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UNIVERSIDADE FEDERAL DO AMAZONAS UFAM FACULDADE DE CINCIAS FARMACUTICAS FCF BIOQUMICA DE ALIMENTOS

RELATRIO DA AULA PRTICA DETERMINAO DE GLICOSE PELO MTODO DA GLICOSE OXIDASE

ANA CAMILA DOS SANTOS 21205148 LETCIA COUTINHO 21201255 RAYSSA LAMANIERE 21203555

MANAUS AM Setembro 2013

INTRODUO

A glicose oxidase (GOD) catalisa a oxidao da glicose para cido glicnico e perxido de hidrognio. Atravs de uma reao oxidativa de acoplamento catalisada pela peroxidase (POD), o perxido de hidrognio formado reage com 4-aminoantipirina e fenol, formando um complexo de cor vermelha (quinoneimina), cuja absorbncia medida em 500 nm diretamente proporcional concentrao de glicose na amostra. A Glucose Oxidase (GOD) uma enzima que tem como fontes microbianas os fungos Aspergillus niger, Penicillium notatum, Penicillium glaucum, Penicillium amagasakiense, e Penicillium purpurogenum, mas a sua principal fonte de obteno o fungo Aspergillus niger. obtida, essencialmente, como um produto ou co-produto da produo de gluconato (HATZIUIKOLAOU, D. G.; MACRIS, B. J., 1995). Estruturalmente falando, trata-se de uma glicoprotena dimrica constituda por duas cadeias de polipeptdios idnticas que so ligadas covalentemente por pontes de sulfeto. Seu peso molecular varia de aproximadamente 130 a 175 KDa. altamente especfica a D-glucose, mas apresenta baixa atividade quando o 2-deoxi-D-glucose, Dmanose e a D-galactose so utilizados como substratos. Sua atividade tambm inibida pelos ons Ag +, Hg2 e Cu2 (ROTHBERG, A.; WEEGAR, J.; SCHALIEN, R.; FAGERVIK, K.; RYDSTRM, M.; LIND, K., 1999). Catalisa a reao de oxidao -D-glucose para a -D-gluco-lactona utilizando oxignio molecular como aceptor de eltrons e produz simultaneamente perxido de hidrognio, o qual mais tarde, pela ao de uma catalase, produzir gua e oxignio. Logos aps, sem interveno enzimtica, ocorre uma hidrolise espontnea que transforma o -D-gluco-lactona em cido glucnico (MIRN, J.; VZQUEZ, J. A.; GONZLEZ, M. P.; MURADO, M. A., 2008; SCHMIDELL, W.; LIMA, U. de A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W., 2001). O local onde esta enzima produzida foi um ponto de discusso por muito tempo. Hoje se sabe que ela produzida tanto no meio intracelular quanto no meio

extracelular, e que ambas contribuem para a produo de cido glucnico (LIU, J. Z.; WENG, L. P.; ZHANG, Q. L.; XU, H.; JI, L. N., 2003). A produo de GOD aumentada em ambientes com alta concentrao de oxignio e glicose, porm estudos mostram que nenhuma quantidade desta enzima pode ser obtida em ambientes onde a concentrao de oxignio dissolvido menor que 7%. No entanto, esto sendo realizadas vrias pesquisas com o objetivo de otimizar a produo de GOD atravs da utilizao de cepas mutantes de Aspergillus niger. Nestes casos, h possibilidade de haver formao da enzima mesmo em concentraes de oxignio inferiores a 7% (LIU, J. Z.; WENG, L. P.; ZHANG, Q. L.; XU, H.; JI, L. N., 2003; RAMZAN, M.; MEHMOOD, T., 2009).

OBJETIVO

- Determinar a concentrao da glicose (g/100ml) em leite desnatado pelo mtodo da glicose-oxidase.

RESULTADOS E DISCUSSO

Para a preparao da amostra, transferiu-se 25 ml de leite desnatado para um tubo de centrfuga de 50 ml e foi adicionado a este 0,048g de HCl, a partir de 5 ml de HCl 0,6 N, obtido por meio do seguinte clculo: 36,51g HCl 100% x g HCl 40% x = 14,60g HCl 14,60g HCl 1M x g HCl 0,6M x = 8,76g HCl 8,76g HCl 1000ml x g HCl 5ml x = 0,048g HCl

Aps isso, o tubo foi levado ao banho de gelo e centrifugado. O sobrenadante resultante foi transferido para um bquer de 50 ml e neutralizado com 2,4 g de NaOH, a partir de NaOH a 0,6 N, obtido por meio do seguinte clculo: 40g NaOH 1000 ml 1M x g NaOH 1000 ml 0,6M x = 24g 24g NaOH 1000 ml x g NaOH 100 ml x = 2,4g NaOH

Posteriormente o sobrenadante foi colocado em um balo volumtrico de 50 ml e completado com gua destilada (diluio 1:2). Com isso, foi utilizado o mtodo da glicose-oxidase para determinar a glicose na amostra. Ento foi pipetado 4 ml do reagente de glicose oxidase nos tubos de ensaio G1 (amostra), G2 (padro) e G (branco), posteriormente levados ao banho-maria a 37C. Aps isso, adicionou-se 40 l de leite ao tubo G1, 40 L do padro de glicose ao tubo G2 e 40 l de gua destilada ao tubo G, ambos incubados a 37C. O espectrofotmetro foi calibrado com o tubo G e posteriormente mediu-se a absorbncia da amostra e do padro. As absorbncias obtidas seguem de acordo com a tabela 1: TABELA 1. Absorbncias da amostra e do padro Tubo de Ensaio G1 G2 Valor da Absorbncia 0,002 0,292

Ao final, foi feito o clculo para obter a concentrao em gramas da glicose em 100 ml de leite, que resultou em 1.369 x 10-3 g de glicose, como mostrado a seguir: Glicose (mg/dL) = 0,002/0,292 x 100 (mg/dL) x 2 (fator de diluio) Glicose (mg/dL) = 1,369 mg

1000 mg 1 g 1,369 mg x x = 1.369 x 10-3 g de glicose Com base em um manual de contagem de carboidratos (AGUIAR, A. C. B.; OLIVEIRA, H. S. D.; GRASSIOLLI, S. M., 2011), onde tem-se que h, no leite desnatado, 10g de carboidratos em 200 ml, e sendo a glicose constituinte dessa quantidade, observou-se que se diminussemos esse volume pela metade (100 ml) seriam obtidos aproximadamente 5g de carboidratos, e o valor resultante do experimento em questo encontra-se dentro dessa quantidade.

CONCLUSO

A quantidade de glicose em gramas foi 1.369 x 10-3g em 100 ml de leite desnatado e pode ser obtida com sucesso pelo mtodo da glicose-oxidase, apresentando um valor, aps a anlise de algumas estimativas, provavelmente dentro do proposto por manuais de contagem de carboidratos, que de 10g de carboidratos por 200 ml (aproximadamente um copo) de leite de vaca desnatado.

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

HATZIUIKOLAOU, D. G.; MACRIS, B. J. Factors regulating production of glucose oxidase by Aspergillus niger. Enzyme and Microbial Technology, vol. 17, Elsevier Science Inc (1995) p. 530-534.

LIU, J. Z.; WENG, L. P.; ZHANG, Q. L.; XU, H.; JI, L. N. Optimization of glucose oxidase production by Aspergillus niger in a benchtop bioreactor using response surface methodology. World Journal of Microbiology & Biotechnology 19 (2003) p. 317-323.

MIRN, J.; VZQUEZ, J. A.; GONZLEZ, M. P.; MURADO, M. A. Joint effect of nitrogen and phosphorus on glucose oidase production by Aspergillus niger: Discussion of an experimental design with risk of co-linearity. Biochemical Engineering Journal 40 (2008) p. 54-63.

RAMZAN, M.; MEHMOOD, T. Enhanced production of glucose oxidase from UVmutant of Aspergillus niger. African Journal of Biotechnology, vol. 8 (2009) p. 288290.

ROTHBERG, A.; WEEGAR, J.; SCHALIEN, R.; FAGERVIK, K.; RYDSTRM, M.; LIND, K. Optimization of an Aspergillus niger glucose oxidase production process. Bioprocess Engineering 21, Springer-Verlag (1999) p. 307-312.

SCHMIDELL, W.; LIMA, U. de A.; AQUARONE, E.; BORZANI, W. Biotecnologia Industrial. Engenharia Bioqumica, vol. 2, So Paulo: Edgard Blcher. 1. ed. 2001.

AGUIAR, A. C. B.; OLIVEIRA, H. S. D.; GRASSIOLLI, S. M. Manual de contagem de carboidratos. Porto Alegre: Instituto da Criana com Diabetes, 2011. p. 35. Disponvel em: <http://www.icdrs.org.br/arquivos/pdf/Manual-Contagem-Carboidratos.pdf>. Acesso em: 5 set. 2013.