SECCIN I: INTRODUCCIN

Tema 1: Tcnicas Bsicas de Gentica Molecular 1) Tecnologa del ADN recombinante Clonacin de ADN Vectores de clonacin Vectores de expresin Fago lambda () Csmidos Aplicaciones de la clonacin del ADN 2) Enzimas de restriccin 3) Hibridacin de cidos nucleicos. PCR. Secuenciacin del ADN

Tecnologa del ADN recombiante

Clonacin del ADN: Algunos bacterifagos pueden infectar algunos tipos concretos de bacterias pero no otros, esto es debido a que algunas bacterias son capaces de digerir el ADN del fago y por tanto impiden su crecimiento. Dicha restriccin se lleva a cabo gracias a unas enzimas del tipo endonucleasas, que digieren el ADN de doble cadena tras el reconocimiento y unin a secuencias especficas en el genoma invasor. Por tanto, dichas enzimas reciben el nombre genrico de enzimas de restriccin. Un ejemplo de esto sera el caso de la Escherichia Coli y la enzima EcoRI*, como muestra el experimento realizado por Boyer y Cohen.

*La nomenclatura de estas enzimas depende del nombre de la cepa bacteriana de la que se aislan, por ejemplo, las enzimas de restriccin purificadas a partir de Escherichia coli se denominan "EcoXX": las tres primeras letras (en cursiva) designan la especie, y uno ms caracteres en mayscula (letras numeros romanos, nunca en cursiva) designan la cepa o distinguen varias enzimas de una misma bacteria.

En ese experimento dos plsmidos, el pSC101 y el RSF1010 (ambos proporcionan inmunidad), fueron "cortados" por la EcoRI resultando 2 secuencias lineales de ADN. A continuacin estas cadenas lineales se ven afectadas por la accin de la ADN Ligasa. Se puede dar los siguientes casos: a) La ADN Ligasa vuelve a unir los extremos de la cadena lineal que previamente haba cortado la EcoRI, volviendose a formar los plsmidos originales. b) La ADN Ligasa une dos cadenas lineales provenientes de plsmidos distintos, pero de extremos idnticos pues ambas han sido cortadas por la misma enzima. c) Los extremos no se unen. Esta solucin de distintos tipos de plsmidos se introducen en un cultivo con bacterias. A continuacin las bacterias se estimulan para que permitan la entrada de los plsmidos a su interior (las bacterias solo son capaces de incorporar un plsmido) y se las deja proliferar. Despus, se introducen en el cultivo los dos compuestos patgenos contra los cuales proporcionan inmunidad los plsmidos. Aquellas bacterias que no haban incorporado ningn plsmido murieron. Tambin lo hicieron aquellas que haban incorporado el pSC101 y el RSF1010 pues solo eran inmunes a un patgeno. Las bacterias que se mantenan con vida eran aquellas que haban incorporado el plsmido producto de la unin del pSC101 y el RSF1010 pues eran inmunes a ambos agentes. Esto demostr que la recombinacin gnica es posible. Vectores de clonacin: En toda estrategia de clonacin molecular son necesarios tres elementos bsicos: un inserto, un vector y un husped. El inserto es el fragmento de ADN que queremos obtener en grandes cantidades, para despus proceder a estudiarlo. Por lo que respecta al husped, lo ms habitual es que se trate de alguna cepa de la bacteria Escherichia coli, especialmente modificada para permitir el crecimiento de vectores con gran eficacia y fidelidad. Respecto a los vectores de clonacin, existe una gran variedad de posibilidades, cada una con caractersticas distintas que los hacen adecuados para aplicaciones concretas. Los primeros vectores utilizados fueron los plsmidos, que son elementos bacterianos extracromosmicos, circulares, que se replican dentro de la bacteria husped con independencia de la replicacin del cromosoma bacteriano. Los plsmidos utilizados en clonacin molecular son variaciones de plsmidos nativos, que han sido modificados con el objeto de conseguir que se repliquen con mayor eficacia (hasta cientos de copias por bacteria). Adems, tambin se ha creado en ellos una regin que se puede cortar fcilmente con enzimas de restriccin (ver ms adelante) para introducir en ella el fragmento de ADN de inters (o inserto). Tambin se ha introducido en ellos el gen de resistencia a algn antibitico, que permita seleccionar las bacterias que llevan el plsmido dentro: cuando al cultivo en el que crecen las bacterias se aade el antibitico, slo crecern aquellas que tienen el plsmido y expresan los genes del mismo. En el esquema adjunto se observa el plsmido pBR322, donde se aprecian: (a) Sitios de restriccin (b) Genes de resistencia a antibiticos (c) Origen de replicacin.

Las endonucleasas cortan el plsmido en localizaciones especficas, no por cualquier base. Para ello deben localizar una secuencia de bases concreta para cortar, generando en la cadena extremos romos si "corta" en el punto medio de la secuencia de bases reconocida, o cohesivo, si corta prxima a un extremo de dicha secuencia (el punto de corte est desplazado respecto del eje de simetra de la secuencia de reconocimiento; dada la naturaleza palindrmica de dicha secuencia, esto genera extremos libres en los que una de las dos cadenas de la doble hlice es ms larga que la otra). En las enzimas que generan extremos cohesivos, se distinguen adems dos tipos segn cul de las dos cadenas de la molcula de ADN es ms larga, la cadena 5' la 3'; as se habla de extremos cohesivos con "salientes" 5' 3', respectivamente. Las endonucleasas siempre cortarn de forma simtrica. El tipo de extremos que genera cada enzima es un factor importante en los experimentos de clonacin molecular, porque las ligasan slo pueden unir extremos que sean compatibles, y adems los extremos cohesivos habitualmente son ligados con mucha mejor eficacia que los extremos romos.