MARCO TEORICO La mayora de protocolos para extraccin de ARN estn basados en el mtodo descrito por Chomezynski y Sacchi (1),

el cual se basa en el aislamiento de este cido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenizacin de la muestra con el (los) reactivo (s) que contengan la solucin fenolisotiocianato, donde este ltimo se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las clulas y disuelve sus componentes, la adicin posterior de cloroformo separa la solucin en fase acuosa y orgnica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitacin el ARN. La metodologa que se va a utilizar en esta prctica, permite recuperar el ARN de la fase acuosa como ya se mencion, igualmente el ADN y las protenas pueden ser recuperados de la fase orgnica por precipitacin secuencia, as con etanol se logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitacin adicional pueden recuperarse las protenas de la fase orgnica. MATERIALES Y REACTIVOS Tubos Vacutainer con EDTA, heparina o citrato Reactivo TRIzol (Gibco Eppendorf estriles de 1.5 mL Micro pipetas Puntas estriles Centrfuga y micro centrfuga Guantes Agua desionizada estril Cloroformo Agua libre de RNasas Isopropanol Etanol al 75% en agua libre se RNAsas PREPARACIN DE REACTIVOS NaCl al 0.9%

-Agua libre de RNAsas 1mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC) 1L de agua destilada estril Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente). Esto debe hacerse en cabina de extraccin y con todas las medidas de bioseguridad conocidas. Autoclavar 2 veces y almacenar a temperatura ambiente - Etanol al 75% 100mL de agua libre de RNAsas Etanol grado biologa molecular Mezclar cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en un frasco estril hasta homogenizar completamente No autoclavar y almacenar a temperatura ambiente PROCEDIMIENTO TECNICA DE TRIzol PARA EXTRACCIN DE ARN 1. HOMOGENIZACIN - En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar el pellet de clulas blancas (obtenidas previo sometimiento de sangre total a gradiente de FicollHypaque para obtencin de PBL- leucocitos de sangre perifrica) con 1 mL de reactivo TRIzol. - Mezclar suavemente por pipeteo con micro pipeta 2. FASE DE SEPARACIN - Incubar la muestra homogenizada durante 5 minutos a temperatura ambiente, permitiendo as la completa disociacin de los complejos de nucleoprotenas - Adicional 200ul de cloroformo, tapar perfectamente el tubo - Agitar fuertemente durante 15 segundos - Incubar por 2 a 3 minutos a temperatura ambiente y en posicin vertical

- Centrifugar las muestras a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos preferiblemente a temperatura de 2 a 8C - Luego de centrifugar, la mezcla se separa en una fase inferior roja, fase de fenol cloroformo, en una interfase y en una fase incolora superior, la cual contiene exclusivamente el ARN 3. FASE DE PRECIPITACIN - Transferir la fase acuosa cuidadosamente a un tubo Eppendorf nuevo (aqu puede separarse igualmente la fase orgnica para posterior purificacin de ADN o protenas) Adicional 0.5 mL de isopropanol para precipitar el ARN de la fase acuosa - Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posicin vertical - Centrifugar a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a temperatura de 2 a 8C - El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugacin como un pellet parecido a un gel. 4. FASE DE LAVADO - Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo - Adicionar 1 mL de etanol al 75% al pellet para lavarlo - Mezclar por agitacin - Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2- 8 C - Eliminar cuidadosamente el sobrenadante 5. FASE DE DISOLUCIN - Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una toalla de papel estril - Adicionar 30ul de agua libre de RNAsas - Disolver el RNA por pipeteo suave, opcionalmente puede incubarse 10 minutos a 55-60C para lograr una completa disolucin