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Blgo. M.Sc Omar Cceres R. Laboratorio de Biotecnologa y Biologa Molecular Instituto Nacional de Salud
M. Marcador 100pb 1. Paciente 1 Aspirado gstrico 2. Control inhibicin paciente 1 3. Paciente 2 LCR 4. Control inhibicin paciente 2 5. Paciente 3 Liquido ascitico 6. Control inhibicin paciente 3 7. Control Negativo 8. Control Positivo H37rv
M. Marcador 100pb 1. M. avium 2. M. fortuitum 3. M. chelonae 4. Humano 5. Paciente 6. Control Positivo H37rv
Genotipificacion de M. tuberculosis
Genotipificacin:
)
Tcnica de genotipificacin para MTb descrita por primera vez en 1993 Basada en las variaciones generadas por el elemento de insercin IS6110 (Transposicin) La variacin de las cepas esta basada en el numero de copias del IS6110 y en la posicin donde se inserta en el ADN bacterial
Brote Epidmico
Tcnica de Genotipificacin basada en PCR descrita por primera vez en 1997, identifica y tipifica a MTB en un solo paso Explota la variacin que existe en el locus DR de MTB (exclusiva de esta bacteria) El locus DR (Direct Repeat) es una regin cromosmica que consiste de regiones repetidas de 36 nucletidos muy conservados Cada DR esta separado por secuencias espaciadoras no repetitivas de 34 a 41pb
Las cepas varan en el numero de DRs y en la presencia o ausencia de los espaciadores particulares La tcnica utiliza 43 diferentes espaciadores para identificar los diferentes genotipos de MTB
Spoligotyping de 35 MTb (aislamientos clnicos) y 5 M. bovis. Presencia de seal indica la presencia del espaciador
MIRU-VNTR fingerprinting
VNTR (Variable Number Tandem Repeat): Son secuencias repetitivas en Tndem similares a minisatlites de eucariotas que han sido identificados dispersos en las regiones intergenicas del genoma del complejo de Mycobacterium tuberculosis. Estos segmentos repetitivos o minisatelites contienen de 46100 bp (pares de bases) y difieren entre las cepas en su nmero de copias. Se ha demostrado que la tipificacin por VNTR es muy til para patgenos cuya poblacin es altamente clonal como MTb
MIRU (Mycobacterial Interspersed Repetitive Units): VNTR localizadas en el genoma de M. tuberculosis H37Rv, se han encontrado 41 posiciones (41 locus) de los cuales 15 son polimrficos en el nmero de repeticiones de una cepa a otra.
Strain 1
MIRU 10
PCR amplification
3 repeats
2 repeats
Strain 2 DNA
PCR amplification
MIRU 4
MIRU 10
2 repeats
1 repeat
Genotipos hallados hasta el momento (N=100) Comparacin por distancia gentica: 0.17 significa
una tolerancia como mximo de 4 locus de diferencia para MIRU-VNTR o 7 espaciadores en Spoligotyping.
Resultados con Da 0.17 (S=100%, E=79%) Haarlem 16%
Comparacin por agrupamiento en un rbol filogentico: Haarlem 28% Beijing 8% Dehli/CAS 2% N.D EAI 3% Uganda 2% N.D Canetti 1% LAM 29% LAM/Cameroon 6% Cameroon 2% N.D Cameroon 2% No match (clster nuevo) 17%
Genotipos de MTB-XDR
Genotipos de MTB-XDR
Genotipos de MTB-XDR
Genotipos de MTB-XDR
Brazil
Paran RGS
17.2 26.9
16 54
Beijing
T S
13
10
9.5
11.8
22
16
No identificado
N=
78
17
9
873
0
1298 220 93
RDRio 38% 50
5
206 41
100
Elis R Dalla Costa et al. BMC Microbiology 2009; 9:39 Cepas analizadas de Per, Brasil y Argentina n=224 LAM es el mas frecuente (46.4%), Haarlem es el segundo (10%) en Sudamrica Resistencia a INH es mas frecuente en Haarlem que en LAM (82.4% n=34) en Per Haarlem ha sido asociado a la emergencia de TB-MDR en brotes ocurridos en Argentina, Republica Checa y Tnez
GRACIAS
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