FACULTAD DE INGENIERIA QUMICA

Ingeniera en Biotecnologa Biologa Molecular EXTRACCIN DE ADN PLASMDICO

28 Agosto 13

Introduccin Los plsmidos son molculas de ADN de doble cadena extracromosomal, pequeas y circulares, que estn presentes en muchos tipos de bacterias y tambin en algunas levaduras y hongos. Estos plsmidos pueden existir y replicarse independientemente del cromosoma o pueden estar integrados en ste y aunque no son necesarios para el crecimiento y la reproduccin del hospedero, pueden contener genes que aportan a la bacteria una ventaja competitiva, por ejemplo la resistencia a antibiticos, nuevas capacidades metablicas, etc.
Cuadro III. Ejemplos de plsmidos naturales presentes en algunas bacterias

Plsmido

Tamao (Kb) 95-100 80 21 9 83 75

Husped

Caracterstica

Factor F R1 pSH6 ColE1 Ent(P307) TOL

E. coli, Salmonella, Citrobacter Banterias Gram negativas Staphylococus aureus E. coli E. coli Pseudomonas putida
1

Pilus sexual, conjugacin Resistencia a antibiticos Resistencia a antibiticos Produccin de colicana E1 Produccin de enterotoxina Degradacin de tolueno

Prescott, Harley y Klein (1999)

Debido a que los plsmidos pueden transferirse de una bacteria a otra, estas molculas son de gran valor para los microbilogos y genetistas moleculares en la construccin y transferencia de nuevas combinaciones genticas y en la clonacin de genes. Actualmente existen plsmidos recombinantes que portan genes de diferentes orgenes y permiten, mediante el uso de las enzimas de restriccin, cortar y pegar genes y entonces transferir estas construcciones dentro de una bacteria, de manera que esta puede ser forzada a manufacturar el ADN y algunas veces la protena producto de ese gen. As se tiene una gran cantidad de ADN plasmdico conteniendo un gen de inters para otros usos, como por ejemplo obtener un ADN molde, obtener la secuencia del gen, realizar mutaciones en el gen para modificar su funcin, o simplemente producir una protena de inters. Los plsmidos que se utilizan para la clonacin de genes o fragmentos de ADN (Fig. 2) constan de los siguientes elementos bsicos: un sitio de origen de la replicacin (ORI) que permite la replicacin autnoma del plsmido, una vez entro de la bacteria. un gen de resistencia a un antibitico (Vg. Ampr) que permita la seleccin de las clulas bacterianas transformadas un sitio mltiple de clonacin (SMC), que consiste en una regin del plsmido que contiene sitios de reconocimiento y corte para diferentes 15

enzimas de restriccin. Este sitio est embebido dentro de un gen que al expresarse le confiere a la bacteria alguna caracterstica distinguible y que permite conocer si la bacteria transformada porta un plsmido vaco (sin inserto) o cargado (con inserto). Este gen se conoce comnmente como reportero. un promotor (P) y un terminador (T) encargados de regular la trascripcin del gen reportero.

Figura 2. Estructura bsica de un plsmido recombinante. OR: sitio de origen de la replicacin, Amp r: gen de resistencia a ampicilina, P: promotor, SCM: sitio de clonacin mltiple, T: terminador de la transcripcin

Conservacin de ADN plasmdico. Los plsmidos pueden ser mantenidos por un periodo corto (hasta un mes) en cepas bacterianas de forma muy simple creciendo en placas selectivas y almacenndolas a 4 C. Para almacenarlos por perodos de tiempo ms largos, se prepara un cultivo saturado de la bacteria que contiene el plsmido en presencia del agente selectivo apropiado y se adiciona un volumen igual (aprox. 1 a 2 ml) de glicerol estril y se congela a -70 C en viales estriles. Las clulas as conservadas deben ser recuperadas por crecimiento en placa con medio selectivo. El ADN plasmdico extrado puede ser almacenado en buffer TE a 4 C durante varias semanas o durante varios aos a -20 C -70 C (preferentemente en etanol al 70%). Muchos investigadores prefieren almacenar los plsmidos purificados y no las clonas bacterianas, debido a que los plsmidos conservados en bacterias algunas veces se pierden, se reordenan o acumulan inserciones de secuencias durante el almacenamiento o la recuperacin. Sin embargo, no hay evidencia de que estos fenmenos ocurran en clulas congeladas. Objetivo Ensayar la recuperacin de ADN plasmdico de un cultivo puro por dos mtodos distintos.

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PROTOCOLOS (P) P1. Miniprep o preparacin en pequea escala por el mtodo de lisis alcalina. Materiales y Equipos 5 ml de cultivo de E. coli (KRN) en medio lquido LB con ampicillina 5 ml de cultivo de E. coli en medio lquido LB. 300 l de solucin GTE (Glucosa/Tris/EDTA) 600 l de solucin NaOH/SDS 400 l de solucin de acetato de potasio. 5 ml de Etanol absoluto. 5 ml de Etanol 70% 80 l de TE 5 tubos de microcentrfuga de 1.5 ml ( tubos eppendorf o similares) Micropipeta de 1000l con puntas. Micropipeta de 200 l con puntas Micropipeta de 10 l con puntas 2 Pipetas pasteur Bao de hielo Microcentrifuga Vortex Cronmetro

Desarrollo. 1. Inocular 5 ml de medio de cultivo lquido con la cepa bacteriana de inters e incubar a las condiciones de crecimiento apropiadas hasta que el cultivo se encuentre saturado (16 h o toda la noche). 2. Centrifugar 1.5 ml del cultivo a mxima velocidad durante 20 seg. Desechar el sobrenadante con una pipeta Pasteur.
Las centrifugaciones de los puntos 2 y 6 pueden realizarse a 4C o a temperatura ambiente. Tiempos ms prolongados de centrifugacin pueden ocasionar dificultad para resuspender las clulas.

3. Resuspender la pastilla en 100 l de solucin GTE y dejarla reposar 5 min. 4. Adicionar 200 l de solucin NaOH/SDS, mezclar por inversin y mantenerlo en hielo durante 5 min.
La solucin NaOH/SDS debe ser preparada en el momento en que se vaya a utilizar pues de lo contrario se precipita.

5. Aadir 150 l de solucin de acetato de potasio y mezclar en vortex a mxima velocidad por 2 seg. Colocar en hielo durante 5 min.

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6. Centrifugar por 3 min como en el paso 2 para separar debris celular y ADN cromosomal. 7. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, mezclar con 0.8 ml de etanol al 95%, y dejarlo reposar 2 min a temperatura ambiente para precipitar los cidos nuclicos. 8. Centrifugar 1 min a temperatura ambiente para precipitar el ADN y ARN plasmdico. 9. Desechar el sobrenadante y lavar la pastilla con 1 ml de etanol al 70% . Secar la pastilla a vacio. 10. Resuspender la pastilla en 30 l de buffer TE y comprobar la extraccin del ADN plasmdico por electroforesis. Puntos crticos Es importante tener en cuenta que la bacteria que contiene el plsmido de inters (clona) siempre tiene que ser resembrada en el medio que contenga la presin de seleccin que obligue a mantener el plsmido, de lo contrario se puede curar la clona y perder la construccin (ver introduccin). En este protocolo el punto 4 resulta crtico pues la lisis alcalina destruye el ADN bacteriano pero conserva el ADN plasmdico. La contaminacin por RNA puede interferir en la deteccin de fragmentos en el gel de agarosa; esta interferencia puede eliminarse adicionando a la mezcla de digestin 1l de una solucin de RNasa 10mg/ml (libre de DNasa) . Consideraciones de tiempo Utilizando este protocolo es posible procesar hasta 12 clonas en una hora.

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P2. Miniprep en 10 minutos Materiales y Equipos o 1 Cultivo de E. coli (KRN) en caja con medio LB y ampicilina. o 1 Cultivo de E. coli DH5en caja con medio LB. o 500 l de agua desionizada estril. o 800 l de solucin TENS (Tris/EDTA/NaOH/SDS) o 500 l de solucin de acetato de sodio 3.0 M pH 5.2 . o 5 ml de Etanol absoluto. o 5 ml de Etanol 70% o 5 tubos de microcentrfuga de 1.5 ml ( tubos eppendorf o similares) o Micropipeta de 1000l con puntas. o Micropipeta de 200 l con puntas o Micropipeta de 10 l con puntas o Palillos estriles o Bao de hielo o Microcentrifuga o Vortex o Cronmetro Desarrollo 1. Tomar una cantidad de cultivo bacteriano directamente de la caja (equivalente a un grano de arroz) con un palillo de dientes estril y resuspenderlo en 50 l de agua estril. Agitar en vortex. Procesar simultneamente los dos cultivos que se proporcionan: E coli (KRN) crecido en medio LB con ampicilina y el cultivo E. coli DH5 cultivado en medio LB. 2. Adicionar 300 l de TENS, mezclar en vortex de 2 a 5 segundos. 3. Adicionar 150 l de acetato de sodio 3.0 M pH 5.2. Mezclar en vortex de 2 a 5 seg. para mezclar completamente. 4. Centrifugar 2 min a 14000 rpm para separar los restos celulares y el ADN. 5. Transferir el sobrenadante a un tubo limpio y mezclar con 0.9 ml de etanol absoluto fro (a -20C). Invertir manualmente el tubo al menos 5 veces. En este punto se precipita el plsmido. 6. Centrifugar 2 minutos a 14000 rpm. 7. Lavar la pastilla 2 veces con 1 ml de etanol al 70%. Secar.

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8. Resuspender en 50 l de agua y comprobar la extraccin de ADN plasmdico por electroforesis en gel de agarosa al 0.8% en TBE 1X. Conservar el ADN plasmdico en congelacin. Puntos crticos Es importante no tomar demasiada biomasa pues esto potencia la probabilidad de contaminacin de la preparacin con ADN genmico. En este tipo de preparaciones difcilmente se observa un precipitado, dada la pequea cantidad de ADN obtenido. Debe tener presente que por el tamao del plsmido tampoco se observa la caracterstica nube de ADN despus de agregar el etanol, sin embargo, confe en le mtodo y compruebe sus resultados mediante electroforesis. La contaminacin con ADN genmico puede ser deletrea en dependencia de la finalidad de la aplicacin. Si se desea digerir el plsmido para obtener el inserto, es aconsejable evitar la presencia de ADN genmico que puede causar un smear que dificulte ubicar el fragmento de inters. Consideraciones de tiempo Dada la simplicidad de este protocolo y el poco tiempo necesario para la extraccin del plsmido, este mtodo es ideal cuando se desea procesar un elevado nmero de clonas. Sin embargo, si el plsmido resultante ha de ser subclonado o secuenciado, se recomienda realizar una digestin con ARNasa y una segunda precipitacin etanlica para garantizar un adecuado grado de pureza. La calidad de esta preparacin permite realizar digestiones con enzimas de restriccin y limpiar el inserto a partir del gel de agarosa utilizando NaI y una suspensin de SiO2.

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PREPARACIN DE SOLUCIONES Y MEDIOS DE CULTIVO o Solucin GTE (Glucosa/Tris/EDTA): Glucosa 50 mM, Tris.HCl 25 mM pH 8.0, y EDTA 10mM. Esterilizar en autoclave y almacenar en refrigeracin. o Solucin NaOH/SDS. Hidrxido de sodio 0.2 N y SDS 1% (w/v). Preparar inmediatamente antes de usarse. Se pueden prepara soluciones concentradas, por ejemplo mezclar 1ml de NaOH 1 N y 0.5 ml de SDS 10% y se lleva a 5 ml con agua destilada. o TENS (Tris/EDTA/NaOH/SDS): NaOH 0.1 N, SDS 0.5%, Tris 10 mM pH 7.5, EDTA 1 mM pH 8.0. pH final 8.0 o Medio LB (Luria y Bertani): Extracto de levadura 5 g, NaCl 10 g, Triptona 10 g. Disolver los ingredientes uno por uno y completar a un volumen de 1000 ml. Esterilizar en autoclave y se almacenar a temperatura ambiente.
Para preparar placas se aaden 20 g de agar bacteriolgico antes de esterilizar el medio. Las placas se pueden conservar a temperatura ambiente para evitar condensacin de vapor de agua en la tapa, lo que puede causar contaminacin del medio.

Acetato de potasio 5M: A 29.5 ml de cido actico glacial agregar perlas de KOH hasta obtener un pH de 4.8 (De 20 a 30 g). Completar a 100 ml. Almacenar a temperatura ambiente. No autoclavear esta solucin! Acetato de sodio 3 M: Disolver 408g de acetato de sodio trihidratado (x 3H2O) en 800 ml de agua. Aforar a un litro. Esterilizar en autoclave y se almacenar a temperatura ambiente. o Ampicilina 250 mg/ml. Se utiliza un mpula de Binotal (Bayer) de 500 mg. Aadir el diluyente (2 ml de agua estril libre de pirgenos) directamente en el frasco usando una jeringa estril. Esta solucin queda a una concentracin de 250 mg/ml y puede conservarse en refrigeracin y protegida de la luz hasta por seis meses.
Los antibiticos se adicionan una vez que el medio lquido est estril y a temperatura ambiente. En el caso de los medios con agar se espera a que la temperatura del medio ya estril sea aproximadamente 45C (que pueda tocarse con la mano sin que queme) y se adiciona el antibitico antes de vaciar el medio a la caja.

o Otros antibiticos
Algunos antibiticos comnmente utilizados en la seleccin de plsmidos recombinates. Antibitico Ampicilina Cloramfenicol d-Cicloserina Gentamicina Kanamicina Acido nalidxico Streptomicina Tetraciclina Stock (mg/ml) 5 10 10 10 10 5 50 12 Disolvente Agua metanol Buffer fosfato 0.1 M, pH 8.0 Agua Agua Agua Agua Etanol 70% Refrigeracin Refrigeracin Muy inestable. Preparar al momento de usar y descartar el sobrante Refrigeracin Congelacin (-20C) Refrigeracin Refrigeracin Congelacin y protegido de la luz (-20C) Conservacin Conc. final (g/ml) 50 20 200 15 30 15 30 12

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