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1) Se trabajaron cuatro levaduras aisladas de mostos tequileros, caracterizadas en trabajos previos y propiedad de la empresa 2) Las cepas de Saccharomyces sp se identificaron

como THL 013, THL 014, THL 018 y THL 110. 3) El criterio de seleccin se hizo considerando tres de los aspectos primordiales en esta industria: (1) eficiencia de la fermentacin (respecto a la ecuacin terica del rendimiento mximo 0.511); (2) cumplimiento de los compuestos indicados en la normatividad mexicana (NOM 006 SCFI 2005) y (3) la generacin de compuestos sensoriales de olor y sabor, evaluado mediante el panel de jueces de la empresa.

Seleccin levadura

de

cepa

de

Cinticas de fermentacin
1) Para la determinacin de la riqueza alcohlica del mosto, en un microdestilador con recirculacin de agua fra, se destilaron 5 mL del mosto a analizar, ajustado a 20 C se le adicionaron 3 mL de agua destilada y se recuperaron 5 mL del destilado a la misma temperatura de entrada 2) se le determin la concentracin de alcohol en el densmetro digital (DMA) (de acuerdo a la norma mexicana NMX - V - 013-Normex-2005) 3) y de ste destilado 2 mL se llevaron al cromatgrafo de gases para analizar los compuestos indicados en la norma mexicana NOM 006 SCFI 2005, de acuerdo al procedimiento indicado en NMX-V- 005Normex-2005 4) adems, se determin furfural mediante la tcnica indicada en la norma NMX-V- 004Normex-2005.

1) El medio utilizado en la seleccin se prepar con un lote de jugo de Agave y sacarosa (mosto mixto) a 10 Brix, adicionado con 0.1 g/L de sulfato de amonio, Se utilizaron matraces erlenmeyer de 1L de capacidad con 750 ml del medio y se esterilizaron durante 10 min a 110 C. 2) Cada matraz fue inoculado con 50 Ml de la levadura correspondiente, crecida previamente durante 12 horas en un agitador orbital a 30 C y 250 rpm. 3) Los matraces se incubaron a 35 C por 72 h. 4) Las determinaciones realizadas al inicio y final de la fermentacin fueron: ARD, ART, poblacin por cuenta directa al microscopio y riqueza alcohlica. 1) Se realiz con una destilacin simple, para obtener una muestra conocida como ordinario del medio final de la fermentacin. 2) Todo el ordinario se ajust a una concentracin de alcohol del 15% (v/v), mediante un clculo en la concentracin final del grado alcohlico de cada uno de los mostos, empleando la frmula V1C1=V2C2, donde V1 es el volumen del medio final de la fermentacin; C1 grado alcohlico final de la muestra y C2, la concentracin deseada de 15%, el V2, volumen a obtener para la muestra de ordinario. 3) Posteriormente las muestras fueron analizadas por siete jueces entrenados en anlisis de materia prima, mostos muertos (medio de fermentacin al tiempo final), ordinarios y producto final (tequila). 4) Mediante una prueba hednica se asignaron valores desde 1 (desagrado total) hasta 7 (mximo agrado) dependiendo de la aceptacin de cada persona. Los resultados de las calificaciones otorgadas se sometieron a un anlisis de varianza bloqueando el efecto del juez. 5) Todos los ensayos realizados fueron por duplicado y los resultados se analizaron utilizando el paquete estadstico Statgrpahics plus. 1) Al volumen final obtenido en la etapa de fermentacin se le realiz una doble destilacin para tener muestra de tequila. Para este fin se utilizaron matraces de destilacin de 1L, cada carga se realiz con 700 ml del medio final de la fermentacin (conocido en la industria con el termin de mosto muerto) se destil a una temperatura de 90C y se retiraron los primeros 3.0 ml del condensado (fraccin referida como cabezas). 2) Por cada 700 ml de mosto muerto, se recuperaron 200 ml de ordinario (primera destilacin), al ordinario se le determin la riqueza alcohlica para establecer el volumen a recuperar en la segunda destilacin. Los 600 ml de ordinario que se obtuvieron, se destilaron nuevamente a 90C, retirndose 3.0 ml y se recuper el volumen de tequila que result despus de determinar la riqueza alcohlica en los mostos ordinarios, dependiendo de las combinaciones y la concentracin de alcohol en el mosto final, se realizaron los clculos necesarios para tener una riqueza alcohlica no menor de 35% de alcohol en volumen (que es la mnima riqueza permitida en la NOM 006SCFI 2005). 1) se realiz utilizando la metodologa de superficie de respuesta, empleando mnimos cuadrados con el paquete estadstico Statgrpahics plus 4.0. 2) La funcin objetivo general que se utiliz fue una de segundo orden

Anlisis de [ ] de alcohol y compuestos de NOM

Evaluacin sensorial

1) se utiliz un diseo estadstico factorial fraccionado 24-1, completamente al azar, manteniendo como bloque la levadura y el mosto por ser variables no continuas. 2) Las cepas de Saccharomyces sp utilizadas en la siguiente etapa fueron las identificadas como THL- 018 y THL-110, en dos tipos de mostos de Agave: mixto y 100% 3) Las variables independientes fueron la concentracin de azcar (Azcar) de 8 y 15 Brix; concentracin de nitrgeno de acuerdo a la adicin extra al mosto (N) de 0 y 0.5 g/L de nitrgeno; concentracin de fsforo de acuerdo a la adicin extra al mosto (P) de 0 y 0.3 g/L de fsforo y la temperatura (T) de 20 C y 40 C. Las variables de respuesta (dependientes) fueron: eficiencia de fermentacin (%E) (respecto a la ecuacin terica de rendimiento mximo 0.511) y concentracin de los compuestos Indicados en la norma oficial del tequila (NOM-006- SCFI-2005). 4) El tiempo de fermentacin fue de 72 h tomando muestras cada 4 horas, para anlisis de ARD, pH; riqueza alcohlica y compuestos de NOM 006 SCFI 2005. El volumen final de la fermentacin que fue de 2.1L se utiliz para la obtencin de muestras de tequila a nivel laboratorio.

Anlisis de la etapa de fermentacin

Destilacin de las muestras de fermentacin

Optimizacin

1) Determinacin de etanol por densidad DMA (NMX - V - 013-Normex-2005) 2) Determinacin de azcares reductores directos (ARD) y totales (ART), mtodo de Fehling, y cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC) NMX-V- 006-Normex-2005. 3) Determinacin de compuestos de Norma: Aldehdos, Esteres, Metanol; Alcoholes Superiores: Norma Mexicana, NMX-V- 005- Normex-2005 y Furfural: NMX-V- 004- Normex-2005. 4) Determinacin de fsforo en mostos de Agave (AOAC, 1990). 5) Determinacin de nitrgeno amoniacal en mostos fermentados (mtodo de Nessler. 2800 Spectrophotomete

Tcnicas Analticas

2) Se determin la funcin objetivo para cada variable de respuesta (Eficiencia, metanol, alcoholes superiores, aldehdos, steres y furfural) y se realiz una optimizacin de respuesta mltiple tomando en cuenta la funcin objetivo, maximizando eficiencia con restricciones en metanol y alcoholes superiores principalmente, considerando los niveles mximos de cada uno de estos parmetros indicados en la normatividad mexicana (NOM 006 SCFI 2005). 3) Por ltimo se realiz una corrida confirmatoria con las condiciones sugeridas por el modelo, empleando del mismo lote de jugo de Agave. 4) El paquete estadstico utilizado fue el Statgraphics plus 4.0. Los anlisis de varianza (ANOVA) realizados en todos los tratamientos se hicieron con un nivel de significancia del 0.05.

Diagrama de proceso para la optimizacin del proceso de fermentacin para la produccin de tequila Redaccin Realiz: Javier Daniel Ramrez Amaya