FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS ENOLGICAS Y AGROINDUSTRIALES CTEDRA ENOLOGA I

LOS AGENTES DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA

La transformacin del jugo de uva en vino es esencialmente un proceso microbiolgico complejo que implica interacciones entre levaduras, bacterias y hongos filamentosos, en el cual las levaduras cumplen un rol fundamental; por lo tanto es muy importante para el Enlogo tener conocimiento acerca de estos microorganismos y de la bioqumica de la fermentacin como base fundamental del proceso de la vinificacin. Tradicionalmente la produccin del vino se ha llevado a cabo utilizando cepas de levaduras procedentes de la superficie de la uva y del ambiente de las bodegas. Las levaduras alcanzan las uvas por efecto de diseminacin del viento y de los insectos y estn presentes en las vias desde la maduracin del fruto. La fermentacin alcohlica, la conversin de los principales azcares de la uva glucosa y fructuosa, a etanol y CO2, es conducida por levaduras del gnero Saccharomyces, y generalmente por las especies S. cerevisiae y S. bayanus.

Ecologa de las levaduras de la uva y del vino

El estudio ecolgico de las especies de levaduras de la uva y del vino, consideran en primer lugar a la distribucin y sucesin de las especies halladas durante el proceso de vinificacin. Las levaduras encontradas en el mosto durante las primeras horas de llenado de los depsitos corresponden a los gneros identificados en la uva, con un predominio de Hanseniaposra y Kloeckera. En la actualidad estos estudios representan una suma considerable de trabajos donde se describe, no solo las especies encontradas sobre las uvas y durante la fermentacin alcohlica, sino tambin aquellas levaduras que se pueden encontrar durante la conservacin y las productoras de enfermedades. Las levaduras estn sumamente esparcidas en la naturaleza, las encontramos en el suelo, en la superficie de los vegetales y sobre las flores. Su diseminacin, como se dijo, se debe al viento y a los insectos. Estn distribuidas en la superficie de la vid en forma despareja, pocas en las hojas, escobajos y uvas verdes, raramente en la pruina y se multiplican preferentemente en los exudados de las microlesiones en las zonas situadas alrededor de los estomas. Tambin all se desarrollan las esporas de Botrytis cinerea y las bacterias lcticas y acticas. El nmero de levaduras en una baya, justo antes de la cosecha, est comprendido entre 103 y 105 clulas por grano segn la situacin geogrfica del viedo, las condiciones de la maduracin, el estado sanitario de la vendimia y las prcticas culturales. Luego de la cosecha, el transporte y el prensado de la vendimia, el nmero de clulas capaces de formar colonias alcanza aproximadamente 106 clulas por mililitro de mosto. La presencia de varios gneros de levaduras sobre las uvas en el viedo tambin ha sido establecida hace tiempo. Efectivamente, microfotografas de registro de electrones, de la superficie de la piel de las uvas muestran distintas e intactas gemaciones bipolares caractersticas que fueron producidas por levaduras. Aunque la presencia de levaduras con brotaciones multilaterales ha sido supuesta por largo tiempo, hoy se conoce que la presencia de Saccharomyces spp sobre las bayas es muy baja; pero es una levadura que frente a condiciones ptimas tiene la capacidad de invadir rpidamente el medio en donde se encuentra; es decir, estn bien adaptadas al mosto de uva como medio de cultivo, dominando fcilmente la fermentacin y llegando a ser las nicas al final del proceso.
1

Las levaduras no - Saccharomyces son apreciadas por proveer su propio matiz especial de flavor, antes de ser abatidas por las Saccharomyces, que adems de completar la fermentacin tambin agregan sus distintas notas de flavor. Se han constatado largas demoras en iniciar la fermentacin del jugo de uvas preparadas (despalilladas y molidas) fuera de la bodega, mientras que cuando las mismas uvas fueron preparadas en las bodegas, hubo una pequea demora en el inicio de la fermentacin. La pregunta surge cmo las levaduras se tornan residentes en las bodegas? La respuesta es esencialmente la misma que para las infecciones por los deshechos de levaduras y bacterias; pero est basada en la simple idea que donde quiera que exista un ambiente suficientemente favorable para la supervivencia o el crecimiento de un microorganismo, dado el tiempo suficiente, se establecer una poblacin. Hemos demostrado la presencia de cepas de S. cerevisiae sobre el hollejo de bayas maduras, sin recurrir a un cultivo en medio enriquecido. La principal dificultad con este tipo de demostracin es que el nmero de clulas de levaduras es tan bajo que los hollejos deben ser directamente aplicados al medio nutritivo slido; o un mnimo volumen de lquido debe ser usado para lavar la superficie de las uvas y luego extendido, es decir esparcido directamente sobre el medio slido.

La taxonoma e identificacin de las levaduras

Es importante poder identificar gneros y especies de las levaduras a fin de poder compararlas entre s y entender sus contribuciones en una bodega o vino dado, para estimar los posibles problemas originados durante la fermentacin, las enfermedades microbiolgicas, y para evaluar distintas levaduras como posibles inculos. Para poder conocer la microflora que se sucede en las diferentes etapas de la fermentacin alcohlica debemos sacar muestras peridicamente durante un proceso de fermentacin espontnea. Una vez que las cepas se encuentran aisladas, purificadas y mantenidas en adecuadas condiciones, se pasa al estudio de la identificacin fisiolgica y molecular. La clave para la identificacin de los gneros de levaduras nativas es derivada de "Levaduras - Una Taxonoma" (Kreger van Rij, 1984). Una clave dicotmica para la identificacin de organismos. En Taxonoma, algunos rasgos tienen ms uso que otros, dependiendo del nmero y de las diferentes clases de genes pronosticados como necesarios para un rasgo dado. Por ejemplo: el tipo y la forma de la espora est bajo el control de muchos genes y es por lo tanto, un carcter taxonmico distintivo. En contraste la habilidad para usar carbn de origen particular, puede reflejar una diferencia en un simple gen. Las preguntas planteadas en la clave deben ser formuladas en un orden adecuado para llegar a una identificacin apropiada. Para la identificacin de gneros de levaduras, los primeros tests, tienen que ver con la morfologa celular y sobre la capacidad de formar esporas sexuales. Una importante distincin hecha por los taxonomistas, se refiere a la diferencia entre levaduras que forman esporas sexuales (perfectas o completas) comparadas con aquellas que no las forman (imperfectas o incompletas). El principal problema consiste en establecer que el estado sin esporas es aparente. Por distintas razones puede ser necesario verificar la identidad de una cepa especial: saber si la cepa aadida sobrevive, o qu cepa est verdaderamente fermentando, entre otras.
Esporas de Saccharomyces cerevisiae: de una a cuatro esporas por asco.

Flora espontnea de la uva y de la bodega

Las condiciones de inoculacin dependen en gran medida de las prcticas de la regin y la experiencia. La fermentacin espontnea se da cuando no se aaden cultivos iniciadores de forma intencionada, y decimos intencionada porque en muchos casos donde un elaborador puede pensar que lleva a cabo una fermentacin espontnea, las levaduras han entrado a travs de las operaciones. Las fermentaciones naturales, en ausencia de dixido de azufre, permiten el desarrollo de la microflora espontnea y contribuyen a las caractersticas globales sensoriales del vino. El impacto de este tipo de fermentacin sobre el aromo y el gusto no es ciertamente predecible. Est generalmente aceptado que la densidad y diversidad de la poblacin microbiana sobre el grano de uva es limitado, con un promedio de 10 2-104 UFC/grano. Aunque especies de Saccharomyces no fueron normalmente encontradas sobre uvas tal como se encuentran en su medio ambiente natural, las uvas hospedan diversos microorganismos. Sin embargo, como Saccharomyces spp est tan bien adaptada al jugo de uva como medio de crecimiento, estas cepas fcilmente dominan la fermentacin del mosto convirtindose en un cultivo puro (homocultivo) al final del proceso. La flora microbiana de la uva depende de muchos factores, como la lluvia, humedad, rgimen de pulverizaciones del viedo, altitud del viedo, insectos vectores, rgimen de fertilizaciones nitrogenadas y prcticas de disposicin de los desages de bodegas. Bsicamente sobre el grano de uva podemos encontrar bacterias, levaduras y mohos. Las poblaciones de levaduras ms abundantes se encuentran en las situaciones ms clidas (bajas latitudes y temperaturas elevadas). En trminos generales, la poblacin de mohos es usualmente muy elevada. Los principales gneros encontrados son: Aspergillus, Penicillum, Rhizopus y Mucor. Bajo ciertas condiciones, miembros del gnero Botrytis pueden ser encontradas en las uvas infectadas con podredumbre. En estos casos de infeccin se producen vinos con una composicin y flavor muy caractersticos. Si hay un importante dao de las bayas y crecimiento de moho, los stos pueden agotar vitaminas y minerales esenciales, reduciendo el contenido de nutrientes del jugo, de manera tal que a las levaduras se les dificulte iniciar y completar la fermentacin del mosto de uva. Los mohos son todos aerobios obligados y no estn presentes durante la fase de la fermentacin en contraste con lo que sucede con las bacterias. La poblacin de bacterias aerbicas y anaerbicas facultativas puede tambin ser alta en uvas daadas en la cosecha. Las especies de bacterias ms prevalentes sobre la superficie de la uva pertenecen al los gneros: Bacillus, Pseudomonas y Micrococcus. Las bacterias acticas, principalmente Acetobacter tambin estn presentes. Estas bacterias son aerobias estrictas y una vez que el mosto se torna con caractersticas de anaerobiosis su metabolismo es inhibido. Varias de estas bacterias tienen mecanismos de sobrevivencia en perodos de anaerobiosis, por lo que pueden permanecer viables al final de la fermentacin en el espacio de cabeza de los tanques y/o piletas. Otros de los microorganismos presentes sobre las bayas son las bacterias del cido lctico. Estas son anaerobias facultativas, microaerfilas, por lo que pueden persistir las condiciones de anaerobiosis del proceso de fermentacin, aunque dependen del pH del jugo. Hay otras especies bacterianas minoritarias que debido a su metabolismo, no persisten en el proceso fermentativo, pero pueden contaminar otras superficies de las bodegas. Por ejemplo: Streptomyces spp es un degradador de celulosa y puede contaminar los filtros sino se mantienen las normas de higiene y desinfeccin adecuadas. Estos procariontes encontrados en frutas sanas estn en menor nmero que levaduras salvajes. Las especies de levaduras significativamente presentes en la uva son limitadas. Encontramos en esencia levaduras de metabolismo estrictamente oxidativo, que pertenecen al
3

gnero Rhodotorula y tambin algunas especies de poco poder de fermentacin como Kloeckera apiculata (Hanseniaspora uvarum su forma perfecta). Tambin hay otras en menor proporcin como Metschnikowia, Hansenula, Pichia y Candida. En general reciben en nombre de levaduras apiculadas o no Saccharomyces. Kloeckera apiculata, pareciera ser la especie dominante de levaduras de viedos que crecen en regiones fras, su contraparte sexual llamada Hanseniaspora uvarum. En cultivo de mosto joven, las clulas se presentan aisladas o en parejas gemantes de forma apiculada, comnmente llamada de limn, es pequea y se encuentran en ms del 50% del total de los microorganismos presentes en la uva. El cultivo en mosto de uva se presenta muy turbio, con trazas de anillo y velo superficial muy tenue. Histricamente, su actividad fue restrictiva de la fase prefermentaria y de las primeras etapas de la fermentacin. Fermenta nicamente la glucosa, de poder fermentativo bajo, en torno al 4%, fermenta el mosto de uva con fuerte produccin de cidos voltiles. Se han encontrado referencias acerca de fermentaciones llevadas a cabo a 10C por cultivos mixtos (Saccharomyces cerevisiae Kloeckera apiculata), cuando, dependiendo de la temperatura, las poblaciones de Saccharomyces pueden establecerse rpidamente y producir suficiente alcohol como para inhibir su crecimiento. El gnero Candida spp representa una gran coleccin de levaduras de formas y fisiologa aparentemente similares, las cuales los microbilogos no han sido capaces de demostrar su fase sexual. Las especies de Candida entran en el proceso de fermentacin en todas sus etapas, desde el viedo y hasta la bodega. A bajas temperaturas presenta una mayor resistencia al alcohol, aunque durante las etapas de conservacin se produce un sinergismo entre la concentracin de alcohol y las temperaturas de bodega. Lo mismo es para el resto de las levaduras que forman velos sobre la superficie de los vinos en general. Las clulas de Candida pulcherrima (su forma sexual Metchinicowia pulcherrima) en mosto de uva se presentan aisladas o en parejas gemantes. En los cultivos viejos se presentan como clulas gigantes dotadas de un grueso grnulo central de grasa. Son de escaso poder de fermentacin, pero se desarrolla en presencia de alcohol etlico, fermenta solamente la glucosa, con un poder fermentativo muy bajo, en torno al 1%. Picchia membranaefaciens es tambin una levadura oxidativa y forma un film sobre la superficie del vino. Tambin se observa su crecimiento durante las primeras etapas de la fermentacin alcohlica, por lo que es muy importante el control del crecimiento de esta levadura. En vino fueron encontradas P. membranaefaciens, P. vini y P. farinosa. Presenta una inhibicin frente al etanol en concentraciones cercanas a 10% (v/v). Otra levadura frecuentemente encontradas y que presenta un pobre poder de fermentacin, es Rhodotorula minuta. Hansenula anomala presenta un metabolismo tanto fermentativo como oxidativo. Cuando se encuentra fermentando es capaz de producir 0,2-4,5% (v/v) alcohol con elevadas cantidades de cido actico (1-2 g/l)y acetato de etilo (2.150 mg/l) y acetato isoamlico. La formacin de steres por esta levadura en las etapas tempranas de la fermentacin alcohlica, puede jugar un rol positivo en la complejidad aromtica del vino.
4

Hansenula es parte de una comunidad levaduriana que consume etanol, glicerol y otros cidos del vino para la produccin tanto de cido actico como de acetaldehdo y sus steres. Es posible encontrar cepas de Hanseniaspora guilliermondi, cuyas clulas son tipicamente con gemacin polar, aisladas o en parejas dos elementos. El cultivo en mosto de uva se presenta turbio con ligero depsito y trazas de anillo y velo incompleto y muy tenue. No desarrolla en presencia del etanol, fermenta solo la glucosa y posee un poder fermentativo en torno al 4%. Las levaduras apiculadas compiten con Saccharomyces spp por nutrientes y pueden producir steres de cidos grasos y otros componentes afectando el bouquet del vino. Muy pocas son tolerantes al etanol y por lo tanto, son generalmente indetectables al final de la fermentacin. La persistencia de estas no-Saccharomyces durante una fermentacin depende de varios factores; tales como la temperatura de fermentacin, disponibilidad de nutrientes, fuerza de inoculacin de Saccharomyces spp, uso y niveles de dixido de azufre. Las levaduras fuertemente fermentativas como Saccharomyces cerevisiae raramente estn presente en las uvas sanas. Luego de unos das de vendimia, las levaduras alcohgenas invaden el material de cosecha y sobre todo de recepcin de las vendimias, los lagares y las prensas; es decir, son flora comn del equipamiento de bodega y medios de transporte. An cuando est bien lavado, el equipamiento de bodega no es estril, a menos que se tomen medidas muy inusuales. Esto explica la cada vez mayor velocidad en el inicio de la fermentacin

Dominancia de Saccharomyces
El estudio ecolgico, durante la vinificacin, de la diversidad clonal de las levaduras, en particular de Saccharomyces cerevisiae, fue por mucho tiempo inabordable debido a la falta de medios para distinguir las cepas entre si, con el desarrollo de los mtodos moleculares de identificacin de levaduras, el conocimiento de la esta diversidad dentro de esta especie, es por cierto mucho ms importante para el vinificador que las investigaciones sobre la microflora poco o no fermentativa de la uva.
Clulas de Saccahromyces cerevisiae al microscopio electrnico

Muchos parmetros fisiolgicos permiten a Saccharomyces spp dominar las fermentaciones en jugo de uva. La rpida produccin y el alto nivel de un PRODUCTO FINAL TXICO, COMO ES EL ETANOl, es una estrategia para asegurar la dominancia en el medio de fermentacin. Las levaduras salvajes no - Saccharomyces y otra flora de la uva no son tolerantes al etanol como lo es Saccharomyces, aunque algunas son capaces de producirlo. Existen otras levaduras dainas comunes en el vino, como Brettanomyces y Zygosaccharomyces, que son tan tolerantes al etanol como Saccharomyces. Zygosaccharomyces veronae en cultivo joven presenta clulas redondeada, en parejas o en grupos de varios elementos. El cultivo en mosto de uva se presenta transparente con anillo bien formado, que al agitar ligeramente el tubo cae enturbiando fuertemente el lquido con abundante depsito en el fondo. Otro parmetro que puede dar a las especies de Saccharomyces spp una ventaja competitiva, es la TOLERANCIA A TEMPERATURAS MS ALTAS que muchas otras levaduras, la fermentacin en condiciones de anaerobiosis es algo ineficiente, generando poca energa en forma de calor. Durante las vinificaciones, las cepas vnicas de Saccharomyces spp pueden mantener viabilidad y continuar fermentando a temperaturas aproximadas de 38 C, mientras que la mayora de la flora salvaje es inhibida a temperatura mayores de 25 C. La produccin de calor como un producto final y la capacidad de sobrevivir temperaturas altas puede haber

seleccionado particularidades fermentaciones.

en

Saccharomyces

spp

contribuyendo

dominar

las

Una exitosa COMPETICIN POR LOS NUTRIENTES LIMITANTES es tambin un factor contribuyente a la dominancia de una especie o gnero sobre otros en una fermentacin microbiolgica mezclada. Muchos estudios se han hecho sobre la utilizacin de nutrientes y captacin en Saccharomyces spp, pero muy pocos anlisis comparativos con otra flora, han sido intentados. El contenido de nutrientes del mosto puede variar ampliamente como funcin de numerosas factores como variedad de uva, regin de crecimiento, efectos climticos, riqueza nutricional del suelo y prcticas de fertilizacin del viedo. El contenido nutricional de un mosto fija el nmero y las clases de organismos que se pueden multiplicarse. En general, se ha consensuado que las fermentaciones naturales (sin inocular) son riesgosas en caracteres no deseados que son frecuentemente producidos por las levaduras salvajes y que pueden persistir en un vino terminado, detractando la calidad del vino. Pero esto no es taxativo ya que existen regiones, entre ellas regiones antiguas de cultivo, donde las fermentaciones naturales han sido rutinarias produciendo vinos con caracteres regionales distintivos. El carcter regional distintivo est ms probablemente asociado a consideraciones de clima y viticultura que a las cepas de levaduras dominantes, las cuales son probablemente residentes en la bodega, ms bien que asociadas con el viedo.

Prcticas de Inoculacin de la Fermentacin

La fermentacin del jugo de uva (mosto) puede ser natural o espontnea, cuando es conducida por la flora presente en las uvas y en la bodega o inoculada, cuando es conducida por la adicin de una cepa seleccionada de Saccharomyces spp. Esta ltima prctica minimiza la influencia de levaduras salvajes en la calidad del vino. Los mostos pueden ser inoculados con una preparacin comercial de levaduras secas rehidratadas de una cepa de levadura vnica seleccionada o con una porcin de mosto en plena fermentacin. Una buena cepa de levadura vnica seleccionada para produccin de vino debera presentar las siguientes caractersticas tecnolgicas (o al menos la mayor cantidad posible de ellas): Rpido inicio de la fermentacin posteriormente a la inoculacin Eficiente conversin del azcar del mosto en etanol Capacidad de flocular al final de la fermentacin Conducir una fermentacin vigorosa y hasta a sequedad (rastros de azcar reductores). Poseer caractersticas de fermentacin reproducibles y comportamiento predecible. Poseer buena tolerancia al etanol. Poseer buena tolerancia a la temperatura. Producir aromas o flavores adecuados Ser tolerante al SO2, segn concentraciones de vinificacin Produccin de glicerol. Baja produccin de espuma. Actividad proteoltica Existen diferentes tipos de fermentaciones: 1. Fermentacin espontnea: Es la que se produce, en un medio con azcares fermentescibles, espontneamente; es decir con los microorganismos que trae la uva (ms de un gnero, ms de una especie).

2. Fermentacin pura absoluta: Interviene una sola cepa de levadura pura. Es el caso de la cerveza en el que el mosto se esteriliza y luego se siembra con una cepa de levaduras especifica. 3. Fermentacin pura relativa: Es la que ocurre la mayora de las veces en Enologa. Se limita el medio con SO2 (esterilizacin parcial) y luego se siembra un pie de cuba que posee alta concentracin de un microorganismo dado. 4. Fermentacin asociada: Es una fermentacin pura, absoluta o relativa, pero interviene un cultivo mixto de levaduras, o sea dos o ms levaduras puras compatibles. 5. Asociacin escalar: No muy comn en la prctica. Se siembran sucesivamente y en distintos tiempos para que cada una intervenga de acuerdo a su capacidad, dos cepas puras. Por ejemplo: iniciar la fermentacin con S. ellipsoideus y terminarla sembrando S. oviformis; o iniciar con S. ellipsoideus y terminar con Schizosaccharomyces pombe; o iniciar con Schizosaccharomyces pombe y terminar con S. Ellipsoideus.

Principales criterios de seleccin para las levaduras:

Poder fermentativo Es la cantidad de azcar que la levadura es capaz de transformar en alcohol independientemente del tiempo empleado para ello. S. cerevisiae necesita aproximadamente 16,8 g de azcar para producir 1 % en volumen. La capacidad alcoholgena lleva implcito el concepto de resistencia al alcohol y la capacidad de producir cantidades elevadas del mismo. S. bayanus llega a producir 18 % o ms. Energa fermentativa. Es la velocidad fermentativa, es decir la cantidad de azcar que la levadura es capaz de transformar en la unidad de tiempo. Est ntimamente relacionada al crecimiento de la poblacin. Selectividad con relacin a los azcares. Por lo general las levaduras fermentan ms rpidamente la glucosa (5 a 6 veces ms rpido) que la fructosa y si el vino queda naturalmente dulce, el azcar remanente es todo o casi todo levulosa y la observacin polarimtrica es siempre levgira. Pero hay levaduras, como S. elegans, S. acidifaciens, S. rouxii y Torulopsis bacilaris, que fermentan ms rpidamente la levulosa. Se las llama levaduras inversivas porque, cuando queda azcar residual sin fermentar, cambia el sentido de rotacin de la luz polarizada debido al predominio de la glucosa. Por ltimo, Kloeckera apiculata fermenta los dos azcares a la misma velocidad. Resistencia al SO2. Es variable. Algunas son ms sensibles y otras, como Saccharomycodes ludwigii, son muy resistentes. Esta levadura es peligrosa en mosto sulfitado. Factor Killer. Las levaduras killer estn ampliamente distribuidas en los hbitats naturales y en las colecciones de laboratorio. La actividad killer puede explicarse como un mecanismo de interferencia competitiva, el cual implica la produccin segregacin al medio de una toxina (glucoprotena) que acta a nivel de la membrana matando a otras cepas de levaduras. El carcter killer est ampliamente distribuido entre gneros de levaduras como: Candida, Hanseniaspora, Kloeckera, Kluyveromyces, Rhodotorula y Saccharomyces. Los determinantes gnicos asociados a esta caracterstica son a la vez citoplasmticos y nucleares. En Saccharomyces se debe a la presencia en el citoplasma de partculas de tipo viral (PLV: virus like particles), parecidas a virus no infecciosos, conteniendo dos tipos de clulas, que difieren en su peso molecular y que requiere de la presencia de determinados
7

genes nucleares para que tenga lugar el mantenimiento, replicacin y expresin de los mismos.

Cultivos iniciadores o estrter

La identificacin de una levadura teniendo en cuenta las caractersticas mencionadas supone que se ha hecho una concisa seleccin de una cepa vnica como iniciadora del proceso. De esta forma, la misma puede estar disponible comercialmente en forma desecada, o puede ser parte de una coleccin de cultivos, y se debe preparar un inculo lquido al momento de trabajar. La cantidad de cualquier tipo de cultivo iniciador que se use (pie de cuba), debe ser suficientemente grande, como para asegurar que la fermentacin se realice completamente con la cepa inoculada. Hasta hace poco tiempo, esto no era fcilmente demostrable. De todas formas, con las nuevas tecnologas disponibles en base al estudio de material gentico, la identidad de la cepa de levadura dominante al final de la fermentacin puede ser determinada. Recientes estudios empleando marcadores genticos, confirma que bajo condiciones normales, la cepa inoculada comanda la fermentacin y constituye la mayora de la poblacin total de levaduras presentes al final.

Levaduras vnicas activas secas

La disponibilidad comercial de levaduras en la forma activa secas, es reciente, pero su uso ha recibido una muy buena aceptacin. Actualmente existen varias compaas en el mundo produciendo cerca de tres docenas de levaduras vnicas, aunque probablemente menos de seis cepas son las ms populares. Las levaduras del vino son producidas bajo altas condiciones de aerobiosis en medios con abundantes nutrientes pero muy bajas concentraciones de glucosa. Frecuentemente se usa melaza diluida. Estas condiciones favorecen la formacin de biomasa, con una mnima fermentacin y produccin de etanol. La alta concentracin de oxgeno indica la formacin de factores de supervivencia, como cidos grasos insaturados y esteroles en las membranas de las clulas las cuales son necesarias para la alta tolerancia al etanol durante la produccin de vino. La baja concentracin de glucosa y las condiciones aerbicas generan clulas con mitocondrias activas, las que tambin pueden tener factores de supervivencia en las membranas. De este modo, durante la fermentacin en vinificacin, estos preparados comerciales estn dotados con suficientes factores de supervivencia para permitir fermentaciones bajo condiciones normales. Aunque estas levaduras son llamadas activas secas (LSA), contienen hasta un 9 % de humedad y son usualmente comercializadas selladas hermticamente en atmsfera de nitrgeno. Cuando se guardan en fro, mantienen su viabilidad al menos por un ao. Durante la mayora de los procesos de secado, las membranas celulares de las levaduras tienden a perder su funcin de barrera de permeabilidad. Al momento de ser utilizadas es importante restablecer esa funcin de barrera, esto es un proceso metablico que se logra ptimamente agregando a las levaduras en pequeos volmenes de agua caliente (40 C), 20 minutos antes de agregar las levaduras al mosto. La dosis recomendada de 0,1 a 0,2 g de levaduras secas por litro de mosto dara una concentracin inicial de 106 clulas/mL. Cantidades ms altas y ms bajas pueden ser usadas; las cantidades menores son menos costosas, pero aumenta el riesgo de no proveer las cantidades suficientes de clulas para lograr una fermentacin completa. La inoculacin al mximo nivel de poblacin (108 clulas/mL) minimiza la multiplicacin de las levaduras, aumenta ligeramente el rendimiento de etanol, y puede dar una nota de levadura al vino terminado.
8

Si bien los cultivos iniciadores de preparaciones comerciales son puros, y se hacen esfuerzos para mantener las condiciones aspticas de produccin, el producto en s mismo no est completamente libre de contaminacin usualmente se encuentran bacterias y otros microorganismos. El control de calidad de las levaduras secas activas debe responder a los siguientes criterios: este producto se presente granulado, de color beige y exento de material pulverulento, con una densidad entre 0,6 y 0,7 y humedad mxima de 9%. La poblacin de levaduras vivas ser del 1 al 3.1010 clulas por gramos de producto. Debe estar exenta de microorganismos patgenos.

Inoculacin lquida
Los cultivos iniciadores pueden ser preparados en el laboratorio de la bodega a partir de cultivos almacenados. Esto tiene la dudosa ventaja de proveer un cultivo iniciador de alguna cepa especial que no est disponible comercialmente, pero requiere una labor intensiva y ser preparada cuidadosamente por personal entrenado en microbiologa. De nuevo, se espera que el cultivo en la coleccin sea puro. Los primeros pasos de la reproduccin del cultivo deben ser hechos aspticamente. Las levaduras crecidas en cultivo de agar inclinado pueden ser transferidas a 5 mL de jugo de uva esterilizado. Despus de uno o dos das, es evidente el crecimiento activo, y el cultivo puede ser transferido a un volumen mayor (cinco veces) de jugo esterilizado. Como las transferencias pueden ser hechas en una o dos veces, los volmenes se vuelven demasiado grandes para una conveniente transferencia asptica. Como las levaduras vnicas crecen rpidamente y como el mosto de uva es un medio ideal para estos organismos, sus nutrientes y el pH permiten el crecimiento de este microorganismo, haciendo desistir el crecimiento de la mayora de otros organismos extraos) numerosas inoculaciones y cantidades juiciosas de agregados de dixidos de azufre mantienen esencialmente la asepsia.

Fermentaciones Naturales
Las condiciones de inoculacin dependen hasta cierto punto de las prcticas y experiencias regionales. Una fermentacin natural es aquella en la cual no se agregan, intencionalmente, levaduras iniciadoras. Decimos, intencionalmente, porque en la mayora de los casos donde un bodeguero puede estar esperando llevar a cabo una fermentacin natural, las levaduras son actualmente introducidas durante las operaciones de bodega. Fermentaciones naturales en ausencia de dixido de azufre permiten persistir a la flora nativa de la uva y probablemente hacer una contribucin al carcter sensorial del vino. Esto puede ser una buena idea, aadiendo complejidad al vino, o un serio error, detractando la calidad del vino, dependiendo de la variedad de uva, el estilo, del vino y de la flora actual presente durante la fermentacin. Ciertamente en una fermentacin natural, el flavor y el aroma del vino no son predecibles. Algunos aromas y flavores particularmente desagradables, pueden ser producidos por levaduras salvajes y bacterias, que son difciles sino imposibles de disminuir en el vino terminado. Otra desventaja de las fermentaciones naturales es su imposibilidad de predecir, en los trminos de la fermentacin, el principio y la duracin, como as tampoco su reproductibilidad en futuras vendimias. Generalmente existe un tiempo de adaptacin requerido antes del crecimiento celular y de la fermentacin, an si se usa una preparacin comercial, ya que las levaduras comerciales se mantienen bajo estrictas condiciones de anaerobiosis, y de poco sustrato. Cuando comienza el proceso de fermentacin, durante las primeras etapas de crecimiento el contacto de las clulas con elevadas concentraciones de oxgeno, aseguran que la levadura iniciadora contenga un amplio suplemento de factores de supervivencia, esteroles y cidos grasos
9

insaturados necesarios para la tolerancia al etanol. Dado todo lo que sabemos sobre las levaduras vnicas, sera bueno concluir que aquellas llamadas fermentaciones naturales o de levaduras salvajes son siempre conducidas finalmente por cepas vnicas de Saccharomyces. Es importante que la inoculacin con levaduras seleccionadas est creciendo como prctica mundial. La prctica de usar mosto de un tanque en fermentacin intermedia para inocular a otro, resulta en una rpida iniciacin de la fermentacin debido a que las levaduras estn preadaptadas al mosto de uva, sin embargo, tiene la desventaja de introducir un inculo con nutrientes disminuidos. Tambin disminuye factores de supervivencia a las clulas, y puede promover la multiplicacin de organismos dainos si se vuelven estables en el mosto usado para la inoculacin. Generalmente, se usa un 2 a 5 % (v/v) de un mosto en fermentacin, hasta 12 a 15 Brix. Las especies de Saccharomyces dominan prontamente las fermentaciones de jugo de uva, an cuando estn en nmeros muy inferiores en los pasos iniciales de la fermentacin. BIBLIOGRAFA BOULTON, R. et al (1996) Principles and practices of winemaking The Chapman & Hall Enology Library CARRASCOSA, Alfonso. (2005) Microbiologa del vino. 1 Edicin. AMV Ediciones. FRIGERIO, H. Diferentes informes y traducciones del Ing. Agr. Humberto Frigerio realizadas para la Asignatura Enologa I. FCA UNC FULGELSANG, K. (1997) Wine Microbiology The Chapman & Hall Enology Library RIBREAU-GAYON, P. et al. (2003) Tratado de Enologa. 1. Microbiologa del vino. Vinificaciones. Buenos Aires. Hemisferio Sur TOGORES, Jos H. (2003) Tratado de Enologa Tomo 1. Ediciones Mundi Prensa. Madrid, Espaa

Lic. Mara Laura Snchez

10