TEMA 4: LAS ENZIMAS CONTENIDO

TEMA 4: LAS ENZIMAS 1. CONCEPTO Y ESTRUCTURA. 2. ESPECIFICIDAD Y MECANISMO DE ACCIN. Especificidad de sustrato. Factores que contribuyen a la actividad cataltica 3. CINTICA DE LAS REACCIONES ENZIMTICAS. ECUACIN DE MICHAELISMENTEN. 4. FACTORES QUE MODIFICAN LA ACTIVIDAD ENZIMTICA. Efecto del pH y de la Temperatura sobre la actividad enzimtica. Inhibicin de las enzimas: reversible (competitiva acompetitiva y no competitiva) e irreversible. Enzimas reguladoras. Cooperatividad.

1. Concepto y estructura Son molculas de naturaleza proteica especializadas en la catlisis de las reacciones biolgicas. Son biocatalizadores. Para que las reacciones bioqumicas que se dan en los seres vivos se produzcan en el laboratorio se precisan condiciones de alta temperatura u otras condiciones que aporten la energa necesaria para dichas reacciones. Pero esa elevacin de la temperatura resultara muy perjudicial para los seres vivos. Las enzimas salvan ese obstculo y actan como catalizadores mucho ms eficaces que los catalizadores hechos por el hombre. Todas las enzimas conocidas son protenas de gran difusibilidad en los medios lquidos del organismo. La mayora son solubles en agua. Atendiendo a la composicin se distinguen 2 tipos de enzimas: *Holoprotenas: cuya molcula est constituida solamente por secuencias de aminocidos. Poco frecuentes. Ej.: la ribonucleasa y la lisozima. *Heteroprotenas: cuya molcula est formada por 2 componentes: 1) Uno de naturaleza proteica, llamado apoenzima. Los aminocidos que forman la apoenzima pueden clasificarse en diversos grupos: .No esenciales: no participan directa ni indirectamente en el proceso cataltico, de forma que pueden ser eliminados de la cadena polipeptdica sin que se pierda la actividad enzimtica. .Estructurales: que mantienen la estructura terciaria de la protena enzimtica. No intervienen directamente en la catlisis, pero s indirectamente, pues determinan la posicin del centro activo de la molcula. .De unin o fijacin: que sujetan la apoenzima al sustrato y orientan la molcula de ste de tal manera que aproximan la parte que ha de ser atacada por la enzima al sitio cataltico de sta. .Catalticos: responsables directos de la actividad enzimtica, que forman el sitio cataltico. Los aminocidos de fijacin y los catalticos forman el centro activo de la apoenzima, que ocupa una pequea parte de la molcula de la apoenzima.

2) Otro no proteico (grupo prosttico), llamado cofactor. El cofactor puede ser un in metlico, o bien una molcula orgnica de bajo peso molecular llamada coenzima. Actualmente se sabe que las coenzimas desarrollan su actividad enzimtica cumpliendo alguna o algunas de las siguientes funciones: .Colaborar en el acoplamiento del sustrato al centro activo de la apoenzima. .Servir como sitio adicional de fijacin del sustrato. .Participar directamente en el mecanismo cataltico, actuando de forma anloga a los aminocidos catalticos del centro activo de la apoenzima. El conjunto (apoenzima + cofactor), catalticamente activo, se denomina holoenzima. La apoenzima separada del cofactor es catalticamente inactiva.

Adems de los glcidos, lpidos, protenas y cidos nucleicos, las clulas vivas contienen tambin unas sustancias orgnicas que actan en cantidades mnimas y que denominamos vitaminas. La importancia de estas sustancias se manifest al comprobar que algunos organismos no las pueden sintetizar y deben adquirirlas, por tanto, por va exgena. Las vitaminas -que, para su estudio, suelen clasificarse en dos grandes grupos: liposolubles e hidrosolubles-, son componentes esenciales de las coenzimas.
En la siguiente tabla aparecen las principales vitaminas, las coenzimas de las que forman parte y las reacciones metablicas especficas catalizadas por las enzimas correspondientes.

2. Especificidad y mecanismo de accin Una reaccin qumica A===>B tiene lugar porque cierto nmero de molculas A se encuentran con la suficiente energa como para alcanzar un estado activado, que denominamos estado de transicin, en el que es muy probable que se establezca o se rompa algn enlace qumico y se forme entonces el producto P.

La velocidad de una reaccin ser proporcional a la concentracin de molculas en ese estado de transicin. Por eso hay 2 mtodos generales mediante los cuales se puede acelerar la velocidad de una reaccin qumica: -Elevar la temperatura: pues se incrementa el n1 de molculas capaces de alcanzar el estado de transicin (en muchas reacciones qumicas la velocidad se duplica cada 10 1C de aumento de la T). -Aadir un catalizador: que se combina con los reaccionantes de forma transitoria y produce un estado de transicin con menor energa de activacin. (Nota: la energa libre de activacin es la diferencia entre la energa libre -G- de 1 mol de sustancia en el estado de transicin y la de 1 mol de sustancia en el estado inicial). Energa libre de activacin (G) calculada para La descomposicin de perxido de hidrgeno a 20 C. La catalasa acelera la v de la reaccin ms de 108 veces. Condiciones log G(Kcal/mol) Sin catalizar 18 Catalizada con Pt coloidal 13 Catalizada por catalasa 7

Las enzimas aceleran la v de las reacciones por el segundo sistema. Actan como catalizadores al disminuir la energa de activacin de las sustancias reaccionantes.

En toda reaccin enzimtica intervienen dos elementos: por una parte, la enzima; por otra, el sustrato (sustancia o sustancias que, mediante una reaccin catalizada por la enzima, se transformar en otro producto o productos). Cuando se forman los productos de la reaccin se regenera el catalizador libre.

a) Especificidad de sustrato de las enzimas Una de las propiedades ms notables de las enzimas es su especificidad de accin, por la que actan slo sobre determinados sustratos y producen slo un tipo de reaccin (sin reacciones colaterales). Si en una reaccin de laboratorio el rendimiento fuese de un 90%, podramos darnos por satisfechos. Pero si esa reaccin fuese el paso de una secuencia de 10 etapas, cada una de las cuales tuviese un rendimiento del 90%, en el producto final slo recuperaramos 1/3 del producto inicial. De no ser por la especificidad de las enzimas, las clulas quedaran rpidamente inmersas en un conjunto de reacciones laterales y productos secundarios. Emil Fisher descubri que las enzimas que hidrolizaban glucsidos eran capaces de distinguir entre formas estereoismeras de stos. En 1894 enunci el principio de que la molcula del sustrato se adapta al centro activo de la enzima del mismo modo que lo haran una llave y una cerradura, es decir, que tienen una relacin complementaria. El centro activo es el lugar de la enzima que se adapta exactamente a la estructura molecular del sustrato y acta sobre ste para dar lugar al producto. La estructura del centro activo explica la especificidad de accin de las enzimas.

No obstante, los datos actuales sobre la estructura de las enzimas han llevado a modificar el modelo clsico de la llave y su cerradura para explicar la especificidad de la reaccin enzimtica. Actualmente se considera que esa esfecificidad radica en la naturaleza de los aminocidos de fijacin del centro activo. Realizada esa fijacin o anclaje, la enzima puede modificar su forma y amoldarse parcialmente sobre el sustrato, de forma que el centro cataltico quede correctamente situado para actuar. Entonces no existira como en la

llave y la cerradura una adaptacin predeterminada, sino una adaptacin inducida por los aminocidos de fijacin.

Adems el grado de especificidad puede ser muy variado. As, la aspartato-amoniaco-liasa, tambin conocida por aspartasa, tiene una especificidad de sustrato casi absoluta. Adems presenta una estereoespecificidad estricta (es incapaz de desaminar el D-aspartato).

Otra enzima estereoespecfica es la lactato deshidrogenasa (slo trabaja con Llactato). En cambio, la fosfatasa alcalina hidroliza muchos steres diferentes del cido fosfrico. Y la carboxipeptidasa cataliza la hidrlisis del enlace peptdico C-terminal, cualquiera que sea la longitud de la cadena o el resto aminocido C-terminal. En general, la especificidad del sustrato sobre el que actan las enzimas se debe a dos rasgos estructurales del sustrato: 1) Un enlace qumico susceptible de ser atacado por la enzima. 2) Otra caracterstica estructural necesaria para efectuar su unin al centro activo de la enzima. Dicha estructura se denomina grupo determinante de la posicin. b) Factores que contribuyen a la actividad cataltica de las enzimas Hemos dicho que las enzimas incrementan de forma considerable la velocidad de las reacciones que catalizan. Son 4 los factores que parecen contribuir al gran incremento de velocidad producido por las enzimas: *Proximidad y orientacin del sustrato. La enzima puede fijar la molcula de sustrato de modo que el enlace susceptible se halle: -prximo al grupo cataltico

-bien orientado respecto al grupo cataltico. Esa proximidad y orientacin adecuadas del sustrato respecto al grupo cataltico permiten que se alcance con facilidad el estado de transicin y se incremente de forma considerable (en el caso ms espectacular hasta 53.000 veces) la velocidad de reaccin.

*Catlisis covalente. Algunas enzimas se combinan con el sustrato para formar un intermediario covalente que reacciona con ms facilidad para formar los productos. Este compuesto se forma y se destruye rpidamente. *Catlisis cido-base. Al proporcionar grupos funcionales capaces de actuar como dadores o aceptores de protones, la enzima puede efectuar una catlisis general cida o bsica. La catlisis cido-base especfica es la debida al incremento o disminucin del pH. En la catlisis cido-base general el catalizador acta como aceptor o dador de protones. La catlisis cido-base general proporciona un medio para efectuar la catlisis a pH neutro (en el que las concentraciones de H+ y de OH- son muy bajas) de reacciones qumicas que de otro modo necesitaran concentraciones muy elevadas de esos iones. *Factor de tensin de la catlisis enzimtica. La enzima puede inducir una tensin o una distorsin en el enlace susceptible de la molcula de sustrato, que determine que la ruptura del enlace sea ms fcil.

3. Cintica de las reacciones catalizadas por enzimas. Ecuacin de Michaelis-Menten En las reacciones enzimticas se da un efecto ausente en las no enzimticas: la saturacin con el sustrato.

A partir de la saturacin la reaccin es esencialmente de orden cero respecto al sustrato (es decir, se mantiene con un v constante). -d[A] reacc. qumica de 1er. orden: A ===> P ------- = K[A] dt -d[A] reacc. qumica de 21 orden: A + B ===> P ------- = K[A][B] dt reacc. qumica de 3er. orden: son raras. Teora de Michaelis y Menten:

Luego: La constante de Michaelis-Menten KM es igual a la concentracin de sustrato en la que la velocidad inicial de la reaccin es la mitad de la velocidad mxima. Conviene recordar que la KM no es un valor fijo para cada enzima, sino que puede variar con: -la estructura del sustrato -el pH -la temperatura *Transformaciones de la ecuacin de Michaelis-Menten

4.Factores que modifican la actividad enzimtica a) Efecto del pH sobre la actividad enzimtica

La mayora de las enzimas tienen un pH caracterstico al cual su actividad es mxima; por encima o por debajo de ese pH la actividad disminuye. En muchos casos los perfiles de actividad de las enzimas en funcin del pH son acampanados. En otros casos no. La relacin del pH con la actividad de la enzima depende del comportamiento cido-base de la misma, as como de otros factores difciles de analizar de forma cuantitativa. El pH ptim o de una enzima no es necesariamente idntico al pH de su entorno intracelular normal, el cual puede hallarse a su vez en la pendiente ascendente o descendente de la curva. Por eso la relacin pHactividad de una enzima puede constituir un factor en el control intracelular de su actividad.

b) Efecto de la temperatura sobre las reacciones enzimticas Al igual que sucede con la mayora de las reacciones qumicas, las reacciones enzimticas incrementan su velocidad con la temperatura. La velocidad de muchas reacciones enzimticas se duplica, aproximadamente por cada 10 1C de aumento de la temperatura. El pico de la grfica al representar la actividad cataltica respecto a la temperatura se debe a que las enzimas, al ser protenas, se desnaturalizan por accin del calor y se inactivan a partir de cierto punto. Luego la aparente temperatura "ptima" viene determinada por estos dos procesos: 1) El incremento habitual de la velocidad de la reaccin con la temperatura. 2) El incremento en la desnaturalizacin trmica de la enzima al sobrepasar una temperatura crtica. A partir de los 5560 1C la mayor parte de las enzimas se inactivan. Sin embargo, las enzimas de bacterias termoflicassiguen siendo activas a temperaturas superiores a los 85 1C. La ribonucleasa como vimos en el tema de protenasrecupera rpidamente su conformacin y su actividad por enfriamiento. c) Inhibicin de las enzimas

La inhibicin de algunas enzimas por metabolitos especficos constituye un elemento importante en la regulacin del metabolismo intermediario. Los tres tipos principales de inhibicin reversible de las enzimas son: competitiva, acompetitiva y no competitiva. Se estudian experimentalmente por los efectos que produce el inhibidor en la cintica de reaccin de la enzima. *Inhibicin competitiva: el inhibidor puede combinarse con la enzima libre de tal modo que compite con el sustrato normal para unirse al centro activo. Un inhibidor competitivo reacciona reversiblemente con la enzima para formar un complejo enzima-inhibidor (E-I) anlogo al complejo enzima sustato: E+I

<=====> EI

La vmx de la reaccin catalizada por la enzima no variar en presencia del inhibidor competitivo (lgicamente, cuando la [S] sea muy elevada, apenas habr ocasin de que se una la E con una molcula de I). En cambio la Km aparente del sustrato aumentar en presencia del inhibidor (es decir, ser precisa una [S] superior para alcanzar 1/2 vmx). Por lo tanto, en la cintica se refleja como una disminucin de la afinidad de E por S.

Un ejemplo clsico de inhibicin competitiva es la succinato deshidrogenasa por el malonato y por otros aniones dicarboxilato.

la

de

*Inhibicin acompetitiva: aqu el inhibidor no se combina con la enzima libre. Sin embargo se combina con el complejo enzima-sustrato-inhibidor (E-S-I), el cual no se transforma en el producto habitual de la reaccin: ES + I

<===> ESI

La presencia del inhibidor hace que disminuya la Km aparente en la misma proporcin que la vmx (como el I se une al complejo ES, su presencia se manifiesta tambin a elevadas [S], por lo que disminuye vmx). La Km aparente disminuye (lo cual quiere decir que la [S] precisa para alcanzar 1/2 vmx ser menor). No es que haya aumentado la afinidad de E por S: en realidad se mantiene igual, pero como la vmx ha disminuido, se precisar menor [S] para alcanzar 1/2 vmx y por eso la Km disminuye -y la afinidad aumenta"aparentemente". La inhibicin acompetitiva es poco frecuente en las reacciones de un solo sustrato, pero es corriente en las reacciones de dos sustratos. *Inhibicin no competitiva: el inhibidor no competitivo puede combinarse con la enzima libre (E) o con el complejo enzima sustrato (ES), e interfiere en la accin de ambos:

<===> EI ES + I <===> ESI

E+I

La presencia del inhibidor hace que decrezca la vmx (es decir, no puede ser compensada su presencia por elevadas [S]) pero la Km aparente no vara (o sea, que a la misma [S] se alcanza la 1/2 vmx correspondiente a la presencia del inhibidor). En realidad la afinidad de E por S s ha disminuido realmente (aunque no "aparentemente"). Algunas enzimas (no todas) que poseen un grupo -SH esencial, son inhibidas no competitivamente por iones de metales pesados (la enzima requiere esos grupos SH intactos para su actividad normal). El agente quelante EDTA (tetra-acetato de etilendiamida) se une reversiblemente al Mg2+ y a otros cationes divalentes, e inhibe as de modo no competitivo a algunas enzimas que precisan esos iones para su actividad. *Inhibicin irreversible: no puede ser tratada por los principios de MichaelisMenten. d) Enzimas reguladoras Son aquellas que desarrollan su actividad en reacciones "estratgicas" del metabolismo. Pueden ser de 2 tipos:

1) Enzimas alostricas: cuya actividad cataltica es modulada por la unin no-covalente de un metabolito especfico a un centro de la protena distinto del centro cataltico. 2) Enzimas moduladas covalentemente. Estudiaremos las primeras: Las enzimas alostricas poseen, adems del centro cataltico, otro espacio al que se enlaza de modo reversible y no covalente el efector o modulador. En general, el centro alostrico es tan especfico para la unin del modulador como el centro cataltico (o centro activo) lo es para la unin del sustrato. Los moduladores pueden aumentar la actividad enzimtica y llamarse moduladores activos o estimuladores. Tambin hay moduladores negativos o inhibidores, que actan dificultando la actividad enzimtica (es el caso de la inhibicin por el producto final, inhibicin feed-back o retroinhibicin).

e) Cooperatividad Las enzimas alostricas no muestran generalmente la clsica relacin cintica de Michaelis-Menten entre [S], vmx y Km. Y muchas presentan una grfica sigmoidea en vez de hiperblica cuando se representa la velocidad en funcin de la [S]. Esto es un ejemplo de cooperatividad positiva (la unin de una molcula de sustrato a un centro incrementa la unin de las molculas de sustrato a los dems centros). Conviene aclarar que no todas las enzimas alostricas exhiben curvas sigmoidales al representar v0 frente a [S]; adems, no todas las enzimas que muestran tales curvas son necesariamente alostricas. Otras enzimas presentan cooperatividad negativa: la unin de una molcula de sustrato provoca un descenso en la unin de molculas de sustrato subsiguientes.