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TECNICAS PARA MEDICION DE BIOMASA MICROBIANA (LEVADURAS).

YESID MARTINEZ FUENTES LUIS PACHECO RUIZ ALEXANDER RODRIGUEZ PEREZ ASTRID SANTOS CACERES JUAN SIERRA MARQUEZ RAFAEL OLIVERO VERBEL ING. ALIMENTOS UNIVERSIDAD DE SUCRE FACULTAD DE INGENIERA PROGRAMA DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL SINCELEJO SUCRE 2009

RESUMEN Las levaduras son microorganismos muy importantes en la industria y en la biotecnologa actual. Por sus caractersticas leudantes y metablicas puede fermentar muchos carbohidratos obteniendo as los llamados vinos de gran acogida entre la sociedad. Para la medicin de biomasa microbiana se emple (Saccharomyces cerevisiae), una levadura con la cual se prepar 200mL solucin madre 2500ppm, de la cual se prepararon 7 muestras de diferentes concentraciones de las cuales se analizo la cantidad de biomasa por dos mtodos: Por conteo directo (cmara de Neubauer), donde fue necesario preparar una dilucin de menor concentracin, debido a que las concentraciones eran muy altas para visualizarse.

Por densidad ptica (espectrofotmetro), un mtodo mas eficaz para medir la concentracin de microorganismos analizando la cantidad de absorbancia de cada muestra. Todos estos datos analizados se muestran a continuacin. ABSTRACT Yeasts are very important microorganisms in the industry and in the current Biotecnolog. Due to characteristics leudants and metabolic it can ferment many carbohydrates obtaining this way the so called wines of great reception among the society. For the measurement of microbial biomass there was used (Saccharomyces cerevisiae), a yeast with which to prepare 200mL solution mother 2500ppm, of which there were prepared 7 samples of

different concentrations of which analyze the quantity of biomass for two methods: - For direct count (Neubauer's camera), where it was necessary to prepare a dilution of minor concentration, due to the fact that the concentrations were very high to be visualized. For optical density (spectrophotometer), a method most effective to measure the concentration of microorganisms analyzing the quantity of absorbancia of every sample. All this analyzed information appears later. INTRODUCCION La biomasa microbiana es un componente esencial del ciclo de los nutrientes en agroecosistemas. El crecimiento microbiano puede ser considerado como un aumento ordenado de todos los constituyentes qumicos de un organismo, lo cual, para todos los organismos unicelulares conduce a un aumento de individuos en la poblacin. Uno de los mtodos mas practico para la determinacin de la biomasa microbiana se basa en pruebas detectando la presencia de compuestos bioqumicas especficos que indican la presencia de microorganismos. La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin embargo existen dificultades para el clculo exacto pues en algunos casos la concentracin de ATP cambia

segn sus condiciones alteradas como las nutricionales y fisiolgicas. Debido a las dificultades que presenta el anterior mtodo y a las exactitudes que se necesitan para realizar de una buena prctica de laboratorio, es recomendado utilizar un mtodo que posea mayor eficacia y efectividad. De acuerdo a esto el mtodo mas usado para la medicin de biomasa es secar volmenes determinados de cultivos celulares lentamente hasta obtener un peso constante. Cuando se trate de mtodos de clulas que sedimenten rpidamente, como las levaduras, esto usualmente implica centrifugacin de muestras del cultivo en tubos de centrifuga prepesados. En el caso de clulas bacterianas difciles de concentrar pro centrifugacin, las muestras de cultivo se filtran a travs de membranas hidrofilicas con tamao de poros de 0.2 um. Otro mtodo muy utilizado es el de determinacin por densidad ptica, en el cual se aprovecha la proporcionalidad de la densidad ptica a la masa celular, cuando no se tienen en el medio de fermentacin u otros slidos en suspensin. Tambin podemos encontrar otros mtodos que son utilizados en la medicin de biomasa, pero los ms destacados son los anteriormente mencionados y destacados en la practica de laboratorio realizada.

PROCEDIMIENTO

RESULTADOS

1. CULTIVO MADRE. Con 5 gr (500mg) de levadura seca comercial (Saccharomyces cerevisiae) y 200 ml (0.2 L) de agua destilada. Ppm= (mg/L) Ppm= (500 mg/ 0.2 L) = 2500 ppm.
Solucin Madre De levaduras. >

2. SOLUCIONES PROBLEMA. TUBOS mL H2O * mL cultivo M Ppm (mg/L)


(*) Agua destilada.

1 9 1 250

2 8.5 1.5 375

3 8 2 500

4 7.5 2.5 625

5 7 3 750

6 6.5 3.5 875

7 6 4 1000

3. MEDICION DE BIOMASA MICROBIANA POR CONTEO DIRECTO EN CAMARA DE NEUBAUER. CAMARA DE NEUBAUER

V. de cultivo = 0.4 mL Ppm =100 mg/L # de clulas en cmara de Neubauer. = 52 # de clulas/ml: 34,66666667

4. MEDICION DE BIOMASA MICROBIANA POR DENSIDAD OPTICA. TABLA 2. Mediciones con celda y con tubo de ensayo con respecto a la concentracin.
Con/cin. ppm Muestra (ml) Absorbancia con el tubo
Ensayo 1 Ensayo 2 Prom.

Absorbancia con la celda


Ensayo 1 Ensayo 2 Prom.

0 250 375 500 625 750 875 1000

Blanco 1 1,5 2 2,5 3 3,5 4

0 0,269 0,398 0,375 0,57 0,684 0,777 0,829

0 0,255 0,398 0,361 0,52 0,666 0,751 0,802

0 0,262 0,398 0,368 0,545 0,675 0,764 0,8155

0 0,318 0,219 0,303 0,283 0,496 0,486 0,487

0 0,317 0,219 0,302 0,286 0,496 0,486 0,487

0 0,3175 0,219 0,3025 0,2845 0,496 0,486 0,487

Grafica # 1

Grafica # 2

ESPECTROFOTMETRO DIGITAL UNISUCRE

MINI VORTERVER UNISUCRE

Muestra problema Concentracin (ppm)

Absorbancia Ensayo 1 Ensayo 2 Promedio 0.851 0.832 0.8415 ?

Tabla 3. Datos de absorbancia con respecto a la concentracin (resumida). Muestra Absorbancia con el Absorbancia con la celda (ml) tubo (promedio). (promedio). Blanco 0 0 1 0,262 0,3175 1,5 0,398 0,219 2 0,368 0,3025 2,5 0,545 0,2845 3 0,675 0,496 3,5 0,764 0,486 4 0,8155 0,487

Con la ecuacin obtenida en la grafica de absorbancia con el tubo de ensayo podramos hallar la concentracin de la muestra problema, pero pese a que el valor de la absorbancia de la muestra problema esta por fuera del rango de datos del experimento, no se puede aplicar dicha formula, por lo que no se puede encontrar la concentracin. ANALISIS DE RESULTADOS De la anterior experiencia de laboratorio se analizaron los siguientes puntos: De la primera grafica donde se analizo la solucin madre se puede observar que el resultado obtenido de la grafica, el R2 es muy aproximado a 1 lo que quiere decir que cada medicin fue lo mas exacta posible y que

los datos tienden a estar en una proporcin directa. En comparacin con la segunda grafica, el R2 es muy alejado del anterior con una diferencia de 0.159 (0.975-0.816), lo que indica que el espectrofotmetro es mas eficiente con los tubos de ensayo que con las propias celdas del equipo. El error es de 16.3%. De la grafica 1 se observa que el valor que acompaa a la X es aproximadamente cero, segn clculos aparte, este valor es 1.9304*10-7 aproximadamente, este valor significa que por cada valor de concentracin en ppm, se aumenta la absorbancia en dicho valor. Al igual sucede en la segunda grafica cuyo valor que acompaa a la X es de 5.92*10-4. Para el conteo de las clulas por medio de la cmara de Neubauer, se utilizo una concentracin muy pequea debido a que entre mayor sea la concentracin (ppm) de las muestras, mayor es el numero de clulas. Es decir que hay una relacin en la concentracin de la muestra con el nmero de clulas (directamente proporcionales). La absorbancia es directamente proporcional a la concentracin de la muestra analizada, debido a que si la concentracin aumenta, la absorbancia tambin aumenta.

Para poder hallar la concentracin de una muestra problema con una ecuacin obtenida de un anlisis realizado, necesitamos que el valor de dado (la absorbancia) este dentro del rango del experimento realizado. CONCLUSIONES Despus de analizar los resultados obtenidos dentro de la prctica de investigacin pudimos observar lo siguiente: Para la medicin de biomasa microbiana se pudieron encontrar distintos mtodos, los cuales se utilizan de acuerdo al tipo de sustancia microbiana a utilizar y de acuerdo a la concentracin de la muestra a analizar. Se debe tener en cuenta que para utilizacin de la cmara de Neubauer las concentraciones de estudio son muy limitadas debido a que a mayor concentracin, menor visibilidad.

CUESTIONARIO Que otros mtodos se utilizan para la medicin de biomasa? Lo mas practico para la determinacin de la biomasa microbiana se basa en pruebas detectando la

presencia de compuestos bioqumicas especficos que indican la presencia de microorganismos. ATP La medida de ATP puede usarse para calcular la biomasa microbiana, sin embargo existen dificultades para el clculo exacto pues en algunos casos la concentracin de ATP cambia segn sus condiciones alteradas como las nutricionales y fisiolgicas. COMPONENTES DE LA PARED CELULAR La mayora de las bacterias poseen acido murmico en su pared celular, y esta es la herramienta til para la determinacin de la biomasa microbiana. Esta se basa en la liberacin de lactato por parte del acido muramico y posteriormente el anlisis qumico para determinar la concentracin de dicho lactato. La conversin de la medida de acido muramico (MA) en biomasa indica que las bacterias Gram positivas presentan una proporcin de 44g MA/mg C y las Gram negativas 1244g MA/mg C. CLOROFILA La biomasa de los microorganismos fotosintticos se puede

determinar a partir de la determinacin de la clorofila. Esta se puede extraer con disolvente como la acetona o el metanol, y cuantificarse midiendo su absorbancia en un espectrofotmetro a una longitud de onda de 665nm. PROTEINA Las protenas son fcilmente cuantificables, y estas con grupos hemo pueden ser detectadas especficamente mediante quimioluminiscencia. Esta determinacin proteica es apropiada solamente cuando se encuentra solamente una poblacin. DNA La determinacin del ADN puede emplearse como la determinacin de la masa microbiana. Suelen emplearse reacciones con colorantes fluorescentes como el bromuro de etidio y la espectrofluorometria. microbiologos.blogspot.co m

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