FACULTAD DE MEDICINA HUMANA DEPARTAMENTO ACADMICO DE CIENCIAS BSICAS

ASIGNATURA

BIOQUMICA
GUA DE PRCTICA

SEGUNDO AO
II Semestre Lima - Per 2013

PRACTICAS DE LABORATORIO N1:

INSTRUMENTACIN, CENTRIFUGACION Y ESPECTROFOTOMETRIA 1.- CENTRIFUGACIN

rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRFUGA para separar partculas que se encuentran en suspensin en un medio lquido. El incremento de la fuerza centrifuga condicionar que las partculas migren alejndose del eje de rotacin de la centrifuga. El proceso migratorio de las partculas se denomina sedimentacin y la velocidad con que sedimentan es proporcional a la fuerza centrifuga expresada como incrementos de la gravedad (G). La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del rotor soporte del medio que se centrifuga y del radio del mismo. El radio del rotor de la centrifuga depende si sta es del tipo ngulo fijo o flotante. En el primer caso es un promedio entre el radio mnimo y el mximo, y en el segundo es la distancia entre fondo del tubo y el eje.

La velocidad de la sedimentacin se altera por la fuerza centrfuga, pero adems por la forma de las partculas, y por la viscosidad del medio lquido que las suspende. Tambin depende de la temperatura en cuanto sta altere la viscosidad del medio o de las cargas elctricas de las partculas. Los equipos que permiten la centrifugacin se llaman centrfugas y constan de un motor con controles, que mueven un rotor que

sostiene los tubos de centrifugacin. Los rotores son de dos clases, de ngulo fijo y flotante, tal como se ve ms arriba. La mayora de la centrfugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm, aunque algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrfugas tienen refrigeracin lo que permite separar partculas biolgicamente activas tales como factores de coagulacin, enzimas, etc. Las ultracentrfugas son centrfugas con vaco, refrigeracin y velocidades de ms de 500 000 x g. Permiten la separacin de los componentes tisulares, tal como se aprecia en el cuadro adjunto y poder estudiar cada uno de ellos a partir del homogenizado de un tejido cualquiera. Para evaluar con certeza la capacidad de una centrfuga para separar los componentes celulares debemos manejar gravedades en lugar de revoluciones por minuto, por lo que frecuentemente usamos el nomograma de Dole y Cotziar que presentamos a continuacin.
Suspender el tejido al 10% Homogenizar en Potter E.

Centrifugar a 600g x 10 Sedimento: ncleos, restos celulares Centrifugar el sobrenadante a 4000g x 15 Sedimento: mitocondrias Centrifugar el sobrenadante a 16 500g x 15 Sedimento: lisosomas Centrifugar el sobrenadante a 100 000g x 40 Sedimento: microsomas Sobrenadante: citosol 3

TIPOS DE CENTRIFUGACIN 1. Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades de sedimentacin de distintas partculas. La usamos en la clnica para separar sedimentos de orina, o componentes del plasma. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un soluto denso, la ms usada la sacarosa, las molculas sedimentan de acuerdo a su coeficiente de sedimentacin. La sacarosa densa evita que las bandas se mezclen.

2.

La gradientes pueden ser discontinuas preparadas mediante la colocacin de soluciones de diversa densidad una sobre otra- y continuas preparada mediante un equipo de mezcla de soluciones, que va incrementando la densidad progresivamente.

TUBOS DE CENTRIFUGACIN : Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRFUGA NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Existen tubos de centrfuga de diversa composicin: 1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente a los cidos y bases de baja dilucin. 2. Borosilicato: vidrio muy resistente a qumicos de alta concentracin . 3. Polietileno: plstico muy resistente a los qumicos, pero sensible a la temperatura. 4. Propileno: plstico bastante resistente a la temperatura autoclavable- y resistente a casi todos los qumicos. PORTATUBOS Son de plstico o de metal y poco resistente a cidos y bases fuertes. Deben ser conservados muy limpios. 2.- COLORIMETRA Es el anlisis de la concentracin de una muestra por el color que presenta. Todos hemos tenido la experiencia de valorar la concentracin de sustancias coloreadas en solucin, por observacin directa, una taza de caf o t, un vaso de refresco, son apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o menor absorcin de luz de acuerdo al mayor nmero de molculas y tonalidad depender de la capacidad de absorber una u otra longitud de onda de luz, especficamente. La fotocolorimetra manipula las variables de este fenmeno controlando la luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de modo tal que slo incida aquella luz que es especficamente absorbida por la partcula que medimos.
Rayos X 1nm a 1pm 450nm 540nm 640nm Microondas: 25um a 1mm

Rayos < 1pm

Ultravioleta: 400nm a 1nm

Infrarrojo: 750nm a 25 um

Ondas de radio > 1mm

Los cuerpos luminosos como el sol o las lmparas elctricas emiten un gran espectro electromagntico que comprende amplias longitudes de onda, de las cuales muy pocas corresponden al espectro visible. En el cuadro anterior se aprecian todas las radiaciones electromagnticas conocidas. Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. No interesa particularmente los colores que absorbe la solucin que queremos medir. La selectividad de absorcin que queremos medir. La selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energa, y para excitar los electrones de cada partcula necesitamos un particular nivel de energa. Si consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la concentracin en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor absorcin de luz y menor luz trasmitida. Estos factores estn considerados en la ley de Lambert y Beer.
Longitud de onda 400-435 435-480 480-490 490-500 500-560 560-580 580-595 595-610 610-750 Color violeta azul verde-azul azul-verde verde amarillo-verde amarillo-verde anaranjado rojo Colores complementarios amarillo-verde amarillo-verde anaranjado rojo purpura violeta azul verde-azul azul-verde

Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos como color propio del cuerpo coloreado. Interesa particularmente
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los colores que absorben la solucin que queremos medir. La selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda se basa en que cada longitud de onda de luz corresponde a un distinto nivel de energa y para excitar los electrones de cada partcula se necesita un particular nivel de energa. S consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la concentracin en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor concentracin de sustancia, mayor absorcin de luz y menor luz trasmitida. Estos factores estn considerados en la Ley de Lambert y Beer, que es la siguiente:

Log Io/It = e.l.c

Donde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentracin, L = longitud de paso, e = constante. 3.- FOTOCOLORIMETRIA ESPECTROFOTOMETRIA La fotocolorimetra es la medida de la luz absorbida por una solucin mediante un aparato que es un fotocolormetro. El equipo consta de una fuente de luz artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio (que alberga la solucin a medir), una clula fotoelctrica que transforma la luz trasmitida en corriente elctrica y una unidad de medida de la corriente elctrica o galvanmetro.

Luz Incidente Io

Luz trasmitida It

La calificacin de colormetro o espectrofotmetro depende del monocromador, s ste es un filtro tendremos un fotocolormetro, pero si es un prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de onda tendremos un espectrofotmetro.

Fuente de luz blanca

Muestra: Absorcin

Galvanmetro

Monocromador

Celda

Los fotocolormetros y los espectrofotmetros reportan sus resultados bajo dos formas: absorbancia o luz absorbida por las partcula de la solucin y transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solucin. La transmitancia se expresa en valores numricos entre 0 y 100%, es decir que una solucin que no tiene particular trasmitir el 100% y una perfectamente opaca el 0%. La absorbancia, tambin llamada densidad ptica DO, se expresa en valores semilogartmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a aquella solucin que no tiene partculas y por lo tanto no absorbe la luz. Para encontrar la concentracin de una solucin problema, debemos comparar su lectura frente a un blanco agua destilada o reactivos sin modificarse con la lectura de un patrn o solucin estndar bajo las mismas condiciones. Una solucin estndar es generalmente una que contiene el problema con una concentracin perfectamente medida en el laboratorio.
CLCULO DE LA CONCENTRACIN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentracin de una muestra problema tenemos dos procedimientos: 1. 2. Factor de Calibracin Curvas de calibracin

Factor de calibracin: es la concentracin de sustancia que corresponde a una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia.

Se obtiene Factor de calibracin:

concentracin del patrn Lectura del patrn (en absorbancia)

Esta frmula deriva de la densidad ptica o absorbancia del problema: DOP= eP lP cP Si el coeficiente de extincin (e) es el mismo en ambos casos y el dimetro del tubo de lectura(l) es el mismo, la nica diferencia est en la concentracin. Luego: DOst = DOp CP Despejando la concentracin del problema cp, obtenemos la siguiente formula:
cs
CS

cp=Dp x -------Dost Concentracin del problema = Densidad ptica del Problema X Factor de calibracin La curva de calibracin consiste en la obtencin de las lecturas de absorcin 0 de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia creciente de concentraciones, estas son graficadas en un papel milimtrico si se trata de absorbancia o densidad ptica y de papel semilogartmico si se trata de % de transmitancia. 4.- POTENCIOMETRA La potenciometra es el procedimiento de eleccin para la medida del pH. El pH en una expresin numrica que corresponde al logaritmo de la inversa de la concentracin de iones H+. La potenciometra se basa en la diferencia de potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos sumergidos en la solucin y bajo condiciones de equilibrio. El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varia de acuerdo a la concentracin de hidrgeno de la solucin y un dispositivo o potencimetro que mide la
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diferencia de potencial. El electrodo de referencia puede ser de dos clase: de calomel, mercurio metlico y cloruro mercurioso y de plata plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la solucin de cloruro de potasio en que est sumergido internamente. El electrodo de medida, es tambin llamado electrodo de vidrio, est constituido por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de iones hidrgeno. En su interior hay cido clorhdrico HCl 0,1 M y un alambre de plata, cloruro de plata,

Batera

0V

1V

AAg.Aa HclgCl.HCl.Vidrio

Solucin Problem a.

KCl.Hg2Cl2.Hg

En el potencimetro, un voltaje variable se opone al de la celda de medida. Un galvanmetro acta como detector del punto nulo para indicar que es igual al voltaje opuesto de la celda de medida. Conectando la celda desconocida al circuito se produce un desnivel de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el punto nulo. La magnitud de la correccin puede leerse como fuerza electromotriz o como pH directamente. En la prctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentracin de otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que slo es selectiva al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos bajo esta manera con facilidad. Tambin existe el electrodo de CO 2 que deja pasar molculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas con el electrodo de vidrio de pH.

5.- ESPECTROFOTOMETRIA

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EXPERIMENTO.- Preparacin de una curva de calibracin: el experimento consiste en preparar tubos de concentracin creciente de un colorante y leerlos al fotocolormetro o al espectrofotmetro, llevando a cero (0) el aparato con agua destilada. Construir una grfica usando papel milimetrado para las lecturas hechas en DO (densidad ptica) o papel semilogartmicos para las lecturas hechas en % transmitancia. Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las soluciones al espectrofotmetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta lectura tanto en DO como en % de transmitancia. Construir dos curvas de calibracin, una en papel milimetrado y otra en papel semilogartmico.
Contenido mL Azul metileno al (5 mg/Ml) mL Agua destilada Concentracin (mg/mL) 1 2 8 Tubo N 2 3 4 4 6 8 6 4 2 %T 5 10 0 A (A=2-logT%)

Desconocido 1 Desconocido 2
Experimento: Efecto del pH
100 80 60 40

t u d p n i c a m r o F %

20 0 0 1 2 3 4 5
pH

10 11 12

COMENTARIO

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 ... Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique usando el papel semilogartmico de esta pgina.

100 % T (540 nm) 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 Concentracin (mg/mL) COMENTARIO .

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA
Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N2: POTENCIOMETRIA EXPERIMENTO: Titulacin de un cido dbil con una base fuerte.
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Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de titulacin de cido actico con hidrxido de sodio. Cuando se titula un cido dbil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rpido para luego hacerse lento, dentro de ciertos mrgenes y al final se alcaliniza rpidamente. La identificacin del cambio de pH en cierto perodo de la titulacin, se debe a la formacin transitoria de una combinacin de cido dbil y la sal correspondiente. En el caso del experimento ser la combinacin de cido actico y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una solucin amortiguadora o solucin buffer.Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:
mL actico 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua destilada 1 5,0 0,0 5,0 2 5,0 0,5 4,5 3 5,0 1,0 4,0 4 5,0 1,5 3,5 5 5,0 2,0 3,0 6 5,0 2,5 2,5 7 5,0 3,0 2,0 8 5,0 3,5 1,5 9 5,0 4,0 1,0 10 5,0 4,5 0,5 11 5,0 5,0 0,0 14 Leer los tubos en el potencimetro y graficar los resultados 13 12 11 10 9 8 7 6 5 4 H p Tubo No

NOTA
1

3 Fecha 2 Hora 0 PRACTICAS DE LABORATORIO N3 4 5 6 7 8 9 10 Volumen (mL)

CINTICA ENZIMTICA: EFECTO DEL Ph y LA TEMPERATURA

11

12

13

Las enzimas son protenas que aceleran las reacciones qumicas hasta su punto de equilibrio. La ecuacin general de las enzimas es:
E + S C ES C E+P

La actividad enzimtica se manifiesta y mide por: Desaparicin de sustrato Formacin de producto Modificacin de cofactor Muchos factores modifican la actividad enzimtica: pH Temperatura Concentracin de sustrato Concentracin de enzima Tiempo de incubacin En nuestra prctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albmina del huevo. La actividad enzimtica se apreciar por la prdida de la turbidez proteica. EXPERIMENTO.- Efecto del pH El pH acta sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos de las enzimas. Los grupos que pierden la ionizacin pierden la capacidad de interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH ptimo de trabajo.
Preparar cinco tubos con: TUBO N 1 Ph 1,0 mL albmina 5,0 mL HCL 1N 2,0 mL CO3Na2 0,0 mL agua destilada 0,0 2 1,5 5,0 0,5 0,0 1,5 3 6,0 5,0 0,0 0,0 2,0 4 9,5 5,0 0,0 0,5 1,5 5 11 5,0 0,0 2,0 0,0

Preincubar los cinco tubos ms un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1% a 37C por 5 minutos. Luego aadir rpidamente 3
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mL de la pepsina preincubada a cada uno de los tubos 15. Mezclar e incubar a 37C por 10 min. Observar la diferencia o leerla en fotocolormetro con filtro azul (420 nm). EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura. Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimtica por aumento de la energa de activacin. Pero paralelamente se va produciendo una desnaturalizacin parcial de la enzima que la inactiva.
Preparar cinco tubos con: TUBO N 1 mL albmina mL HCL 1N mL agua destilada 5,0 0,5 3,5 2 5,0 0,5 3,5 3 5,0 0,5 3,5 4 5,0 0,5 3,5 5 5,0 0,5 3,5

Preparar otros cinco tubos con: TUBO N 6 mL pepsina 1% 1,0

7 1,0

8 1,0

9 1,0

10 1,0

Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura: TUBO N 1y6 2y7 3y8 4y9 5 10 Temperatura O C Amb. 37 C 70 C 37 C 100 C

Agregar los respectivos tubo N 6 al N 10 a los que hay que incubar a las temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 5.

Experimento: Efecto del pH

100 % Formacin producto 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 pH
% Formacin producto 100 80 60 40 20 0 0

Experimento: Efecto de la temperatura

20

40

60

80

100

Temperatura (C)
15

Comentario: Firma del alumno

Comentario: Firma del profesor

NOTA
Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N4
CINETICA ENZIMATICA: EFECTO CONCENTRACION, ENZIMA Y SUSTRATO EXPERIMENTO. -Efecto de la concentracin de la enzima Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas en la cubeta de reaccin incrementa la velocidad.
Preparar 5 tubos con: TUBO N mL albmina mL HCL 1N mL agua destilada mL pepsina 1 5,0 0,5 1,5 0,0 2 5,0 0,5 2,5 0,0 3 5.0 0.5 3.5 0.0 4 5,0 0,5 4,0 0,0 5 5,0 0,5 4,5 0,0

Incubar los 5 tubos a 37C por 5 minutos y enseguida aadir: TUBO N 1 2 3 mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0

4 0.5

5 0,1

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Incubar por cinco minutos a 37C. Observar al fotocolormetro a 420 nm (filtro azul), contra una lectura de agua.

EXPERIMENTO.-Efecto de la concentracin del sustrato Si es una reaccin enzimtica incrementamos progresivamente la concentracin del sustrato, aumentar la velocidad enzimtica (velocidad inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos saturado la enzima.
Preparar 6 tubos con: TUBO N mL albmina mL HCL 1N mL agua destilada mL pepsina 1% 1 2,0 0,5 7,0 0,0 2 3,0 0,5 6,0 0,0 3 4,0 0,5 5,0 0,0 4 5,0 0,5 4,0 0,0 5 6,0 0,5 3,0 0,0 6 7,0 0,5 2,0 0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37C. Colocar 0,5 mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37C. Leer al fotocolormetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera. Graficar y comentar los resultados.

Experimento: Efecto de la concentracin de enzima

% Formacin producto

Experimento: Efecto de la concentracin de sustrato

% Formacin producto

100 80 60 40 20 0 0 2 4 6 8 10 12 Concentracin enzima (mg/mL)

100 80 60 40 20 0 0 1 2 3 4
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Concentracin de sustrato

Comentario:

Comentario:

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA
Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N5
DIGESTIN DE CARBOHIDRATOS El carbohidratos ms importante en la alimentacin es la glucosa, la cual ingerimos bajo la forma de disacridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de almidn, polisacridos formado por muchas molculas de glucosa. El almidn es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubrculos y races. La digestin del almidn se produce en el intestino delgado gracias a la presencia de enzimas digestivas producidas por las glndulas salivares, el pncreas y la pared intestinal. Estas enzimas son: La alfa amilasa salivar La alfa amilasa pancretica La amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal Las alfa amilasas son enzimas que actan a pH neutro y en presencia de iones cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacridos y glucosa. Existe dos formas de evaluar la actividad enzimtica de la amilasa: Por desaparicin de sustrato: forma como desaparece el almidn el que se aprecia por la reaccin del lugol.
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Por formacin de producto: forma como aparecen carbohidratos reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reduccin del cobre. En nuestra prctica evaluaremos la actividad enzimtica de la amilasa sobre el almidn mediante la reaccin del remanente de almidn frente al yodo a mayor decoloracin, mayor actividad enzimtica. EXPERIMENTO.- Digestin del almidn por la amilasa salivar . Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente esquema.
TUBO ml almidn 1% ml Buffer fosfato pH 6,6 ml HCL 0,3N ml Suero fisiolgico ml Agua destilada 1 2 1 0 3 0 2 2 1 0 2,4 0 3 2 1 0 0 2,4 0,6 4 2 0 3,4 0 0 0,6

Colocar en bao de Mara a 37C por 5 minutos. Agregar: ml solucin de saliva 0 0,6 Colocar en bao de mara a 37C por 20 minutos

Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos ms de acuerdo al esquema

TUBO ml digestin tubo 1 ml digestin tubo 2 ml digestin tubo 3 ml digestin tubo 4 ml HCL 0,05N ml Solucin yodada

1 0, 5 0 0 0 5 0,5

2 0 0,5 0 0 5 0,5

3 0 0 0,5 0 5 0,5

4 0 0 0 0,5 5 0,5

Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolormetro con filtro rojo (660nm)

INFORME DE LA PRCTICA

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Nombre: Grupo :

Fecha:

Experimento.- Digestin del almidn por la amilasa salivar

1.05 0.90 0.75 Abs 0.60 0.45 0.30 0.15 0.00 Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
COMENTARIO: . Firma del alumno Firma del profesor

NOTA
Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N6:

ABSORCIN DE CARBOHIDRATOS

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Despus de la digestin de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y pancretica, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado monosacridos: glucosa, fructosa, galactosa, que debern ser absorbidos por la mucosa intestinal para su ingreso a la circulacin sangunea. Los carbohidratos se absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple difusin favorecida por la gradiente de concentracin y el transporte activo, an contra la gradiente. El orden de facilidad en la absorcin es de galactosa glucosa: ribosa. El borde en cepillo de las clulas intestinales tiene varios sistemas trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el tenor de sodio intracelular. La energa necesaria para este transporte se obtiene de la hidrlisis del ATP vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio

Tambin participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado GLUT 5. La hidrlisis de los polisacridos, oligosacridos y disacridos es muy rpida por lo que usualmente los procedimientos de absorcin se saturan con rapidez. EXPERIMENTO.-Absorcin de la glucosa por el intestino de la rata

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1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia con eter bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se retira una porcin de 5 cm de intestino, de modo que no puede mesenterio adherido. 2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con solucin Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una baqueta de vidrio se empuja un extremo del intestino dentro del mismo buscando evertir la porcin mucosa hacia fuera. Mantener el intestino en solucin Ringer Fosfato pH 7,4 a temperatura ambiente. 3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura suelta en el otro extremo del intestino. 4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solucin Ringer Fosfato pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta y revisar que no haya prdida de lquido. 5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solucin Ringer Fosfato pH 7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37C por 30 minutos. Pasado del tiempo sacar el saquito, secarlo por fuera con papel de filtro. Cortarlo con tijera y vaciar el contenido en u tubo de ensayo. 6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito, como el del tubo que lo recibi durante la incubacin. Luego proceder a preparar 4 tubos de acuerdo al siguiente esquema .
TUBO ml reactivo para glucosa l agua destilada l patrn 20 mg/dL l solucin diluida intra saco l solucin diluida extra saco 1 2 50 0 0 0 2 2 0 50 0 0 3 2 0 0 50 0 4 2 0 0 0 50

Incubar a 37C por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolormetro a 520nm. Usando el tubo 1 como blanco COMENTARIO: . Firma del alumno Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N7:
GLICLISIS

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La va metablica ms importante para la glucosa es la va glicoltica o de Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es responsable del aprovechamiento energtico de la glucosa y an de otros carbohidratos. Tiene dos formas de manifestarse: la forma anaerbica cuando la concentracin de oxgeno es baja, produce cido pirvico y cido lctico, y genera escasamente dos molculas de ATP, tal como se aprecia en la siguiente frmula global.
GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la gliclisis transcurre en presencia abundante de oxgeno, tiene como producto final el cido pirvico, el cual se transforma en actil CoA mediante el proceso de decarboxilacin oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs donde produce 38 molculas de ATP.

EXPERIMENTO.- Gliclisis.

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La gliclisis anaerbica (parcialmente) se demuestra por el aumento de compuestos cidos (pirvico y lctico) en el tubo de reaccin. Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.

TUBO ml solucin de Potter pH 7,4 ml Glucosa 0,1 m ml NAD 10m g/ml ml ATP 5m g/ml ml Nicotinamida 0,4m ml Yodoacetato 0,1m ml Agua destilada

1 2,5 0,5 0,2 0,2 0,1 0

2 2,5 0,5 0,0 0,2 0,1 0

3 2,5 0,5 0,2 0 0,1 0 0,3 ii 0,5

4 2,5 0,5 0,2 0,2 0,1 0,1 0 Ii 0,5

0,1 0,3 Colocar en bao de mara 37C por 5 minutos Gotas de rojo de fenol ml homogenizado de hgado Ii 0,5 Ii 0,5

Tapar e incubar 1 hora a 37C Titular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original

COMENTARIO:
.

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA
Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N8:

RESPIRACIN TISULAR
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La respiracin tisular es el proceso por el cual se aprovecha la energa almacenada en los nutrientes (glucosa, cidos grasos, aminocidos) a travs del Actil CoA, mediante procesos de oxidacin. Durante el proceso de oxidacin del Acil Coa se forman equivalentes reductores en forma de hidrgeno o electrones que ingresan a la cadena respiratoria, localizada en las mitocondrias y genera muchas molculas de ATP. Como puede apreciarse en el esquema adjunto hay tres fuentes de generacin de electrones que producen 3 molculas de ATP, el isocitrato, el cetoglutarato y el malato y una que slo proporciona dos ATP que es el succinato, debido a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la Coenzima Q y no del NAD como las otras. El punto final del transporte de los electrones por la cadena respiratoria es el oxgeno. Dos tomos de hidrgeno se unen a molcula de oxgeno para forma una molcula de agua. El proceso oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxgeno. EXPERIMENTO: Respiracin Tisular El experimento estudia la respiracin tisular mediante la manometra. Un manmetro es un instrumento que mide los cambios en la presin de los gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un lquido en dos recipientes que se comunican entre s, ambas ramas sern iguales siempre que sobre ellas exista la misma presin sobre una de ellas disminuye los niveles de lquido se desigualan. Los

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equipos que usaremos sern iguales o semejantes a los que se observan en el grfico, es decir constan de un ambiente cerrado para la reaccin, un medio de absorcin de CO 2 que puede combinar
Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema: FRASCO N ml Solucin de Potter pH 7,4 ml Succinato de potasio 0,5m ml Agua destilada ml Homogenizado 1 3 0,3 0,7 0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos la modificacin del nivel del manmetro. Prepara un grfico de consumo de oxgeno vs tiempo. Consumo de oxgeno en el tiempo 0.5
Volumen O2 consumido

0.4
(cm3)

0.3 0.2 0.1 0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

Tiempo (Minutos)

Comentario:
Firma del alumno Firma del profesor

NOTA
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Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N9:

COLESTEROL DE LAS FRACCIONES LIPOPROTECAS Las protenas son lpidos complejos resultado de unir la grasa con protenas. Los lpidos sanguneos se encuentran bajo esta forma y divididos en cuatro tipos de lipoprotena: Alfa lipoprotena (HDL) ricas en protenas y fosfolpidos Pre beta lipoprotenas (VLDL): ricas en triglicrido Beta lipoprotenas (LDL): ricas en colesterol Quilomicrones (Q): ricos en triglicridos dietticos

Toda las lipoprotenas tienen colesterol, triglicridos, fosfolpidos y protenas, pero en distinta concentracin relativa. El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al depositarse en las paredes de los vasos sanguneos. El colesterol de las betalipoprotenas est en actitud de depositarse en los vasos constituye la mayor parte del colesterol sanguneo. El colesterol de las alfa lipoprotenas (HDL) es aquel que est siendo retirado de los vasos, por lo que su presencia es beneficiosa. Para investigar el colesterol de las alfa lipoprotenas usamos un reactivo precipitante (fosfotngstico-cloruro de calcio) que precipita

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a las betas y prebetalipoprotenas dejando en solucin a las alfa, sobre las que se realiza la reaccin de color tpica del colesterol.

EXPERIMENTO: Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre. Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24 horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante. Preparar un tubo al que se le coloca: 1ml de suero lmpido 0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10 minutos separar el sobrenadante. Preparar cuatro tubos lmpidos y colocar:
TUBO N ml Suero lmpido ml Sobrenadente anterior ml Patrn de colesterol ml Agua destilada ml Reactivo de color 1 0,02 0 0 0 2 2 0 0,02 0 0 2 3 0 0 0,02 0 2 4 0 0 0 0,02 2

Agitar: Incubar por 15 minutos a 37C. Leer al fotocolormetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el blanco (tubo4) Clculos
200

Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 2)

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D.O (3)

EXPERIMENTO : Dosaje de triglicridos

Preparar tres tubos con: TUBO N ml Suero ml Patrn de triglicridos ml Reactivo de color Agitar, incubar a 37C por 15 minutos 1 0 0 2 2 0,02 0 2 3 0 0,02 2

Leer al fotocolormetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a O con el tubo 1

Conc. Patrn

Triglicridos mg/dl = ------- x D.O.(2) D.O (3)

INFORME DE LA PRCTICA : RIESGO CORONARIO Nombre: ............................................................................................................. ............................................................................................................. ............................................................................................................. .......................................................................................... Experimento: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre Patrn: Lectura: Concentracin: Factor de Calibracin:
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Colesterol total:

PRACTICAS DE LABORATORIO N10:

LIPIDOS: ELECTROFORESIS DE PROTEINAS La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al polo positivo, mientras que las protenas son molculas cuya carga neta depende del contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente cido glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e histidina). Para la separacin se usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir pasando por el papel, por la que las pequeas se movern mejor y rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes quedarn cerca del lugar de partida. En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de: 1) su carga elctrica 2) su tamao 3) la intensidad del campo elctrico y 4) la temperatura del medio. Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables (principalmente -COO -y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o negativamente, o bien permanecer elctricamente neutras segn la proporcin de los diversos grupos ionizados a un determinado pH. En suero humano la composicin normal es: Protena total: 6,4 a 8,3 g/dL Albmina: 3,5 a 5,0 g/dL Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL

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ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA Se usa para la separacin y caracterizacin de protenas y otras molculas. El soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de adsorcin mnimas, por lo que se evita la formacin de colas y los solutos pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son: 1) La separacin es muy rpida 2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeas 3) Las tiras pueden hacerse transparentes 4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados 5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos MATERIAL Y REACTIVOS Material - Tiras de acetato de celulosa (Cellogel) - Papel de filtro para secar las tiras de acetato - Cubeta de electroforesis - Aplicador - Fuente de electroforesis Reactivos -Tampn Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6 -Solucin de tincin: 0.1% (p/v) ponceau S stain en cido actico 1% -Solucin de lavado: cido actico 1% -Suero PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL Electroforesis: - Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su uso, para su equilibrado. - Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie - penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la esquina inferior derecha - Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo prximo al ctodo. - Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios durante 60 minutos. Revelado:

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- Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con solucin de tincin, de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10 minutos. - Lavar las tiras en solucin de distincin hasta que se observen bien las bandas de protena (rojo) sobre un fondo blanco. TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto de aplicacin de la muestra. Identificar las protenas que corresponden a cada banda y justificar el orden. Comentario: Firma del alumno profesor Firma del

NOTA Fecha Hora

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PRACTICAS DE LABORATORIO N11:

TRANSAMINACIN Una de las reacciones generales de los aminocidos es la transaminacin o trasporte de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, trasformado al primero en cetocido y al segundo en aminocido. Esta transformacin posibilita la formacin de carbohidratos a partir de aminocidos, esto es el fenmeno de la neoglucognesis. LA ecuacin general de estas reacciones es:
R=CH-COOH + R-C-COOG
Nh2

R-C-COOH+R-CH-COOH O NH2

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la transaminasa glutmico pirvica que transforma el alfa cetoglutrico (cetocido) en glutmico (aminocido) y a la alanina (animocido) en pervico (cetocido). Esa enzima que es particularmente rica en el tejido heptico es un excelente herramienta de estudio clnico de ese rgano, en problemas como la hepatitis o la cirrosis heptica. El procedimiento de anlisis se llevar a cabo mediante la cromatografa en capa fina.

PROCEDIMIENTO CROMATOGRFICOS

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La cromatografa es un procedimiento de anlisis por el cual una mezcla de molculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase estacionaria y una mvil. La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografa: papel, columna, capa fina y la fase mvil es lquida o gaseosa. La separacin de componentes se produce por el fenmeno de particin por solventes, esto es ante una mezcla de lquidos no miscible entre s, algunos componentes tendrn mayor posibilidad de localizarse en uno u otro componente, aquellos que se localicen en el componente ms lejano del soporte migraran ms y aquellos cercanos sern adsorbidos por el soporte. Existen una forma identificatoria de medir la migracin de las molculas analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relacin entre los cm migrados por la molcula y aquellos migrados por el medio mvil. EXPERIMENTO: cromatografa Demostracin de transaminacin por

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema: TUBO N ml cetoglutarato 0,2 M ml alanina 0,2M ml piruvato 0,2M ml glutamato 0,2M ml arsenito 0,1M ml Enzima activa ml Enzima inactiva 1 0,3 0,3 0 0 0,4 0 1 2 0,3 0,3 0 0 0,4 1 0 3 0 0 0,3 0.,3 0,4 0 4 0 0 0,3 0,3 0,4

1 =----------------0 RF

a a
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Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37C. Retirar los tubos del bao de Mara y agregar 6ml de alcohol etlico a cada tubo. Agitar y esperar por dos minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografa. Cromatografa Marcar a 3 cm del borde una lnea suave con un lpiz, tratando de no daar la slica gel. Marcar en esa lnea seis puntos separados por 2 cm cada uno. Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos ltimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar Colocar la cromatoplaca en una cmara de cromatografa con una mezcla de propanol: agua en la proporcin de 8: Dejar correr hasta que el nivel lquido le falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanz el lquido con un lpiz y dejar secar. Aplicar con un spray una solucin de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas .
Obtener el Rf de cada mancha mediante la frmula:
Distancia de origen al punto medio de la mancha

Rf:
Distancia de origen al nivel mximo del solvente

Comentario: .

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA
Fecha Hora

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PRACTICAS DE LABORATORIO N12:

EVALUACIN NUTRICIONAL Experimento .- Manejo de Tablas de Composicin de Alimentos La forma ms exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un sujeto es a travs del clculo de la ingesta alimentaria, bien documentada y exacta y mediante las Tablas de Composicin de Alimentos. En la presente prctica analizaremos: 1. Las necesidades calricas de un sujeto: tomando en cuenta, peso y trabajo. As conocemos que una persona gasta como Metabolismo Basal 1 kcalora /kg. Peso/hora. A ello aadimos aproximadamente un 50% por trabajo de mediana intensidad. 2. Las necesidades protecas de un sujeto: tomado su peso, aceptamos una necesidad de 1g/kg de peso/da( en condiciones mnimas 0,5/kg peso/da). 3. Las necesidades de nutrientes (protena, carbohidratos y grasa) de un da al azar. Con ello podemos establecer su ingesta calrica y proteca y por lo tanto su dficit o adecuacin. Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composicin de Alimentos resumida.

TABLA DE COMPOSICIN DE ALIMENTOS g/100g de alimento Alimento Atn (conserva) Bacalao (seco) Calamar Camarn Carne (cerdo) Protena 29,0 81,8 16,4 17,3 15,0 Lpido 4,8 2,8 0,9 0,2 15,1 Carbohidratos 0,0 0,0 0,0 2,5 0,0

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Carne (Pavo) Carne (pollo) Carne (pulpa) Carne Seca Chicharrones Cojinova Corvina Hgado Huevo (total) Jamn del Pas Jamn Ingls Leche fresca Lenguado Merluza Pejerrey Queso Fresco Queso mantecoso Tocino Trucha

20,1 18,2 21,3 48,1 11,3 20,2 19,9 19,5 12,8 15,9 25,8 2,9 19.0 19,3 18,7 16,0 25,8 9,1 18,2

20,2 10,2 1,6 9,4 61,4 0,7 0,9 6,6 11,8 26,6 20,5 3,3 0,5 0,8 1,2 10,3 20,2 65,0 1,0

0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 3,6 1,0 0,0 0,0 7,0 0,0 0,0 0,0 3,7 7,4 1,6 0,0

Alimento Arroz (seco) Arveja (verde) Avena Bizcocho Camote Fideos Frejol negro Frejol soya Frejol tarhui Galletas (soda) Galletas (Vainilla) Garbanzo

Protena 6,5 8,3 10,6 8,8 1,2 8,7 21,2 33,4 40,9 9,4 6,0 19,1

Lpido 0,7 0,7 0,9 6,9 0,2 0,3 1,7 16,4 13,4 14,7 12,7 5,1

Carbohidratos 78,1 24,2 68,5 64,4 27,1 78,3 53,3 35,5 27,3 67,9 75,0 61,4

Alimento Lentejas Maz (cancha)

Protena 22,8 6,7

Lpido 1,2 2,7

Carbohidratos 59,4 79,8

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Maz (choclo) Man Nuez Olluco Pallares Pan (frances) Papa blanca Papa Seca Quinua Yuca Aceitunas Blanquillo Cebolla Coco Col Coliflor Lechuga Nabo Pepina Rabanitos Tomate Zanahoria Zapallo

3,3 28.8 13,7 0,8 19,9 9,2 2,1 8,3 11,9 0,8 1,2 0,6 0,9 3,8 1,4 2,0 1,4 0,8 0,5 0,8 0,8 0,6 0,7

0,8 46,9 67,2 0,1 1,1 0,3 0,3 0,5 4,7 0,2 33,2 0,1 0,1 18,9 0,0 0,6 0,2 0,2 0,1 0,0 0,2 0,4 0,2

27,8 18,1 13,2 14,2 61,8 68,2 22,4 73,2 67,6 39.3 6,8 17,1 7,4 19,7 5.2 5,8 3,3 5,2 2,7 3,1 4,0 9,5 6,4

Alimento Aceite Azucar Chocolate Cocoa Gelatina(seca)* Limn Maizena Margarina Naranja Palta Papaya Platano isla Uva negra
* Se usan al 3-4g%

Protena 0,0 0,0 2.0 9,0 85,6 0.5 8,0 0,6 1.2 1,7 0,4 0,8 0,3

Lpido 100 0,0 30,0 19,0 0,1 0,0 3,0 81 0,0 12,6 0,1 0,2 0,1

Carbohidratos 0,0 99,5 60,0 31,0 0,0 11,2 74,0 0,4 11,2 6,5 8,3 23,8 17,9

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GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO ACTIVIDAD Durmiendo Muy Ligera: manejo de auto, laboratorio, mecanografa, coser y planchar Ligera: caminar, carpintera, mecanica, lavado de ropa Moderada: fregar pisos, ciclismo, tenis, baile Pesada: albail, natacin, ftbol, bsquetbol. MUJER : Kcal /kg/hora 1,1 2,0 3,9 5,9 10,0 HOMBRE : Kcal /k Kg/hora 1,0 1,2 ,91,2 2.5 1,12,5-4,9 5,0-7,4 7,5-12,0 2,04,06,0-

Firma del alumno

Firma del profesor

NOTA Fecha Hora

PRACTICAS DE LABORATORIO N13:

LABORATORIO DE LIQUIDOS CORPORALES. Examen de orina. Examen Fisico-Quimico
EXAMEN FISICO- QUMICO El anlisis de orina de rutina incluye pruebas qumicas para pH, protenas, glucosa, cetonas y sangre oculta. Algunos laboratorios tambin incluyen pruebas de bilirrubina, urobilingeno y nitrito, segn el tipo de tira reactiva que utilice. Desde la introduccin de tiras reactivas simples y mltiples, cintas de prueba y tabletas, el examen qumico de la orina se ha convertido en un procedimiento sensible y rpido. Actualmente es posible analizar hasta nueve pruebas diferentes en menos de 60 segundos. Existen dos marcas bsicas de tiras reactivas y cada una posee tiras reactivas con posibilidad de medir desde una hasta nueve reacciones diferentes.

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La compaa Bayer fabrica el producto Multistix y la Boehringer Mannheim Corporation (BMC) fabrica el Combur-10. ambas tiras miden pH, protenas, glucosa, cetonas, sangre oculta, bilirrubina, urobilingeno, nitritos, leucocitos y gravedad especfica. Pero qu es una tira reactiva? Esencialmente, es una banda angosta de plstico con pequeos tacos adheridos. Cada taco contiene reactivos para una reaccin diferente, lo que permite la determinacin simultnea de varias pruebas. Un requerimiento crtico es que las reacciones de las tiras sean ledas en el momento prescrito despus de haber sido sumergidas en la muestra, luego deben ser comparadas cuidadosamente con la carta de colores proporcionada por el fabricante. Con el objeto de obtener resultados exactos y confiables con las tiras reactivas, deben tomarse ciertas precauciones para ayudar a mantener la reactividad de los reactivos. Las tiras no deben estar expuestas en medios hmedos, a la luz directa del sol, al calor ni a sustancias voltiles, debiendo ser almacenadas en su envase original. Dicho envase no debe ser guardado en el refrigerador no ser expuestos a temperaturas superiores a 30C. Estos envases contienen un desecante, pero aun as las tiras no deben quedar expuestas a la humedad. Sacar slo la cantidad de tiras necesarias por vez y luego cerrar hermticamente el envase. Si los bloques de color de la tira no se parecen a los bloques "negativos" de la carta de colores, si ha pasado la fecha de vencimiento impresa en el envase, las tiras deben ser descartadas. Si la muestra de orina fue refrigerada debe dejarse que alcance la temperatura ambiente antes de efectuar las pruebas. El procedimiento para usar las tiras reactivas es el siguiente: Sumergir completamente las reas de prueba de la tira en orina fresca, bien mezclada y sin centrifugar y retirar la tira en forma inmediata. Debe tenerse cuidado de no tocar las reas reactivas. Eliminar el exceso de orina de la tira tocando con el borde de ste el frasco que contiene la muestra. Las tiras deben sostenerse en posicin horizontal. En el tiempo determinado comparar las reas reactivas con la correspondiente carta de colores del envase, la lectura deben hacerse con buena iluminacin para lograr una comparacin exacta del color. Al mismo tiempo que se introducen mejoras en las caractersticas de las tiras reactivas pueden modificarse las indicaciones para su uso. Esto puede significar una diferencia en los tiempos o en los reactivos utilizados; por eso es importante seguir siempre las ltimas indicaciones del fabricante. An con el amplio uso de estos rpidos y convenientes procedimientos de anlisis, sigue siendo necesario comprender los principios bsicos de las pruebas, as como la tcnica correcta en que deben de usarse. A continuacin se mencionarn brevemente los principios en que se basan dichos estudios, con las tiras reactivas. pH En las tiras reactivas utilizan dos indicadores, el rojo de metilo y el azul de bromotimol, que cubren la escala de pH entre 5 y 8,5 o 9. Los colores van del anaranjado al amarillo y del verde al azul. Los resultados pueden informarse en unidades enteras o bien valores intermedios (media unidad). Si se necesita una lectura ms precisa, pueden hacerse las mediciones utilizando un potencimetro con electrodo de vidrio. El momento de lectura del pH no es un elemento crtico; sin embargo, es recomendable que el pH sea ledo en forma inmediata ya que de este modo se evitarn lecturas errneas por rebosamiento (run-over). PROTENAS Este mtodo colorimtrico se basa en el concepto conocido como "error proteico de los indicadores", un fenmeno que se caracteriza por que el punto de cambio de color de algunos indicadores de pH es diferente en presencia de protenas. Por lo general el indicador cambia del amarillo al azul (o verde) entre pH 3 y pH 4, pero en presencia de protena el cambio de color se produce entre el pH 2 y el pH 3. en consecuencia, en presencia de protena se produce un "error" en el comportamiento del indicador. El indicador que se utiliza en el Multistix es el azul de tetrabromofenol 3, 3, 5, 5tetrabromofenolsulfonftalena, y el indicador del Combur-10 es el 3, 3, 5 5-tetraclorofenol-3, 4, 5, 6tetrabromofenolsulfonftalena. En el rea reactiva se agrega un amortiguador cido para mantener un pH constante de 3, que en ausencia de proteinuria de un color amarillo. La aparicin de color verde o azul indica la presencia de protena con el Multistix; en el Combur-10, el color cambia al verde, la intensidad del color es proporcional a la cantidad de protena presente. El tiempo de lectura en el Multistix no es un factor crtico, y puede leerse en forma inmediata. Para obtener una lectura semicuantitativa en el Combur-10, efectuar la lectura a los 60 segundos (seguir las ltimas indicaciones del fabricante) el color del rea reactiva debe compararse cuidadosamente con la carta de colores proporcionada. Los resultados por lo general pueden informarse como negativos o hasta 3+ o 4+. Las dos marcas de tiras reactivas poseen diferentes reas blanco, de modo que no son clnicamente intercambiables. Los valores de las diferentes lecturas se muestran en la tabla 2.

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Tabla 2. Valores de protenas en diferentes tiras reactivas Multistix Combur-10 Trazas 1+ 2+ 3+ 5-20 mg/dL 30 mg/dL 100 mg/dL 300 mg/dL 6-20 mg/dL 30 mg/dL 100 mg/dL 500 mg/dL

4+ Mas de 2,000 mg/dL GLUCOSA Con tiras reactivas impregnadas con la enzima glucosa oxidasa puede detectarse slo glucosa. Estas tiras utilizan las dos reacciones enzimticas secuenciales siguientes: Glucosa + O2 GLUCOSA OXIDASA cido glucnico H2O2 + cromgeno PEROXODASA cromgeno oxidado + H2O El cromgeno que se utiliza vara con las diferentes tiras reactivas. CETONAS El Multistix contiene reactivos el nitroprusiato de sodio y un amortiguador alcalino. La reaccin con el cido diactico de la orina forma un color castao. Esta tira no reacciona con acetona ni con el b -hidroxibutrico. El Multistix se lee a los 15 segundos y permite detectar niveles de cido diactico hasta de 5-10 mg/dL. El cambio de color es de rosado ante a castao, y la reaccin se informa como: negativa, trazas, cantidad moderada, gran cantidad, o como 5, 15, 40, 80 o 160 mg/dL. Con el Multistix pueden ocurrir resultados positivos falsos (trazas o menos) en los casos en que la muestra de orina sea muy pigmentada o cuando posee grandes cantidades de metabolitos de la levodopa. Algunas muestras con elevada densidad y pH pueden dar reacciones positivas falsas (trazas, 5 mg/dL). Debido a la especificidad del nuevo Multistix para determinacin del cido diactico, el reactivo para cetonas no da resultados positivos con controles que tienen acetona. El Cumbur-10 contiene los siguientes reactivos: nitroferrocianuro sdico, glicina y un amortiguador alcalino. El nitroferrocianuro de sodio y glicina reaccionan con el cido diactico y con la acetona en medio alcalino formando un complejo color violeta. Esta tira reactiva es ms sensible al cido actico que la acetona; no permite detectar cido b -hidroxibutrico. El Combur-10 se lee a los 60 segundos y permite detectar niveles de cido diactico de 5-10 mg/dL y de acetona de 40-70 mg/dL. El color cambia desde el beige al violeta, y la reaccin se grada de la siguiente forma: negativa, 1+ (5-40 mg/dL), 2+ (40-100 mg/dL), o 3+ (>100 mg/dL). SANGRE OCULTA El procedimiento de deteccin de sangre oculta con tiras se basa en la actividad tipo peroxidasa de la hemoglobina y de la mioglobina, que catalizan la oxidacin de un indicador por la accin de un perxido orgnico. En el Multistix el indicador es el 3, 3, 5, 5-tetrametilbencidina y el perxido orgnico. En el Multistix el indicador es el 3, 3, 5, 5-tetrametilbencidina y el perxido de hidroperxido de cumeno. El Combur-10 utiliza el indicador tetrametilbencidina y el perxido es el 2,5-dimetil-2, 5-dihidroperoxihexano. Ambas marcas de tiras reactivas permiten la deteccin de eritrocitos intactos, as como la hemoglobina libre y mioglobina. Los hemates intactos de la orina se hemolizan al contactar con el taco reactivo. La hemoglobina liberada reacciona con el reactivo dando puntos verdes sobre un fondo amarillo o anaranjado. Entonces, la presencia de hemates intactos da una reaccin de color verde punteado, mientras que la de hemoglobina libre y la mioglobina dan una coloracin uniforma de color verde o del verde al azul oscuro. El Multistix se lee a los 25 segundos, y el color cambia del anaranjado al azul oscuro pasando por el verde. Por lo general permite detectar 5 a 15 hemates intactos por microlitro o bien 0,0015 a 0,0060 mg/dL de hemoglobina libre. Los resultados se informan en una escala que va desde trazas hasta 3+ o gran cantidad. El Combur-10 se lee a los 60 segundos y el color cambia del amarillo al verde. La concentracin ms baja que puede detectarse es de unos 5 hemates intactos/m L, o la cantidad de hemoglobina libre equivalente a 20 hemates/m L. BILIRRUBINA Y UROBILINGENO Las tiras reactivas se basan en la reaccin de acoplamiento de una sal de diazonio con la bilirrubina en un medio cido. Difieren, sin embargo, en la sal de diazonio utilizada y en el color que aparece.

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El Multistix contiene la sal 2, 4-dicloro-anilina diazonio, se lee a los 20 segundos y el color vara del ocre a diferentes tonos de canela (tostado) o prpura. Se miden as 0,2- 0,5 mg/dL de bilirrubina. El Combur-10 contiene 2,6-dicloro-benceno-diazonio-tetrafluorborato, se lee a los 30-60 segundos, y el color cambia del rosado al rojo-violeta segn la concentracin de bilirrubina. La prueba permite detectar concentraciones de 0,5 mg/dL de bilirrubina. Los resultados con ambos tipos de tiras pueden informarse como 1+, 2+, 3+ o cantidad pequea (dbil), moderada o grande (fuerte). Para obtener resultados exactos el color de la tira debe ser comparado cuidadosamente con el de la carta de colores. NITRITO En el Multistix, en el medio cido del rea reactiva el nitrito reacciona con el cido p-arsanlico formando un compuesto de diazonio. Este compuesto se une luego con la 1, 2, 3, 4-tetrahidro-benzo (h) quinolina-3ol produciendo un color rosado. La tira se lee a los 40 segundos. Cualquier grado de color rosa uniforme debe interpretarse como prueba de nitrito positiva y sugiere la presencia de 10 5 o mas organismos por mL. De orina. El desarrollo de color rosa no debe considerarse como prueba positiva. Si el color rosado uniforme es dbil es mejor verlo colocando la tira sobre el fondo blanco. En el Combur-10, una amina aromtica, la sulfanilamida, reacciona con nitrito en presencia de un amortiguador cido produciendo una sal de diazonio. Esta sal de diazonio se une luego con la 3-hidroxi-1, 2, 3, 4-tetrahidroxibenzo-(h)-quinolina, formando un colorante azico. La intensidad del color rojo refleja la concentracin del nitrito presente, pero no constituye un ndice de la gravedad de la infeccin. La prueba se lee a los 30 segundos, y el color cambia del blanco al rojo pasando por el rosa plido.

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Practica N 13 Urianalisis Objetivo Realizar los procedimientos generales del urianalisis Materiales Muestras de orina Tiras reactivas para anlisis de orina Tubos de ensayo Centrifuga Laminas portaobjeto Laminas cubre objeto Microscopio binocular Guantes descartables Tips descartables Pipeta automtica Procedimientos 1. Colquese los guantes 2. Observe los aspectos fsicos de las muestras seleccionadas por el profesor: Color, Aspecto; anote los resultados en la tabla adjunta 3. Tome una tira reactiva y sumerja la zona de anlisis dentro de cada muestra por un lapso de 10 a 15 segundos 4. Retire la tira reactiva con cuidado, elimine el exceso y compare el color de cada uno de los parmetros contra el cuadro de valores correspondiente. Anote los resultados en la tabla adjunta 5. Elimine la tira en la bolsa de bioseguridad correspondiente URIANALISIS Aspecto fsico Color Aspecto Densidad Evaluacin Qumica

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PRACTICAS DE LABORATORIO N14:

LABORATORIO DE INVESTIGACION
Exposicin de Equipamiento del Laboratorio de Investigacin, metodos empleados.

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