5.2: Tcnica de contagem em placa com diluio


Fonte: CTISM

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Microbiologia Aplicada

c) Semeadura em profundidade ou Pour Plate depois de preparadas as diluies, estas so inoculadas em quantidades de 0,1 ou 1,0 ml em placas de Petri estreis, utilizando-se duas placas para cada diluio. Aps colocar o material (amostra em estudo) na placa, agrega-se de 10 a 15 ml do meio de cultura fundido e resfriado a temperatura de 45C, agitando-se em movimentos rotativos. As placas assim preparadas devem ser incubadas a temperatura e condies recomendadas, devendo ser colocadas em posio invertida na estufa. Aps incubao realizar a contagem, utilizando contador de colnias. d) Semeadura em superfcie aps preparar as placas com meio de cultura (15 ml) e uma vez preparadas as diluies escolhidas semeia-se 0,1 ml de cada uma das diluies, utilizando-se tambm duas placas por cada diluio. Distribuir toda alquota semeada com uma ala de Drigalski. Levar incubao nas mesmas condies descritas acima.

Figura 5.3: Ala de Drigalski


Fonte: http://www.seelen-care.dk/drigalski-spatel-glas.aspx

A seguir veja o Quadro 5.1 contendo as regras para interpretar a contagem de colnias:

Aula 5 - Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica

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Quadro 5.1: Normas para contagem de colnias


Interpretao 1. Duas placas da mesma diluio apresentam entre 30 e 300 colnias. 2. Em uma mesma diluio uma placa apresenta entre 30 e 300 colnias e outra < 30 ou > 300. Contar as duas placas. Exemplo Diluio 10 Placa 1 = 180 Placa 2 = 140
-2

Clculo Mdia aritmtica X = 160

Reporte Contagem standard em placa: 16 x 103 Contagem standard em placa: 48 x102

Diluio 10-2 Placa 1 = 70 Placa 2 = 26

Mdia aritmtica X = 48

3. As placas de 2 diluies consecutivas apresentam entre 30 e 300 colnias. Contar as 4 placas.

a) X Dil. 10-3 = 35 X Dil. 10-2 = 250

Relao 10-3/10-2 35000/25000 = Se < que 2, tomar a mdia Relao 10-3/10-2 38000/15000 = Se > que 2, tomar o nmero maior X=1 Mdia aritmtica 180 X 4 = 720 160 X 4 = 640 X = 680 > 200 em 8 = 1600

Contagem standard em placa: 30 x 103 Contagem standard em placa: 15 x 103 Contagem estimada em placa: < 1 x 101 Contagem estimada em placa: 68 x 104 Contagem estimada em placa: > 16 x 105 Presena de colnias disseminadas: 15 x 103

b) X Dil. 10 = 38 X Dil. 10-2 = 150


-3

4. No tem colnias nas placas da suspenso mais concentrada. 5. Duas placas da diluio mais alta apresentam mais de 300 colnias. Dividir as placas de forma radial (2, 4, 8) e contar o nmero de colnias por seco. 6. Presena de colnias disseminadas em uma rea menor que a metade da placa. Contar a outra metade.

Diluio 10-1 Placa 1 = < 1 Placa 2 = < 1 a) Diluio 10-3 Placa 1 = 180 em 1/4 Placa 2 = 160 em 1/4

b) mais de 200 em 1/8

Diluio 10-2 Placa 1 (metade) = 60 X 2 Placa 2 = 180

Mdia aritmtica X = 150

Fonte: Ceccato-Antonini, 2004

Resumo
Estudamos nessa aula sobre as tcnicas de colorao de microrganismos, que so utilizadas com o propsito de visualiz-los e identificar as suas propriedades. Vimos os principais tipos de colorao existentes, dando nfase colorao de Gram e sua aplicao. Aprendemos ainda algumas tcnicas de contagem de microrganismos, frequentemente empregadas para acompanhar e quantificar o crescimento de populaes microbianas, como a contagem direta e a contagem em placas.

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Microbiologia Aplicada

Atividades de aprendizagem
1. Quais os tipos de colorao existentes? 2. Para qual finalidade a colorao de Gram utilizada? 3. Descreva resumidamente a tcnica de colorao de Gram. 4. Aps ter acessado o texto sobre contagem direta ao microscpio, discorra sobre as limitaes desse mtodo. 5. Qual o objetivo de proceder s diluies sucessivas na tcnica de contagem de viveis?

Aula 5 - Tcnicas de colorao e de contagem microbiolgica

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Aula 6 Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool


Objetivos
Conhecer as principais tcnicas de monitoramento microbiolgico no processo industrial de produo de lcool, seus objetivos e aplicaes. Apresentar os principais testes de deteco de bactrias e leveduras contaminantes, testes de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos, caracterizao de Bacillus e Lactobacillus, entre outros procedimentos.

6.1 Leveduras

6.1.1 Determinao da viabilidade celular, concentrao celular e brotamento em leveduras


Viabilidade celular indica a porcentagem de leveduras vivas em relao ao total de leveduras. Concentrao celular nmero de leveduras vivas por ml da amostra. Brotamento porcentagem de leveduras vivas que esto se multiplicando. At o momento, no se conhece um mtodo absoluto para determinao da viabilidade celular de uma populao de clulas de levedura, cujos resultados possam ser considerados totalmente seguros. Entretanto, mtodos baseados no plaqueamento ou contagem direta tm sido utilizados para estimar a proporo de clulas viveis em uma cultura ou processo fermentativo. Os mtodos de contagem direta so rpidos e simples e permitem, simultaneamente, a observao da morfologia celular. A tolerncia da levedura ao seu produto de fermentao, o etanol, bastante significante em relao eficincia de produo de lcool em fermentaes

Aula 6 - Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool

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em escala industrial. A presena de lcoois superiores (n-butanol, isoamlico), cidos graxos e seus steres mesmo em baixas concentraes, juntamente com o etanol, intoxicam a clula da levedura levando-a morte e consequentemente diminuindo a viabilidade celular. Portanto, a determinao da viabilidade celular um aspecto de grande importncia no controle da fermentao alcolica, pois pode indicar se o desempenho do processo ser satisfatrio ou no. Quanto maior esse nmero, melhor ser o desempenho. Os mtodos mais empregados na determinao da viabilidade celular nos processos de produo de levedura (fermento prensado) e fermentao alcolica (lcool) so a colorao das clulas da levedura com azul de metileno ou eritrosina e o cultivo por plaqueamento.

6.1.1.1 Tcnica de colorao com azul de metileno ou eritrosina


A tcnica de colorao com azul de metileno consiste em se misturar partes iguais da suspenso de levedura (amostra), adequadamente diluda, e da soluo corante (azul de metileno). As clulas com alta atividade fisiolgica no se colorem, enquanto as clulas inativas (mortas) apresentam-se coloridas de azul. A tcnica de colorao com eritrosina a mesma, entretanto, nesse caso, as clulas no viveis colorem-se de rosa intenso. A porcentagem ou o nmero de clulas viveis determinado transferindo-se com uma pipeta de Pasteur a amostra para a cmara de Neubauer.

Figura 6.1: Determinao da viabilidade celular de leveduras com azul de metileno


Fonte: Ceccato-Antonini, 2004

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Microbiologia Aplicada

Objetivo determinar a viabilidade celular, o brotamento e a populao de leveduras. Material cmara de Neubauer, pipeta de Pasteur, pipetas graduadas de 1ml, tubos de ensaio, agitador para tubos, lamnulas (24 x 24), microscpio. Reagentes azul de metileno ou eritrosina, soluo tampo, gua destilada esterilizada. Procedimento fazer a diluio da amostra, se necessrio, em um tubo de ensaio (1:10, 1:15, 1:20, 1:40) conforme o caso especfico de cada unidade. Misturar partes iguais de amostra e soluo corante, homogeneizando a mistura em agitador de tubos. Em seguida, preparar a cmara de Neubauer, fixando a lamnula adequada e com auxlio da pipeta de Pasteur, transferir um pequeno volume da amostra preparada. Levar ao microscpio ptico e com a objetiva de 40x, fazer a contagem das clulas coradas, clulas no coradas e brotos. Contar 10 quadrculos de 2 colunas, de preferncia, a segunda e a quarta. Considerar todas as clulas que esto no interior deles e as que esto at 2/3 para dentro. A diluio feita de modo que se tenha de 40 a 50 clulas por quadrculo. Observao considerar como broto as clulas menores que a metade do tamanho da clula me. Clculos Viabilidade (%) = (nmero de clulas no coradas (vivas) / nmero total de clulas) x 100 N total de clulas/ml = n clulas nos 10 campos x 2,5 x diluio x 100 ou N total de clulas/ml = n clulas nos 100 retculos x 4 x diluio x 100 Brotamento por reposio (%) = (n brotos no corados / n total de clulas no coradas) x 100

Aula 6 - Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool

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6.1.1.2 Plaqueamento por profundidade (Pour Plate) e diluio em srie


A semeadura em placas ou plaqueamento revela o nmero de clulas de leveduras capazes de se multiplicarem e formarem colnias em meios de cultivo apropriados e sob condies de incubao adequadas. Cada colnia desenvolvida supe-se ter sido originada a partir de uma unidade vivel, a qual pode ser uma clula ou mais. O resultado depende da capacidade do organismo se desenvolver nas condies dos meios de cultivo. Como consequncia, essa tcnica d uma estimativa da populao da amostra, j que somente as clulas viveis sero quantificadas. Como para uma maior preciso da anlise somente devero ser contadas as placas com nmero de colnias entre 30 e 300, uma diluio da amostra dever ser feita antes de se proceder a sua mistura com o meio de cultura. Objetivo avaliar o nmero de microrganismos, usando-se meios de cultivo. Material placas de Petri, tubos de ensaio, pipetas graduadas (1 ml), suporte para tubos, ala de Drigalsky, agitador para tubos, contador de colnias, estufa, banho-maria, termmetro, bico de Bunsen. Reagentes gua de diluio, meios de cultivo especficos. Procedimento coletar 1 ml da amostra (suspenso de clulas) e transferir para um tubo de cultura com 9 ml de gua ou soluo salina esterilizada (diluio 1:10 ou 10-1). Homogeneizar em agitador de tubos. Em seguida, pipetar 1 ml da diluio anterior para outro tubo com 9 ml de gua ou soluo salina esterilizada, obtendo-se uma diluio 1:100 ou 10-2. Diluies maiores podem ser obtidas tomando-se 1 ml de cada diluio sucessiva e colocando em tubos com 9 ml de gua ou soluo salina, at se atingir a diluio desejada. Aps a diluio mais conveniente, fazer a semeadura em placas de Petri, pipetando 1 ml e adicionando-se o meio de cultivo adequado liquefeito e resfriado a uma temperatura de 45-46C. Agitar a placa com movimentos horizontais (para direita e para esquerda) para distribuir as clulas com uniformidade (plaqueamento em profundidade). Semear no mnimo 2 placas de cada diluio e escolher 3 diluies. Incubar a 32C por 24-48 horas. Alternativamente, pode-se proceder ao plaqueamento em superfcie. Inicialmente colocar o meio de cultura (WLN) nas placas de Petri, esperar a solidifi-

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Microbiologia Aplicada

cao e a seguir, pipetar 0,1 ml espalhando o inculo com auxlio da ala de Drigalsky (plaqueamento em superfcie). Fazer a contagem de cada placa e para estimar o nmero de colnias, escolher as placas que apresentem de 30 a 300 colnias. Calcular a mdia das colnias das duas placas e multiplicar pelo fator de diluio para se obter o nmero de colnias. Se for utilizado o plaqueamento em superfcie, multiplicar por 10. Clculo N de colnias na placa x ndice de diluio da amostra = n de UFCs de leveduras/ml A contagem deve ser expressa em nmero de unidades formadoras de colnias por mililitro ou grama de amostra (UFC/mL ou UFC/g) e o resultado expresso em apenas dois dgitos (Exemplo: 0,0 x 10x).

6.1.2 Meios seletivos para deteco de leveduras selvagens


A diferenciao entre a levedura alcolica (processo) e a levedura contaminante (selvagem) pode ser detectada pela utilizao de meios seletivos ou diferenciais. Como j vimos anteriormente, os meios de cultura diferenciais ou seletivos podem ser usados para isolamento e quantificao de populaes de leveduras contaminantes e baseiam-se em caractersticas fisiolgicas comuns s leveduras selvagens, mas ausentes em linhagens iniciadoras do processo de fermentao, ou seja, o meio empregado permite somente o desenvolvimento da levedura contaminante. Entretanto, um nico meio no permite a avaliao de todas as leveduras presentes, j que todos apresentam variaes. De modo geral, os meios seletivos ou diferenciais podem ser classificados em: meios para deteco de leveduras contaminantes no Saccharomyces (WLD, LWYN, meio de lisina) e meios para deteco de leveduras contaminantes Saccharomyces (LWYN). Procedimento coletar as amostras em frascos estreis e homogeneizar cuidadosamente, transferindo 10 ml das amostras para tubos de centrfuga estreis, assepticamente. Centrifugar a 3000 rpm por 5 minutos. Descartar os sobrenadantes, adicionando-se em seguida soluo salina estril para ressuspenso das clulas. Centrifugar as amostras novamente, desprezando-se os sobrenadantes e ressuspendendo-se as clulas a um volume final de 10

Aula 6 - Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool

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ml com soluo salina estril. Aps a recomposio do volume inicial, fazer a diluio em srie das amostras. Utilizar o plaqueamento em duplicata para duas diluies, de cada amostra, em cada um dos meios a serem analisados: WLN diluies 10-7 e 10-8. WLD plaqueamento direto e 10-1. Lisina gar plaqueamento direto e 10-1. LWYN plaqueamento direto e 10-1. Utilizar a tcnica de espalhamento de 0,1 ml da suspenso de clulas em superfcie e incubar as placas a 28C por 72 horas. Realizar as contagens das colnias.

6.2 Bactrias

6.2.1 Contagem direta ao microscpio ptico


Essa tcnica mais adequada para a contagem de bastonetes, embora outros tipos de bactrias (cocos) possam ser contados. Pode ser aplicado na contagem de bastonetes em amostras de caldos primrio e misto, vinho (em fermentao ou no final de fermentao) e levedo tratado ou no. um mtodo rpido, de preciso relativa, sendo mais seguro e preciso quando o nmero de bastonetes/ml da amostra est entre 106 e 107. Objetivo avaliar a contaminao em amostras de caldos primria e mista, vinho (em fermentao ou no final de fermentao) e levedo tratado ou no, por meio da contagem de bastonetes. Material pipetas graduadas (1 ml, 0,1 ml); lminas (26 x 76 mm); lamnulas (22 x 22 mm ou 20 x 20 mm); tubos de ensaio; agitador para tubos; microscpio. Reagentes azul de metileno; sulfato azul de nilo. Procedimento a amostra de caldo deve ser filtrada em algodo para eliminar as impurezas slidas. J a amostra da dorna utilizada da forma

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Microbiologia Aplicada

como coletada. As amostras de vinho e de levedo devem ser previamente diludas para que a visualizao ao microscpio no apresente mais que 3 a 5 bastonetes por campo. Misturar em tubo de ensaio partes iguais de corante azul de metileno/sulfato azul de nilo e da amostra a ser analisada e homogeneiz-los em agitador para tubos. Transferir 0,003 ml dessa mistura para uma lmina de vidro, colocando sobre essa uma lamnula, sem formar bolhas. Aps o preparo da lmina, observar ao microscpio ptico com a objetiva de imerso (100x) e fazer a contagem dos bastonetes no corados (vivos). As clulas viveis aparecero incolores e as no viveis coloridas de azul intenso. O nmero mnimo de campos a serem contados depende da amostra analisada, variando de 50 a 100. Exemplos: Caldo primrio e misto = 70 campos. Caldo clarificado e mosto = 100 campos. Vinho e levedo tratado = 50 campos.

Figura 6.2: Contagem direta de bastonetes viveis e no viveis


Fonte: CTISM

Clculo N bastonetes/ml = FM x 1 / volume da amostra x M x D Onde: FM = fator do microscpio (rea preparao da lamnula / rea do campo do microscpio) M = total de bactrias vivas / n campos contados D = diluio usada

Aula 6 - Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool

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6.2.2 Plaqueamento e diluio em srie


Para saber mais sobre a tcnica, acesse: http://www.e-escola.pt/topico. asp?id=306&ordem=5

O mtodo de contagem de bactrias por plaqueamento o mesmo usado para as leveduras. Pode ser utilizado para qualquer amostra, como: mosto, vinho, leite de leveduras turbinado e tratado (concentrado de leveduras obtido aps centrifugao), gua, etc., modificando-se apenas as diluies, que variam de acordo com o material analisado e seu ndice de contaminao.

6.2.3 Colorao de Gram


Objetivo diferenciar bactrias tanto de suspenses lquidas como de colnias de cultivos slidos, por meio de reaes tinturiais da parede celular. Procedimento preparo da lmina Amostra lquida com a ala de platina, espalhar a suspenso em exame numa lmina limpa e seca. Deixar secar e fixar por aquecimento. Deixar esfriar. Cultivo slido colocar uma gota de gua sobre uma lmina de vidro. Com a ala de platina, retirar uma pequena poro da colnia em cultura slida e emulsion-la na gota, para obter uma suspenso uniforme. Espalhar at obter um esfregao fino. Deixar secar em temperatura ambiente, no levando diretamente chama, para no modificar a morfologia dos microrganismos. Antes de corar, deixar que a lmina esfrie completamente. Colorao cobrir o filme fixado com o corante cristal-violeta, deixando agir por 2 minutos e depois lav-lo para retirar o excesso. Em seguida cobrir o esfregao com soluo de iodo (lugol), que atuar como o mordente, deixando agir por mais 1 minuto e lavando-o. Neste momento, ambas as bactrias Gram-positivas e Gram-negativas adquirem cor prpura. A lmina lavada sucessivamente com lcool a 95% ou com uma soluo de lcool-acetona, at que a soluo escorra da lmina sem nenhuma colorao, pois estes atuam como descolorantes. Lavar em gua corrente. Fazer uma contracolorao com safranina, por 1 minuto, lavando-a em seguida. Deixar a lmina secar e examin-la ao microscpio. As bactrias Gram-positivas retm o corante prpuro, mesmo aps a lavagem com lcool, apresentando-se coloridas de azul-violeta intenso. J as bactrias Gram-negativas aparecem na cor vermelha, pois retm o contracorante safranina.

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Microbiologia Aplicada

Observao Essa tcnica no se aplica a microrganismos que sofreram danos fsicos na membrana (ao do calor). As clulas jovens tm maior afinidade pelos corantes, por isso recomendvel utilizar cultivos de 18 a 24 horas para obteno de melhores resultados.

6.2.4 Caracterizao de Bacillus e Lactobacillus


Esses dois gneros de bactrias podem ser diferenciados por meio de alguns testes, como: colorao de Gram, deteco de esporos, motilidade e catalase. Antes de proced-los necessrio o isolamento da cultura. Para isso, verter o meio de cultivo com inibidor de leveduras em placas de Petri, levando estufa 35C por 48 horas. Isolar os diferentes tipos de colnia, transferindo-as com agulha para meio de cultivo lquido. Incubar em estufa por 24 horas e esfriar novamente, incubando em seguida por 24-48 horas. Se for observado s um tipo de colnia, o microrganismo est isolado; se no, proceder nova purificao.

6.2.4.1 Tcnica de colorao para identificao de esporos


De maneira geral, as bactrias dos gneros Bacillus e Clostridium so capazes de formar estruturas de parede espessa, denominadas esporos ou endosporos, que lhes conferem extrema resistncia situaes adversas, podendo sobreviver por longos perodos de tempo. Quando encontram-se em condies favorveis, esses esporos germinam, dando origem a uma nova clula. O processo fermentativo pode ser bastante prejudicado pela presena dessas formas resistentes, que podem germinar, aumentando sensivelmente a carga bacteriana, comprometendo toda a produo. A deteco de esporos um mtodo de controle importante dentro da indstria sucroalcooleira. Pode ser feita por meio de cultivo em placas, depois de germinadas, ou por contagem direta ao microscpio. A tcnica de colorao pode ser feita para diferenciar os esporos das clulas vegetativas. A colorao feita em esfregao preparado da mesma forma que na tcnica de Gram, adicionando sobre a lmina de vidro gotas de soluo verde malaquita 5%. Deixar colorir por 1 minuto e aquecer para emisso de vapores (no entrar em ebulio). Lavar e contracorar com safranina 0,5%. Lavar

Aula 6 - Mtodos microbiolgicos aplicados produo de lcool

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novamente e deixar secar. Observar ao microscpio. As clulas vegetativas so visualizadas em vermelho e os esporos em verde.

Figura 6.3: Colorao e identificao de endosporos


Fonte: http://microbiologiabrasil.blogspot.com/2008_12_01_archive.html

6.2.4.2 Teste de motilidade


Nesse teste podem ser utilizadas dois tipos de lminas: convencional ou com concavidade para gota pendente. Ser descrito o mtodo com lmina convencional. Colocar sobre a lmina uma gota de gua e transferir com auxlio de uma agulha, uma poro da colnia do microrganismo, homogeneizando-a com a gua. Cobrir com uma lamnula e observar ao microscpio, com objetiva de imerso (100x). Se o microrganismo apresentar movimento em vrias direes, ele tem motilidade.

6.2.4.3 Teste de catalase


Adicionar sobre a colnia do microrganismo uma gota de gua oxigenada a 3%. Se a cultura apresentar a enzima catalase, haver formao de efervescncia pela reao de converso da gua oxigenada em gua + O2.

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Figura 6.4: Teste de catalase positivo


Fonte: http://randstarteam.blogspot.com/

6.2.4.4 Interpretao dos resultados


Bacillus so caracterizados por bastonetes Gram-positivos, presena de esporos, clulas vegetativas com motilidade e presena de catalase. Lactobacillus bastonetes Gram-positivos, sem esporos, clulas vegetativas sem motilidade e ausncia de catalase.

6.3 Dextrana em caldo


Dextranas so polmeros de glicose, produzidos a partir de sacarose principalmente por bactrias do gnero Leuconostoc. A penetrao de microrganismos no colmo, atravs de rachaduras, contamina a cana formando dextranas, cuja presena afeta a qualidade do acar e a eficincia industrial. Ocorre perda de sacarose, aumento da viscosidade do caldo e dificuldade de filtrao no processo industrial.

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Objetivo obteno de um parmetro a ser usado na avaliao da qualidade da matria-prima. Material pipetas (1 ml,10 ml, 25 ml); bquer (100 ml); bales volumtricos (25 ml e 100 ml); tubos de ensaio; funil com filtro de vidro sintetizado (3D4); espectrofotmetro; bureta (5 ml); centrfuga; tubos de centrfuga; papel de filtro; banho-maria. Reagentes dextrana; cido tricloroactico a 10%; etanol absoluto; etanol a 80%; NaOH 2,5N (saturada com Na2SO4); reagente alcalino cprico; H2SO4 (2N); fenol 5%; H2SO4 concentrado. Procedimento transferir 1 ml de soluo de NaOH (2,5N) (saturada com Na2SO4) para tubo de centrfuga. Adicionar 5 ml de soluo problema. Adicionar 1 ml do reagente alcalino cprico - soluo de trabalho. Deixar em gua fervente por 5 minutos. Esfriar. Centrifugar a 5.000 rpm por 20 minutos. Desprezar o sobrenadante. Adicionar 7 ml da soluo de lavagem, suspender e agitar o precipitado. Centrifugar novamente. Desprezar o sobrenadante, inverter os tubos e deixar cinco minutos gotejando. Dissolver o precipitado com 2 ml de H2SO4 (2N) e transferir para balo de 25 ml. Lavar com mais 2 ml de H2SO4 (2N) e depois com gua at 25 ml. Agitar. Transferir 2 ml para tubos de ensaios padronizados. Adicionar 1 ml de soluo de fenol 5%. Adicionar 5 ml de H2SO4 concentrado, devendo ser colocado rapidamente e no centro da soluo. Usar bureta com ponta raspada. Colocar os tubos em banho-maria fervente durante 2 minutos. Esfriar. Fazer a leitura a 485 nm (filtro 50). Observao usar 2 ml de padro de trabalho e 2 ml de gua destilada como prova em branco. Preparo do padro de trabalho deixar a dextrana, no mnimo, uma semana em dessecador a vcuo. Pesar uma quantidade de dextrana que contenha 250 mg de dextrana pura e dissolver em gua at 100 ml (soluo estoque). Diluir 10 ml a 250 ml com gua destilada obtendo-se o padro de trabalho que deve conter 0,02 mg/ml. Clculo ppm de dextrana = 400 x (La-Lb)/(Lp-Lb) Onde: La = leitura da amostra Lb = leitura do branco Lp = leitura do padro

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6.4 Delta pH
Objetivo determinao da atividade microbiana (produo de cidos) em caldos e mosto. Material bquer de 250 ml; proveta de 100 ml; banho-maria ou estufa; bureta; pHmetro. Reagentes NaOH (1N); H3PO4 (1N). Procedimento coletar amostra de caldo (primrio, misto, mosto) e filtrar, se necessrio. Transferir 100 ml para um bquer e ajustar o pH para 5,5 (pH inicial, com NaOH (1N) ou H3PO4 (1N)). Incubar a 37C por 4 horas em banho-maria ou estufa. Determinar o pH aps incubao (pH final). Clculo Delta pH = pH inicial - pH final

6.5 Acidez sulfrica


Objetivo determinar a acidez em uma amostra de caldo e mosto. Material bquer de 100 ml; bureta de 10 ml; pipeta volumtrica de 20 ml; proveta de 50 ml; pHmetro. Reagentes NaOH (1N). Procedimento transferir 20 ml da amostra para um bquer de 100 ml. Adicionar 50 ml de gua destilada. Titular com NaOH (0,1N) at pH 8,5. Clculo Acidez = volume gasto de NaOH x fator 0,245 (g/L)

6.6 Nvel de floculao


Objetivo avaliar o nvel de floculao em vinho bruto. Material proveta (100, 500 ou 1000 ml). Procedimento coletar uma amostra do vinho na dorna, antes de centrifugar. Agitar para liberao de CO2. Colocar a amostra na proveta. Anotar o volume do sobrenadante aps 15 minutos. Expressar os resultados em % de floculao.

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6.7 Teste de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos


A avaliao de antimicrobianos utilizados na indstria alcooleira pode ser feita atravs de algumas metodologias diferentes. Em nosso estudo apresentaremos um mtodo que se baseia na variao da acidez do meio e outro pela determinao da variao da absorbncia, determinada por espectrofotometria.

6.7.1 Teste de variao da acidez


6.7.1.1 Preparo das solues-estoque
a) Soluo-estoque actidiona (inibidor de leveduras) pesar 0,1 g de actidiona e dissolver em 100 ml de gua destilada. b) Soluo-estoque de HJ pesar 0,01g de HJ, solubilizar em algumas gotas de lcool e dissolver em 100 ml de gua destilada. c) Soluo-estoque de virginiamicina pesar 0,01 g de virginiamicina, solubilizar em algumas gotas de lcool, dissolver em 100 ml de gua destilada. d) Soluo-estoque de penicilina pesar 0,01 g de penicilina e dissolver em 100 ml de gua destilada.

6.7.1.2 Procedimento
Preparar 4 Erlenmeyers de 250 ml, da seguinte forma: a) Erlenmeyer 1 Testemunha colocar 70 ml de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona. b) Erlenmeyer 2 Tratamento HJ 3 ppm (HJ) colocar 70 ml de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona + 3 ml da soluo-estoque de HJ (= 3 ppm). c) Erlenmeyer 3 Tratamento virginiamicina 3 ppm (V) colocar 70 ml de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque de actidiona + 3 ml da soluo-estoque de virginiamicina (= 3 ppm). d) Erlenmeyer 4 Tratamento penicilina (5 ppm) (P) colocar 70 ml de mosto de alimentao + 30 ml de vinho bruto + 1 ml da soluo-estoque e de actidiona + 5 ml da soluo-estoque de penicilina (= 5 ppm).

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Assim, temos:

Figura 6.5: Teste de variao de acidez


Fonte: CTISM

Em seguida, retirar 20 ml de cada Erlenmeyer para determinar a acidez inicial e, imediatamente incub-los em estufa a 35C por, aproximadamente, 6 horas. Aps esse perodo, retirar os Erlenmeyers da estufa e novamente determinar a acidez (acidez final).

6.7.1.3 Determinao da acidez


Determinar a acidez sulfrica das 4 amostras (acidez inicial). Procedimento utilizar 20 ml da amostra + 50 ml de gua destilada, ferver por 2 minutos, e titular com NaOH 0,1N, at pH = 8,5. Anotar o volume gasto para cada amostra. Clculo Acidez (g H2SO4) = Volume de NaOH gasto x 0,245 x fator do NaOH

6.7.1.4 Interpretao dos resultados


Calcular a variao da acidez (acidez final acidez inicial) para as 4 amostras. A amostra que apresentar a menor variao da acidez provavelmente corresponder ao antibitico mais recomendado para ser dosado na fermentao. No exemplo da Tabela 6.1, o HJ foi o mais indicado, seguido da virginiamicina, e por ltimo, a penicilina.

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Tabela 6.1: Variao de acidez das amostras


T Acidez inicial Acidez final Variao da acidez Fonte: Amorim, 2000 0,82 1,31 0,49 HJ (3 ppm) 0,84 0,88 0,04 V (3 ppm) 0,84 0,91 0,07 P (5 ppm) 0,83 0,98 0,15

6.7.2 absorbncia
Material e equipamentos tubos de ensaio com tampa rosquevel; suporte para tubos de ensaio; pipetas esterilizadas de 2 ml e 10 ml; bquer; estufa de esterilizao; estufa incubadora; autoclave ou similar; aquecedor com agitao; espectrofotmetro. Meio de cultivo YEPD. Reagentes e produtos a serem testados actdiona 10 ppm; KAMORAN; KAMORAN WP; CORSTAN; HJ GOLD; SPECTRAN 100E; TOP MIX; VIP-QR. Preparo do inculo adicionar a um tubo contendo 9 ml de meio de cultivo YEPD esterilizado, 1 ml da amostra (vinho bruto coletado das dornas) a ser testada. Incub-la por 24 horas a 35C. Observao manter o bico de Bunsen aceso sobre a bancada de trabalho, por 30 minutos antes do incio do teste e durante o mesmo. Procedimento adicionar assepticamente 2 gotas de soluo de actidiona a 10 ppm (inibidor de leveduras) em tubos de ensaio contendo 9,7 ml de meio de cultivo YEPD esterilizado. Utilizar 2 tubos (A e B) para cada concentrao de cada antibitico a ser testado, um tubo para prova em branco e outro para calibrao do aparelho. Identificar os tubos. Adicionar nos tubos A e prova em branco 0,3 ml do inculo obtido anteriormente. Os tubos B para calibrao no sero inoculados. Dosar os produtos a serem testados nos tubos identificados como A e B. Agitar os tubos. Efetuar a leitura inicial da absorbncia, de todos os tubos, a 520 nm em espectofotmetro imediatamente aps a dosagem dos produtos, usando para calibrao do aparelho o tubo reservado para tal (YEPD esterilizado). Incubar os tubos a 35C por 6 horas. Efetuar a leitura final de todos os tubos nas mesmas condies em que a leitura inicial foi obtida.

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Resultado absorbncia = absorbncia final (tubo Ax) absorbncia inicial (tubo Ax). O produto que, comparativamente e nas mesmas condies de teste, apresentar a menor absorbncia, ser considerado o mais eficiente frente aos contaminantes testados. Observao o absorbncia obtido pelas leituras dos tubos B (sem inculo) deve ser o mais prximo de zero possvel. Se isso no ocorrer, deve-se recorrer a outra metodologia para o teste, pois a interferncia dos prprios produtos testados nos valores de absorbncia invalida o teste.

Resumo
Nessa aula, conhecemos as principais tcnicas de monitoramento microbiolgico empregadas no processo industrial de produo de lcool. Entre elas, aprendemos mtodos aplicados ao controle da viabilidade celular, concentrao celular e brotamento em leveduras, identificao de bactrias e de leveduras contaminantes, com seus objetivos e procedimentos especficos, alm da caracterizao de Bacillus e Lactobacillus, contaminantes de grande incidncia nos processos de produo. Vimos tambm testes de sensibilidade de bactrias a antimicrobianos, que so teis para evitar a resistncia adquirida por bactrias a determinados antibiticos, possibilitando o uso racional desses medicamentos na indstria sucroalcooleira.

Atividades de aprendizagem
1. Defina viabilidade celular, brotamento e concentrao de leveduras. 2. Com base nos dados abaixo, calcule a viabilidade celular, a porcentagem de brotamento e a populao de leveduras: Total de clulas vivas = 500 Total de clulas mortas = 50 Total de brotamentos vivos = 30 Diluio = 1:20

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3. Explique por que a determinao da viabilidade celular um parmetro importante para o controle do processo fermentativo. 4. Quais as tcnicas utilizadas para determinar a viabilidade celular? 5. Considerando-se a tcnica de Pour Plate, determine o nmero de clulas de levedura/ml (expresse em UFC/ml): Diluio = 1/10.000 N colnias = 32 6. Como possvel fazer a deteco de leveduras selvagens? Explique. 7. Calcule o n bastonetes/ml da seguinte amostra: N campos = 60 Diluio da amostra = 1:2 FM = 14017,9 Volume da amostra = 0,002 ml N bastonetes contados = 263 8. A tcnica da colorao de Gram no pode ser feita em microrganismos que tiveram suas membranas danificadas fisicamente. Explique por qu. 9. Aps a realizao dos testes de colorao de Gram, deteco de esporos, motilidade e catalase para proceder caracterizao dos gneros Bacillus e Lactobacillus, como essas bactrias podem ser diferenciadas?

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Aula 7 Microbiologia do acar


Objetivos
Conhecer os principais microrganismos contaminantes do acar, suas caractersticas e importncia. Conhecer as principais tcnicas de anlises de bactrias, leveduras e bolores em acar. Apresentar os padres microbiolgicos nacionais e internacionais para qualidade do acar.

7.1 A importncia da microbiologia do acar


O acar produzido pelas usinas deve seguir padres microbiolgicos de qualidade que permitam seu consumo de forma segura em bebidas, alimentos enlatados, doces, etc., a fim de no causar no s prejuzos econmicos, mas principalmente os relacionados sade de seus consumidores. Dentre os microrganismos presentes no ambiente de fabricao dos acares esto bactrias, fungos e leveduras, cujo monitoramento de grande importncia para a manuteno da qualidade do produto. Os fatores que contribuem para a ocorrncia de microrganismos nas indstrias do acar resultam, na sua quase totalidade, do baixo nmero de medidas de qualidade e da ignorncia ou inobservncia das normas bsicas dos procedimentos de manipulao dos alimentos, como a aplicao das boas prticas de fabricao (BPF), que so imprescindveis para produo de alimentos microbiologicamente seguros. As medidas de qualidade devem ser implantadas em todas as etapas de processamento do acar, a fim de minimizar os problemas e proporcionar a produo de produtos que atendam aos padres internacionais de qualidade.

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7.2 Principais microrganismos relacionados ao processo de fabricao do acar


7.2.1 Mesfilos aerbios totais
As espcies mais frequentemente encontradas em alimentos so provenientes do solo. Crescem em temperaturas entre 20 e 40C, em meio com pH 5,0 a 9,0. So bastonetes Gram-positivos, aerbios e anaerbios facultativos. So representados especialmente por bactrias do gnero Bacillus. Todas as espcies desse gnero produzem esporos em meios aerbios, o que lhes confere resistncia s condies adversas (antibiticos, extremos de temperatura, etc.).

7.2.2 Bolores e leveduras


So microrganismos amplamente distribudos no meio ambiente, e se desenvolvem em meios menos favorveis ao desenvolvimento bacteriano, como baixos valores de pH, altas concentraes de sal ou de acar, baixa temperatura de armazenagem, presena de antibiticos e exposio irradiao. Podem causar deteriorao em alimentos, alterar o sabor, causar perda de odores, provocarem descolorao da superfcie dos alimentos e levar produo de metablitos txicos. A cana e o solo so as principais vias de entrada destes microrganismos na indstria.

7.2.3 Esporos termfilos produtores de flat-sour (acidez plana)


As bactrias produtoras de flat-sour so consideradas termfilas obrigatrias porque se desenvolvem bem entre 55 a 65C e seus esporos possuem extrema resistncia a elevadas temperaturas. So difceis de serem destrudos no alimento ou na indstria de processamento. Elas promovem a acidificao dos produtos, por meio da reduo do pH, sem haver produo de gs. So responsveis pela deteriorao de alimentos enlatados. Esta deteriorao chamada de flat-sour (acidez plana), j que este microrganismo praticamente no produz gs, no provocando alteraes nas embalagens. So bactrias encontradas no solo.

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7.2.4 Esporos termfilos produtores de H2S (bactrias de deteriorao sulfdrica)


So bactrias que promovem deteriorao em alimentos enlatados de baixa acidez, como milho, ervilha, cogumelo, tornando os alimentos enegrecidos, com odor caracterstico de sulfeto de hidrognio (semelhante a ovo podre), sem mostrar, no entanto, sinais de estufamento. Estas bactrias podem contaminar o acar, se a temperatura de aquecimento (no processo de fabricao de acar cristal) no for suficiente para a inativao dos esporos. So encontradas no solo.

7.2.5 Esporos termfilos produtores de gs (no produtores de H2S)


So microrganismos anaerbios obrigatrios, no produtores de H2S. Apresentam intensa produo de cido e gs, sendo altamente sacarolticos, e seus esporos tm elevada resistncia ao calor. A espcie mais importante Clostridium thermosaccharolyticum. Essas bactrias no so produtoras de toxinas ou infeces, diferentemente de algumas bactrias pertencentes ao gnero Clostridium spp, que produzem poderosas neurotoxinas, como C. tetani e C. botulinum, sendo consideradas patognicas e de grande importncia na sade pblica. As bactrias produtoras de gs, no entanto, causam deteriorao nos alimentos como acar, farinha, cereais, produtos enlatados, etc. So encontradas no solo.

7.2.6 Coliformes totais e fecais


So enterobactrias, frequentemente encontrados no trato intestinal de animais, como Escherichia coli, e algumas espcies so encontradas em vegetais, como Enterobacter aerogenes. Crescem em vrios substratos e utilizam carboidratos ou outros compostos orgnicos como fonte de energia. So capazes de produzir quantidades considerveis de cidos e gs a partir de acares, como a lactose. Causam sabores e odores desagradveis nos alimentos, tornando-os imprprios para o consumo humano. So considerados como indicadores de contaminao fecal e no se admite a sua presena em alimentos.

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Figura 7.1: Escherichia coli


Fonte: http://archive.microbelibrary.org/asmonly/details.asp?id=2038

7.2.7 Salmonellas
So enterobactrias, Gram-negativas, no esporuladas. Tambm fazem parte das enterobactrias patognicas, causadoras de problemas gastrointestionais para o homem e animais. A via direta de entrada so os alimentos e as amostras de acar que apresentam esse microrganismo, estando fora dos padres microbiolgicos.

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Figura 7.2: Salmonellas


Fonte: http://www.solabia.fr/solabia/produitsdiagnostic.nsf/sw_prod/8af14c118957deb2c12574c90031dbbd?opendocu ment&lg=en&

7.2.8 Bacillus cereus


So bactrias Gram-positivas, cuja faixa de pH para crescimento est entre 4,9 e 9,3. So produtoras de toxinas, que podem levar a dois tipos de intoxicaes, causando dores abdominais, diarria intensa, nuseas moderadas e raramente vmitos na forma clssica e na segunda forma, nusea aguda seguida de vmito. So amplamente distribudas, podendo ser encontradas no solo, poeira e gua.

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Figura 7.3: Bacillus cereus


Fonte: http://archive.microbelibrary.org/microbelibrary/files/ccimages/articleimages/atlas-bld/bacillus%20cereus%20fig2.jpg

7.2.9 Staphilococcus aureus


So bactrias Gram-positivas, encontrados em cavidades nasais, garganta e trato intestinal. Sua presena em alimentos indica manuseio inadequado, com contaminao a partir da pele, boca e fossas nasais dos manipuladores, bem como limpeza e sanitizao inadequada dos materiais e equipamentos. Algumas cepas so produtoras de toxinas, causando intoxicaes alimentares. Os sintomas da contaminao por S. aureus mais comuns incluem nuseas, vmitos, dores abdominais e diarria.

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Figura 7.4: Staphilococcus aureus


Fonte: http://archive.microbelibrary.org/asmonly/details_print.asp?id=2040&lang=

7.3 Anlises microbiolgicas


As amostras devem ser as mais representativas possveis do lote a ser analisado. Deve-se coletar diariamente 50 g de acar para compor amostras semanais ou mensais, acondicionando em frascos esterilizados. Para a execuo das anlises pesar 20 g de acar, de cada amostra, em Erlenmyer de 250 ml, previamente estril. Adicionar 100 ml de gua destilada e esterilizada. Agitar at a completa dissoluo do acar.

7.3.1 Contagem de bactrias mesfilas totais (aerbias)


Retirar 5 ml da amostra preparada, distribuindo-as em 5 placas de Petri. Em seguida, adicionar o meio de cultura glicose-triptona-gar. Aps homogeneizar e solidificar, proceder incubao das placas de Petri por 72 horas a 30C. Aps esse perodo, realizar as contagens das colnias produtoras de cido, expressando o resultado total em UFC de mesfilos/g de acar.

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Figura 7.5: Colnias de bactrias mesfilas aerbias


Fonte: Godoy, 2005

Figura 7.6: Colnias de bactrias mesfilas aerbias


Fonte: http://www.airelimpioilimitado.net/page/lema.html

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7.3.2 Contagem de bolores e leveduras


Seguindo o mesmo procedimento anterior, distribuir volumes de 5 ml da amostra em 5 placas de Petri e sobre as mesmas adicionar o meio de cultivo BDA (Batata-Dextrose-gar), acidificado com pH 3,5. Aps homogeneizar e solidificar, incubar por um perodo de 4 a 5 dias a 30C. Em seguida, realizar as contagens de colnias de leveduras e de bolores e expressar os resultados UFC de leveduras e bolores/g de acar.

Figura 7.7: Colnias de leveduras e bolores


Fonte: Godoy, 2005

7.3.3 Bactrias termfilas esporuladas


As amostras para contagem de bactrias termfilas esporuladas devem ser submetidas primeiramente a choque trmico, levando-as ebulio por 5 minutos e em seguida resfriando com gua.

7.3.3.1 Contagem de esporos de bactrias termfilas anaerbias totais e flat-sour (acidez plana)
Aps o choque trmico, distribuir 2 ml da amostra em cada uma das 5 placas de Petri. Em seguida adicionar o meio de cultura (glicose-triptona-gar), homogeneizar, solidificar e incubar em estufa temperatura de 55C por 48 horas. As colnias de bactrias produtoras de flat-sour so circundadas por um halo amarelo, que pode desaparecer aps a retirada das placas da estufa. Por isso, proceder a contagem logo aps a retirada e expressar o resultado em nmero de esporos termfilos flat-sour por 10 gramas de acar, multiplicando o total por 5.

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Figura 7.8: Colnias de bactrias produtoras de flat-sour


Fonte: Godoy, 2005

7.3.3.2 Contagem de esporos de bactrias termfilas anaerbias produtoras de gs (no produtores de H2S)
Aps choque trmico, distribuir 20 ml em 6 tubos de ensaios (3,3 ml/tubo) contendo 20 ml do meio de fgado (Liver Broth) aquecidos a 55C. Vedar os tubos com uma camada de parafina, mergulhando os tubos em gua para solidificar. Incub-los em anaerobiose a 55C por 72 horas. Aps esse perodo, realizar as contagens dos tubos positivos, isto , aqueles que apresentarem deslocamento da parafina para cima, indicando o crescimento das bactrias termfilas presentes. Os resultados desse teste so apenas qualitativos, no podendo ser expressos em nmeros.

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Figura 7.9: Termfilos anaerbios produtores de gs (no produtores de H2S)


Fonte: Godoy, 2005

7.3.3.3 Contagem de esporos de bactrias termfilas anaerbias produtoras de H2S


Para a determinao de esporos anaerbios termfilos produtores de cido sulfrico, distribuir 20 ml da amostra, submetida ao choque trmico, em 6 tubos de ensaio (3,3 ml/tubo) contendo o meio gar-sulfito, previamente exaustados, ou seja, aquecidos a 55C. Colocar a amostra de 3,3 ml abaixo da superfcie do meio, agitar suavemente, em seguida, evitando-se a introduo de ar. Aps solidificar, incubar os tubos a 55C por 48 horas. As colnias de deteriorao sulfdrica so negras. Realizar as contagens nos 6 tubos e expressar o resultado como nmero de esporos por 10 gramas de acar.

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Figura 7.10: Termfilos anaerbios produtores de H2S


Fonte: Godoy, 2005

7.3.4 Contagem de coliformes totais e fecais


Dissolver 10 g de acar em 90 ml de gua destilada esterilizada. Preparar 9 tubos de ensaio com 10 ml do meio de caldo lactosado em cada tubo, com tubo de Durhan: 3 (grandes) em concentrao dupla e 6 (mdios) com concentrao simples. Autoclavar 121C por 15 minutos. Em seguida, nos tubos com concentrao dupla inocular 10 ml da amostra, nos 3 primeiros de concentrao simples 1 ml e nos 3 ltimos 0,1 ml. Aps 48 horas de incubao temperatura de 37C, proceder o teste confirmativo nos tubos que apresentarem resultados positivos (presena de gases no tubo de Durhan). Com a ala de platina, repicar cada tubo positivo para tubos com 5 ml de caldo Verde Brilhante 2% e tubos com 5 ml de meio EC. Incubar o meio Verde Brilhante 2% por 24-48 horas temperatura de 37C, enquanto o EC por 24 horas temperatura de 45C. O meio de cultura Verde Brilhante 2% usado como teste confirmativo para presena de coliformes totais e o meio EC para bactrias do grupo dos coliformes fecais (Escherichia coli). Se ocorrer produo de gs (fermentao), indica presena de coliformes totais e fecais, respectivamente.

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7.4 Padres internacionais para o controle microbiolgico do acar


Veja na Tabela 7.1 os padres internacionais exigidos para controle microbiolgico do acar.
Tabela 7.1: Controle microbiolgico do acar
Exigido por Mesfilas Leveduras e bolores 50 UFC/g Termfilas

Flat-sour
50 esp/10 g

H2S (+) 5 esp/10 g

H2S (-) < 65% dos tubos (+)

Salmonella sp ausente/ 25 g

National Canners Association Natinal Soft-Drinks Association


ICUMSA Coca-Cola Internacional

50 UFC/g

200 UFC/10 g

10 UFC/10 g < 65% dos tubos (+)

200 UFC/10g 200 UFC/10 g

20 UFC/10 g 10 UFC/10 g

50 esp/10 g

5 esp/10 g

Fonte: Amorim, 2000

Resumo
Vimos nesta aula sobre os principais microrganismos contaminantes do acar. Entre eles esto bactrias, fungos e leveduras, cujo monitoramento e deteco so de grande importncia para a manuteno da qualidade do produto. As medidas de qualidade devem ser implantadas em todas as etapas de processamento do acar, a fim de minimizar os problemas e proporcionar a fabricao de produtos que atendam aos padres internacionais de qualidade. Para isso aprendemos as principais caractersticas dos contaminantes e as anlises microbiolgicas respectivas para o devido controle.

Atividades de aprendizagem
1. Preencha as lacunas de acordo com as caractersticas dos principais contaminantes do acar: a) Bactrias de deteriorao sulfdrica. b) Termfilas produtoras de gs. c) Bactrias produtoras flat-sour.

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d) Salmonellas. e) Staphilococcus aureus. f) Mesfilos aerbios totais. ( ) Elas promovem a acidificao dos produtos, por meio da reduo do pH, sem haver produo de gs. ( ) So enterobactrias, Gram-negativas, no esporuladas. Tambm fazem parte das enterobactrias patognicas. ( ) So bastonetes Gram-positivos, esporulados aerbios e anaerbios facultativos, representados especialmente por bactrias do gnero Bacillus. ( ) Bactrias Gram-positivas, encontrados em cavidades nasais, garganta e trato intestinal. ( ) So bactrias que promovem deteriorao em alimentos enlatados de baixa acidez, com odor caracterstico semelhante a ovo podre. ( ) A espcie mais importante Clostridium thermosaccharolyticum. 2. Por que deve ser feito o controle microbiolgico do acar? 3. Como podem ser caracterizadas as colnias de bactrias produtoras de flat-sour? 4. Na contagem de esporos de bactrias no produtoras de H2S, qual a funo da parafina? Explique.

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Microbiologia Aplicada

Referncias
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Currculo do professor-autor
Darlene Ana de Paula Vieira Professora do Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois IFGois, atuando na rea biolgica. Formada em biologia pela Pontifcia Universidade Catlica de Gois (1998), com mestrado em Biologia pela Universidade Federal de Gois (2006). Acumulou experincia profissional de mais de 14 anos na rea de educao, iniciou as suas atividades profissionais em 1994, como professora da rede estadual de educao. Nayara Cludia de Assuno Queiroz Fernandes atua como Tcnica em Laboratrio de Cincias no Instituto Federal de Educao, Cincia e Tecnologia de Gois. Possui graduao em Farmcia pela Universidade Federal de Gois (2005), com especializao em Cincias Biolgicas pelas Faculdades Integradas de Jacarepagu (2009). Acumulou experincia profissional na rea de Farmcia Clnica, com aperfeioamento em Farmacologia Clnica pelo Instituto de Ensino Ethosfharma (2006).

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