TCNICAS POLAROGRFICAS: DETERMINACIN DE FOTOSNTESIS Y RESPIRACIN EN SUSPENSIONES CELULARES DE CIANOBACTERIAS

1. BASES TERICAS MEDIDA DE LOS INTERCAMBIOS DE OXGENO EN FOTOSNTESIS Y RESPIRACIN MEDIANTE UN ELECTRODO DE OXGENO. En la fotosntesis, la energa de la luz se absorbe por la clorofila y se usa para reducir el CO2 a carbohidratos, desprendindose adems O2. Por lo tanto, si a una suspensin celular de cianobacterias se la ilumina y se la suministra CO2 o bicarbonato, se desprender oxgeno que nos permitir valorar el proceso fotosinttico. El proceso respiratorio, por el contrario, da lugar a un consumo de oxgeno en la oscuridad. El oxgeno que se acumula durante la fotosntesis o el que se consume durante la respiracin se puede detectar polarogrficamente por un electrodo tipo Clark. La versin Hansatech del tpico electrodo Clark consiste en un ctodo de platino y un nodo de Ag-AgCl (entre los cuales se establece un voltaje constante de -0.65 V) inmersos en una solucin saturada de KCl y separados de la solucin problema por una membrana de tefln permeable al oxgeno, que se reduce en el ctodo. La membrana tambin atrapa una pequea capa del electrolito sobre la superficie de los electrodos. Un papel espaciador se coloca por debajo de la membrana para proveer una capa uniforme de electrolito entre el nodo y el ctodo. La intensidad de la corriente generada entre los electrodos es proporcional a la concentracin de oxgeno en la solucin. La corriente generada se convierte en una seal externa de voltaje por la caja de control en la que se sita el electrodo. La seal de medida es lo suficientemente grande para poder medirse en el rango de 1 voltio. La caja de control est, a su vez, conectada a un registrador u ordenador. 1.1.1. Diseo del electrodo La figura 1 muestra un diagrama del electrodo de Clark. El sensor (disco del electrodo) est localizado en la parte inferior de una cmara de reaccin termostatizada por agua circulante. Un pequeo imn que agita la mezcla de reaccin, rota directamente sobre el electrodo de platino cubierto con una membrana. La cmara de reaccin se cierra con un mbolo que se puede ajustar a cualquier volumen entre 0.2 y 2.5 ml. Con una microjeringa se pueden aadir o eliminar soluciones desde la mezcla de reaccin sin producir perturbaciones en el trazo del registrador. El disco del electrodo se puede quitar fcilmente para cambiar la membrana.

Figura 1. Esquema del electrodo de oxgeno tipo Clark 1

1.1.2. Preparacin y ensamblaje del electrodo Sobre el disco del electrodo limpio (la limpieza se lleva a cabo peridicamente frotndolo con una solucin muy densa de xido de aluminio) se aade una gota de electrolito (2.4 M KCl). Se coloca un papel espaciador de aprox. 2 cm2 sobre el electrodo empapado de electrolito. Este papel espaciador (generalmente papel de fumar) se utiliza para proveer una capa uniforme de electrolito entre el nodo y el ctodo.

Figura 2. Ensamblaje del electrodo

Sobre el papel de fumar, se coloca un trozo de membrana PTFE de aprox. 2 cm2 y se asegura la membrana y el papel de fumar en su posicin correcta mediante un anillo de goma que sirve para este propsito (Figura 2). Se debe revisar que la membrana no presente pliegues, arrugas, roturas o burbujas. En cualquiera de estos casos, se debe de retirar dicha membrana y comenzar el proceso de nuevo. Una vez que se ha preparado el electrodo, ste se inserta y ajusta en el fondo de la cmara de reaccin. Tanto el electrodo como la caja de control y el registrador se han de encender 30 min antes de las medidas para que se estabilicen. Durante las medidas, la suspensin celular se mantiene en agitacin y se controla la temperatura de la cmara de reaccin mediante un bao de agua termostatizada. 1.1.3. Calibracin rutinaria previa a la medida. El electrodo produce una corriente proporcional a la concentracin de O2. Para relacionar la lectura en mV de la caja de control con la concentracin de O2 (en micromoles), es necesario calibrar el electrodo: a. Ajuste a los niveles de saturacin de O2 en agua destilada: Para ajustar el electrodo a los niveles de saturacin de O2 del agua destilada a una determinada temperatura, se aade a la cmara del electrodo agua destilada que ha sido
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agitada al aire y mantenida a la temperatura deseada durante unos minutos (agua saturada de O2). Se observa que la lectura en mV se incrementa hasta que se estabiliza. b. Ajuste del cero elctrico: Se aade agua destilada al electrodo y mientras se mantiene en agitacin, se gasea con argn que desplaza el oxgeno del agua. Se observa que la lectura de la caja de control comienza a bajar rpido y despus de 2 3 min, la lectura se estabiliza en un valor que prcticamente coincide con el cero elctrico del registrador. La tabla que aparece debajo muestra los niveles de saturacin de O2 en agua destilada a distintas temperaturas. Temperatura 0 5 10 15 20 25 30 35 O2 (ppm) 14,16 12,37 10,92 9,76 8,84 8,11 7,52 7,02 O2 (mol/ml) 0,442 0,386 0,341 0,305 0,276 0,253 0,230 0,219

2. PRCTICA La prctica consiste en medir la actividad fotosinttica (total y de cada uno de los fotosistemas) y actividad respiratoria, as como el contenido en pigmentos fotosintticos (clorofila a y ficobiliprotenas) de cultivos de la cianobacteria filamentosa Anabaena sp. PCC7120. La prctica se llevar a cabo en dos sesiones (en das consecutivos) en grupos de 2-3 alumnos: I. Sesin 1: Se medir la actividad fotosinttica de los cultivos de Anabaena sp. utilizando distintas calidades de luz. Se medir la actividad respiratoria de los mismos cultivos. Se determinar el peso seco de los cultivos. Se realizar la extraccin de la clorofila a Se realizar la extraccin y cuantificacin de la ficobiliprotena ficocianina. Se realizarn espectros in vivo de los cultivos de las cianobacterias. II. Sesin 2: Se medir el contenido de clorofila a extractos realizados en la sesin 1. Se medir la actividad de cada uno de los fotosistemas de los cultivos de Anabaena sp. PCC7120. MEDIDA DE LA ACTIVIDAD FOTOSINTTICA La actividad fotosinttica se determina como desprendimiento de O2. Una vez calibrado el electrodo, podemos medir el desprendimiento de O2 de suspensiones celulares de cianobacterias: 1. Se aaden 2 ml del cultivo a la cmara del electrodo y se gasea con argn para bajar la saturacin del O2. 2. La medida se inicia iluminando la muestra con luz saturante (300 E m-2s-1) a partir de una fuente de luz fra; por lo general, el CO2 en la muestra es saturante pero si es preciso se aade bicarbonato sdico potsico a una concentracin final de 20 mM (aadir 40 l de la solucin de bicarbonato 1 M a la muestra en la cmara del electrodo). 3. Se sigue la evolucin del desprendimiento de O2 al menos durante 5-10 min. El electrodo da los valores como una tasa expresada en nmoles de O2/minuto. 4. La tasa fotosinttica se expresa como moles de O2 desprendidos por mg de clorofila y por hora. MEDIDA DE LA FOTOSNTESIS CON DISTINTAS CALIDADES DE LUZ. Se determinar la actividad fotosinttica siguiendo el protocolo descrito en el apartado 2.1. utilizando, en lugar de luz blanca, luz roja y luz de 620nm (naranja)(Figura 3) utilizando filtros especficos que se situarn en la fuente de luz fra. Las cianobacterias tienen dos complejos antena, uno para el fotosistema I y otro para el fotosistema II. El complejo antena del fotosistema I est compuesto fundamentalmente por clorofila a que absorbe la luz roja (665 nm) y la luz azul (435 nm) (Figura 4). El complejo antena del fotosistema II est compuesto por los ficobilisomas, formados por pigmentos (ficobilinas: aloficocianina, ficocianina y ficoeritrocianina) asociados a protena (ficobiloproteinas) acopladas como se aprecia en figura 5; los mximos de absorcin de la ficobiliproteinas tambin se muestran en la figura 4: 650-655 nm (aloficocianina), 615-640 nm (ficocianina) y 565 nm (ficoeritrocianina).

MEDIDA DE LA ACTIVIDAD RESPIRATORIA La actividad respiratoria se determina como consumo de O2. Las medidas se realizan de manera anloga a las de desprendimiento de O2 pero la cmara del electrodo se mantiene en oscuridad. Los datos obtenidos se expresan como moles de O2 consumidos por mg de clorofila y por hora.
Filtro rojo

Filtro 620nm

Figura 3. Espectros de transmitancia de los filtros de la fuente de luz.

Figura 4. Espectros de absorcin de clorofilas (A), ficobiliprotenas y carotenoides (B)

Figura 5. Disposicin del ficobilisoma en la membrana tilacoidal (A) y la composicin y distribucin de las ficobiliprotenas dentro del ficobilisoma (B). 5

DETERMINACIN DEL TRANSPORTE ELECTRNICO FOTOSINTTICO: MEDIDAS DE LAS ACTIVIDADES DE LOS FOTOSISTEMAS I Y II EN CLULAS INTACTAS DE CIANOBACTERIAS Las membranas tilacoidales de cloroplastos de plantas, algas verdes y cianobacterias, pueden llevar a cabo las reacciones de oxido-reduccin fotosintticas, si estn en presencia de aceptores y donadores de electrones, que tienen como misin la transferencia de electrones al NADP+, utilizando la energa de dos cuantos de luz por electrn. Los electrones son "activados" mediante dos fotorreacciones, sensibilizadas por los fotosistemas I y II (PS I y PS II), que estn conectados por una cadena de transportadores electrnicos. El uso de diversos compuestos artificiales (aceptores y donadores de electrones) que son capaces de interaccionar a distintos niveles con la cadena de transporte de electrones fotosinttica, nos permitir separar las dos fotorreacciones citadas (Fig. 6).

DCMU

Figura 6. Esquema de las reacciones de oxido-reduccin fotosintticas en el que aparecen los algunos de los muchos inhibidores que afectan a la cadena fotosinttica de electrones (PBQ: p-benzoquinona, DCMU: diclorometilurea, Asc: Ascorbato sdico, DPIP: diclorofenol-indofenol y MV:metilviolgeno)

Para la realizacin de las medidas de ambos fotosistemas, se necesita concentrar las clulas hasta conseguir 10-15 g de clorofila por ml de cultivo y para esta parte del experimento se van a necesitar 10 ml de cultivo concentrado (100-150 g de clorofila totales). Para ello, conociendo la concentracin de clorofilas del cultivo, se realiza el clculo pertinente y se toman los mililitros necesarios de ste para obtener la cantidad de clorofila indicada, se centrifuga a la mxima velocidad durante 10-15 minutos y se resuspende en tampn Hepes 25 mM pH 7.5 hasta los 10 ml finales necesarios.

2.4.1. Actividad del Fotosistema I (PS I) En este caso, se utiliza como donador artificial de electrones al fotosistema I el par Ascorbato (Asc)-diclorofenol-indofenol (DPIP), y como aceptor final de electrones el metilviolgeno, producindose consumo de oxgeno. Para inhibir el Fotosistema II, se aade el inhibidor especfico DCMU; de este modo, esta reaccin es dependiente de la cadena transportadora de electrones ntimamente asociada con el PS I (Fig. 6). La estimacin del consumo de O2 se realiza polarogrficamente en el electrodo de O2, situando 3 ml de mezcla de reaccin (indicada en la tabla I) en la cmara del electrodo modelo Clark (Hach) a temperatura constante de 30 C, en agitacin e iluminacin saturante continua. Protocolo: 1. A un tubo de ensayo aadir 2.5 ml de las clulas previamente concentradas. 2. Aadir el DCMU, el Hepes y el KCl y mezclar bien. 3. Aadir a la mezcla celular del tubo de ensayo, el metilviolgeno y la solucin de DPIP y ascorbato y agitar. 4. Encender inmediatamente la luz y comenzar a registrar el consumo de O2. El consumo de O2 se estima como mol de O2 consumido x mg Cl-1 x h-1.

Tabla I. Compuestos y cantidades utilizados para la medida de la actividad del PS I

[Stock] Clulas (10-15 g clorofila/ml) DCMU 0.6 mM Hepes pH 7.5 0.5 M KCl 1.5 M Metilviolgeno 2.5 mM DPIP 1.5 mM y Ascorbato Na 150 mM

[Final] 10 M 25 mM 50 mM 83 M 50 M/ 5 mM

Volumen Final (3ml) 2.5 ml 50 l 150 l 100 l 100 l 100 l

2.4.2. Actividad del Fotosistema II (PS II) Se utiliza como donador de electrones el agua y como aceptor artificial la quinona pbenzoquinona (PBQ). Se aade ferricianuro potsico para tener a la quinona en la forma oxidada. La reduccin de la quinona junto con la liberacin de oxgeno es absolutamente dependiente del PS II, no mostrando ningn requerimiento del PS I o de un acoplamiento redox entre los dos fotosistemas (Fig. 6). Se estima la actividad del PS II como desprendimiento de O2 utilizando el electrodo de O2; para ello, se sitan 3 ml de mezcla de reaccin (indicada en la tabla II) en la cmara del electrodo modelo Clark (Hach) a temperatura constante de 30 C, en agitacin e iluminacin continua. La liberacin de O2 se estima como mol de O2 liberado x mg Cl-1 x h-1.
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Protocolo: 1. A un tubo de ensayo aadir 2.5 ml de las clulas previamente concentradas. 2. En el tubo de ensayo mezclar (muy bien) las clulas con el Hepes y el KCl. 3. Poner esta mezcla celular en la cmara del electrodo, gasear con argn para disminuir los niveles de O2. 4. Aadir en la cmara el ferricianuro y en ltimo lugar la PBQ. 5. Inmediatamente, encender la luz y comenzar a registrar el desprendimiento de O2.

Tabla II. Compuestos y cantidades utilizados para la medida de la actividad del PS II.

[Stock] Clulas (10-15 g clorofila/ml) Hepes pH 7.5 0.5M KCl 1.5M Ferricianuro K 25 mM PBQ 30mM

[Final]

Volumen Final (3ml) 2.5 ml 150 l 100 l 50 l 200 l

25 mM 50 mM 0.42 mM 2mM

*La solucin de ferricianuro se prepara en el momento en agua. La solucin de PBQ (metanol) y la de DPIP y ascorbato (agua) tambin se preparan en el momento.

CLCULO DEL PESO SECO Se mide la densidad ptica del cultivo a 750 nm y se aplica la siguiente frmula: mg Peso Seco/ml = 0.396 X DO750nm 0.004 EXTRACCIN Y DETERMINACIN DE PIGMENTOS FOTOSINTTICOS 2.5.1. Determinacin del contenido en clorofilas Se centrifuga 1 ml de cultivo en una centrfuga eppendorf durante 10 min a mxima velocidad. Se descarta el sobrenadante y el precipitado se resuspende en 1 ml de metanol puro. Se agita bien la mezcla y se mantiene 24 h a 4C en oscuridad. Tras ello, se centrfuga 5 min a la mxima velocidad y se recoge el sobrenadante. Se mide la D.O. del sobrenadante a 665 nm en un espectrofotmetro, usando como blanco metanol. Para calcular la concentracin de clorofila, se aplica la frmula de Marker, midiendo la concentracin de clorofila en g/ml a partir de la siguiente ecuacin: g Clorofila/ml = 13.14 X DO 665nm

2.5.2. Determinacin de la ficobiliprotena ficocianina 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Se parte de un volumen inicial de 1,5 ml de cultivo. Se centrfuga 10, y se retira todo el sobrenadante. Resuspender las clulas en 1,5 ml de agua destilada. Aadir 50 l de tolueno. Agitar vigorosamente en vortex durante al menos. Dejar reposar un tiempo mnimo de 30 en oscuridad. Se centrfuga 10, se observa el sedimento, el sobrenadante y una fase superior de tolueno con algunos restos celulares. 8. Se recoge 1 ml del sobrenadante con las ficocianinas (color azulado), procurando no coger ni sedimento ni la fase superior de tolueno para evitar restos celulares (utilizar una punta de pipeta por muestra). 9. Se mide en el espectro, tomando como blanco agua destilada. 10. La concentraciones de la ficocianina se obtendr de la siguiente frmula: g Ficocianina/ml = 135 x DO620nm 2.5.3. Obtencin de espectros in vivo Se recogern 3 ml de cultivo y se realizar, usando un espectrofotmetro, un barrido de longitudes de onda desde 400nm hasta 750 nm para determinar el espectro de accin de las diferentes cepas de cianobacterias debido a la presencia de los pigmentos fotosintticos.

Figura 7. Esquema resumen de los transportes electrnicos fotosintticos lineal y cclico en cianobacterias (adaptado de http://www.genome.ad.jpg/kegg/pathway/map/map00195.html).

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Figura 8. Esquema de los transportes electrnicos fotosinttico y respiratorio en Synechocystis sp. PCC 6803 (adaptado de Pils y Schmetterer, 2001). Se encuentran representados los lugares de accin de los inhibidores HQNO (2-heptyl-4-hydroxy-quinoline-N-oxide), PCP (pentaclorofenol), CN (KCN) y Azida. MP (membrana plasmtica), MT (membrana tilacoidal).
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MEDIDAS DE CRECIMIENTO DEL CULTIVO A.PESO SECO mg PS/ml 0,396xDO750nm-0,004 B.CLOROFILAS g Cla/ml 13,14xDO665 C.FICOCIANINAS g FC/ml 135xDO620

MEDIDAS DE CONTENIDO CELULAR DE PIGMENTOS D.CONT. CLOROFILAS g Cla/ mg PS B/A E.CONT. FICOCIANINAS g FC /mg PS C/A F.CONT. FICOCIANINAS g FC / g Cla C/B

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CLCULOS TASA FOTOSINTTICA, RESPIRATORIA, FOTOSISTEMA I Y FOTOSISTEMA II G.TASA DE O2 BRUTA nmol O2/mlmin Dato electrodo FOTOSNTESIS LUZ BLANCA FOTOSNTESIS LUZ ROJA FOTOSNTESIS LUZ 620 nm RESPIRACIN H. TASA DE O2 BRUTA nmol O2/mlh Gx60 I. CLOROFILAS mg Cla/ml Bx10-3 J.TASA FOT, RESP, FSI, II nmol O2/mg clh H/I K.TASA FOT, RESP, FSI, II mol O2/mg clh J/103

*FOTOSISTEMA I

*FOTOSISTEMA II

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