Instructivo tcnico para Recuento de Coliformes y E. coli mediante Tcnica Petrifilm AOAC Official Method 991.14 998.

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INSTRUCTIVO TCNICO DE ANALISIS/ENSAYO PARA RECUENTO DE COLIFORMES Y E.COLI MEDIANTE TCNICA PETRIFILM AOAC OFFICIAL METHOD 991.14 998.08

Tabla de Contenidos Contenido 1 2 3 4 Pgina

Objetivos y Alcance ........................................................................................................................ 2 Referencias y Documentos Relacionados ..................................................................................... 2 Definiciones y Abreviaturas ............................................................................................................ 2 Requisitos ....................................................................................................................................... 3 4.1 4.2 4.3 4.4 Requisitos infraestructura, equipos, materiales y reactivos ..................................................... 3 Requisitos de personal ............................................................................................................. 4 Requisitos especficos .............................................................................................................. 4 Medios de verificacin de Requisitos ....................................................................................... 5

Anlisis/Ensayo .............................................................................................................................. 5 5.1 5.2 5.3 Captacin y envo de la muestra .............................................................................................. 5 Recepcin y manejo de la muestra .......................................................................................... 6 Metodologa .............................................................................................................................. 6 Caractersticas del procedimiento de ensayo.................................................................. 6 Preparacin de la muestra............................................................................................... 6 Protocolo de trabajo ......................................................................................................... 7

5.3.1 5.3.2 5.3.3 5.4

Clculo y expresin de los resultados ...................................................................................... 8 Clculo e informe de los recuentos en placa................................................................... 9

5.4.1 6 7 8

Registro y envo de resultados ....................................................................................................... 9 Supervisin a los laboratorios acreditados................................................................................... 10 Anexos:......................................................................................................................................... 10

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OBJETIVOS Y ALCANCE

El objetivo del instructivo es dar a conocer los requisitos especficos para la acreditacin de laboratorios por parte del SAG para la realizacin del anlisis/ensayo para Recuento de Coliformes y E. coli Mediante Tcnica PETRIFILM AOAC Official Method 991.14 998.08. Del mismo modo, en este documento se estipulan instrucciones tcnicas que deben cumplir los laboratorios para que obtengan y mantengan tal acreditacin. Este procedimiento aplica para muestras de piel de cuello de ave, enjuague de carcasa de aves y esponjas de superficie de carcasas, las cuales corresponden a muestreos microbiolgicos oficiales tomados desde plantas de faenamiento de productos pecuarios de exportacin.

REFERENCIAS Y DOCUMENTOS RELACIONADOS

Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiolgico Oficial en Carnes faenadas en Mataderos de Exportacin. SAG. Chile 2005. Programa de Control Microbiolgico de carnes faenadas para exportacin. SAG. Chile 2005. Norma Chilena Oficial NCh-ISO 17025.Of 2001. Norma Chilena Oficial NCh 2726.Of. 2002. Norma Chilena Oficial NCh 426/2 Of. 97. Mtodo Oficial AOAC 991.14: Placa Petrifilm Recuento de E. coli y coliformes en alimentos (mtodo de film seco rehidratable). Mtodo Oficial AOAC 998.08: Recuento confirmado de Escherichia coli en aves, carnes y alimentos marinos (mtodo de film seco rehidratable). Entrenamiento Microbiolgico FSIS/SAG en tcnicas diagnsticas para Salmonella y E.coli Genrico. Santiago, 3 al 7 de Marzo del 2003. Actas Reuniones entre Subdepartamento Laboratorios Pecuarios y Laboratorios habilitados.

Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research Council, Canad 1999.

DEFINICIONES Y ABREVIATURAS
Documentos emitidos por profesionales del SAG: Protocolo de Toma de Muestra E.coli. Programa de Reduccin de Patgenos, Protocolo de Toma de Muestras y Resultados Laboratorio. United States Department Agriculture. Food Safety and Inspection Service.

Protocolo Oficial SAG:

USDA: FSIS:

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SAG: ISO: AOAC: SAC: MVO: INN:

Servicio Agrcola y Ganadero. International Organization for Standardization. Association of Official Analytical Chemists. Sistema de Aseguramiento de la Calidad. Mdico Veterinario Oficial del SAG. Instituto Nacional de Normalizacin.

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4.1

REQUISITOS
Requisitos infraestructura, equipos, materiales y reactivos

i) Infraestructura Infraestructura requerida para llevar a cabo las actividades contempladas en el alcance, cumpliendo lo sealado en los puntos correspondientes de la NCh-ISO 17025.Of. 2001. Equipamiento bsico para realizar las actividades comprendidas en el alcance de la habilitacin, de acuerdo a requisitos sealados en NCh-ISO 17025.Of. 2001. El Laboratorio debe poseer infraestructura adecuada a un nivel Bioseguridad 2, de acuerdo a Laboratory Biosafety Guidelines, Medical Research Council, Canad 1999. ii) Equipos, instrumentos y materiales Stomacher. Bolsas para Stomacher estriles. Material estril para contener los volmenes de APT necesarios para el anlisis. Pipetas graduadas estriles y/o micropipetas. Probeta estril. Tubos de ensayo estriles. Balanza. Etiquetas (identificacin de muestras) o lpiz marcador indeleble. Gabinete de Bioseguridad. Mechero.

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Vortex o Agitador de Tubos. Aplicador Petrifilm. Estufa de Incubacin a 35 C 1C. Contador de colonias o equivalente. iii) Reactivos, soluciones y medios de cultivo Agua Peptonada Tamponada (APT) en cantidad necesaria para procesar los diferentes tipos de muestras y adems dispensada en 9 ml en tubos de ensayo para las diluciones. Placas Petrifilm 3M, para recuento de E.coli y Coliformes dentro del perodo de vigencia. iv) Estndares Se utilizarn como estndares Cepas ATCC de Escherichia coli (25922), u otra equivalente, la cual ser mantenida y utilizada de acuerdo a lo sealado en la Norma Chilena 2726. Las cepas de trabajo obtenidas a partir de dichas cepas ATCC, sern utilizadas tanto para el control de calidad de los medios de cultivo, como para el control del mtodo de ensayo.

4.2
i)

Requisitos de personal
Segn lo dispuesto en el numeral 4.2 del Reglamento Especfico para la acreditacin de Laboratorios de anlisis / ensayo, el Laboratorio debe contar con un responsable tcnico, quien ser la contraparte del SAG, en temas tcnicos asociados a su actividad como Laboratorio acreditado.

ii) Contar con personal tcnico y/o profesional que debe cumplir el siguiente perfil: Calificado y capacitado en el uso de procedimientos, instructivos, manuales y otros documentos, tanto en los aspectos de gestin como en las metodologas que se desean acreditar, cumpliendo lo sealado en los puntos correspondientes de la NCh-ISO 17025.Of. 2001. Calificado y capacitado en la realizacin del mtodo Recuento de Coliformes y E. coli Mediante Tcnica PETRIFILM en el tipo de muestras correspondientes al alcance de la acreditacin. Tales capacitaciones y calificaciones debern ser acreditadas y documentadas mediante los correspondientes certificados.

4.3

Requisitos especficos

El Laboratorio debe poseer documentacin tcnica y de gestin que avale el cumplimiento de NCh-ISO 17025.Of. 2001.

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Una vez que el laboratorio solicitante obtenga la acreditacin de las tcnicas por el SAG, se le otorgar un plazo de 2 aos para lograr la acreditacin de stas ante el INN.

4.4

Medios de verificacin de Requisitos

De acuerdo al punto 6.1 del Reglamento Especfico para la acreditacin de Laboratorios de anlisis / ensayo, los interesados en acreditarse para este anlisis deben presentar junto a su solicitud de acreditacin lo siguiente: i) ii) Un dossier con los antecedentes generales del laboratorio que se solicitan en dicho reglamento. Un dossier para verificar el cumplimiento de los requisitos establecidos en los puntos 4.1 a 4.3 de este instructivo tcnico, para lo cual debe adjuntar: El laboratorio solicitante deber presentar todos los documentos que avalen el SAC implementado en el laboratorio y/o que demuestren la acreditacin en NCh-ISO 17025.Of. 2001. Todos los documentos tcnicos relacionados con las metodologas a acreditar. La documentacin tcnica deber contemplar como mnimo los documentos sealados en el Anexo N 1 y deber ser entregada al momento de realizar la postulacin. El Departamento de Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias podr solicitar adicionalmente, si lo estima necesario, otros documentos que acrediten esta condicin. Listado de identificacin de personal tcnico y/o profesional, indicando nombre completo, nmero de cdula de identidad y firma. Ttulo (copia legalizada) y Currculum vitae de cada una de las personas identificadas en el listado anterior. Certificado de capacitacin de los anlisis de acuerdo al requisito establecido en el captulo 4.2 ii) de este instructivo.

5
5.1

ANLISIS/ENSAYO
Captacin y envo de la muestra

La captacin de las muestras no es una actividad incluida en la competencia del laboratorio acreditado para este anlisis. Para este tipo de anlisis no se utilizarn contramuestras. La toma y envo de muestras deben ser realizada por el Mdico Veterinario Oficial del SAG (MVO), el cual debe adjuntar las muestras a un Protocolo Oficial SAG, en cuyo documento debe sealar al menos la identificacin de cada una de ellas, el tipo de muestras, la fecha y la hora de la recoleccin de stas. Lo anterior debe realizarse de acuerdo a lo definido en el Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiolgico Oficial en Carnes faenadas en Mataderos de Exportacin. SAG ltima versin vigente. Cdigo: IT-LAB-16-v01

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5.2

Recepcin y manejo de la muestra

La recepcin y manejo de las muestras en el laboratorio debe realizarse de acuerdo a lo sealado en el Manual de Procedimientos para Muestreo Microbiolgico Oficial en Carnes faenadas en Mataderos de Exportacin. SAG. Chile 2005. Cabe sealar, la importancia de verificar los siguientes puntos: Temperatura de recepcin (rango aceptado: 4 8 C). Tiempo entre la toma de muestras y la recepcin, ya que DEBEN SER PROCESADAS DENTRO DE LAS 24 HORAS DESDE LA TOMA DE LAS MUESTRAS. Integridad de las muestras. Cantidad suficiente de muestras para el anlisis. Identificacin adecuada. Contenedor con sello SAG intacto. Protocolo fuera del contenedor y con los datos requeridos de acuerdo al Manual anteriormente mencionado.

5.3
5.3.1

Metodologa
Caractersticas del procedimiento de ensayo

La placa de 3M Petrifilm Recuento de E.coli y Coliformes (EC), constituyen un sistema listo para usar que contiene elementos nutritivos de Violeta Rojo Bilis (V.R.B.), un agente gelificante soluble en agua, un indicador de la actividad glucuronidasa (5-bromo-4-cloro-3-indolil--D-glucuronido) (BCIG) y un indicador de tetrazolio que facilita la enumeracin de colonias. 5.3.2 Preparacin de la muestra

Enjuague de carcasa (se eliminaron especies, ya que est detallado en el Manual del SAG sealado en las referencias) La muestra llega al laboratorio en un frasco exclusivo para el anlisis de E. coli, con un mnimo de 30 ml de agua de enjuague (agua peptonada tamponada). Por cada carcasa enjuagada se debe enviar un frasco para este anlisis. A partir de la muestra del frasco (100), depositar 1 ml de esta dilucin de acuerdo a lo descrito en punto 5.3.3. La siembra en duplicado queda a criterio del laboratorio, para lo cual se debe repetir el procedimiento antes descrito. Posteriormente, del mismo contenido del frasco se toma 1 ml el cual se diluye en 9 ml de APT. Esta dilucin es denominada 10-1. Con estas 2 diluciones se contina en el punto 5.3.3.

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En caso de ser necesario, el laboratorio puede realizar ms diluciones sucesivas con el objeto de obtener placas con recuentos contables.

Mtodo de esponja sobre carcasa (se eliminaron especies, ya que est detallado en el Manual del SAG sealado en las referencias) La muestra (esponja) no recibe ninguna preparacin antes del anlisis, ya que viene previamente humedecida en 10 ml de APT. Adicionar 15 ml de APT, totalizando un volumen final de 25 ml. Este volumen es crtico para la numeracin de E. coli. Homogenizar la muestra en la misma bolsa, apretando con la mano por el exterior de la bolsa. A partir de este homogenizado (100), depositar 1 ml de esta dilucin de acuerdo a lo descrito en punto 5.3.3. La siembra en duplicado queda a criterio del laboratorio, para lo cual se debe repetir el procedimiento antes descrito. Posteriormente, del mismo contenido de la bolsa se toma 1 ml el cual se diluye en un tubo con 9 ml de APT. Esta dilucin es denominada 10-1. Con estas 2 diluciones se contina en el punto 5.3.3. En caso de ser necesario, el laboratorio puede realizar ms diluciones sucesivas con el objeto de obtener placas con recuentos contables.

Piel cuello de ave Aspticamente pesar a lo menos (manteniendo relacin 1:10 con la solucin de APT) 10 0.1 g de muestra representativa dentro de una bolsa estril Stomacher. Agregar 90 ml de APT para tener relacin 1:10. Esta dilucin es denominada 10-1. No usar tampones que contengan citrato, bisulfito o tiosulfato con las placas Petrifilm, ya que pueden inhibir el crecimiento. Luego depositar depositar 1 ml de esta dilucin de acuerdo a lo descrito en punto 5.3.3. La siembra en duplicado queda a criterio del laboratorio, para lo cual se debe repetir el procedimiento antes descrito. Homogenizar la muestra en equipo Stomacher por 1 minuto a velocidad media. A partir de la dilucin anterior tomar 1 ml y depositarlo en un tubo que contenga 9 ml de APT. Esta dilucin es denominada 10-2. Con estas 2 diluciones se contina en el punto 5.3.3. En caso de ser necesario, el laboratorio puede realizar ms diluciones sucesivas con el objeto de obtener placas con recuentos contables. Protocolo de trabajo

5.3.3

Colocar la placa Petrifilm para Recuento de E.coli y Coliformes, en una superficie plana.

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Levantar el film superior y colocar 1 ml de la muestra o su dilucin en el centro del film inferior. Bajar con cuidado el film superior sobre la muestra evitando que se formen burbujas de aire. Colocar el aplicador con la cara lisa hacia abajo en el centro de la placa. Presionar ligeramente el centro del aplicador para distribuir la muestra uniformemente. Distribuir el inculo por toda el rea de crecimiento del Petrifilm antes de que se forme el gel. No deslizar el aplicador por el film. Sacar el aplicador y dejar la placa en reposo durante al menos un minuto para que el gel se solidifique. Por cada dilucin existente siembre en una o dos placas. Incubar las placas en posicin horizontal, cara arriba, en pilas de hasta 20 placas. Incubar las placas Petrifilm EC y coliformes para lectura de E. coli durante 48 h 4 h a 35C 1C (AOAC. 991.14) y 24 h 1 h a 35C 1C (AOAC 998.08).

5.4

Clculo y expresin de los resultados

El recuento de las placas Petrifilm EC puede hacerse en un contador estndar de colonias u otra fuente de luz amplificada. No contar las colonias desarrolladas sobre la zona blanca ya que no estn bajo la influencia selectiva del medio. No contar las burbujas presentes debidas a artefactos. Enumerar las colonias azules a rojo-azulado asociadas a gas atrapado, independientemente del tamao o intensidad de color, como E.coli confirmados. Las colonias azules sin gas no se cuentan como E. coli. Las dems colonias de coliformes sern rojas y asociadas a burbujas de gas. Las colonias no asociadas a gas (con distancias superior al dimetro de una colonia, entre la colonia y la burbuja de gas) no se cuentan como coliformes. El rea de crecimiento circular del Petrifilm es aproximadamente de 20 cm2. Pueden realizarse estimaciones en placas que contengan ms de 150 colonias contando el nmero de colonias en uno o ms cuadrados representativos y obteniendo el promedio. Multiplicar dicho nmero por 20 para obtener el recuento total por placa. Las placas Petrifilm EC con una cantidad de colonias Muy Numerosa para Contar (MNPC) tienen una o ms caractersticas siguientes: muchas colonias pequeas, muchas burbujas de gas y un oscurecimiento del color del gel. Altas concentraciones de E.coli causarn que el rea de crecimiento se vuelva azul mientras que altas concentraciones de coliformes (no E.coli) causarn que el rea de crecimiento se torne de un rojo oscuro, cuando esto ocurra, diluir ms la muestra para obtener un recuento ms preciso. Si se requiere, las colonias pueden aislarse para una posterior identificacin. Levantar el film superior y seleccionar la colonia del gel. Proceder al anlisis siguiendo los mtodos estndar.

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Si no es posible realizar el recuento despus de terminada la incubacin, las placas pueden conservarse en congelacin a temperaturas bajo o igual a los 15 C por un mximo de una semana, para efectuar el conteo. Esto es slo para casos de emergencia, no se debe establecer como procedimiento rutinario. 5.4.1 Clculo e informe de los recuentos en placa

Seleccionar las placas que presenten un rango de conteo entre 15 150 colonias, para el mtodo AOAC 991.14 y un rango de conteo entre 10 150 colonias para el mtodo AOAC 998.08. Para muestras de enjuague de carcasa y piel de cuello, en caso de realizar diluciones en duplicado se deben promediar el N colonias encontradas en ambas placas de la misma dilucin y multiplicar por el inverso de la dilucin. En caso de realizar slo una placa en diluciones consecutivas, registrar el nmero de colonias de cada dilucin, multiplicar por el inverso de la dilucin y luego determinar el promedio del recuento bacteriano entre ambas diluciones. Para muestras de esponja, se debe realizar el clculo mencionado anteriormente, dependiendo si se realizan o no duplicados en cada dilucin y posteriormente, se debe dividir el nmero obtenido por 16 ( 400 cm2 de superficie muestreada / 25 ml de dilucin inicial ). Se informar como UFC / cm2. Para el Recuento de E. coli en muestras de esponja los valores < 1 > 1 se informarn con 2 decimales. En el resto de las muestras los valores se informarn de acuerdo al nmero entero obtenido sin cambios y sin aproximaciones (ejemplo: 333, 90, 16 etc.). En el caso de valores obtenidos sobre o bajo el rango deben ser informados como Recuento Estimado en Placa (RESP). En caso de recuentos incontables se informar como Muy Numeroso Para Contar (MNPC). En caso de no obtener desarrollo en las placas se debe informar de acuerdo al lmite de deteccin de la tcnica. Ejemplo: a) < 1 UFC/ ml Muestras agua de enjuague en dilucin directa (100). b) < 10 UFC / ml /g Muestras de piel de cuello de ave en dilucin 10-1. c) < 0,06 UFC/ cm2 Muestra de esponja en dilucin directa (100).

6 REGISTRO Y ENVO DE RESULTADOS

Los resultados deben ser registrados en el Protocolo Oficial del S.A.G., el cual debe contener la firma y nombre del responsable del laboratorio. El responsable del laboratorio debe enviar los resultados en el Protocolo Oficial del S.A.G. al MVO, este ltimo, una vez que verifique los datos remitidos en el protocolo, despachar cada una de las copias de acuerdo a lo sealado en los Manuales correspondientes (ver punto 2). Cabe sealar, que adems debe mantener una copia de los resultados para sus registros.

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i)

SUPERVISIN A LOS LABORATORIOS ACREDITADOS

Todo laboratorio acreditado ser supervisado mediante visitas de auditoras de seguimiento al menos una vez al ao. Los laboratorios debern participar en programas de ensayos interlaboratorios nacionales y/o internacionales, al menos una vez al ao, cuyos resultados debern ser remitidos al Departamento de Laboratorios y Estaciones Cuarentenarias. El laboratorio acreditado deber estar dispuesto a recibir auditoras nacionales y/o internacionales, en el momento que el Servicio lo requiera.

ii)

iii)

ANEXOS:

Anexo N 1: Listado de Documentos Tcnicos. i) ii) Procedimiento / Instructivo Manejo de Muestras involucrados en el alcance de la acreditacin. Procedimiento e Instructivos Preparacin de Medios de Cultivo involucrados en el alcance de la acreditacin.

iii) Procedimiento / Instructivo Preparacin y Esterilizacin de Material de Vidrio. iv) Procedimiento / Instructivo Eliminacin y Descontaminacin de Residuos y Materiales. v) Procedimiento / Instructivo Aseo y Limpieza de Laboratorios.

vi) Procedimiento / Instructivo Control Biolgico de Esterilidad en Autoclaves. vii) Procedimiento / Instructivo de Verificacin de Equipos. viii) Procedimiento / Instructivo Control Material de Lavado. ix) Procedimiento / Instructivo Control de Calidad Interno. x) Procedimiento / Instructivo Control de Ambiente.

xi) Procedimiento / Instructivo Manejo de Cepas Control. xii) Lista Maestra de Equipos e Instrumentos de Medicin involucrados en el alcance de la acreditacin. xiii) Instructivo de uso de los equipos involucrados en el alcance de la acreditacin. xiv) Programa de Mantencin / Verificacin / Calibracin de los equipos involucrados en el alcance de la acreditacin.

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