EXTRAO DE DNA

Eduardo Dias

O exame de DNA para fins de identificao pessoal considerado um dos maiores avanos do sculo na rea da gentica. Atualmente, grande a necessidade de determinar paternidade com confiabilidade em diversas situaes da vida. Esta necessidade surge, por exemplo, em casos amigveis de confirmao de paternidade, disputas legais para fins de penso alimentcia e herana, casos criminais envolvendo estupro, rapto, troca ou abandono de crianas e casos mdicos de diagnstico pr-natal e aconselhamento gentico. Outra grande utilidade a identificao humana em investigaes criminais. A anlise de amostras biolgicas como provas forenses teve seu incio no sculo XX utilizando-se os grupos sangneos ABO, seguidos pela utilizao do complexo HLA (Histocompatibility Leucocyte Antigen). Apenas em 1985 a tipagem molecular do material gentico foi utilizada oficialmente pela primeira vez, na Inglaterra. Devido ao alto grau de variabilidade observado nas regies polimrficas do DNA e ao rpido avano nas reas de biologia molecular e estatstica populacional, a tipagem de polimorfismos humanos em nvel de DNA hoje o mtodo mais sensvel, especfico e informativo para a identificao humana, tornando-se um elemento crucial na elucidao de casos forenses. O teste de DNA oferece a soluo cientfica para a resoluo destas e outras questes. Ter um conhecimento mnimo sobre as tcnicas de estudo para extrao e identificao seqencial do DNA de fundamental importncia, pois evita que sejam valorizados exames feitos de forma no idnea. Existem vrias tcnicas para extrao do DNA, que utilizam diferentes metodologias e espcimes biolgicos. O sangue o padro-ouro de material utilizado para extrao de DNA porque fonte abundante de informao gentica e por fornecer amostra fresca para anlise. No entanto, muitos outros materiais podem ser efetivamente analisados: clulas epiteliais da mucosa oral; unhas, plos e fios de cabelo (regio do bulbo capilar); manchas de material biolgico (lquido seminal, urina, saliva) em vidro, faca, txtil; ossos carbonizados, ossadas ou dentes; material anatomopatolgico; e inclusive clulas deixadas por impresso digital em selos, filtros de cigarro, copos, talheres e telefone. A extrao do DNA a partir de sangue perifrico consiste de uma srie de etapas, que se baseiam na eliminao do material no passvel de ser analisado, at a obteno do cido nuclico em questo. Portanto, parte-se do princpio de que devem ser lisados os eritrcitos (anucleados), os leuccitos, o RNA e as protenas, para obteno do DNA. Uma vez extrado, o material gentico deve ser analisado. Duas tcnicas so rotineiramente utilizadas: o RFLP (restriction fragment length polymorphism) e o PCR (polymerase chain reaction). O mtodo RFLP baseia-se na identificao de padres genticos, aps a obteno de fragmentos de DNA por tratamento com enzimas de restrio. Este processo de anlise necessita de maiores quantidades de material de amostra e a tcnica fornece bandas de diferentes tamanhos para leitura, constituindo um padro nico para cada indivduo. O mtodo PCR baseia-se na amplificao de regies prselecionadas, por ao da enzima Taq polimerase, necessitando de menores quantidades de cido desoxirribonucleico. uma tcnica rpida e automatizada que pode obter o padro gentico do DNA de um nico bulbo capilar, de uma clula, de uma amostra com DNA altamente degradado ou de material contaminado. Seqncias de DNA repetitivo em tandem esto amplamente dispersas pelo genoma, agrupadas em minissatlites (9-80 pb; nmero varivel de repeties em tandem VNTR)

ou em microssatlites (2-5 pb; repeties curtas em tandem STR). Estas regies so extremamente polimrficas, ou seja, a variedade de alelos presentes na populao to grande que diferencia um indivduo do outro quando mltiplos locos de microssatlites so examinados. Quanto mais polimrficos forem os locos analisados, maiores so as chances de que eles sejam informativos na determinao da identidade. E quanto maior o nmero de locos polimrficos analisados, maior o grau de certeza obtida na anlise. Para se obter um perfil gentico de um indivduo especfico, o resultado estabelecido pela diferena de tamanho das bandas causada por menor ou maior nmero de blocos repetidos. Outra forma de anlise est no seqenciamento destas bandas, que d maior confiabilidade ao exame. Uma banda pode ter o mesmo tamanho de outra, mas no ser idntica primeira em relao seqncia de bases. A anlise do DNA no identifica um nico indivduo, mas sim fornece a probabilidade estatisticamente comprovada de sua incluso ou excluso. Pode chegar a uma semelhana estatstica de 99,99%, mas nunca ser 100%. Isso significa que a probabilidade de uma dada combinao de alelos ocorrer ao acaso menor do que 0,01%. Portanto, a chance de existir um outro indivduo com a mesma informao gentica nas regies analisadas imensamente remota, mas existe. Assim, deve-se associar anlise do DNA outros dados da investigao. Os clculos de probabilidades so baseados em tabelas de frequncias allicas determinadas experimentalmente em amostras representativas da populao brasileira. Nos casos de incluso de paternidade, uma certeza maior que 99,99% obtida com cinco ou seis locos, apesar de um nmero maior de locos ser rotineiramente utilizado (em torno de 13). Nos casos de excluso de paternidade sempre obtemos excluso em mais de dois locos, geralmente de trs a cinco locos. A investigao de vnculo gentico de filiao por DNA permite determinar se um indivduo ou no o pai (ou a me) biolgico (a) de outro indivduo. Ao contrrio dos exames usados no passado, onde somente era possvel provar que uma pessoa no era o pai biolgico (excluso de paternidade), o exame de DNA permite uma resposta definitiva que ou exclui a suposta paternidade ou comprova a mesma (incluso de paternidade). Isto possvel porque cada pessoa possui um conjunto nico de informaes genticas herdadas de seus pais biolgicos. Nos casos de determinao de paternidade, comparam-se os padres de DNA do suposto pai, filho e me. possvel determinar quais bandas encontradas na me foram herdadas pelo filho. O filho tem necessariamente que herdar a outra metade do padro do pai. Se estas bandas estiverem presentes no padro de DNA do suposto pai, conclu-se que este o pai biolgico da criana em questo. Caso uma determinada banda presente no filho, e que no seja herdada da me, no seja encontrada no suposto pai, podemos desconfiar que este no pai biolgico da criana. Este processo de anlise repetido para cada um dos locos genticos estudados, at a confirmao ou excluso da paternidade. Vale lembrar que ocasionalmente observa-se excluso em um nico loco estudado. Nessa situao, pode-se avaliar se houve uma mutao durante a transmisso do alelo paterno ou materno. Como as taxas de mutao para cada loco so conhecidas, os clculos de probabilidades podem ser ajustados correspondentemente. Os casos das percias de investigao de paternidade com suposto pai falecido so mais complexos que os exames comuns, uma vez que no existe material fresco a ser coletado in vivo. Desta forma, procede-se analisando diretamente o material cadavrico ou tentando reconstituir o DNA do falecido atravs de seus parentes prximos.

Em exames a partir de coletas cadavricas, vrios fatores devem ser avaliados: o perodo de tempo desde que se deu o bito, as condies em que foi feito o sepultamento e a causa mortis so apenas algumas das variveis que devem ser levadas em considerao. Com posse destes dados, analisamos a possibilidade de obtermos informaes, ou seja, de extrair DNA intacto dos restos mortais. O DNA resiste um bom tempo aps a morte do indivduo, mas impossvel precisarmos antecipadamente, dadas as condies especficas de cada caso, a relativa degradao do DNA ou a presena de DNA contaminante ou de substncias que venham a inibir as reaes de anlise deste DNA. Quanto mais recente o bito, maior a possibilidade de ser encontrado e extrado DNA intacto. A grande desvantagem desta percia o alto custo do exame, associado ao fato dos resultados serem diretamente relacionados ao sucesso da extrao do DNA. A melhor alternativa para se contornar as dificuldades do exame a partir de material cadavrico a inferncia do gentipo atravs da tipagem do DNA de seus parentes prximos (1 ou 2 grau). Diante do exposto, fica claro que um dos tpicos de fundamental importncia a ser avaliado, ao interpretar um exame desse tipo, a tcnica que foi utilizada para execuo. Deve, portanto, o laudo do exame de DNA constar de forma clara e expressa o material biolgico e o mtodo utilizados no exame; mencionar a probabilidade de paternidade e a base de clculo estatstico para sua obteno; mencionar uma bibliografia razovel, para posterior consulta e, se necessrio, uma anlise comparativa entre os mtodos disponveis na ocasio. Inferncias semelhantes podem ser feitas para outros casos de investigaes criminais, que no determinao de paternidade.