Universidad Andrs Bello -UNAB Departamento de Morfologa Laboratorio Embriologa Humana Carrera de Odontologa - Sede Via del Mar

GUA 1 LABORATORIO MICROSCOPIO PTICO REPRODUCTIVOS PROF: VCTOR MOYA S OBJETIVOS.

DE EMBRIOLOGA HUMANA: USO DEL APLICADO AL ESTUDIO DE TEJIDOS

Conocer los componentes del microscopio ptico y describir algunas de sus propiedades Aplicar correctamente las normas de uso del microscopio al estudio de muestras histolgicas. Reconocer y dibujar diversas estructuras asociadas a testculo de mamferos. Reconocer la estructura del tbulo seminfero y el espacio intersticial, as como tambin identificar las distintas clulas de la lnea germinal y las clulas de Leydig

REQUISITOS DE ENTRADA A LABORATORIO. Se realizar una prueba de entrada que evaluar parcialmente los objetivos 1 y 2, planteados previamente, para ello Ud. deber conocer desde una perspectiva terica lo siguiente:

Componentes del microscopio ptico de campo claro (de luz) Las principales propiedades pticas del microscopio: poder de aumento, amplitud de campo, distancia de trabajo y poder de resolucin. Las normas sobre el correcto de uso del microscopio ptico. Las normas sobre el funcionamiento de laboratorios y seminarios contenidas en el Anexo de Programa de Embriologa (BIO 024)

Prof. Vctor Moya S. M. Cs. Biol.

INTRODUCCIN El tamao de una clula eucarionte oscila entre 10 y 100 m., sin embargo el ojo humano puede resolver objetos de hasta 0,2 mm. (200 m.). De tal forma que para estudiar la clula y los diversos tejidos se deber emplear algn instrumento que permita aumentar esta y otras capacidades asociadas a nuestra percepcin visual (ver Figura 1).

En los laboratorios de Embriologa Humana Ud. estudiar diversas muestras histolgicas, relacionadas con las unidades temticas del curso y para ello deber emplear adecuadamente instrumentos pticos tales como: el microscopio ptico y la lupa estereoscpica. Por lo antes expuesto ser necesario que Ud. conozca las caractersticas estructurales y pticas del microscopio ptico (Ver Figura 2), as como su correcto uso.

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EL MICROSCOPIO PTICO (M.O). Los componentes del M.O. de campo claro los podemos clasificar en: sistema mecnico y sistema de iluminacin. Mientras que sus caractersticas o propiedades pticas podrn ser estudiadas como poderes del microscopio SISTEMA MECANICO a) Pie o base de sustentacin: puede ser de diferentes formas. b) Columna: articula con la base y sostiene al condensador, platina y tubo. Este ltimo lleva todo el sistemas de lentes es decir, oculares y revlver con los objetivos y mide 160 mm. c) Platina: es una plataforma horizontal con un orificio central por donde pasan los rayos luminosos. En ella se coloca la preparacin que se afirma mediante el carro vernier. d) Revlver o portaobjetivos: es un mecanismo situado en el extremo inferior del tubo. Por simple rotacin permite el cambio de las lentes objetivos. e) Tornillos de enfoque: son el macromtrico y el micromtrico. El primero permite el enfoque aproximado con el uso del lente objetivos de 10x y el segundo precisa el enfoque al utilizar lentes objetivos de mayor aumento. SISTEMA DE ILUMINACION a) La fuente de iluminacin es artificial, consiste en una ampolleta ubicada en la base del instrumento. La intensidad de la luz es controlada con una perilla conocida como potencimetro. b) Condensador: es un dispositivo formado por un sistema de lentes que concentra la luz en el orificio de la platina. c) Lente adicional en el condensador: se maneja moviendo hacia la izquierda la palanca ubicada bajo la platina. Esta lente se usa con el lente objetivo 3.2x, tambin llamado lupa. d) Diafragma: es un dispositivo anexado al condensador que sirve para regular la cantidad de luz que llega a la preparacin. e) Filtro: vidrio de color que se usa para obtener luz monocromtica (selecciona una sola longitud de onda) Unidades ms empleadas en microscopa

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SISTEMA OPTICO a) Lentes objetivos: sistema de lentes ubicado al extremo del revlver. Su cantidad puede ser variable. La calidad de los objetivos es determinante para la calidad de la imagen y sta no puede ser mejorada con los otros elementos del microscopio. Los objetivos estn marcados con nmeros que indican caractersticas esenciales. Por ejemplo en un lente Zeiss se hallan las siguientes indicaciones: Entre los lentes objetivos se encuentran el de 100x, llamado lente de inmersin. Cuando se utiliza se interpone entre la preparacin y el lente una sustancia cuyo ndice de refraccin sea lo ms aproximado posible al vidrio. b) Lentes oculares: estn ubicados en la parte superior del tubo del microscopio y su finalidad es aumentar la imagen producida por el objetivo. El aumento total (AT) es igual al producto del aumento del objetivo (AOb) por el del ocular (AOc) Ej. Objetivo de 40x Ocular de 10x Aumento total = 400x PODERES DEL MICROSCOPIO a) Poder de aumento: Es la razn existente entre el tamao de la imagen que el microscopio produce y el tamao del objeto observado. b) Poder de resolucin: Es la capacidad del instrumento para dar imgenes distintas de puntos situados muy cerca uno del otro en el objeto. Depende de la longitud de onda (lambda=) y de la apertura numrica del objetivo ( AN). El lmite de resolucin, que se define como la distancia mnima que debe existir entre dos puntos para que puedan ser discriminados como tales, es: Siendo la apertura numrica AN = n x seno n: ndice de refraccin del medio existente entre el objetivo y la preparacin Seno : seno de la mitad del ngulo de apertura

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Al iluminar la preparacin la luz emerge de todos los puntos del objeto en todas direcciones, por lo tanto se forma un cono de luz que penetra a travs del lente objetivo. Se llama ngulo de apertura al tamao de este cono y se llama alfa a la mitad de este ngulo. Cada lente objetivo tiene su propia apertura numrica que indica el poder de resolucin del objetivo y a mayor apertura numrica, mayor poder de resolucin del lente. A su vez el ngulo de apertura vara con la distancia de trabajo, que es la distancia existente entre el objeto enfocado y la lente del objetivo. Por lo tanto a mayor distancia de trabajo, menor ngulo de apertura, menor apertura numrica, menor poder de resolucin. Es importante recordar que el lmite de resolucin es la inversa del poder resolutivo, de manera que cuanto mayor sea ste, menor ser el lmite de resolucin. Puesto que el seno de alfa no puede exceder de 1, y que el ndice de refraccin de los mejores materiales pticos no puede ser superior a 1.6 usando aceite de inmersin, la mxima AN de las lentes es de alrededor de 1.4. AN = 1.6 x 1 AN = 1.4m x apertura numrica Con estos parmetros es fcil calcular a partir de la frmula de lmite de resolucin del microscopio que ste no excede de los 170 nm cuando se usa luz de longitud de onda de 400nm (luz ultravioleta)

Con luz blanca, el lmite de resolucin es de 250 nm c) Poder de definicin: Es la capacidad del microscopio de dar imgenes ntidas, de contornos precisos. d) Poder de penetracin: Es la cualidad de las lentes que permite averiguar hasta qu lmites podemos reconocer detalles de estructuras situadas a diferentes niveles de preparacin. Si con lente de 10x se enfocan dos estructuras que estn superpuestas, al pasar a 40x podr enfocarse una de ellas y slo con nuevo ajuste del micromtrico podr enfocarse la otra, por lo tanto al pasar a los aumentos mayores se pierde penetracin.

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NORMAS BSICAS SOBRE USO DEL MICROSCOPIO El microscopio debe estar siempre al centro del mesn de trabajo Si necesita limpiar un lente, avise al (a la) profesor(a) de laboratorio para que le proporcione el papel y la solucin adecuada. La mantencin del microscopio es su responsabilidad por lo que si al inicio encuentra algn desperfecto avise de inmediato al (a la) profesor(a) de laboratorio Antes de comenzar el microscopio debe encontrarse en posicin de descanso, lo que implica: Luz apagada y el nivel de intensidad lumnica al mnimo Cable desenchufado, platina abajo y objetivo de menor aumento en la mira. Para comenzar: Enchufe el cable del microscopio la toma de corriente Encienda la luz del microscopio, abra el diafragma y fije la intensidad lumnica a la mitad. Con la platina abajo coloque la muestra sobre la platina y asegrela con la pinza de sujecin. La muestra debe quedar con el cubreobjeto hacia arriba. Con el objetivo de menor aumento recorra la preparacin e identifique la estructura que se le indique. Si es necesario mueva el diafragma para regular el paso de luz a la muestra. Una vez encontrada la estructura de inters cambie al objetivo de deseado, para enfocar emple solo el tornillo micromtrico. Al enfocar con el objetivo de 40X enfoque con cuidado para evitar romper la muestra (si rompe la muestra recuerde que deber cancelar una suma de $8.000. (En este laboratorio no empleara el objetivo de mayor aumento) Para terminar o cambiar la muestra: Pase nuevamente al objetivo de menor aumento. Baje la platina y retire la muestra cuidadosamente Si termin de observar muestras, deje nuevamente el microscopio en la posicin de descanso. ETAPAS BASICAS EN LA ELABORACION DE UNA PREPARACION HISTOLGICA 1) FIJACIN: es esencialmente un mtodo para la preservacin de la morfologa y la composicin qumica de la clula. Consiste en la muerte de sta, de manera que las estructuras que posee en estado viviente se conserven con un mnimo de variaciones. 2) INCLUSION: se incluye el tejido en un material que le confiera la consistencia adecuada para el corte, por ejemplo la parafina 3) CORTE: en el caso de la preparacin de muestras para microscopa ptica los cortes se practican con un instrumento llamado micrtomo, el cual es capaz de entregar cortes muy finos. 4) TINCION: se utilizan diferentes colorantes de acuerdo al tipo de tejido que se desee teir; un ejemplo tpico es la hematoxilina-eosina.

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ACTIVIDADES DE REPRODUCTIVOS

LABORATORIO:

RECONOCIMIENTO

DE

TEJIDOS

FORMATO GENERAL PARA EL DIBUJO Y RECONOCIMIENTO DE MUESTRAS. Cada vez que observe y dibuje una muestra en su cuaderno de croquis, debe hacerlo al interior de un crculo que representara el campo observado e indicar lo siguiente: nombre de la muestra, aumento total empleado, tipo de corte y si es posible la tincin empleada. Dentro del campo observado, debe sealar las estructuras que se le solicite reconocer haciendo uso de flechas, llaves o crculos los cuales deben estar claramente rotulados.

Siga atentamente las instrucciones del (de la) profesor(a) de laboratorio, y desarrolle las siguientes actividades. En la muestra de testculo de roedor, Ud deber: Reconocer los tbulos seminferos, indicando el tipo de corte Diferenciar las distintas clulas de la lnea germinal en base a su localizacin y aspecto del ncleo y/o caractersticas especiales como presencia o ausencia de flagelo (identificar, espermatogonias, espermatocitos, espermtidas y espermatozoides) Si es posible reconocer los ncleos de las clulas de Sertoli basndose en su aspecto y ubicacin en las paredes de los tbulos seminferos. Identificar el espacio intersticial y reconocer las clulas de Leydig Si observa estructuras como fibras de colgeno en el intesticio (espacio intersticial) compartimiento peritubular indquelo en su dibujo

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