Microscopio

El microscopio (de micro-, , pequeo, y scopio, , observar) es un instrumento que permite observar objetos que son demasiado pequeos para ser vistos a simple vista. El tipo ms comn y el primero que se invent es el microscopio ptico. Se trata de un instrumento ptico que contiene dos o ms lentes que permiten obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. La ciencia que investiga los objetos pequeos utilizando este instrumento se llama microscopa. Partes del microscopio

Lente ocular.Platina. Lentes pticos. Diafragma. Pinzas de la platina. Base o pie.

Lmpara. Tornillo micromtrico(ajuste fino). Tornillo macromtrico(de cremallera). Brazo o columna. Tubo ocular.

Breve Historia del microscopio

Microscopio compuesto fabricado hacia1751 por Magny. Proviene del laboratorio delduque de Chaulnes y pertenece al Museo de Artes y Oficios, Pars. El microscopio fue inventado hacia los aos 1610, por Galileo segn los italianos, o por Zacharias Janssen en 1590, en opinin de los holandeses. En 1665 aparece en la obra de William Harvey sobre la circulacin sangunea al observar al microscopio los capilares sanguneos y Robert Hooke publica su obra Micrographia. En 1665 Robert Hooke observ con un microscopio un delgado corte de corcho y not que el material era poroso, en su conjunto, formaban cavidades poco profundas a modo de celditas a las que llam clulas. Se trataba de la primera observacin de clulas muertas. Unos aos ms

tarde, Marcello Malpighi, anatomista y bilogo italiano, observ clulas vivas. Fue el primero en estudiar tejidos vivos al microscopio. A mediados del siglo XVII un holands, Anton van Leeuwenhoek, utilizando microscopios simples de fabricacin propia, describi por primera vez protozoos, bacterias, espermatozoides y glbulos rojos. El microscopista Leeuwenhoek, sin ninguna preparacin cientfica, puede considerarse el fundador de la bacteriologa. Tallaba l mismo sus lupas, sobre pequeas esferas de cristal, cuyos dimetros no alcanzaban el milmetro (su campo de visin era muy limitado, de dcimas de milmetro). Con estas pequeas distancias focales alcanzaba los 275 aumentos. Observ los glbulos de la sangre, las bacterias y los protozoos; examin por primera vez los glbulos rojos y descubri que el semen contiene espermatozoides. Durante su vida no revel sus mtodos secretos y a su muerte, en 1723, 26 de sus aparatos fueron cedidos a la Royal Society de Londres. Durante el siglo XVIII continu el progreso y se lograron objetivos acromticos por asociacin de Chris Neros y Flint Crown obtenidos en 1740 por H. M. Hall y mejorados por John Dollond. De esta poca son los estudios efectuados por Isaac Newton y Leonhard Euler. En el siglo XIX, al descubrirse que la dispersin y la refraccin se podan modificar con combinaciones adecuadas de dos o ms medios pticos, se lanzan al mercado objetivos acromticos excelentes. Durante el siglo XVIII el microscopio tuvo diversos adelantos mecnicos que aumentaron su estabilidad y su facilidad de uso, aunque no se desarrollaron por el momento mejoras pticas. Las mejoras ms importantes de la ptica surgieron en 1877, cuando Ernst Abbepublic su teora del microscopio y, por encargo de Carl Zeiss, mejor la microscopa de inmersin sustituyendo el agua por aceite de cedro, lo que permite obtener aumentos de 2000. A principios de los aos 1930 se haba alcanzado el lmite terico para los microscopios pticos, no consiguiendo estos aumentos superiores a 500X o 1,000X. Sin embargo, exista un deseo cientfico de observar los detalles de estructuras celulares (ncleo, mitocondria, etc.). El microscopio electrnico aumentos de de transmisin 100.000X. (TEM) Fue fue el primer tipo de microscopio Knoll y Ernst

electrnico desarrollado. Utiliza un haz de electrones en lugar de luz para enfocar la muestra consiguiendo barrido (SEM). desarrollado por Max Ruska enAlemania en 1931. Posteriormente, en 1942 se desarrolla el microscopio electrnico de

Tipos de microscopios

Microscopio ptico Microscopio simple Microscopio compuesto Microscopio de luz ultravioleta Microscopio de fluorescencia Microscopio petrogrfico Microscopio en campo oscuro Microscopio de contraste de fase Microscopio de luz polarizada

Microscopio confocal Microscopio electrnico Microscopio electrnico de transmisin Microscopio electrnico de barrido Microscopio de iones en campo Microscopio de sonda de barrido Microscopio de efecto tnel Microscopio de fuerza atmica Microscopio virtual

Microscopio ptico

Microscopio ptico.Descripcin:A) ocular, B) objetivo, C) portador del objeto, D) lentes de la iluminacin, E) sujecin del objeto, F) espejo de la iluminacin. Un microscopio ptico es un microscopio basado en lentes pticos. Tambin se le conoce como microscopio de luz, (que utiliza luz o "fotones") o microscopio de campo claro. El desarrollo de este aparato suele asociarse con los trabajos de Anton van Leeuwenhoek. Los microscopios de Leeuwenhoek constaban de una nica lente pequea y convexa, montada sobre una plancha, con un mecanismo para sujetar el material que se iba a examinar (la muestra o espcimen). Este uso de una nica lente convexa se conoce como microscopio simple, en el que se incluye la lupa, entre otros aparatos pticos. Historia

1608 Zacharias Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes. 1611 Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto. 1665 Robert Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y describe los pequeos poros en forma de caja a los que l llam "clulas". Publica su libro Micrographia. 1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observar bacterias por primera vez 9 aos despus. 1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada. 1838 Schleiden y Schwann proponen la teora de la clula y declaran que la clula nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales. 1849 J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio.

1876 Abb analiza los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el microscopio y muestra cmo perfeccionar el diseo del microscopio. 1881 Retzius describe gran nmero de tejidos animales con un detalle que no ha sido superado por ningn otro microscopista de luz. En las siguientes dos dcadas l, Cajal y otros histlogos desarrollan nuevos mtodos de tincin y ponen los fundamentos de la anatoma microscpica.

1886 Carl Zeiss fabrica una serie de lentes, diseo de Abb que permiten al microscopista resolver estructuras en los lmites tericos de la luz visible. 1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia. 1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia. 1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases. 1937 Ernst Ruska y Max Knoll, fsicos alemanes, construyen el primer microscopio electrnico. 1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial para el microscopio de luz.

Partes del microscopio ptico

Tubo.

Tornillos macro y micromtrico.

Objetivo. Ocular.

Diafragma - Condensador.

Revlver.

Platina.

1 * Ocular: lente situada cerca del ojo del observador. Capta y ampla la imagen formada en los objetivos. 2 * Objetivo: lente situada cerca del revolver. Ampla la imagen, es un elemento vital que permite ver a travs de los oculares 3 * Condensador: lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparacin. 4 * Diafragma: regula la cantidad de luz que llega al condensador. 5 * Foco: dirige los rayos luminosos hacia el condensador. 6 * Tubo: es una cmara oscura unida al brazo mediante una cremallera. 7 * Revlver: Es un sistema que agarra los objetivos, y que rota para utilizar un objetivo u otro

8 * Tornillos macro y micromtrico: Son tornillos de enfoque, mueven la platina hacia arriba y hacia abajo. El macromtrico lo hace de forma rpida y el micromtrico de forma lenta. Llevan incorporado un mando de bloqueo que fija la platina a una determinada altura. 9 * Platina: Es una plataforma horizontal con un orificio central, sobre el que se coloca la preparacin, que permite el paso de los rayos procedentes de la fuente de iluminacin situada por debajo. Dos pinzas sirven para retener el portaobjetos sobre la platina y un sistema de cremallera guiado por dos tornillos de desplazamiento permite mover la preparacin de delante hacia atrs o de izquierda a derecha y viceversa. 10 * Base: Es la parte inferior del microscopio que permite el sostn del mismo.

Sistema de iluminacin
La fuente de luz, con la ayuda de una lente (o sistema) , llamada colector, se representa en el plano del diafragma iris de abertura del condensador . Este diagrama se instala en el plano focal anterior del condensador y puede variar su abertura numrica. El diagrama iris dispuesto junto al colector es el diafragma de campo. La variacin del dimetro del diafragma de campo permite obtener su imagen igual al campo visual lineal del microscopio. La abertura numrica del condensador supera, generalmente la de la abertura del objetivo microscpico. es la iluminacion que permite ver mejor lo que queremos observar como las clulas o las membranas celulares entre otros

Microscopio ptico compuesto

Un microscopio compuesto es un microscopio ptico con ms de un lente. Se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan. Principales elementos de un microscopio bsico

Diagrama simple de la ptica de un microscopio. Los microscopios de este tipo suelen ser ms complejos, con varias lentes en el objetivo como en el ocular. El objetivo de stas lentes es el de reducir la aberracin cromtica y laaberracin esfrica. En los microscopios modernos el espejo se sustituye por una lmpara que ofrece una iluminacin estable y controlable. Los microscopios compuestos se utilizan para estudiar especmenes delgados, puesto que su profundidad de campo es muy limitada. Por lo general, se utilizan para examinar cultivos, preparaciones trituradas o una lmina muy fina del material que sea. Normalmente depende de la luz que atraviese la muestra desde abajo y usualmente son necesarias tcnicas especiales para aumentar el contraste de laimagen. La resolucin de los microscopios pticos est restringida por un fenmeno llamado difraccin que, dependiendo de la apertura numrica (AN o ) del sistema ptico y la longitud de onda de la luz utilizada ( ), establece un lmite definido ( ) a la resolucin ptica. Suponiendo que las aberraciones pticas fueran despreciables, la resolucin sera:

Normalmente, se supone una la

de 550 nm, correspondiente a la luz verde. Si el medio es el aire,

prctica mxima es de 0,95, y en el caso de aceite de hasta 1,5.

Ello implica que incluso el mejor microscopio ptico est limitado a una resolucin de unos 0,2 micrmetros.

Microscopio simple

Microscopio simple de Leeuwenhoek. La muestra se colocaba en la punta del tornillo, en frente de la nica lente, de la que destaca la pequeez de su dimetro. Un microscopio simple es aquel que utiliza un solo lente de aumento. Es el microscopio ms bsico. El ejemplo ms clsico es lalupa. El microscopio ptico estndar utiliza dos sistemas de lentes alineados. El objeto por observar se coloca entre el foco y la superficie de la lente, lo que determina la formacin de una imagen virtual, derecha y mayor cuanto mayor sea el poder diptrico del lente y cuanto ms alejado est el punto prximo de la visin ntida del sujeto. El holands Antoni van Leeuwenhoek construy microscopios muy eficaces basados en una sola lente. Esos microscopios no padecan las aberraciones que limitaban tanto la eficacia de los primeros microscopios compuestos, como los empleados por Robert Hooke, y producan una ampliacin de hasta 300 veces; gracias a ellos Leeuwenhoek fue capaz incluso de describir por primera vez las bacterias

Microscopio compuesto

Objetivos de un microscopio moderno.

Un microscopio compuesto tiene ms de un lente objetivo. Los microscopios compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para sostener, elevar y detener los instrumentos a observar. El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos, dispuestas de tal manera que producen las ranuras de luz. El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros llamados "de antigel subsecuente".

Parte mecnica del microscopio

Esquema de un micoscopio ptico. La parte mecnica del microscopio comprende el pie, el tubo, el revlver, el asa, la platina, el carro y el tornillo micromtrico. Estos elementos sostienen la parte ptica y de iluminacin; adems, permiten los desplazamientos necesarios para el enfoque del objeto.

El pie y soporte: Constituye la base sobre la que se apoya el microscopio y tiene por lo general forma de Y o bien es rectangular. La columna o brazo:llamada tambin asa, es una pieza en forma de C, unida a la base por su parte inferior mediante unabisagra, permitiendo la inclinacin del tubo para mejorar la captacin de luz cuando se utilizan los espejos. Sostiene el tubo en su porcin superior y por el extremo inferior se adapta al pie.

El tubo: tiene forma cilndrica . El tubo se encuentra en una carretera superior de la columna mediante un sistema de cremalleras, las cuales permiten que el tubo se mueva mediante los tornillos.

El tornillo macromtrico o macroscopico: girando este tornillo, asciende o desciende el tubo del microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el enfoque rpido de la preparacin.

El tornillo micromtrico o microscopico: mediante el ajuste fino con movimiento casi imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva acoplado un tambor graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus movimientos y puede medir el espesor de los objetos.

La platina: es una pieza metlica plana en la que se coloca la preparacin u objeto que se va a observar. Presenta un orificio, en el eje ptico del tubo, que permite el paso de los rayos luminosos a la preparacin. La platina puede ser fija, en cuyo caso permanece inmvil; en otros casos puede ser giratoria; es decir, mediante tornillos laterales puede centrarse o producir movimientos circulares.

Las pinzas: son dos piezas metlicas que sirven para sujetar la preparacin. Se encuentran en la platina. El revlver: es una pieza giratoria provista de orificios en los que se enroscan los objetivos. Al girar el revlver, los objetivos pasan por el eje del tubo y se colocan en posicin de trabajo, lo que se nota por el ruido de un pin que lo fija.

Sistema ptico
El sistema ptico es el encargado de reproducir y aumentar las imgenes mediante el conjunto de lentes que lo componen. Est formado por el ocular y los objetivos. El objetivo proyecta una imagen de la muestra que el ocular luego ampla.

El ocular: se encuentra situado en la parte superior del tubo. Su nombre se debe a la cercana de la pieza con el ojo del observador. Tiene como funcin aumentar la imagen formada por el objetivo. Los oculares son intercambiables y sus poderes de aumento van desde 5X hasta 20X. Existen oculares especiales de potencias mayores a 20X y otros que poseen una escala micromtrica; estos ltimos tienen la finalidad de medir el tamao del objeto observado.

Los objetivos: se disponen en una pieza giratoria denominada revlver y producen el aumento de las imgenes de los objetos y organismos, y, por tanto, se hallan cerca de la preparacin que se examina. Los objetivos utilizados corrientemente son de dos tipos: objetivos secos y objetivos de inmersin.

Los objetivos secos se utilizan sin necesidad de colocar sustancia alguna entre ellos y la preparacin. En la cara externa llevan una serie de ndices que indican el aumento que producen, la abertura numrica y otros datos. As, por ejemplo, si un objetivo tiene estos datos: plan 40/0,65 y 160/0,17, significa que el objetivo es planacromtico, su aumento 40 y su apertura numrica 0,65, calculada para una longitud de tubo de 160 mm. El nmero de objetivos vara con el tipo de microscopio y el uso a que se destina. Los aumentos de los objetivos secos ms frecuentemente utilizados son: 4X, 10X, 20X, 40X y 60X.

El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro. Generalmente, estos objetivos son de 100X y se distingue por uno o dos crculos o anillos de color negro que rodea su extremo inferior.

Sistema de ILuminacin
Este sistema tiene como finalidad dirigir la luz natural o artificial de tal manera que ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera adecuada. Comprende los siguientes elementos:

Fuente de iluminacin: se trata clsicamente de una lmpara incandescente de tungsteno sobrevoltada; en versiones ms modernas con leds. Por delante de ella se sita un condensador (una lente convergente) e, idealmente, un diafragma de campo, que permite controlar el dimetro de la parte de la preparacin que queda iluminada, para evitar que exceda el campo de observacin produciendo luces parsitas.

El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est construida dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones. La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin artificial, y la plana, para natural (luz solar). Los modelos ms modernos no poseen espejos sino una lmpara que cumple la misma funcin que el espejo.

Condensador: est formado por un sistema de lentes, cuya finalidad es concentrar los rayos luminosos sobre el plano de la preparacin, formando un cono de luz con el mismo ngulo que el del campo del objetivo. El condensador se sita debajo de la platina y su lente superior es generalmente planoconvexa, quedando la cara superior plana en contacto con la preparacin cuando se usan objetivos de gran abertura (los de mayor ampliacin); existen condensadores de inmersin, que piden que se llene con aceite el espacio entre esa lente superior y la preparacin. La abertura numrica mxima del condensador debe ser al menos igual que la del objetivo empleado, o no se lograr aprovechar todo su poder separador. El condensador puede deslizarse verticalmente sobre un sistema de cremallera mediante un tornillo, bajndose para su uso con objetivos de poca potencia.

Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico.

Microscopio de luz ultravioleta

Microscopio de luz fluorescencia - La lente, que habitualmente es de vidrio es sustituida por lentes de cuarzo y la iluminacin se produce por unas lmparas de mercurio. No usa filtros y se observa en placas fotogrficas. La variedad de fluorescencia, si usa filtros, y la observacin es directa. Microscopio de luz ultravioleta La imagen en el microscopio de luz ultravioleta depende de la absorcin de esa luz por las molculas de la muestra. La fuente de luz ultravioleta tiene una longitud de onda de 200 nm, por lo tanto puede alcanzar una resolucin de 100 nm. La microscopia ultravioleta no es muy diferente del funcionamiento de unespectrofotmetro pero sus resultados son registrados en fotografas. La muestra no se puede observar directamente a travs del ocular porque la luz ultravioleta puede daar la retina. El mtodo sirve para detectar cidos nucleicos, protenas que contienen determinados aminocidos. Mediante longitudes de ondas especficas para la iluminacin se puede obtener mediciones espectrofotomtricas para cuantificar el ADN y el RNA de cada clula. El microscopio de luz ultravioleta utiliza el rango ultravioleta del espectro luminoso en lugar del rango visible, bien para aumentar la resolucin con una longitud de onda menor o para mejorar el detalle absorbiendo selectivamente distintas longitudes de onda de la banda ultravioleta. Dado que el vidrio no transmite las longitudes de onda ms cortas de la luz ultravioleta, los elementos pticos de estos microscopios estn hechos con cuarzo, fluorita o sistemas de espejos aluminizados. Adems, dado que la radiacin ultravioleta es invisible, la imagen se muestra con fosforescencia (vase Luminiscencia), en fotografa o con un escner electrnico. El microscopio de luz ultravioleta se utiliza en la investigacin cientfica.

Microscopio de fluorescencia

El microscopio de fluorescencia Olympus BX61, acoplado con unacmara digital.

El microscopio de fluorescencia es una variacin del microscopio de luz ultravioleta en el que los objetos son iluminados por rayos de una determinada longitud de onda. La imagen observada es el resultado de la radiacin electromagntica emitida por las molculas que han absorbido la excitacin primaria y reemitido una luz con mayor longitud de onda. Para dejar pasar slo la emisin secundaria deseada, se deben colocar filtros apropiados debajo del condensador y encima del objetivo. Se usa para detectar sustancias con autofluorescencia (vitamina A) o sustancias marcadas con fluorocromos.

Fluorescencia y microscopio
El fenmeno de la fluorescencia se produce cuando un electrn de un tomo absorbe toda la energa de una determinada longitud de onda de la luz, saltando a otros orbitales. Es una situacin inestable durante la cual se emite la mayor parte de la energa que se ha absorbido (con mayor longitud de onda) y vuelve a desplazarse a su orbital. Aprovechando este fenmeno, se han creado los flurocromos. Para utilizarlos necesitamos una bombilla que emita luz ultravioleta y luz visible. Para excitar el flurocromo necesitamos un filtro de excitacin que seleccione la longitud de onda que excita nuestro flurocromo. Los ms comunes son el DAPI que tie el ncleo de las clulas y el GFP.

Microscopio petrogrfico

Microscopio petrogrfico antiguo del Museo Geominero de Madrid. El microscopio petrogrfico o de polarizacin se utiliza para identificar y estimar cuantitativamente los componentes minerales de lasrocas gneas y las rocas metamrficas. Cuenta con un prisma de

Nicol u otro tipo de dispositivo para polarizar la luz que pasa a travs del espcimen examinado (vase ptica: Polarizacin de la luz). Otro prisma Nicol o analizador que determina la polarizacin de la luz que ha pasado a travs del espcimen. El microscopio tiene un soporte giratorio que indica el cambio de polarizacin acusado por el espcimen

Microscopio de campo oscuro

El microscopio de campo oscuro utiliza un haz enfocado de luz muy intensa en forma de un cono hueco concentrado sobre el espcimen. El objeto iluminado dispersa la luz y se hace as visible contra el fondo oscuro que tiene detrs, como las partculas de polvo iluminadas por un rayo de sol que se cuela en una habitacin cerrada. Por ello las porciones transparentes del espcimen quedan oscuras, mientras que las superficies y partculas se ven brillantes, por la luz que reciben y dispersan en todas las direcciones, incluida la del eje ptico que conecta el espcimen con la pupila del observador. Esta forma de iluminacin se utiliza para analizar elementos biolgicos transparentes y sin pigmentar, invisibles con iluminacin normal, sin fijar la muestra, es decir, sin matarla. Tambin es bastante utilizado en la observacin de muestras metalogrficas para la observacin de detalles en superficies con alta reflectancia. El objetivo recibe la luz dispersa o refractada por las estructuras del espcimen. Para lograrlo, el microscopio de campo oscuro est equipado con un condensador especial que ilumina la muestra con luz fuerte indirecta. En consecuencia el campo visual se observa detrs de la muestra como un fondo oscuro sobre el cual aparecen pequeas partculas brillantes de la muestra que reflejan parte de la luz hacia el objetivo. El efecto es similar a las partculas de polvo que se ven en el haz de luz emanado de un proyector de diapositivas en una habitacin oscura. La luz reflejada por las partculas de polvo llegan hasta la retina del ojo, lo que las hace visibles. La luz dispersa permite incluso distinguir partculas ms pequeas que el poder separador del sistema ptico usado por transparencia. Los condensadores que se emplean en Microscopa de campo oscuro son de dos tipos: del tipo paraboloide (tiene una superficie espejada), y los del tipo cardioide, con dos superficies espejadas. El empleo de uno u otro es indistinto, mediante cualquiera de ambos, la luz no incide directamente en el objetivo (este es el objetivo de estos condensadores), sino que incide con una apertura numrica mayor al del objetivo.

Microscopio de contraste de fases

El microscopio de contraste de fases permite observar clulas sin colorear y resulta especialmente til para clulas vivas.1 Este aprovecha las pequeas diferencias de losndices de refraccin en las distintas partes de una clula y en distintas partes de una muestra de tejido. La luz que pasa por regiones de mayor ndice de refraccin experimenta una deflexin y queda fuera de fase con respecto al haz principal de ondas de luz que pasaron la muestra. Aparea otras longitudes de onda fuera de fase por medio de una serie de anillos pticos del objetivo y del condensador, anula la

amplitud de la porcin fuera de fase inicial del haz de luz y produce un contraste til sobre la imagen. Las partes oscuras de la imagen corresponden a las porciones densas del espcimen; las partes claras de la imagen corresponden a porciones menos densas. Por lo tanto estos microscopios se utilizan para observar clulas vivas, tejidos vivos y cortes semifinos no coloreados.2 Dos modificaciones del microscopio de fase son el microscopio de interferencia y el microscopio de interferencia diferencial.[ ] Su inventor fue el fsico neerlands Frits Zernike que junto al mtodo de contraste de fases le vali para ganar el Premio Nobel de Fsica en 1953 .

Microscopio de luz polarizada

Microscopio de luz polarizada usado para el estudio de secciones delgadas de roca en petrografa. Los microscopios de luz polarizada son microscopios a los que se les han aadido dos polarizadores (uno entre el condensador y la muestra y el otro entre la muestra y el observador). El material que se usa para ello es un cristal de cuarzo y un cristal de Nicol, dejando pasar nicamente la luz que vibra en un nico plano (luz polarizada). Esta luz produce en el campo del microscopio claridad u oscuridad, segn que los dos nicoles estn paralelos o cruzados. Algunos compuestos inorgnicos responden al efecto de la luz, stos tienen un alto grado de orientacin molecular (sustancias anistropas), que hace que la luz que los atraviesa pueda hacerlo en determinados planos vibratorios atmicos. El prisma de Nicol permite el paso de luz en un solo plano, as el cuarzo gira la posicin de polarizacin, facilitando la identificacin desustancias que extinguen la luz. Al fenmeno de extincin de luz causado por estos planos atmicos y orientaciones moleculares se llamabirrefringencia. Este tipo de microscopio se usa para poder identificar mejor sustancias cristalinas o fibrosas (como el citoesqueleto), sustancia amiloide,asbesto, colgeno, cristales de uratos, queratina, slice, y otras de origen exgeno.

Microscopio confocal

Principios en los que se basa la microscopa confocal. El microscopio confocal es un microscopio que emplea una tcnica ptica de imagen para incrementar el contraste y/o reconstruir imgenes tridimensionales utilizando un "pinhole" espacial (colimador de orificio delimitante) para eliminar la luz desenfocada o destellos de la lente en especmenes que son ms gruesos que el plano focal.1 El pinhole es una apertura localizada delante del fotomultiplicador que evita el pasaje de fluorescencia de las regiones de la muestra que no estn en foco, la luz que proviene de regiones localizadas por encima o por debajo del plano focal no converge en el pinhole y no es detectada por el fotomultiplicador. Esta tcnica ha ido adquiriendo cada vez mayor popularidad entre las comunidades cientfica e industrial. Se aplica tpicamente en las ciencias de la vida y en la inspeccin de semiconductores.

CONCEPTO BSICO
El concepto de imagen confocal fue patentado por Marvin Minsky en 1957.2 En un microscopio de fluorescencia convencional (p.ej., de campo amplio), el espcimen entero est sobresaturado de luz a partir de la fuente de iluminacin. Debido a la conservacin de la intensidad de la luz en su recorrido, todas las partes del espcimen a lo largo de su ruta ptica sern excitadas y la fluorescencia detectada por un fotodetector o una cmara. Por el contrario, un microscopio confocal utiliza iluminacin puntual y un "pinhole" en un plano ptico conjugado en frente del detector para eliminar la informacin que est fuera del plano focal. Slo la luz que est dentro de este plano puede ser detectada, de modo que la calidad de imagen es mucho mejor que las de campo amplio. Puesto que slo se ilumina un punto cada vez en el microscopio confocal, se requiere una exploracin (scanning) sobre un raster regular en el espcimen para obtener imgenes bi o tridimensionales. La delgadez del plano focal se define mayormente como el cuadrado de la apertura numrica de la lente del objetivo y tambin por las propiedades pticas del espcimen y el ndice de refraccin del ambiente.

Tipos
Existen tres tipos de microscopios confocales disponibles comercialmente: El Microscopio confocal lser de barrido, el microscopio confocal de disco giratorio (disco de Nipkow) y microscopios de matriz programable,(Programmable Array Microscope, PAM). La microscopa confocal de barrido por lser produce un mayor rendimiento en la calidad de la imagen que los de disco o PAM, pero la tasa de frames era muy lenta (menos de tres frames/segundo) hasta hace poco. Los microscopios de disco

pueden lograr velocidades compatibles con la creacin de videos un rasgo desable para observaciones dinmicas, compo pueden ser las imgenes de clulas vivas. La microscopa confocal lser de barrido actualmente ha sido mejorada para obtener tasas superiores a las del video (60 frames/segundo) utilizando MEMS basados en espejos de barrido.

Microscopio electrnico

Microscopio electrnico. Un microscopio electrnico es aqul que utiliza electrones en lugar de fotones o luz visible para formar imgenes de objetos diminutos. Los microscopios electrnicos permiten alcanzar ampliaciones hasta 5000 veces ms potentes que los mejores microscopios pticos, debido a que lalongitud de onda de los electrones es mucho menor que la de los fotones "visibles". El primer microscopio electrnico fue diseado por Ernst Ruska y Max Knoll entre 1925 y 1930, quines se basaron en los estudios de Louis-Victor de Broglie acerca de las propiedades ondulatorias de los electrones. Un microscopio electrnico, como el de la imagen, funciona con un haz de electrones generados por un can electrnico, acelerados por un alto voltaje y focalizados por medio de lentes magnticas (todo ello al alto vaco ya que los electrones son absorbidos por el aire). Los electrones atraviesan la muestra (debidamente deshidratada) y la amplificacin se produce por un conjunto de lentes magnticas que forman una imagen sobre una placa fotogrfica o sobre una pantalla sensible al impacto de los electrones que transfiere la imagen formada a la pantalla de un ordenador. Los microscopios electrnicos slo se pueden ver en blanco y negro, puesto que no utilizan la luz, pero se le pueden dar colores en el ordenador. Como se puede apreciar, su funcionamiento es semejante a un monitor monocromtico. Limitaciones del microscopio electrnico

El limitado dimetro de la apertura no permite que la informacin detallada alcance la imagen, limitando de este modo la resolucin. El contraste de amplitud (que radica en la naturaleza corpuscular de los electrones) se debe al contraste de difraccin, provocado por la prdida de electrones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes gruesos.

El contraste de fase (que radica en la naturaleza ondulatoria de los electrones) se debe al contraste de interferencia provocado por los desplazamientos en las fases relativas de las porciones del rayo. Es un contraste dominante en especmenes finos.

Existen tambin distintas aberraciones producidas por las lentes: astigmtica, esfrica y cromtica El problema de la funcin de transferencia de contraste (CTF): la CTF describe la respuesta de un sistema ptico a una imagen descompuesta en ondas cuadrticas.

El material biolgico presenta dos problemas fundamentales: el entorno de vaco y la transferencia de energa. Para resolverlos, se utilizan distintas tcnicas dependiendo del tamao de la muestra:

Para muestras grandes como rganos, tejidos o clulas, se utilizan tres tcnicas: 1. La fijacin qumica o la criofijacin 2. La inclusin en resinas (criosustitucin) 3. La rplica metlica

Para muestras pequeas como complejos macromoleculares se utilizan las siguientes tcnicas: 1. La tincin negativa: los agentes de tincin ms usados son el molibdato amnico, el fosfotungstato sdico y sales de uranio como acetato y formiato. Todos ellos presentan las siguientes propiedades: interactan mnimamente con la muestra y son estables en la interaccin con los electrones, son altamente solubles en agua, presentan una alta densidad que favorece el contraste, tienen un punto alto de fusin, tienen un tamao de grano pequeo. 2. La rplica metlica: para construir la rplica metlica se evapora el metal (estao), que se deposita sobre la muestra a la vez que esta, por el vaco, se disuelve. 3. La criomicroscopa

Tipos de microscopios electrnicos

1 carcasa, 2 emisor de electrones, 3 electrones, 4 ctodo, 5 nodo, 6 inductor de enfoque, 7 muestra analizada, 8 detector. Existen dos tipos principales de microscopios electrnicos: el microscopio electrnico de transmisin y el microscopio electrnico de barrido.

Microscopio electrnico de transmisin

Artculo principal: Microscopio electrnico de transmisin. El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto cuya imagen se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra. Para utilizar un microscopio electrnico de transmisin debe cortarse la muestra en capas finas, no mayores de un par de miles dengstroms. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar la imagen de un objeto hasta un milln de veces.

]Microscopio electrnico de barrido (MEB)

I imagen de una hormiga tomada con un MEB (microscopio electrnico de barrido). : Microscopio electrnico de barrido. En el microscopio electrnico de barrido (MEB) la muestra es recubierta con una capa de metal delgado, y es barrida con electrones enviados desde un can. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV. Su resolucin est entre 3 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. Aplicaciones en distintas reas En el estudio de los circuitos integrados se suele utilizar el microscopio electrnico debido a una curiosa propiedad: Como el campo elctrico modifica la trayectoria de los electrones, en un circuito integrado en funcionamiento, visto bajo el microscopio electrnico, se puede apreciar el potencial al que est cada elemento del circuito.

Microscopio electrnico de transmisin

Comparacin de la formacin de la imagen en un microscopio de transmisin ptica, un microscopio electrnico de transmisin (TEM), unmicroscopio electrnico de barrido (SEM) y un tubo de rayos catdicos(CRT) de pantalla de TV. Un microscopio electrnico de transmisin (TEM, por sus siglas en ingls, o MET, en espaol) es unmicroscopio que utiliza un haz de electrones para visualizar un objeto, debido a que la potencia amplificadora de un microscopio ptico est limitada por la longitud de onda de la luz visible. Lo caracterstico de este microscopioes el uso de una muestra ultrafina y que la imagen se obtenga de los electrones que atraviesan la muestra. Los microscopios electrnicos de transmisin pueden aumentar un objeto hasta un milln de veces. Estructura Debido a que los electrones tienen una longitud de onda mucho menor que la de la luz visible, pueden mostrar estructuras mucho ms pequeas. Las partes principales de un microscopio electrnico de transmisin son:

Can de electrones, que emite los electrones que chocan o atraviesan el espcimen (dependiendo que tipo de microscopio electrnico es), creando una imagen aumentada. Lentes magnticas para crear campos que dirigen y enfocan el haz de electrones, ya que las lentes convencionales utilizadas en los microscopios pticos no funcionan con los electrones. Sistema de vaco es una parte muy importante del microscopio electrnico. Debido a que los electrones pueden ser desviados por las molculas del aire, se debe hacer un vaco casi total en el interior de un microscopio de estas caractersticas.

Placa fotogrfica o pantalla fluorescente que se coloca detrs del objeto a visualizar para registrar la imagen aumentada. Sistema de registro que muestra la imagen que producen los electrones, que suele ser una computadora.

El microscopio electrnico de transmisin emite un haz de electrones dirigido hacia el objeto que se desea aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen aumentada de la muestra.

Can de electrones

Esquema de un microscopio electrnico de transmisin. De arriba a abajo, el TEM consiste en una fuente de emisin, que puede ser un filamento de tungsteno o bien una fuente de hexaboruro de lantano (LaB6). Para el caso del tungsteno el filamento puede ser o bien en la forma de una horquilla de pelo o bien pequeo y en forma de pa. Las fuentes de LaB6 utilizan un pequeo monocristal. Conectando dicho can a una fuente de alto voltaje (~120kV para muchas aplicaciones) comenzar a emitir electrones hacia el vaco. Esta extraccin de electrones suele reforzarse con la ayuda de un cilindro Wehnelt. Una vez extrados, las lentes de la parte superior del TEM manipulan los haces de electrones permitiendo su focalizacin al tamao deseado y su localizacin sobre la muestra. La manipulacin de los electrones se consigue mediante la combinacin de dos efectos fsicos. La interaccin de los electrones con un campo magntico hace que estos se muevan de acuerdo a la frmula vectorial F= (q.v) x B (siendo v y B, el vector velocidad del electro, B el vector campo magntico y "x" el producto vectorial). Este efecto permite que los electrones emitidos puedan ser manipulados por medio de electroimanes. Esta tcnica permite la formacin de una lente magntica de distancia focal variable, dependiendo de la distribucin del flujo magntico. Adems un campo elctrico puede deflectar la trayectoria de los electrones en un ngulo fijo. Mediante dos deflexiones seguidas pueden desplazarse lateralmente las trayectorias de los electrones. Esta tcnica permite el desplazamiento lateral de los haces de electrones en el TEM, siendo esta operacin especialmente importante para el barrido de los haces en la variante STEM. De la combinacin de estos dos efectos as como del empleo de un sistema de visualizacin (tal como una pantalla de fsforo) se obtiene el nivel de control de los haces requerido para la operacin del TEM.

Las lentes del TEM permiten realizar la convergencia de los haces y el control del ngulo de la misma. Dicho control se ejerce modificando la cantidad de corriente que fluye a travs de las lentes cuadrupolares y hexapolares y permite modificar los aumentos del TEM. La lente cuadrupolar consiste en un conjunto de cuatro bobinas situadas en los vrtices de un cuadrado. La lente hexapolar simplemente incrementa el grado de simetra del campo resultante. Tpicamente un TEM contiene tres conjuntos de lentes con muchas posibles variantes en la configuracin de las lentes, en particular la de TEM con filtrado energtico o EFTEM. Los conjuntos se denominan respectivamente lentes condensadoras o condensador, lentes de objetivo o simplemente objetivo y lentes de proyeccin o proyector. Las lentes condensadoras se encargan de la formacin inicial del haz tras la emisin de los electrones. Las lentes de objetivo focalizan el haz sobre la muestra y finalmente las lentes de proyeccin se encargan de expandir el haz reflejado hacia la pantalla de fsforo u otro dispositivo de visualizacin tal como pelcula. Los aumentos del TEM vienen dados por la razn de las distancias entre la muestra y el plano imagen del objetivo. Es de apreciar que la configuracin de un TEM vara significativamente segn su implementacin. As algunos fabricantes usan configuraciones especiales de lentes, tales como en instrumentos corregidos de aberracin esfrica, en particular en aplicaciones de alto voltaje en TEM de emisin de campo. El sistema de visualizacin en un TEM puede consistir en una pantalla de fsforo para observacin directa por el operador y opcionalmente en un sistema de registro de imgenes tales como pelcula o una retina CCD combinada con una pantalla de fsforo. Normalmente estos sistemas de visualizacin pueden ser intercambiados a conveniencia del operador.

Microscopio electrnico de barrido

Microscopio electrnico de barrido. El Microscopio electrnico de barrido o SEM (Scanning Electron Microscope), es aquel que utiliza un haz de electrones en lugar de un haz de luz para formar una imagen. Tiene una gran profundidad de campo, la cual permite que se enfoque a la vez una gran parte de la muestra. Tambin produce imgenes de alta resolucin, que significa que caractersticas espacialmente cercanas en la muestra

pueden ser examinadas a una alta magnificacin. La preparacin de las muestras es relativamente fcil pues la mayora de SEMs slo requieren que estas sean conductoras. En el microscopio electrnico de barrido la muestra generalmente es recubierta con una capa de carbn o una capa delgada de unmetal como el oro para darle propiedades conductoras a la muestra. Posteriormente es barrida con los electrones acelerados que viajan a travs del can. Un detector mide la cantidad de electrones enviados que arroja la intensidad de la zona de muestra, siendo capaz de mostrar figuras en tres dimensiones, proyectados en una imagen de TV o una imagen digital. Su resolucin est entre 4 y 20 nm, dependiendo del microscopio. Inventado en 1931 por Ernst Ruska, permite una aproximacin profunda al mundo atmico. Permite obtener imgenes de gran resolucin en materiales ptreos, metlicos y orgnicos. La luz se sustituye por un haz de electrones, las lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su superficie. Antecedentes Los primeros instrumentos desarrollados para este propsito, fueron microscopios pticos, porque con el ojo humano es imposible visualizar. Estos instrumentos fueron desde una simple lupa, hasta un microscopio compuesto. Sin embargo, an en el mejor instrumento ptico, la resolucin est limitada a la longitud de onda de la luz que se utilice, que en este caso es la luz violeta, cuya longitud de onda es de aproximadamente 400 nanmetros; por lo tanto, los detalles ms pequeos que pueden resolverse, debern estar separados no menos de esta longitud. En trminos de amplificacin, esto quiere decir que no podemos amplificar ms de 1,000 veces. Una salida inmediata a esta limitante de resolucin, es utilizar alguna radiacin de longitud de onda ms corta que la de la luz violeta. Los candidatos inmediatos son los rayos X, que se caracterizan por una longitud de onda del orden de 0.15 nanmetros; desafortunadamente stos tienen la gran desventaja de ser absorbidos rpidamente por lentes de vidrioy de no poder ser desviados por lentes magnticas (Adems de las precauciones que debera tener el operador). Otra posibilidad es aprovechar el comportamiento ondulatorio de los electrones acelerados por alguna diferencia de potencial. Sea el caso, por ejemplo, de electrones acelerados en un campo de 100,000 voltios que presentan comportamiento ondulatorio con una longitud de onda de 0.0037 nm (3.7 picmetros), lo que en principio permitira tener un aparato que resolviera detalles del mismo orden, lo cual es ms de lo que se necesita para resolver detalles atmicos, puesto que los tomos en un slido estn separados en un orden de 0.2 nm. Sin embargo, en la prctica, detalles inherentes a la tcnica de observacin, o defectos en el maquinado de las piezas polares producen aberraciones. Funcionamiento En el microscopio electrnico de barrido es necesario acelerar los electrones en un campo elctrico, para aprovechar de esta manera su comportamiento ondulatorio, lo cual se lleva a cabo en la columna del microscopio, donde se aceleran por una diferencia de potencial de 1,000 a 30,000 voltios. Los electrones acelerados por un voltaje pequeo son utilizados para muestras muy sensibles, como podran ser las muestras biolgicas sin preparacin adicional, o muestras muy aislantes. Los altos voltajes se utilizan para muestras metlicas, ya que stas en general no sufren

daos como las biolgicas, y de esta manera se aprovecha la menor longitud de onda para tener una mejor resolucin. Los electrones acelerados salen del can, y son enfocados por las lentes condensadora y objetiva, cuya funcin es reducir la imagen del filamento, de manera que incida en la muestra un haz de electrones lo ms pequeo posible (para as tener una mejor resolucin). Con las bobinas deflectoras se barre este fino haz de electrones sobre la muestra, punto por punto y lnea por lnea. Cuando el haz incide sobre la muestra, se producen muchas interacciones entre los electrones del mismo haz, y los tomos de la muestra; puede haber por ejemplo, electrones rebotados como las bolas de billar. Por otra parte, la energa que pierden los electrones al "Chocar" contra la muestra puede hacer que otros electrones salgan despedidos (electrones secundarios), y producir rayos X, electrones Auger, etc. El ms comn de stos es el que detecta electrones secundarios, y es con el que se hacen la mayora de las imgenes de microscopios de barrido. Podemos tambin adquirir la seal de Rayos X que se produce cuando se desprenden estos mismos de la muestra, y posteriormente hacer un anlisis espectrogrfico de la composicin de la muestra . Utilizacin

Cabeza de hormiga vista con un (MEB). Son ampliamente utilizados en la biologa celular. Aunque permite una menor capacidad de aumento que el microscopio electrnico de transmisin, este permite apreciar con mayor facilidad texturas y objetos en tres dimensiones que hayan sido pulverizados metlicamente antes de su observacin. Por esta razn solamente pueden ser observados organismos muertos, y no se puede ir ms all de la textura externa que se quiera ver. Los microscopios electrnicos slo pueden ofrecer imgenes en blanco y negro puesto que no utilizan la luz. Este instrumento permite la observacin y caracterizacin superficial de materiales inorgnicos y orgnicos, entregando informacin morfolgica del material analizado. A partir de l se producen distintos tipos de seal que se generan desde la muestra y se utilizan para examinar muchas de sus caractersticas. Con l se pueden realizar de los aspectos morfolgicos de zonas microscpicas de diversos materiales, adems del procesamiento y anlisis de las imgenes obtenida.

Microscopio de iones en campo

Imgenes obtenidas al microscopio deiones con un ctodo de tungsteno. El sistema muestra la localizacin de manchasen el borde de tomos individuales. La disposicin anular los puntos es una foto de una red cbica en una superficie esfrica

Diagrama de microscopa deiones La microscopa de iones en campo (FIM) es una tcnica analtica empleada en ciencia de materiales. El microscopio de iones en campo es una variedad de microscopio que puede ser usado para visualizar la ordenacin de los tomos que forman la superficie de la punta afilada de una aguja de metal. Fue la primera tcnica con la que se consigui resolver espacialmente tomos individuales. La tcnica fue desarrollada por Erwin Mller. En 1951 se publicaron por primera vez imgenes de estructuras atmicas de tungsteno en la revista Zeitschrift fr Physik. En la FIM, se produce una aguja de metal afilada y se coloca en una cmara de ultra alto vaco, que despus se llena con un gas visualizador tal como el helio o el nen. La aguja se enfra hasta alcanzar temperaturas criognicas (20-100 K). Luego se aplica un voltaje positivo que va de 5.000 a 10.000 voltios sobre la punta. Los tomos de gas absorbidos por la punta se ven ionizados por el fuerte campo elctrico que existe en las proximidades de ella. La curvatura de la superficie cercana a la punta provoca una magnetizacin natural; los iones son repelidos bruscamente en direccin perpendicular a la superficie (un efecto de "proyeccin de punto"). Se coloca un detector de modo que pueda recoger esos iones repelidos; y la imagen formada por todos los iones repelidos puede tener la resolucin suficiente como para mostrar tomos individuales en la superficie de la punta. Al contrario que los microscopios convencionales, donde la resolucin espacial se ve limitada por la longitud de onda de las partculas empleadas en la visualizacin, el microscopio basado en FIM funciona por proyeccin y alcanza resoluciones atmicas, con una magnificacin aproximada de unos pocos millones de aumentos.

Microscopa virtual

Vista microscpica de una muestra histolgica humana de mama, teida conhematoxilina y eosina. La microscopa virtual es un mtodo de revisin y transmisin de imgenes provenientes de un microscopio a travs de redes informticas. Esto permite la visualizacin independiente de las imgenes por grandes nmeros de personas en distintos lugares. Involucra la unin de tecnologas pticas microscpicas y digitales.1 El estudio a distancia de las imgenes se puede

denominar telehistologa, telecitologa o telepatologa dinmica virtual dependiendo del tipo de informacin biolgica. Mediante un microscopio virtual, una persona localizada en cualquier lugar del mundo controlar el rea de estudio del preparado microscpico (lmina virtual), y analizar los tejidos o clulas en el aumento que desee con el simple uso del perifricos como el ratn con unos pocos clics y sin factores horarios intervinientes. Descripcin Un microscopio virtual puede ser esttico o dinmico: esttico es cuando una imagen se encuentra previamente digitalizada a un aumento determinado (20x, 50x, 100x). Un microscopio virtual dinmico (tambin denominado interactivo) permite hacer zoom a la imagen en tiempo real, y en algunos casos, permitir el control del campo visualizado mediante la manipulacin remota de las muestras un microscopio robotizado, el cual consiste bsicamente en un microscopio con un sistema de captacin de imgenes adosado (p. ej., cmara digital) y conectado a una computadora, con lo que es posible controlar los parmetros del microscopio remotamente (ejes x,y, y z, luz, diafragma, aumentos). Los sistemas de digitalizacin para microscopa virtual actuales permiten el "escaneo" automtico de muestras preparadas y provenientes de citologa o histologa creando una preparacin virtual en cuestin de minutos. Con ello, es posible digitalizar todo tipo de preparaciones histolgicas o citolgicas, desde gruesos cortes (15 m) de tejidos incluidos en parafina, hasta finos cortes de 5 m de histologa o histopatologa convencional con tinciones como hematoxilina eosina, inmunohistoqumica o de inmunofluorescencia. Una preparacin virtual es uno o un conjunto de archivos que contienen toda la informacin en imgenes de toda una preparacin. Un sistema informtico conectado a un microscopio realiza el barrido mediantes fotografas de toda la preparacin, y las organiza de manera que, mediante un software especial, es posible obtener tener una imagen a bajo aumento a modo de mapa de la preparacin y los sucesivos altos aumentos. Una de las ventajas ms inmediatas de este sistema es

que permite obtener fotografas a bajo aumento con un enfoque perfecto, pues el bajo aumento proviene del ensamblado de imgenes bien enfocadas a alto aumento. Los archivos obtenidos tienen un peso (tamao) muy elevado que puede oscilar entre 200 MB y 40 GB.

Microscopio de fuerza atmica

Diagrama de un microscopio de fuerza atmica El Microscopio de fuerza atmica (AFM, de sus siglas en ingls Atomic Force Microscope) es un instrumento mecano-ptico capaz de detectar fuerzas del orden de los piconewtons. Al rastrear una muestra, es capaz de registrar continuamente sutopografa mediante una sonda o punta afilada de forma piramidal o cnica. La sonda va acoplada a un listn o palanca microscpica muy flexible de slo unos 200 m. El microscopio de fuerza atmica ha sido esencial en el desarrollo de lananotecnologa, para la caracterizacin y visualizacin de muestras a dimensiones nanomtricas ( ). Historia Gerd Binnig y Heinrich Rohrer fueron galardonados con el Premio Nobel de Fsica en 1986 por su trabajo en microscopa de barrido de tnel. Binnig y Rohrer fueron reconocidos por el desarrollo de la tcnica de microscopa poderosa, que puede formar una imagen de cada uno de los tomos sobre una superficie de metal o de semiconductores mediante el escaneo de la punta de una aguja sobre la superficie a una altitud de slo unos pocos dimetros atmicos. Compartieron el premio con el cientfico alemn Ernst Ruska, el diseador del primer microscopio electrnico.

Comparacin del AFM con otros microscopios

Microscopio ptico El microscopio ptico es una herramienta muy til para obtener imgenes de muestras orgnicas e inorgnicas, pero est limitado para una resolucin de 1mm a 1 micra.

Microscopio electrnico El microscopio electrnico tiene una resolucin entre 1mm y 1nm. Es, por lo tanto, idneo para la determinacin de estructuras a nivel molecular y atmico. La resolucin no est limitada por la difraccin, pero s por las lentes. El microscopio de campo cercano tiene una resolucin todava mayor: entre 1m y 1. TEM El Microscopio electrnico de transmisin, tiene las siguientes caractersticas que lo hacen muy til:

Resolucin atmica. Puede determinarse estructuras en 2 dimensiones. Interaccin electrones a electrones.

SEM El Microscopio electrnico de barrido tiene las siguientes caractersticas:

Resolucin atmica. Requiere vaco. Debe cubrirse a menudo el espcimen. Permite caractersticas superficiales.

STM El microscopio de efecto tnel (STM) es un instrumento que permite visualizar regiones de alta o baja densidad electrnica superficial, y de ah inferir la posicin de tomos individuales o molculas en la superficie de una red. La observacin atmica se ha vuelto una tarea comn en muchos laboratorios debido al bajo costo de este tipo de microscopa en comparacin con la microscopa electrnica. Las tcnicas de microscopa de barrido por sondeo (SPM: Scanning probing microscopy) que incluyen al STM y al AFM se utilizan en reas de la ciencia que van desde la biologa hasta la fsica del estado slido. Consideraciones

Las muestras deben ser conductoras. Algunas superficies parecen demasiado lisas al STM, la altura aparente o corrugacin es de 1/100 a 1/10 dimetros atmicos. Entonces, para resolver tomos individuales la distancia entre punta y muestra debe mantenerse constante a menos de 1/100 de dimetro atmico o hasta 0.002 nm., por ello el STM debe aislarse de las vibraciones.

Debe tomarse en cuenta que el resultado es una visualizacin que permite conocer caractersticas de la muestra. No es una fotografa de los tomos en la superficie. Los tomos parecen tener superficies slidas en las imgenes de STM, pero en realidad no las tienen.

Sabemos que el ncleo de un tomo est rodeado de electrones en constante movimiento. Lo que parece una superficie slida es en realidad una imagen de un conjunto de electrones. Las imgenes tambin dependen de ciertos mecanismos de interaccin punta-muestra que no se entienden bien hasta la fecha. Aun cuando no necesita alto vaco para su operacin, es deseable para eliminar contaminacin y adems una cmara de vaco asla de vibraciones externas.

Recientemente (4 de junio de 2007) un equipo liderado por el Consejo Superior de Investigaciones Cientficas (CSIC) ha perfeccionado la tcnica empleada por los microscopios atmicos. La nueva tcnica, denominada Phase Imaging AFM, est basada en la microscopa de fuerzas, y permite realizar medidas tanto en aire como en medios lquidos o fisiolgicos. El desarrollo de esta tcnica podra tener aplicaciones en reas diferenciadas, como la biomedicina, la nanotecologa, la ciencia de materiales o estudios medioambientales.