UNIVERSIDADE PAULISTA UNIP

EDERVAL MATOS DANIELE CRISTINA PAULA GISLENE NEVES TAMIRES OLIVEIRA

TCNICA DE COLORAO DE GRAM

SOROCABA 2013

I N T R O D U O A colorao de Gram foi desenvolvida em 1884 por Hans C h r i s t i a n J o a c h i m G r a m , m d i c o bacteriologista dinamarqus. um procedimento de colorao diferencial, pois no cora todos os tipos de clulas igualmente; e muito til, pois classifica as bactrias em dois grandes grupos: g r a m - p o s i t i v a s e g r a m - n e g a t i v a s , d e a c o r d o c o m d i f e r e n a s n a p a r e d e c e l u l a r d a s b a c t r i a s . Consiste no tratamento sucessivo do esfregao bacteriano, fixado pelo calor, com os reagentes:cristal violeta, iodo, etanol - acetona e fucsina bsica1, 3. Os diferentes tipos de bactrias reagem de modo diferente colorao de Gram, por que existem diferenas estruturais em suas paredes celulares, o que afetam a reteno ou liberao de uma combinao de violeta genciana e iodo, denominada complexo violeta-iodo (CV-I). Entre outras diferenas, as bactrias gram-positivas tm uma parede celular mais espessa de

peptideoglicana

(dissacardeos e aminocidos) que as bactrias gram-

negativas. Alm disso, as bactrias gram-negativas contm uma camada de lipopolissacardeos (lipdeos e polissacardeos) como parte de s u a parede celular. Quando aplicada a clulas gram-positivas e g r a m - n e g a t i v a s , a v i o l e t a d e genciana e o iodo penetram facilmente nas clulas. Dentro as mesmas, a violeta de genciana e o iodo se combinam para formar o CV-I. Esse complexo maior que a molcula CV que entrou na clula e, devido ao seu tamanho, no pode ser removido da camada intacta de peptideoglicano das clulas gram-positivas pelo lcool. Nas clulas gram-negativas o lcool rompe a camada

lipopolissacardica e o complexo removido atravs da camada fina de peptideoglicano, resultado, as que no co n s e g u e reter o complexo. o Como e

clulas

gram-positivas

retm

corante

p ermanecem de cor prpura. As clulas gram-negativas no retm o corante e ficam incolores at serem contra coradas com um corante vermelho, aps o que adquirem cor rosa1, 3. O mtodo de Gram uma das mais importantes tcnicas de colorao em microbiologia mdica. Porm, os resultados da colorao de Gram no so

universalmente aplicveis, pois algumas clulas bacterianas coram fracamente ou no adquirem cor2. Este mtodo consiste no tratamento de uma amostra de uma cultura bacteriana crescida em meio slido ou lquido, com um corante primrio, o cristal violeta, seguido de tratamento com um fixador, o lugol. Tanto bactrias gram-positivas quanto gram-negativas absorvem de maneira idntica o corante primrio e o fixador, adquirindo uma colorao violeta devido formao de um complexo cristal violeta-iodo, insolvel, em seus citoplasmas. Segue-se um tratamento com um solvente orgnico, o etanol-acetona. O solvente dissolve a camada lipdica das membranas externas das bactrias gram-negativas, deixando tambm pequenos buracos na fina camada de peptideoglicana pelos quais o complexo CV-I se espalha , decorando as clulas. Por outro lado, o solvente desidrata as espessas paredes celulares das bactrias grampositivas e provoca a contrao dos poros do peptideoglicano, tornando-as impermeveis ao complexo; o corante primrio retido e as clulas permanecem coradas. A etapa da descolorao crtica, pois a exposio prolongada ao solvente ir provocar a remoo do cristal violeta dos dois tipos de bactrias, podendo produzir resultados falsos. A reteno ou no do corante primrio , portanto, dependente das propriedades fsicas e qumicas

das paredes celulares bacterianas tais como espessura, densidade, porosidade e integridade. Em seguida, a amostra tratada com um corante secundrio, a fucsina bsica. Como as bactrias gram-negativas ficam incolores aps a lavagem com lcool, a adio do contra corante colore as clulas. Ao microscpio, as clulas gram-positivas aparecero coradas em violeta e as gram-negativas em rosa. Em clulas de bactrias gram-positivas velhas, mortas ou com envelopes danificados por agentes fsicos ou qumicos, tendem a perder o cristal violeta e uma mesma amostra bacteriana pode exibir parte ou todas as clulas coradas como gram-negativas. Portanto, o uso de amostra nova importante. Por outro lado, resultados do tipo "falso gram-positivo" s so obtidos se o tratamento com etanol-acetona for omitido. O corante cristal violeta pode ser substitudo, com os mesmos resultados, pelo azul de metileno e a fucsina bsica pode ser substitudo pelo corante vermelho safranina. A fucsina cora muitas bactrias gram-negativas mais intensamente que a

safranina, que por sua vez no cora prontamente algumas espcies de bactrias. O solvente etanol-acetona pode ser substitudo por lcool95%. A reao de Gram mais consistente quando usada em bactrias jovens, em crescimento1, 2,3,5.

1.0 BACTRIAS ANALISADAS 1.1 Escherichia Coli A E. coli, tambm chamada de Escherichia coli, um tipo de bactria que habita normalmente no intestino humano e no de alguns animais, mas que em alguns casos pode causar infeco, gerando diarria ou infeco urinria, por exemplo5. As bactrias que habitam no intestino humano geralmente no causam diarria, mas se um indivduo consumir alimentos contaminados com outro tipo de E. Coli, seu organismo no a reconhecer e isto poder causar doenas 5. A contaminao com a Escherichia coli, ocorre atravs do consumo de gua ou alimentos contaminados com a bactria e neste caso ela poder causar gastroenterite. Mas nas mulheres, a infeco urinria pode ser causada pela E. Coli, pois elas migram do nus para a uretra devido sua proximidade5. Os sintomas da contaminao por E. coli vo depender da gravidade da doena e do local afetado5. Quando a E. coli infecta os intestinos pode haver:

Diarreia com ou sem sangue e Dor ao evacuar;

Quando o E. coli infecta o trato urinrio pode haver:

Dor ou ardor ao urinar; Dor nas relaes ntimas.

E.coli Fonte:prokariotae

1.2 STAPHYLOCOCCUS AUREUS

O Staphylococcus aureus uma bactria esfrica, aerbia ou anaerbia facultativa, gram positiva que cresce na forma de cachos de uva. Essa bactria considerada pelos mdicos um problema, j que, alm de provocar infeces, costumam ser encontradas na pele de at 15% dos seres humanos6. comum termos em nosso organismo, como pele, boca, nariz, intestino, colnias de bactrias que no nos causam doenas, mas importante frisar que essas bactrias no causam doenas somente enquanto permanecem restritas a esses locais, pois as colnias so verdadeiros reservatrios de bactrias prontas para invadir o corpo todas as vezes que o sistema imunolgico estiver fragilizado6. As bactrias encontradas na pele ficam esperando apenas uma leso para poderem entrar no corpo, e por isso extremamente importante lavar bem as feridas, pois vrios tipos de infeces no organismo so causados pelo Staphylococcus aureus, e o tipo mais comum a infeco da pele, cuja porta de entrada pode ser at uma pequena mordida de inseto. O Staphylococcus aureus tambm responsvel por infeces como impetigo, terol, furnculo, foliculite, mastite puerperal entre outras6. O Staphylococcus aureus tambm pode invadir o nosso corpo atravs de alimentos contaminados com as toxinas da bactria, provocando intensa infeco intestinal, vmitos e diarria. Esses alimentos podem ser contaminados na hora de sua manipulao (por pessoas que estejam contaminadas com a bactria em secrees nasofarngeas, ou com ferimentos nas mos, abscessos ou acnes). Produtos que no foram cozidos ou refrigerados adequadamente permitem a multiplicao da bactria e a produo da toxina6. Uma vez em nosso organismo, o Staphylococcus aureus pode no ficar restrito apenas nossa pele. Se invadir a circulao sangunea, poder atingir qualquer rgo, desencadeando infeces graves, sepse e choque sptico. Uma das infeces mais temidas, provocadas pelo Staphylococcus aureus, a endocardite, no corao, mas outras infeces possveis so a pneumonia, a pielonefrite e osteomielite6.

Staphylococcus aureus Fonte: Brasil Escola

2.0 Objetivo A avaliao da morfologia microbiana muito importante para a execuo da maior parte dos exames microbiolgicos. A colorao de Gram tambm deve ser revisada dada sua grande importncia no diagnstico clnico das amostras microbiolgicas.

3.0 Mtodo 1) Em uma lmina pingar uma gota de soluo salina estril; 2) Flambar a ala de platina; 3) Recolher uma colnia pr-cultivada com ala bacteriolgica; 4) Colocar a colnia selecionada junto lmina e homogeneizar fazendo um esfregao; 5) Fixar esfregao no calor; 6) Cobrir o esfregao com cristal de violeta por 1 min; 7) Lavar o esfregao com gua corrente removendo o excesso de corante; 8) Cobrir o esfregao com lugol por 1 min; 9) Repetir passo 7; 10) Descorar com lcool acetona at remover o excesso de corante; 11) Repetir passo 7; 12) Cobrir o esfregao com safranina por 30 segundos; 13) Lavar e secar; 14) Examinar ao microscpio (1000x).

4.0 Materiais e Equipamentos

4.1 Materiais Utilizados Soluo salina estril Corantes para a colorao de Gram: Cristal de violeta, lugol, lcool-cetona e safranina; gua Destilada; Lminas; Papel absorvente; Ala de Inoculao; Placas pr cultivadas com S. aureus (gar Manitol); Placas pr cultivadas com E. coli (gar MacConkey); leo de imerso 4.2 Equipamentos Bico de Bunsen; Microscpio ptico.

5.0 Resultados Em microscopia foi observado com nitidez s formaes caractersticas das espcies de bactrias analisadas: No passo de diferenciao pelo lcool, as clulas de E. coli perderam o complexo violeta de cristal-iodo (cor violeta escuro) e no passo seguinte adquiriram o corante safranina, ficando coradas de rosa (Gram Negativa).

E. coli imagem de internet

E. coli lmina de experimento do grupo (recorte)

O s Staphylococcus aureus, c o m f o r m a d e c o c o s , v i s t o s n o microscpio eram gram-positivos, apresentaram colorao roxa devida fixao do reagente primrio (Cristal Violeta).

S. aureus imagem de internet

S. aureus lmina de experimento do grupo (recorte)

6.0 Concluso A realizao de testes bsicos para identificao de bactrias, atravs do mtodo de colorao de Gram, permitiu concluir que existem diferenas significativas na composio da parede celular de bactrias Gram positivas e Gram negativas. O mecanismo de reao de Gram demonstra-se um mtodo eficiente de colorao diferencial, podendo-se, atravs dos resultados obtidos, diferenciar bactrias Gram positivas de Gram negativas, atuando como ferramenta auxiliar, na identificao de bactrias.

BIBLIOGRAFIA 1. MICHAEL J. PELCZAR JR. & E.C.S. CHAN & NOEL R.

KRIEG. Microbiologia: Conceitos eAplicaes - vol. 1. 2 Ed. 2. TORTORA, Gerard J., FUNKE, Berdell R. e CASE, Christine L. Roberta Marchiori Martins.Microbiologia. Porto Alegre: Artmed, 2005. 3. MERCK CHEMICALS Brazil. Disponvel em:http://www.merck-

chemicals.com.br/is-bin/intershop.enfinity/wfs/Merck-brSite/pt_BR/. Acessado em: 14 de setembro de 2013. 4. DE CARVALHO, Arthur Luis Alves Frazo(CRM/PE-16878). Site consultado: http://www.tuasaude.com/escherichia-coli/. Acessado em: 17/09/13. 5. Agencia Nacional de Vigilncia Sanitria. Site consultado: http://www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/microbiologia/mod_4_2 004.pdf. Acessado em: 16/09/13. 6. LOREDO, Paula (Biolga). Site consultado: http://www.brasilescola.com/biologia/staphylociccus-aureus.htm. Acessado em: 17/09/13