TCNICAS

TCNICAS
IMUNOENZIMTICAS
IMUNOENZIMTICAS
ENZIMAIMUNOENSAIO
ENZIMAIMUNOENSAIO
As tcnicas imunoenzimticas so baseadas na
utilizao de Ag ou Ac marcados com enzimas e
permitem a deteco, titulao e quantificao de
substncias de interesse biolgico
localizao de constituintes celulares, medida de pq
quantidades de Ag, Ac e haptenos
sistemas homogneos e heterogneos em fase
slida
O marcador marcador uma enzima enzima que na presena de um
substrato altera sua cor, de modo a diferenciar o teste
positivo do negativo
ENZIMAIMUNOENSAIO
ENZIMAIMUNOENSAIO
Vantagens: Vantagens:
S, reagentes estveis, testes manuais ou
automao, sistemas de deteco (leituras): visuais a
fotomtricas, com substratos coloridos, fluorescentes
ou luminescentes
A enzima deve ter as seguintes propriedades: A enzima deve ter as seguintes propriedades:
ligadas covalentemente ao Ag ou Ac, alta atividade
especfica, produto corado estvel, fcil
quantificao, conjugao e obteno na forma
purificada, sem perda da sua reatividade,
ter preo acessvel
ENZIMAIMUNOENSAIO
ENZIMAIMUNOENSAIO
amarelo-S
lilas-!ns
P-NFF
5-B-+-C-3-!F
Fosfatase
alcalina
laranja-S, azul-S
marrom-!ns, violeta-!ns
OPD, TNB
DAB, +CN
H
2
O
2
Peroxidase
cor cromgeno substrato enzima
S= solvel / Ins= insolvel
OPD OPD: orto-fenil-diamina TMB TMB: tetrametilbenzidina
DAB DAB: diaminobenzidina 4CN 4CN: 4-Cloro-1-naftol
ENZIMAIMUNOENSAIO
ENZIMAIMUNOENSAIO
REAES IMUNOENZIMTICAS
-Imunoperoxidase
-ELISA
-Dot-ELISA
-Western blot
ENZIMAIMUNOENSAIO
ENZIMAIMUNOENSAIO
IMUNOPEROXIDASE IMUNOPEROXIDASE
1966, Avrameas e Uriel; Nakane e Pierce
utilizao: deteco e localizao de Ag celulares Ac
precipitados so vistos em microscpio ptico
comum e eletrnico
enzima: peroxidase
a enzima converte o componente cromgeno
(substrato + doador de hidrognio) em produto
insolvel que precipita no stio da reao
PAP (peroxidase anti-peroxidase)
ELISA (ENZYME-LINKED
ELISA (ENZYME-LINKED
IMMUNOSORBENT ASSAY)
IMMUNOSORBENT ASSAY)
1971- Engvall e Permann, Van Wemmen e Schuurs
molcula solvel adsorvida no suporte
alternativa ao RIE para a deteco de Ag e Ac
apresenta resultado final na forma de produto
solvel corado
PRINCPIO PRINCPIO
Imobilizao de um dos reagentes em uma fase slida,
enquanto outro reagente pode ser ligado a uma
enzima, com preservao tanto da atividade
enzimtica como da imunolgica do anticorpo
(molcula solvel adsorvida ao suporte).
Fase slida Fase slida: : placas plsticas, partculas de poliestireno,
partculas de agarose, poliacrilamida, dextran, fibra de
vidro, micropartculas, prolas, tubos
Cuidados: Cuidados: parmetros, reagentes (padronizao)
suporte: tipo de material escolhido;
Ag (pesquisa de Ac) ou Ac (pesquisa de Ag): grau de
pureza
conjugado
Vantagens: Vantagens: aplicado em vrios sistemas, S e E, rpido,
baixo custo, simplicidade da tcnica, automao em
diferentes graus
ELISA
ELISA
Enzimas comumente utilizadas Enzimas comumente utilizadas
ELISA
ELISA
+50 amarelo-S P-NFF
Fosfatase
alcalina
+92f
+50
laranja-S,
azulfamarelo-S
OPD, TNB H
2
O
2
Peroxidase
nm cor cromgeno substrato enzima
Resultado Resultado: :
visual (qualitativo)
densidade ptica (DO)
(quantificao/espectrofotometricamente)
Limiar de reatividade (cut-off)
Titulao (diluio em srie)
Absorbncia
Unidade padro (absorbncia transformada em
unidade)
ELISA
ELISA
Para Anticorpo Para Anticorpo
ELISA indireto ELISA indireto
ELISA de captura para Ac ELISA de captura para Ac
Para Para Antgeno Antgeno
ELISA de captura para Ag ELISA de captura para Ag
ELISA de competio com Ac marcado ELISA de competio com Ac marcado
ELISA de competio com Ag marcado ELISA de competio com Ag marcado
ELISA
ELISA
ELISA INDIRETO
ELISA INDIRETO
Ag fixado
Ac da
amostra
lavagem
conjugado
lavagem
substrato
cromognico
leitura
Ac fixado
Ac da
amostra
Ag* marcado
(conjugado)
lavagem
Ag
lavagem
conjugado
lavagem
substrato
cromgeno
leitura
ELISA de captura para Ac
ELISA de captura para Ac
Mtodo de Captura para
Mtodo de Captura para
Antgeno
Antgeno
Ac fixado
Ag da amostra
lavagem
conjugado
lavagem
Substrato
cromognico
leitura
ELISA COMPETIO COM
ELISA COMPETIO COM
ANTICORPO MARCADO
ANTICORPO MARCADO
Ag fixado
Ac* (conjugado) +
Ag no marcado (amostra)
lavagem
Substrato
cromognico
leitura
MTODO DE COMPETIO COM
MTODO DE COMPETIO COM
ANTGENO MARCADO
ANTGENO MARCADO
Ac fixado
Ag* (conjugado) +
Ag no marcado (amostra)
lavagem
Substrato
cromognico
leitura
IMMUNO-DOT
1982 - Hawkes
variao do ELISA
amostras aplicadas na forma de gotas
apresenta resultado final na forma de produto
insolvel corado
suporte: membrana de nitrocelulose, nylon, tecido
de polister, lminas plsticas
dot-ELISA, dot-immunobinding assay, dot-blotting
assay, dot-blot ELISA
o cromgeno cromgeno deve ser deve ser precipitante precipitante sob ao da
enzima, pois o teste colorido ser visualizado sobre o
dot (mancha)
ensaios qualitativos, membrana de nitrocelulose (alta
adsoro) e utiliza pequenas quantidade de Ag (na
sensibilizao) e Ac (amostra:1 l), simples, rapidez,
caracterizao de MoAc, intensidade da cor s pode ser
avaliada visualmente e portanto subjetiva, precipitado
estvel
Enzimas Enzimas: : peroxidase e fosfatase alcalina
IMMUNO-DOT IMMUNO-DOT
lilas-!ns 5-B-+-C-3-!F
Fosfatase
alcalina
marrom-!ns, violeta-!ns DAB, +CN H
2
O
2
Peroxidase
cor cromgeno substrato enzima
IMMUNO-DOT IMMUNO-DOT
Membrana Ag
Ac
amostra
lavagem
Conjugado
substrato
lavagem
leitura
Western blotting
Western blotting
SDS-PAGE
1969 Weber e Osborn
1970 Laemmli
identifica protenas e glicoprotenas
separao de acordo com tamanho
gel de poliacrilamida com SDS (porosidade)
1979 - Towbin: transferncia
identificao imunolgica das fraes separadas e
transferidas
Etapas Etapas
preparao do gel (concentrao poliacrilamida/gradiente)
SDS (detergente aninico/confere carga negativa)
migrao: plo - plo +
preparo da amostra (solubilizao das protenas)
tampo corrida
voltagem/amperagem
transferncia (semi-seco; over-night)
membrana (nitrocelulose; PVDF)
Western blotting
Western blotting
Western blotting
Western blotting
Emprego: Emprego: pesquisa de Ag ou Ac diagnstico
qual protena est sendo reconhecida diferentes
perfis fase da doena
Western blotting
Western blotting
DOT-ELISA: esquema para
deteco de Anticorpos anti-HIV
DOT-ELISA: esquema para deteco de
Anticorpos IgA anti-Chlamydia trachomatis