Actas Urol Esp.

2013;37(2):100-105

Actas Urolgicas Espaolas

www.elsevier.es/actasuro

ARTCULO ORIGINAL

Diagnstico de infertilidad masculina: necesidad de valoraciones funcionales y cromatnicas

G. Curti , M. Cnepa, L. Cant y J.M. Montes
Laboratorio Fertilab, Montevideo, Uruguay Recibido el 14 de noviembre de 2011; aceptado el 16 de noviembre de 2011 Disponible en Internet el 17 de junio de 2012

PALABRAS CLAVE
Fragmentacin del ADN espermtico; Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling; Nitroblue Tetrazolium; Pruebas funcionales espermticos

Resumen Objetivos: Estudiar la incidencia de alteraciones funcionales y cromatnicas en espermatozoides de pacientes, agrupados segn normalidad de los parmetros seminales estndar en funcin de la quinta edicin del manual de la Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Identicar y correlacionar las caractersticas alteradas con mayor frecuencia en la subpoblacin normal para los parmetros estndar. Materiales y mtodos: Estudio prospectivo en el que se evaluaron en muestras de semen de 110 pacientes y 6 donantes frtiles (control), los parmetros seminales estndar (volumen, concentracin, motilidad, morfologa, clulas redondas, clulas peroxidasa-positivas) segn las directrices de la OMS, as como test complementarios funcionales (sobrevida 24 horas, test hipo-osmtico, test de estrs modicado) y adicionales (azul de anilina, nitroblue-tetrazolium, TUNEL). Segn el resultado de los anlisis estndar los pacientes se dividieron en dos grupos (A: todos los parmetros estndar normales; B: al menos uno de los parmetros estndar alterado). Resultados: El 96,61% de las muestras present alterada al menos una de las variables analizadas. Los grupos A y B mostraron diferencia estadsticamente signicativa en todos los test complementarios. En el grupo A el 93,68% de las muestras present al menos un test complementario alterado, y la variable afectada con mayor frecuencia fue la fragmentacin del ADN espermtico (16,95%). Conclusiones: La profundizacin en el estudio seminal, introduciendo en la rutina ensayos funcionales y cromatnicos, redunda en un diagnstico ms anado de la infertilidad del varn. Los parmetros de la OMS deben considerarse como un abordaje primario. 2011 AEU. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados.

Autor para correspondencia. Correo electrnico: giannicurti@gmail.com (G. Curti).

0210-4806/$ see front matter 2011 AEU. Publicado por Elsevier Espaa, S.L. Todos los derechos reservados. 10.1016/j.acuro.2011.11.015

Diagnstico de infertilidad masculina: necesidad de valoraciones funcionales y cromatnicas

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KEYWORDS
Sperm DNA fragmentation; Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling; Nitroblue Tetrazolium; Sperm function tests

Diagnosis of Male Infertility: A Need of Functional and Chromatin Evaluation

Abstract Objectives: To evaluate the incidence of functional and chromatin alterations on spermatozoids in patients grouped according to normality of standard semen parameters based on the 5th edition of the World Health Organization (WHO) guidelines. To identify and correlate the most frequently altered characteristics in the normal standard semen parameters sub-population. Materials and Methods: A prospective study was performed. It evaluated standard semen parameters (volume, sperm concentration, motility and morphology, round cells, peroxidasepositive cells) according to WHO guidelines, as well as functional tests (24 hours survival, hypoosmotic swelling test, modied stress test), and additional assays (aniline blue, nitrobluetetrazolium, TUNEL) in 110 semen samples from patients and 6 from fertile donors (control). Based on standard semen parameters values, patients were divided into two groups (A: all standard parameters normal; B: one altered standard parameter at least). Results: At least one of the variables analyzed was altered in 96.61% of the samples. Groups A and B showed statistically signicant differences in all the complementary tests. At least one of the complementary tests were altered in 93.68% of the samples in group A, and the most frequently affected variable was sperm DNA fragmentation (16.95%). Conclusions: Performing a more in-depth seminal study within the routine functional and chromatin assays provides a more precise diagnosis of male infertility. The WHO standards should be considered as a primary approach. 2011 AEU. Published by Elsevier Espaa, S.L. All rights reserved.

Introduccin
Se estima que la infertilidad afecta aproximadamente al 15% de las parejas en edad reproductiva1 , y que en alrededor del 50% de los casos est involucrado el factor masculino2 . El anlisis del semen es actualmente un procedimiento de rutina para la determinacin de la contribucin del factor masculino en el estudio de la pareja infrtil. Constituye de este modo una herramienta fundamental para los profesionales clnicos a la hora de decidir entre algoritmos para continuar con el diagnstico, o directamente entre alternativas teraputicas. En bsqueda de la estandarizacin a gran escala del anlisis de semen, la Organizacin Mundial de la Salud (OMS) public en 1980 la primera edicin de su Manual de laboratorio para el examen de semen humano y la interaccin entre el semen y el moco cervical3 . Siguiendo los avances en la materia, la OMS reedit versiones revisadas y actualizadas del manual en 19874 , 19925 , 19996 y 20107 . Estas publicaciones generaron controversias en torno al verdadero valor de las caractersticas recomendadas y sus valores de referencia8---13 . El espermatozoide debe exhibir un conjunto nico de propiedades biolgicas para conseguir fertilizacin y desarrollo embrionario normales. Dada esta complejidad resulta difcil el diagnstico de alteraciones en su siologa mediante el anlisis estndar del semen, esto es, el estudio de las variables recomendadas en los manuales de la OMS14 . Otros test, adicionales a los recomendados en dichos manuales, han sido desarrollados en bsqueda de una evaluacin ms integral. Estudiando tanto caractersticas funcionales como cromatnicas del espermatozoide, sus resultados se han correlacionado positivamente con la calidad espermtica y el xito reproductivo, constituyendo potenciales herramientas diagnsticas y pronsticas15---19 .

El objetivo de este trabajo fue estudiar la incidencia de alteraciones funcionales y cromatnicas en los espermatozoides de una poblacin de pacientes con infertilidad conyugal subdividida en funcin de la normalidad de los parmetros seminales estndar, segn la ltima edicin del manual de la OMS7 . A su vez se pretendi identicar y correlacionar las caractersticas alteradas con mayor frecuencia en la subpoblacin normal para los parmetros estndar.

Materiales y mtodos
Pacientes y muestras
En este trabajo se incluyeron 110 pacientes con infertilidad conyugal, cuya edad media fue de 38 7 a nos, seleccionados entre marzo y julio de 2011. Un grupo control se conform con 6 donantes voluntarios frtiles, de 25 1 a nos. Despus de la abstinencia sexual estndar, y siguiendo las directrices de la OMS7 , las muestras de semen se recolectaron por masturbacin, en recipientes estriles testeados y provistos por el personal del laboratorio. Todos los sujetos incluidos en este estudio rmaron formularios de consentimiento informado. Los parmetros seminales estndar analizados fueron: volumen de la muestra, concentracin espermtica, motilidad espermtica progresiva, porcentaje de formas normales, porcentaje de formas inmaduras, concentracin de clulas redondas y concentracin de clulas peroxidasa-positivas. Adems se realizaron los siguientes test funcionales: sobrevida espermtica a las 24 horas, test hipo-osmtico (HOST [del ingls: hipo-osmotic swelling test]), test de estrs modicado (MOST [del ingls: modied stress test]), y los tests adicionales que siguen: nitroblue tetrazolium test (NBT), test de azul de anilina (AB [del

102 ingls: Aniline Blue]), y ensayo terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling (TUNEL). Los parmetros estndar se estudiaron segn el ltimo manual de la OMS7 y se catalogaron como normales o anormales tomando como referencia los rangos publicados en dicho manual. De acuerdo con lo anterior se dividi el conjunto total de pacientes en dos grupos: grupo A, en el que se incluyeron los pacientes cuyas muestras se catalogaron como normales para todos los parmetros estndar; y grupo B, con los pacientes cuyas muestras presentaron alteraciones en al menos uno de estos parmetros.

G. Curti et al

Test adicionales
Test de azul de anilina Para este estudio se realizaron extendidos con semen fresco que fueron jados en glutaraldehdo al 3% en buffer fosfato 0,2 M, y te nidos con una solucin de azul de anilina al 5% en el mismo buffer. El resultado del test se expres como el porcentaje de espermatozoides te nidos. Nitroblue tetrazolium test Se diluy 1:1, una alcuota de semen fresco con una solucin al 0,1% de NBT (Sigma-Aldrich, St. Louis, EE. UU.) en buffer fosfato salino (PBS - Dako North America Inc., CA, EE. UU.), e incub 30 minutos a 37 C. Despus de lavar la suspensin se realizaron extendidos que se ti neron con colorante segn Wright. Bajo inmersin y 1.000 aumentos en microscopio de campo claro los espermatozoides se clasicaron como NBTpositivos al detectarse grnulos de formazn en su interior, y el resultado del ensayo se expres como el porcentaje de dichos espermatozoides. Ensayo TUNEL Para esta tcnica se utiliz el kit In Situ Cell Death Detection Kit-Fluorescein (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemania) siguiendo las especicaciones del fabricante. Brevemente, alcuotas de semen lavado se transrieron en portaobjetos multiceldillas y se jaron en paraformaldehdo al 4% en PBS durante 30 minutos. Despus de lavados en PBS, las preparaciones se permeabilizaron en una solucin de Triton X-100 al 0,1% en citrato de sodio al 0,1% en fro. Posteriormente se realiz el marcaje en cmara hmeda a 37 C con la solucin de reaccin de TUNEL. En cada experimento se incluy un control negativo (omitiendo la enzima en la solucin de reaccin) y un control positivo (tratado con DNasaI 1 mg/ml). Como contratincin se utiliz Hoechst 33342 (Molecular Probes, Invitrogen Detection Technologies). Las preparaciones se analizaron en microscopio de epiuorescencia (Olympus BX40) y se clasic el ADN de los espermatozoides como intacto o fragmentado (uorescencia verde nuclear). El resultado del ensayo se expres como el porcentaje de espermatozoides con ADN fragmentado. Los espermatozoides de los controles negativos no exhibieron uorescencia, mientras que el 100% de los controles positivos present su ADN fragmentado.

Anlisis del semen estndar

Despus de la licuefaccin y la determinacin del volumen de las muestras se analizaron la concentracin y la motilidad espermtica, as como la concentracin de clulas redondas, por microscopa de contraste de fase (Olympus BX51) utilizando una cmara de recuento tipo Makler (Makler counting chamber, Se-Medical Instruments, Haifa, Israel). Para evidenciar las clulas peroxidasa-positivas se utiliz la tcnica de bencidina-cianosina-H2 O2 , y la lectura de la misma se realiz por microscopa de campo claro (Olympus BX51). La morfologa espermtica se determin analizando extendidos te nidos segn la tcnica de Papanicolaou descrita en el ltimo manual de la OMS7 . Las formas espermticas inmaduras se contabilizaron en las mismas preparaciones.

Test funcionales
Sobrevida 24 horas El porcentaje de sobrevida se determin en funcin del cociente entre los porcentajes de espermatozoides mviles contabilizados despus y antes de 24 horas de incubacin a temperatura ambiente, de una alcuota de semen lavado (medio Earles Balanced Salt Solution [EBSS] + 10% HSA).

Test hipo-osmtico Este ensayo se llev a cabo incubando 100 l de semen durante 30 minutos a 37 C, en 1 ml de solucin hipoosmtica (D-fructosa 0,075 M, citrato de sodio 0,025 M). Estas condiciones provocan un ujo pasivo de agua a travs de las membranas intactas y funcionales hacia el interior de las clulas, que a su vez produce que stas se hinchen. Esta hinchazn se evidencia por el enrollamiento de las colas de los espermatozoides. Los espermatozoides muertos o con sus membranas alteradas no se hinchan, y sus colas se observan rectas. El resultado del test se expresa como el porcentaje de espermatozoides hinchados.

Anlisis estadstico
Para determinar diferencias signicativas entre los grupos se utiliz el test one-way ANOVA. En los casos en que se evidenciaron correlaciones se recurri al test de Spearman Rank Order Correlation. Se asumi signicacin estadstica con valores de p inferiores a 0,05. La estadstica se realiz en la plataforma SigmaPlot 11.0 (Systat Software Inc.).

Test de estrs modicado El ndice descrito como resultado de este test se calcul como el cociente entre los porcentajes de espermatozoides mviles contabilizados antes y despus de 4 horas de incubacin, a 40 C de una alcuota de semen lavado con EBSS + 10% HSA.

Resultados
Para el conjunto total de muestras de pacientes la media para el volumen, la concentracin espermtica, la motilidad progresiva y el porcentaje de formas normales se ubic dentro de los rangos de referencia, mientras que porcentaje

Diagnstico de infertilidad masculina: necesidad de valoraciones funcionales y cromatnicas

Tabla 1 Parmetros seminales evaluados con sus correspondientes rangos de referencia. Los valores estn expresados como media error estndar (n = 110) Valor Parmetros estndar Volumen (ml) Concentracin (mill/ml) Motilidad progresiva (%) Formas normales (%) Formas inmaduras (%) Clulas redondas (mill/ml) Peroxidasa + (mill/ml) Test funcionales Sobrevida 24 h (%) HOST (%) MOST Test adicionales Azul de anilina (%) NBT (%) TUNEL (%) 3,57 48,14 55,84 7,69 3,03 1,00 0,48 0,16 3,48 1,84 0,45 0,93 0,24 0,20 Referencia > 1,5 > 15 > 32 >4 <2 <1

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Tabla 2 Parmetros alterados dependiendo del grupo de pacientes analizado. La tabla muestra los parmetros no considerados por el manual de la OMS 20107 . Los valores corresponden al porcentaje de muestras del total de cada grupo Grupo A Formas inmaduras 2% Clulas redondas 1 mill/ml Sobrevida 24 h 20% HOST 60% MOST 0,50 TUNEL 20% Azul de anilina 25% NBT 23% 11,86% 13,25% 13,56% 8,47% 0% 16,95% 15,25% 5,08% Grupo B 27,45% 29,41% 41,18% 43,14% 3,92% 47,06% 59,90% 19,61% Grupo control 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0% 0%

45,48 2,52 63,06 1,73 0,84 0,01 20,38 0,88 12,08 0,58 15,39 0,85

> 20 > 60 > 0,50 < 25 < 23 < 20

y AB (r = 0,271; p < 0,01); NBT y TUNEL (r = 0,279; p < 0,005); y AB y TUNEL (r = 0,258; p < 0,01).

Discusin
Nuestros resultados muestran que al analizar nicamente los parmetros recomendados por la OMS en la ltima edicin de su manual7 , se obtiene una visin parcial de la situacin real de la muestra estudiada. Aun encontrando dichos parmetros dentro de los rangos de referencia, y por tanto catalogando las muestras como normales, al efectuar los dems test no todas esas muestras resultaron realmente normales. De la observacin anterior surgen varias consideraciones. En primer lugar es preciso un manejo cuidadoso del concepto normalidad, sobre todo teniendo en cuenta el efecto que pueda tener en este particular tipo de pacientes que consulta por infertilidad, dada la carga emocional, social, etc. a la que estn generalmente sometidos. Luego, una funcin importante de los manuales y los rangos de referencia es facilitar un pronstico que ayude a determinar si las intervenciones mdicas son necesarias, si lo son que establezca cul es la que mejor se adapta a las condiciones del paciente y qu probabilidades de xito existen, o si deben ser consideradas otras acciones como el uso de donantes o la adopcin13 . Claramente, esto se diculta si se tienen en cuenta solamente los parmetros del anlisis de semen estndar con sus rangos de referencia recomendados en la quinta edicin del manual de la OMS7 . Por otro lado, el estudio seminal estndar no brinda informacin sobre la patognesis, es decir, sobre el mecanismo que subyace a la alteracin observada en determinado parmetro13 . Introducir test funcionales y los test adicionales evaluados en este trabajo en la evaluacin seminal de rutina es brindar informacin valiosa para el diagnstico, pronstico y etiologa de la infertilidad. Est documentado el hecho de que una muestra pueda presentar alteraciones en los test funcionales o en los dems parmetros espermticos evaluados en este trabajo, aun teniendo los parmetros estndar dentro de los rangos de referencia20,21 . Saleh et al. en 2002 describen niveles signicativos de da no en el ADN espermtico en pacientes normales para los parmetros espermticos estndar14 . En

de formas inmaduras y la concentracin de clulas redondas se vio levemente alterado. Los resultados de los test complementarios tambin se ubicaron dentro de los rangos de referencia (tabla 1). Resulta interesante que solamente en el 3,39% de las muestras todas las variables testeadas fueron clasicadas como normales. Esto signica que el 96,61% de las muestras present alterado al menos uno de los parmetros analizados. La divisin del conjunto total de muestras segn la normalidad de los parmetros seminales estndar result en la composicin del grupo A con el 53,64% de las muestras y del grupo B con el 46,36%. Junto a esto, y teniendo en cuenta el dato anterior, se obtuvo que para el grupo A el 93,68% de las muestras present alterado al menos uno de los test complementarios. Considerando solamente los parmetros alterados no incluidos en las recomendaciones del ltimo manual de la OMS7 , o bien los test complementarios, y analizndolos uno a uno para cada grupo, se obtuvieron los resultados presentados en la tabla 2. Sorprendentemente se hall en el grupo A un porcentaje considerable de muestras catalogadas como anormales para alguno de esos parmetros. Como poda sospecharse esos porcentajes fueron mayores en el grupo B. En el grupo control para todas las variables se obtuvieron valores incluidos en los rangos de referencia. Se hallaron diferencias estadsticamente signicativas entre los grupos A y B en todos los test complementarios y en algunos parmetros del anlisis estndar (volumen, concentracin, motilidad progresiva y formas normales). Ninguna de las variables mostr diferencia signicativa cuando se compar el grupo A con el control, mientras que este ltimo diri con signicacin estadstica del grupo B en la concentracin, la motilidad progresiva, las formas normales y los test HOST, AB, NBT y TUNEL (tabla 3). Del anlisis de correlacin entre los test adicionales se obtuvieron correlaciones directas y signicativas entre NBT

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G. Curti et al

Tabla 3 Parmetros seminales estudiados en los grupos A, B y control, y comparaciones entre los grupos. Los valores de las variables estn expresados como media error estndar. Las comparaciones se realizaron utilizando el test one-way ANOVA; se muestran los valores de p Grupo A Parmetros estndar Volumen (ml) Concentracin (x106 /ml) Motilidad progresiva (%) Formas normales (%) Formas inmaduras (%) Cl. redondas (x106 /ml) Peroxidasa + (x106 /ml) Test funcionales Sobrevida 24 h (%) HOST (%) MOST Test adicionales Azul de anilina (%) NBT (%) TUNEL (%) 3,94 64,25 64,93 10,71 2,06 0,69 0,17 0,22 4,37 1,03 0,50 1,13 0,19 0,03 Grupo B 3,14 29,51 45,33 4,19 4,16 1,37 0,83 0,21 4,27 3,21 0,40 1,51 0,46 0,43 Grupo control 3,73 73,01 63,33 11,33 0,23 0,42 0,24 1,05 13,03 3,77 1,38 0,11 0,22 0,19 A vs. B p = 0,012 p < 0,001 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,254 p = 0,150 p = 0,096 p < 0,001 p < 0,001 p = 0,001 p < 0,001 p = 0,019 p < 0,001 A vs. control p = 0,769 p = 0,549 p = 0,835 p = 0,724 p = 0,658 p = 0,794 p = 0,944 p = 0,945 p = 0,265 p = 0,994 p = 0,666 p = 0,315 p = 0,455 B vs. control p = 0,403 p = 0,004 p = 0,021 p < 0,001 p = 0,344 p = 0,369 p = 0,594 p = 0,061 p = 0,002 p = 0,137 p = 0,023 p = 0,040 p = 0,018

54,39 3,16 67,56 0,67 0,87 0,01 17,14 1,00 10,86 0,68 12,71 1,00

33,52 3,38 57,65 2,24 0,80 0,02 24,20 1,32 13,57 0,96 18,74 1,45

53,67 11,00 73,17 4,91 0,87 0,04 15,50 3,45 8,33 1,20 10,00 1,88

Los valores de p en negrita indican signicacin estadstica.

lnea con lo anterior, un hallazgo interesante es el publicado en los trabajos de Aveda no et al. Los autores demostraron que pacientes infrtiles pueden presentar fragmentacin en el ADN de espermatozoides catalogados como morfolgicamente normales, y que esta condicin impacta de manera negativa sobre la calidad de los embriones generados mediante ICSI22,23 . Nuestros resultados son coherentes con las observaciones anteriores, y demuestran que la gran mayora de los pacientes cuyas muestras de semen seran catalogadas como normales, segn el criterio de la OMS para los parmetros seminales estndar7 , presenta alterado al menos uno de los dems test realizados en este trabajo. Es llamativo que la caracterstica que se ve afectada con mayor frecuencia en este grupo de pacientes sea la integridad del ADN espermtico. Si a esto se suma que est documentada desde hace ya tiempo su correlacin con la capacidad fecundante del espermatozoide tanto in vivo como in vitro24,25 , resulta evidente que su evaluacin debera ser incluida en los algoritmos diagnsticos de infertilidad masculina de manera casi rutinaria. La salvedad est dada por aquellos casos en los que del estudio de los parmetros seminales estndar se desprenda un diagnstico claro, como por ejemplo el de azoospermia. Actualmente se acepta que son tres los mecanismos fundamentales que dan origen al da no en el ADN del espermatozoide: a) estrs oxidativo generado por un desequilibrio entre la produccin de especies oxgeno-reactivas por parte de espermatozoides y leucocitos y la actividad antioxidante del plasma seminal; b) alteraciones en el empaquetamiento de la cromatina dadas por una actividad alterada de la enzima topoisomerasa II durante el remplazo de histonas por protaminas en el proceso de maduracin espermtica; y c) apoptosis abortiva, esto es, eventos apoptticos que normalmente ocurren durante la espermatognesis se descontrolan por razones que an

se desconocen, arrojando en el eyaculado espermatozoides que han entrado en la va apopttica26 . Si bien sera errneo pensar que estos mecanismos actan de manera independiente, cuando lo que ms probablemente tenga lugar sea una combinacin de los tres27 , es posible indagar en ellos, especialmente en casos de pacientes con niveles elevados de da no en su ADN espermtico. En este trabajo examinamos dos de los mecanismos. La produccin espermtica de especies oxgeno-reactivas mediante el test NBT, y el recambio errneo de histonas por protaminas a travs del test AB. A travs de estos ensayos se obtiene una visin indirecta de la contribucin en el da no del ADN espermtico de la accin de las especies oxgeno-reactivas y de los errores en el empaquetamiento de la cromatina durante la maduracin espermtica. Consideramos esta aproximacin efectiva, tcnicamente sencilla y econmica que puede ser incluida en la rutina de cualquier laboratorio. Adems, las correlaciones halladas entre estos test y el porcentaje de espermatozoides con ADN da nado refuerzan la idea de que los mecanismos indirectamente estudiados por estos dos ensayos actan en detrimento de la integridad del ADN espermtico. Por otro lado, y por la correlacin que encontramos entre ambos test, nos adherimos a la idea de que los mencionados mecanismos actuaran de forma paralela y no individualmente. Son necesarios ms estudios, aumentando el nmero de casos y a nadiendo el anlisis de la va apopttica como tercer mecanismo fuente de da no del ADN espermtico, para continuar contribuyendo a la comprensin de la etiologa de la infertilidad masculina, y concomitantemente al desarrollo de herramientas ecientes para su correcto diagnstico. Ir ms all de los parmetros recomendados por la OMS7 , profundizando en el estudio seminal al introducir ensayos que evalen la funcionalidad del espermatozoide, as como su integridad cromatnica, redunda en un diagnstico ms anado y en una estrategia ms adecuada.

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Conicto de intereses
Los autores declaran no tener ningn conicto de intereses.
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