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Tcnicas de Purificao

Maria Alice Zarur Coelho Priscilla Filomena Fonseca Amaral Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos

Tcnicas de Purificao
Introduo
Meios de fermentao: - produtos extracelulares (solveis e insolveis), - produtos intracelulares, - fragmentos de clulas, - microrganismos intactos - substratos ou demais componentes no convertidos em produto. Diversidade: mtodos de separao passveis de utilizao muito vasto. suspenso diluda
processo de separao e/ou purificao

composto altamente purificado

Quatro etapas similares, que ocorrem seqencialmente: - remoo de material insolvel Separao - separao dos produtos - purificao Purificao - polimento (geralmente associado a cristalizao)

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Etapas de Recuperao
Separao Operaes Unitrias: - centrifugao Remoo de material insolvel - filtrao - adsoro, Separao de produtos - extrao com solvente Duas etapas vm sendo combinadas em um nico estgio; Nota-se um grande aumento da concentrao do produto nesta fase

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Separao Enzimas extracelulares: - Resfria-se o meio fermentado a 5C (estabilidade e evitar contaminao) - pH ajustado Fungos filamentosos: - centrifugao - ou filtrao (filtro-prensa/ filtro rotativo a vcuo) Leveduras e Bactrias: - prvia floculao (sulfato de alumnio, CaCl2) - centrifugao - ou filtrao (filtro-prensa/ filtro rotativo a vcuo)

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Separao Enzimas hidrolticas: centrifugao - bactrias gram-positivas tais como Bacillus subtilis (produtora da protease subtisilina) - bactrias gram-negativas como Klebsiella pneumoniae (produtora da pululanase): presena de membrana externa complicaes: liberao apenas parcial da enzima no meio.

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Extrao Enzima localizada na parte externa da membrana celular (mas no extracelular) Obteno de enzimas intracelulares: Tcnicas de lise celular: - mtodos fsicos, - mtodos qumicos, - mtodos enzimticos liberao da enzima: destruio parcial ou total da clula (exemplo: autlise das clulas a 50oC durante 14 horas).

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Extrao Mtodos enzimticos: - Utilizao de enzimas que catalisam a digesto de parede celular: Lisozima bactrias Glucanase, tripsina e protease leveduras - Pouco usado industrialmente: alto custo

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Extrao Mtodos enzimticos:
Tratamento prvio com EDTA

Ao da lisozima: hidrlise das ligaes glicosdicas beta 1,4 entre resduos do cido N-acetilmurmico (Mur2Ac) e N-Acetil-D-glucosamina (GlcNAc) num pepitdeoglicano

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Extrao Mtodos enzimticos: Glucanase, tripsina e protease leveduras

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Extrao Mtodos qumicos: - tratamentos com bases (NaOH) enzima tolerante a alto pH - choque osmtico (variao da concentrao de soluto presente no tampo): Extrato resultante com pouca contaminao Bactrias Gram-positivas: alta presso osmtica interna - tratamento com detergentes (Tween, laurilsulfato de sdio, triton) Agem sob condies de baixa fora inica, combinando as lipoprotenas da membrana para formar miclios - tratamento com solventes orgnicos (lcool isoproplico, etanol).

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Extrao Mtodos fsicos: - Congelamento / descongelamento: formao de cristais de gelo intracelulares Demorado Pode inativar enzima - Moagem com abrasivos: moinhos vibratrios com esferas de vidro largamente empregada Opera em batelada ou contnuo Necessita de sistema de resfriamento - Mixers ou liquidificadores: tecidos animais e vegetais

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Extrao Mtodos fsicos: - Cisalhamento lquido: passagem por pequenos orifcios sob alta presso - Sonicao: aparelhos de ultrassom altssimas frequncias ruptura das clulas por cavitao No muito aplicada em escala industrial

O extrato enzimtico contm muitos componentes celulares. Em particular, as clulas bacterianas lisadas liberam elevadas quantidades de cidos nucleicos.

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Extrao Extrao a partir de Tecidos Animais e Vegetais - Tecidos animais: similares s tcnicas empregadas em leveduras Homogeneizao do tecido selecionado em uma soluo tampo adequada a tcnica mais amplamente empregada. Segundo passo: se utiliza a centrifugao diferencial para selecionar a subfrao celular apropriada. - Tecidos vegetais: Foras necessrias so elevadas Presena de compostos fenlicos facilmente oxidados

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As caractersticas das etapas de um processo de purificao so, em grande parte, determinadas pela natureza do produto final e pela sua aplicao Existe necessidade para a purificao completa de uma enzima? Maioria das aplicaes: suficiente um menor grau de purificao ainda que existam algumas atividades contaminantes desde que no afetem substrato(s), produto(s) ou enzima(s) envolvido(s) em um processo especfico. Existem algumas aplicaes (na medicina clnica, rea farmacutica, anlises especficas, projeto de biosensores, engenharia gentica) onde essencial que a protenas contaminantes sejam reduzidas ou completamente eliminadas.

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Cuidados devem ser tomados para que ao passar de uma etapa a outra mnimas alteraes nas condies de estabilidade, pH, temperatura, etc. sejam promovidas. As enzimas so molculas de elevado peso molecular, cujas funes dependem de uma estrutura altamente ordenada. Tamanho, carga, hidrofobicidade, solubilidade e atividade biolgica so as principais caractersticas proteicas utilizadas na etapa de purificao das protenas

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Concentrao Precipitao - A solubilidade de uma protena o resultado de: interaes polares com o solvente aquoso, interaes inicas com os sais presentes, foras eletrostticas de atrao e repulso. - O desempenho do processo de precipitao depende tambm da composio da soluo, incluindo as propriedades das demais protenas presentes (coprecipitao). - Outros fatores determinantes na solubilidade das protenas: pH, temperatura e fora inica.

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Concentrao Precipitao Isoeltrica: - Ponto isoeltrico: pH no qual as protenas apresentam a carga lquida igual a zero. no ocorre migrao das molcula se submetidas a um campo eltrico. Abaixo do PI: forma catinica Acima do PI: forma aninica. - Quanto maior o carter inico: maior a tendncia solvatao.

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Concentrao Precipitao com sais inorgnicos: - Sais inorgnicos neutros (NaCl, (NH4)2SO4) que promovam a precipitao seletiva das protenas. - Efeito salting-out: dependente da hidrofobicidade das protenas. - Distribuio de grupos hidrofbicos e hidroflicos na superfcie da molcula de protena: afeta enormemente sua solubilidade frente a vrios solventes. Grupos hidrofbicos: papel importante no comportamento das molculas proteicas, devido carga e aos grupos polares que apresentam;

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Concentrao Precipitao com sais inorgnicos: - A fora inica mede a concentrao das cargas em soluo. Variao da fora inica (concentrao do sal) no meio. Solubilidade aumenta exponencialmente com a concentrao do sal, passa por um mximo e depois decresce.

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Concentrao Precipitao com sais inorgnicos: - Salting-in: foras de atrao entre os ons da protena e os ons do sal; ons do sal: muito hidratados - contribuem para o aumento da camada de hidratao da molcula, favorecendo o aumento da solubilidade. - Salting-out: Aumento da concentrao inica decrscimo na atividade da gua reduo das interaes entre a gua e os grupos polares das protenas Ptns mais susceptveis aglomerao

O fenmeno da salting out bastante aprecivel no ponto isoeltrico, onde a repulsividade eletrosttica passa por um mnimo.

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Concentrao Precipitao com sais inorgnicos: Sulfato de amnio: - barato e de fcil obteno; - no txico; - alta solubilidade mesmo em baixas temperaturas; - efeito estabilizante em algumas protenas, sendo normalmente utilizado no processo de armazenagem de enzimas comerciais; - alta concentrao deste sal previne ao proteoltica e bateriana, o que reduz as perdas de atividade enzimtica. OBS: a adio do sal deve ser lenta e sob agitao para favorecer a homogeneizao

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Concentrao Precipitao com solventes orgnicos: - A adio de solventes orgnicos (acetona e lcool): diminui a sua solubilidade. abaixamento da constante dieltrica da soluo, ou seja, diminuio da atividade da gua. - Constante dieltrica: medida da polaridade do solvente, ou seja, da capacidade que ele apresenta de se colocar entre dois ons de cargas opostas e separ-los, solvatando-os. Constante dieltrica da gua: muito elevada A gua separa os ons de carga oposta, solvatando-os, e mantendo a protena em soluo. O solvente j o faz com mais dificuldade, permitindo maior atrao entre as molculas proteicas.

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Concentrao Precipitao com solventes orgnicos: - Os solventes devem ser usados somente a baixas temperaturas (< 0 oC); - O uso de solventes tem diminudo nos ltimos anos; - Mais usados: metanol, etanol e acetona inflamveis; - Vantagem: recuperao do solvente para reutilizao.

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Concentrao Precipitao com polmeros: - Polietilenimidas e polietilenoglicis de diferentes pesos moleculares. - Mecanismo de precipitao: similar ao existente com solventes orgnicos e resulta da mudana na solvatao das molculas proteicas pela gua. - Acredita-se que as molculas de polmero ocupem o lugar das molculas proteicas na solvatao. - Muitas enzimas precipitam com concentraes de polmero variando entre 15 e 20%.

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Concentrao Ultrafiltrao: - Princpio: Uma membrana semipermevel permite a separao das molculas de solvente das molculas enzimticas grandes porque apenas as molculas pequenas podem penetrar na membrana quando a presso osmtica excedida. - O processo de ultrafiltrao empregado para concentrao, dessalinizao e fracionamento. - A fora motriz a diferena de presso entre os lados da membrana.

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Concentrao Ultrafiltrao: Vantagens do processo: - utiliza baixas presses hidrostticas; - no ocorre mudana de fase; - no utiliza reagentes qumicos; - mantm fora inica e pH da soluo concentrada; - evita desnaturao e inativao das enzimas. Desvantagens: - Concentrao por polarizao (acmulo de molculas grandes perto da superfcie da membrana), - Formao de camadas de gis na membrana (reduz-se atravs da manuteno de escoamento turbulento ou laminar com alta vazo) - fouling (deposio) na membrana (especialmente agentes anti-espumantes usados nas fermentaes ocasionam depsitos).

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Concentrao Ultrafiltrao: - Materiais: Acetato de celulose e polmeros orgnicos (polisulfonas e polipropileno) - Fluxo inversamente proporcional a resistncia. Como minimizar a resistncia? - Aumentando o tamanho dos poros (at o mximo) - Aumentando a quantidade de poros; - mnima expessura da membrana; - Mxima hidratao da membrana; - Mnima viscosidade da soluo;

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Concentrao Liofilizao: - Concentrao dos sais presentes na soluo inicial - Pode provocar perda na atividade enzimtica - Uma vez ativa em forma de p: mais estvel do que em soluo aquosa - Cuidado: no descongelar durante o processo

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Cromatografia A cromatografia pode ser considerada como uma separao diferencial dos componentes de uma amostra entre uma fase mvel e uma fase estacionria. Fase estacionria: partculas esfricas de um material insolvel empacotado em uma coluna; A mistura de enzimas introduzida na coluna pela fase mvel e forada a migrar atravs da coluna; As enzimas que possuem maior atrao pela fase estacionaria iro migrar de forma diferenciada das que tem maior afinidade pela fase estacionria.

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Cromatografia Cromatografia de gel-filtrao (permeao em gel, excluso por tamanho ou peneira molecular) - Para o fracionamento e purificao de protenas e aplicvel determinao de seus pesos moleculares. - Molculas so separadas de acordo com seu tamanho efetivo quando em soluo, utilizando matrizes (ou gis) com porosidade definida. Estabilidade, rigidez, tamanho de partcula, distribuio de poros e inrcia qumica so fatores que podem afetar o tamanho da coluna, a vazo a ser adotada e a eficincia de separao. - Definio: partio difusional das molculas de soluto entre a fase mvel, constituda pelo solvente, e a fase estacionria formada pelos poros do gel.

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Cromatografia Cromatografia de gel-filtrao - Gel: matriz tridimensional, aberta, formada por ligaes cruzadas, contendo poros de diferentes tamanhos que permitem o acesso de apenas algumas molculas. Ex.: matrizes formadas por ligaes cruzadas de dextranas (Sephadex): Molculas maiores: eludas mais rapidamente; Molculas menores: movem-se mais lentamente por terem um maior caminho a percorrer.

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Cromatografia Cromatografia de gel-filtrao -Escolha do gel: depende da finalidade - Separao de molculas maiores (enzima) de menores (sais): geis com poros pequenos - Separao de molculas de tamanho prximo: gis que fracionam vrias faixas de peso molecular - Parmetros crticos para a otimizao do processo de gel-filtrao: - volume da amostra; - concentrao da amostra; - vazo adotada; - altura do leito da coluna.

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Cromatografia Cromatografia de gel-filtrao - Vantagens: - no utilizao de energia, - foras cisalhantes desprezveis, - sistemas simples de automao - altas recuperao aliadas a mxima resoluo. - Desvantagens: - quantidade de amostra aplicada: mx 1-2% do volume total da coluna; - gis, Sephadex e Sepharose (agarose), tendem a empacotar; - problemas de diluio no processo de eluio da coluna.

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Cromatografia Cromatografia de gel-filtrao - Equipamento: coluna, detector de UV coletor de fraes Controle de fluxo (bomba peristltica) - Utilizada para etapas finais de purificao, mas pode ser usada na dessalinizao e na determinao de pesos moleculares.

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Cromatografia Cromatografia de Troca-inica - Fracionamento de substncias biolgicas que apresentem semelhanas em suas propriedades qumicas e fisico-qumicas, - Mtodo de fracionamento baseado na fixao de substncias carregadas a um suporte que contm uma carga oposta. A separao ocorre porque as interaes eletrostticas entre os grupos so reversveis e dependentes da afinidade de cada substncia pelo trocador. Esta afinidade funo do pH do meio, da temperatura, da fora inica, do tampo, etc.

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Cromatografia Cromatografia de Troca-inica - Suportes: trocadores inicos ou resinas, sendo normalmente empregados em colunas. As resinas so obtidas pela introduo de grupamentos polares em matrizes insolveis em gua. Ex.: Celulose, poliacrilamida, gis de dextrana e copolmeros de estireno e divinilbenzeno. - Classificao: Permutadores de ctions: grupamentos cidos (ativos em pH > pK) Permutadores de nions: grupamentos bsicos (ativos em pH < pK)

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Cromatografia Cromatografia de Troca-inica - Ativao do trocador catinico:
Trata-se a resina com um cido forte (HCl) lava-se com gua deionizada trata-se com uma base forte (NaOH) lava-se com gua deionizada tratamento com tampo cujo pH deve ser superior ao pK do grupamento trocador

Os trocadores catinicos assim tratados so considerados ativos na sua forma sdica, ou seja:
R-COOH Forma Inativa
NaOH

R-COO- Na+ Forma Ativa

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Cromatografia Cromatografia de Troca-inica - Ativao do trocador aninico:
trata-se com uma base forte (NaOH) lava-se com gua deionizada Trata-se a resina com um cido forte (HCl) lava-se com gua deionizada tratamento com tampo cujo pH deve ser inferior ao pK do grupamento trocador

Os trocadores catinicos assim tratados so considerados ativos na sua forma cloreto, ou seja:
R-COOH Forma Inativa
HCl

R-CO+ ClForma Ativa

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Cromatografia Cromatografia de Troca-inica - Caso uma soluo contendo um ction X+ for colocada em contato com um trocador catinico ativo, este deslocar o ction presente no trocador e ser fixado:
R-COO-Na+ + X+ R-COO- X+ + Na+

- Capacidade total de troca: funo do tipo de trocador. Importncia deste parmetro: se excedido, os ons no sero totalmente retidos. capacidade disponvel ou real de troca: capacidade de cada trocador em uma determinada condio experimental (pH, natureza do tampo, fora inica, etc.).

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Cromatografia Cromatografia de Troca-inica - Escolha do tipo de resina Protenas com cargas positivas e negativas: Carga funo do pH do meio, Fator principal: estabilidade da molcula nos diferentes pHs. Protenas labis: trocadores fracos - Trocador catinico (p.ex. CM-celulose), uma fora inica baixa e um pH = 5 so condies ideais para fixar as protenas. (pK tpico dos grupos carboximetlicos = 4) e a maioria das protenas se encontrariam positivamente carregadas (abaixo do seu ponto isoeltrico).

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Cromatografia Cromatoenfoque: - As protenas so eludas de uma coluna de troca inica utilizando-se um enfraquecedor - Efeito de enfoque: concentra a enzima de interesse - A coluna equilibrada com um tampo e, depois da aplicao da amostra, se utiliza um segundo tampo, enfraquecedor de pH (para a eluio). - Gerao de um gradiente linear de pH in situ como conseqncia da capacidade enfraquecedora da resina. - Este gradiente de pH tem efeito de enfoque e as molculas com o ponto isoeltrico especfico se concentram conjuntamente.

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Cromatografia Cromatografia de adsoro: - Os componentes da amostra sero retidos ou no sobre a superfcie da fase estacionria por foras do tipo van der Waals, ligaes hidrognio ou interaes eletrostticas. - O deslocamento das partculas adsorvidas ser funo da maior ou menor interao destas com a fase estacionria.

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Cromatografia Cromatografia de afinidade: - Cromatografia de adsoro onde o suporte apresenta afinidade especfica com a substncia a ser isolada. - capaz de fornecer um alto grau de purificao. - Acopla-se covalentemente uma molcula ligante apropriada a uma matriz insolvel. - A molcula ligante adsorve da soluo a substncia a ser isolada, sendo eliminadas as que no apresentam nenhuma afinidade com o suporte. - Dessoro: mudanas nas condies experimentais ([substrato] , coenzimas). - Isolamento de substncias de acordo com sua funo biolgica

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Cromatografia Interao hidrofbica: - Observou-se: protenas so retidas nos gis de afinidade contendo braos de hidrocarbonetos (C2 a C10). - As interaes hidrofbicas so mais fortes em alta fora inica sendo, portanto, convenientemente utilizadas aps a precipitao com sais ou cromatografia de troca inica. - A eluio pode ser efetuada alterando o pH do solvente, a fora inica ou usando um modificador orgnico (como etilenoglicol).

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Cromatografia Eletroforese: - Existncia de grupos ionizveis nas molculas biolgicas - Quando em soluo podem existir como espcies eletricamente carregadas. - A taxa de migrao destas partculas, quando submetidas a um campo eltrico, proporcional a fora do campo e a carga efetiva das partculas e inversamente proporcional ao atrito, dependo da sua forma e tamanho.

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Cromatografia Eletroforese: - Papel: simples e mais usado Em alguns casos, no se obtm uma boa separao. - Em gel: amido, agarose e poliacrilamida Utilizao de outros fatores como a difuso e a separao por peneiramento molecular, alm do campo eltrico. Mais conhecida: SDS-poliacrilamida usada na determinao de peso molecular e da pureza da amostra.

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Cromatografia Eletroforese: - Sdio dodecilsulfato (SDS): detergente aninico que se liga fortemente as protenas causando sua desnaturao e fornecendo uma carga negativa constante por unidade de massa. - Os complexos SDS-protena: movem-se para o anodo durante a eletroforese. - Propriedades de peneira molecular do gel: mobilidades so inversamente proporcionais ao logaritmo de seus pesos moleculares. - Protenas padro de peso molecular conhecido so aplicadas: o peso molecular das amostras proteicas pode ser determinado. - Relevao do gel: Comassie Brilliant Blue, Bromofenol ZnSO4 cido actico ou Nitrato de prata.

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Cromatografia Gis bidimensionais: - Amostras so parcialmente separadas por diferenas entre pontos isoeltricos, usando uma coluna cilndrica. - O anodo possui um pH menor que o catodo e um gradiente estvel de pH mantido. - Protenas abaixo do seu pI: carregadas negativamente e migraro para o catodo, at uma regio onde o pH corresponda a seu pI, cessando o movimento de migrao. Oposto: protenas acima do seu pI. - Esta tcnica conhecida como enfoque isoeltrico.

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Cromatografia Gis bidimensionais: - Aps separao parcial: eletroforese em SDS no sentido perpendicular primeira separao - separao baseada nas diferenas de peso molecular.

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