Master Universitario in Monitoraggio e valutazione del rischio ambientale mutageno, cancerogeno e teratogeno

Epidemiologia Molecolare
Antonella Agodi
Dipartimento GF Ingrassia Universit degli Studi di Catania Catania, 12 Settembre 2013

Epidemiologia
Lepidemiologia descrittiva consente di ottenere una descrizione attendibile dello stato di salute di una popolazione Risponde alle domande Chi? Dove? Quando? consente di formulare lipotesi di associazione fra fattori e malattia Lepidemiologia analitica o investigativa individua i fattori e/o le condizioni che determinano lo stato di salute o di malattia Fornisce indicazioni anche sul Perch?: verifica delle ipotesi Lepidemiologia sperimentale studia la validit delle ipotesi eziologiche e lefficacia di eventuali interventi Risponde alla domanda: Funziona?: valutazione di interventi preventivi e trattamenti terapeutici

EPIDEMIOLOGIA
Valuta la frequenza e le modalit di comparsa, la propagazione ed il meccanismo dazione di tutti quei fattori in grado di influenzare le condizioni di salute delle popolazioni umane

Esposizione

Black box

Malattia

EVOLUZIONE DELLEPIDEMIOLOGIA

Mentre nel passato la valutazione dello stato di salute aveva come unico target possibile lo stato patologico conclamato i recenti sviluppi scientifico-tecnologici e le diverse caratteristiche dei rischi hanno permesso di individuare dei marcatori biologici utili per registrare variazioni precliniche dello stato di salute

EVOLUZIONE DELLEPIDEMIOLOGIA
I progressi nel campo della biologia molecolare, della genetica, della chimica analitica e in altre scienze di base, hanno reso possibile misurare sia i contaminanti e i cancerogeni ambientali che rappresentano lesposizione negli studi epidemiologici sia i cambiamenti biologici che definiscono leffetto ad un livello di elevata definizione Questi progressi possono essere utilizzati per valutare la suscettibilit genetica attraverso la tipizzazione genotipica e altri metodi genetici e per identificare i meccanismi a livello cellulare e molecolare che, a partire dallesposizione, conducono alla malattia
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EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE

Esposizione

Biomarcatori Black box

Malattia

Epidemiologia

Biologia Molecolare

Genetica

PROGRESSIONE DEGLI EVENTI CHE CONDUCONO AL CANCRO AMBIENTALE

NRC, 1987

Lo schema del NRC pu essere generalizzato ad includere altre malattie mediate dallambiente e diverse dal cancro
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BIOMARCATORI

Alterazioni cellulari, biochimiche e molecolari misurabili nei tessuti, nelle cellule e/o nei fluidi biologici, e vengono convenzionalmente classificate come: misure di esposizione misure di effetto misure di suscettibilit

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE
Il monitoraggio dei biomarcatori, piuttosto che quello delle malattie, nelle popolazioni umane il tema dellepidemiologia molecolare

EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE

La scienza che studia i fattori di rischio e protettivi intrinseci ed estrinseci - identificati a livello molecolare i loro meccanismi eziopatogenetici ed il loro ruolo nella distribuzione e controllo delle malattie nelle popolazioni e in gruppi familiari selezionati

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EPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: OBIETTIVI

1. Definire accuratamente lesposizione 2. Predire loutcome di malattia 3. Identificare e misurare fattori di suscettibilit genetici o acquisiti che aumentano il rischio di malattia 4. Chiarire le interazioni cancerogeno - target e i meccanismi patogenetici

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BIOMARCATORI

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GLI STRUMENTI DELLEPIDEMIOLOGIA MOLECOLARE: I MARCATORI BIOLOGICI

Marcatori di esposizione: - di dose interna - di dose biologica efficace Marcatori di effetto: - di effetti biologici precoci - di strutture e funzioni alterate Marcatori di suscettibilit

MISURARE I BIOMARCATORI
I biomarcatori possono essere misurati quantitativamente o qualitativamente metodi biochimici immunochimici citogenetici molecolari genetici

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DOVE MISURARE I BIOMARCATORI

I biomarcatori possono essere misurati in diversi materiali biologici: Tessuti normali o tumorali Sangue Urine Possono essere costituiti da: DNA RNA proteine altro
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BIOMARCATORI
Marcatori specifici sostanze chimiche che vengono determinate come tali nei tessuti o nei fluidi corporei (ad esempio metalli pesanti nei capelli) o sono costituiti dai loro metaboliti chimici rilevati nei tessuti o nei fluidi corporei (acido tricloroacetico nelle urine per lesposizione a tricloroetilene) o infine sono costituiti da addotti al DNA (addotti benzo(a)pirene in vari tessuti)

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BIOMARCATORI
Poich esposizioni a sostanze diverse a volte possono determinare gli stessi effetti, le loro misure sono considerate biomarcatori non specifici (scambi tra cromatidi fratelli, aberrazioni cromosomiche o presenza di micronuclei nei linfociti) poich indicano potenzialmente varie esposizioni che conducono allo stesso effetto biologico

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BIOMARCATORI
Marcatori a specificit intermedia sono gli amino composti urinari totali o la metaemoglobinemia per le amine aromatiche, il fenolo urinario per il benzene e altre sostanze organiche

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ESPOSIZIONE
Presenza di una certa sostanza chimica, di un fattore fisico, di un agente biologico o di un insieme di tali componenti nellambiente in cui vivono gli individui a rischio che conduce alla loro introduzione dallesterno allinterno dellorganismo

Definire accuratamente lesposizione

Un limite degli studi di epidemiologia ambientale costituito dallincertezza qualitativa e/o quantitativa sullesposizione ai cancerogeni Lesposizione ambientale ed occupazionale comunque un evento frequentemente complesso e in ogni caso avviene anche decenni prima che la specifica patologia possa manifestarsi

Esposizione: dati surrogato

Informazioni ottenute da interviste o questionari: storia lavorativa, abitudini di vita, prossimit allincidente/esplosione, quantit di acqua consumata Non sorprende pertanto che spesso occorrano errori di classificazione degli esposti e dei non-esposti, dei pi esposti e dei meno esposti

MARCATORI DI ESPOSIZIONE
Misure dellesposizione costituite dai livelli di fattori esogeni presenti nei fluidi biologici degli individui esposti In questa categoria di marcatori vengono incluse le sostanze chimiche, i prodotti del loro metabolismo, i nutrienti e gli agenti infettivi

Marcatori di dose interna

Evidenziano lavvenuto assorbimento della sostanza esogena allinterno dellorganismo umano I composti assorbiti possono: - mantenere la propria struttura - essere modificati per via metabolica - essere accumulati nel tessuto adiposo e/o nel tessuto osseo

Marcatori di dose interna: esempio

LIARC ha classificato le Aflatossine B1 (AFB1) fattori cancerogeni riconosciuti per luomo (IARC, 1987) Per verificare lesposizione alle Aflatossine B1 possibile misurare nelle urine i livelli di (AFB1) o dei suoi metaboliti AFM1 o AFP1 E possibile stimare la dose giornaliera probabile (probable daily intake, PDI) di AFB1 a partire dalla concentrazione di questa micotossina, determinata mediante lanalisi di composizione degli alimenti pi frequentemente consumati e combinandola con i profili di consumo alimentare ottenuti mediante un Food Frequency Questionnaire (FFQ) e confrontando i dati di PDI con il provisional tolerable daily intake per le AFB1 stabilito dalla FAO/WHO Export Committee on Food Additivies

Marcatori di dose biologica effettiva

Evidenziano linterazione avvenuta tra il composto assorbito ed una struttura subcellulare (addotti al DNA, alle proteine)

Marcatori di dose biologica effettiva: esempio

Gli idrocarburi policiclici aromatici (Polycyclic Aromatic Hydrocarbons PAH) sono prodotti dallincompleta combustione dei materiali organici Sorgente ambientale di PAH: forni industriali, motori a benzina e diesel, fumo di sigaretta I PAH sono cancerogeni che richiedono unattivazione metabolica per reagire con le macromolecole cellulari, il passo iniziale nel processo di cancerogenesi

LIMITI DEI MARCATORI DI ESPOSIZIONE

Sono misurati nei materiali biologici che pertanto devono essere disponibili o prelevati ad hoc Alcuni marcatori, quali gli addotti allemoglobina e i livelli di cotinina nel sangue (breve emivita) riflettono solo le esposizioni recenti I costi per la loro determinazione sono generalmente molto pi elevati rispetto alla raccolta dei dati mediante questionari o interviste

I BIOMARCATORI DI EFFETTO
I marcatori di effetto sono utilizzati per predire e valutare in termini probabilistici il rischio delloutcome e cio di malattia - Marcatori di effetti biologici precoci - Marcatori di strutture e funzioni alterate il valore predittivo del biomarcatore ha un significato probabilistico

VALORE PREDITTIVO DEL BIOMARCATORE

E necessario uno studio di validazione prima che qualsiasi biomarcatore possa essere utilizzato per predire la malattia La ricerca ha infatti gi messo a disposizione una grande quantit di biomarcatori di effetto ma quale sia il loro significato predittivo rimane per molti di essi ancora da determinare Identificare precocemente il processo di iniziazione del cancro mediante specifici biomarcatori avrebbe un grande impatto sulla vera prevenzione dei tumori, sia a livello di popolazione che, probabilmente, anche per il singolo individuo sottoposto al test

MARCATORI DI EFFETTO: LA RISPOSTA BIOLOGICA

La risposta biologica definita da una modificazione biologica, biochimica e/o molecolare, nelle cellule e tessuti bersaglio, che risulta dallazione del composto esogeno e che potrebbe costituire un primo passaggio del processo patologico che conduce alla malattia

2. APPLICAZIONI
Ecotossicologia: monitoraggio del suolo e dellacqua Epidemiologia nutrizionale Biomonitoraggio ambientale Valutazione di inquinanti ambientali da siti contaminati Epidemiologia umana: valutazione dei livelli di danno al DNA in individui esposti

RISPOSTA BIOLOGICA PRECOCE: ALTERAZIONI GENETICHE

Marcatori citogenetici: aberrazioni cromosomiche evidenziabili con il cariotipo (analisi dei cromosomi di un individuo in cellule metafasiche, quando il DNA duplicato e condensato) e micronuclei nei linfociti del sangue periferico o nelle cellule dellepitelio buccale Mutazioni in Oncogeni: famiglia dei geni ras Mutazioni in Geni oncosoppressori: gene TP53 (o p53)

COMET ASSAY PRINCIPIO:

La rottura del DNA porta alla riduzione della grandezza della molecola e questo pu essere evidenziato mediante elettroforesi

COMET ASSAY
double strand breaks (DSBs) single strand breaks (SSBs) alkali labile sites oxidative DNA base damage DNA-DNA/DNA-protein/DNA-Drug crosslinking DNA repair

Marcatori di effetto Fluorescent in situ hybridization (FISH)

Benzene is a recognized hematotoxicant and carcinogen that produces genotoxic damage. Benzene metabolites can produce reactive oxidative species. Mitochondrial DNA (mtDNA) copy number may be increased in response to oxidative stress to compensate for damaged mitochondria. We carried out a cross-sectional study of 40 benzene-exposed workers and 40 controls to evaluate the association between benzene exposure and mtDNA copy number. Copy number of mtDNA in leukocyte DNA was determined by real-time PCR. Compared with controls, the copy number of mtDNA increased by 4% and by 15% in workers exposed to 10 ppm (n = 20) and >10 ppm (n = 20) benzene, respectively. After adjusting for recent infection, the factor that was significantly correlated with mtDNA, the increase of mtDNA was statistically significant in the high exposed group (P 5 0.016) with a significant linear trend (P 5 0.024). Benzene exposure may induce mtDNA amplification, possibly in response to oxidative stress caused by benzene. The finding needs to be replicated by other studies.
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I biomarcatori di effetto misurano una risposta biologica quantificabile che possa essere direttamente attribuita a unesposizione C un crescente interesse per lo studio delle relazioni fra esposizioni ambientali, rischio di cancro in siti specifici e spettro mutazionale nei geni che predispongono al cancro: lesposizione a specifici cancerogeni potrebbe produrre una sorta di impronta digitale ossia un caratteristico spettro mutazionale in alcuni geni e/o codoni specifici

Mutazioni del TP53 nellesposizione a carcinogeni

Da Vahakangas K, 2003

Perch studiare le mutazioni del TP53?

Il TP53 il gene pi comunemente mutato nel cancro delluomo (pi del 50% dei tipi di tumori invasivi) e questo lo candida come un buon marcatore negli studi di epidemiologia molecolare del cancro Le mutazioni somatiche del TP53 sono riscontrate in molti tipi di cancro sporadici con una frequenza variabile dal 5% al 70%

Organizzazione della proteina p53: fattore di trascrizione

5 domini, 393 residui

mdm2

80% delle mutazioni

Le mutazioni del TP53 si ritrovano (80%) allinterno del DNA binding domain della proteina
30% 273 siti hotspot 245 282

248 175

NTransactivation Proline-rich DNA binding Oligomerisation Regulation

-C
(1-42; 43-62) (65-97) (102-292) (323-356) (363-393)

Mut. frequency Missense mut.

1% 50.8 %

2.3 % 45.4 %

80 % 82.1 %

3.4 % 36.4 %

0. 3% 72.7 %

July 2005

http://wwwhttp://www -p53.iarc.fr

I tumori con la pi alta frequenza di mutazioni del gene p53 (40-55%) sono quelli dellovaio, dellesofago, del colon-retto, della testa e del collo, e il cancro del polmone I tumori del cervello, della mammella, dello stomaco e del fegato mostrano una frequenza di mutazioni intermedia (20-35%)

 IARC TP53 DATABASE: http://www-p53.iarc.fr

Nato nel 1997 contiene tutte le pubblicazioni correlate allalterazione del gene p53 nelle cellule tumorali umane Ad oggi circa 20.000 mutazioni sono riportate in questo database Fornisce importanti informazioni sui fattori ambientali e i processi biologici che costituiscono le cause delle aberrazioni del gene

MARCATORI DI MALATTIA
Sono indicatori misurabili di un evento biologico o biochimico o molecolare che rappresenta uno stadio preclinico della malattia o una sua manifestazione I marcatori tumorali vengono utilizzati per rilevare e misurare la presenza di proteine, ormoni o altre sostanze, per seguire landamento clinico di un tumore, verificando lefficacia della terapia o la fase di ripresa della malattia

Marcatori di malattia: esempi

MARCATORI DI SUSCETTIBILIT

Indicatori della presenza di fattori genetici preesistenti allesposizione e da questa indipendenti, ma che possono influenzare la probabilit che la malattia si sviluppi a seguito dellesposizione

Marcatori di suscettibilit

Rappresentano un gruppo di marcatori tumorali che possono conferire predisposizione al cancro Possono essere ereditati (mutazioni nelle cellule germinali), geneticamente determinati o acquisiti Sono indipendenti dallesposizione ambientale

Suscettibilit genetica
Fenomeno dellinterazione gene-ambiente Le varianti genetiche assumono in tale contesto il significato di modificatori di effetto: data una relazione causa-effetto tra lesposizione ambientale e una definita patologia, al variare di un terzo fattore si osserva un incremento (suscettibilit) o decremento (protezione) della forza dellassociazione studiata Pertanto, la popolazione esposta risulta suddivisa in due gruppi distinti, luno a pi elevato rischio genetico e laltro a minor rischio genetico di sviluppare la malattia a seguito degli stessi livelli di esposizione ambientale

Polimorfismi genetici

Il genoma umano contiene approssimativamente 3.500.000.000 pb e di queste 10.000.000 sono probabilmente differenti tra individui diversi, costituendo i cosiddetti polimorfismi genetici I polimorfismi sono variazioni nella sequenza del DNA che includono delezioni, inserzioni, sostituzioni o mutazioni diverse e generalmente sono presenti nella popolazione con una frequenza di almeno l1%

Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs)

Le varianti genetiche, sia allo stato omozigote che eterozigote, nei geni di suscettibilit possono conferire differenti caratteristiche fenotipiche rispetto al wild type Alcune varianti di singole paia di basi sono definite Single Nucleotide Polymorphisms (SNPs) e sono potenzialmente responsabili della suscettibilit alle malattie

Interazione gene-ambiente nel cancro: origine genetica franca

Il 5-10% di tutti i tumori alla mammella si verificano in donne portatrici delle mutazioni nel gene BRCA1 o BRCA2, che conferisce ai portatori un rischio di cancro alla mammella di circa il 50-60%, Si tratta di una sindrome familiare ereditaria (le mutazioni sono germinali), a insorgenza precoce e che pu interessare anche il sesso maschile I geni BRCA1 e BRCA2 sono dei tumor-suppressor genes ad alta penetranza ma a bassa frequenza

Interazione gene-ambiente nel cancro: origine ambientale

Esistono alcuni tipi di cancro dovuti interamente a cause ambientali senza nessun ruolo della predisposizione genetica 15 lavoratori esposti alla beta-naftilamina in una industria chimica inglese nel 1950: tutti hanno sviluppato un cancro alle cellule di transizione della vescica

Interazione gene-ambiente nel cancro

La maggior parte dei tipi di cancro, comunque, sono probabilmente collocati in mezzo a questa scala: sono dovuti ad una interazione tra esposizione esogena e suscettibilit genetica causata da geni a bassa penetranza ma ad elevata frequenza

Identificare e misurare fattori di suscettibilit

I geni di suscettibilit possono modulare tutte le fasi del processo di cancerogenesi Sono molto diffusi nella popolazione, ma scarsamente correlati con il rischio di insorgenza di manifestazione clinica o Sono relativamente rari, ma altamente correlati con il rischio di insorgenza della manifestazione clinica

Identificare e misurare i fattori di suscettibilit

Fattori di suscettibilit ad elevata penetranza e bassa frequenza (0.1% nella popolazione generale) sono associati a geni deputati al controllo del differenziamento, del ciclo cellulare e della riparazione del DNA Fattori di suscettibilit a bassa penetranza ed elevata frequenza sono determinati da geni coinvolti nella produzione di enzimi implicati nel metabolismo delle sostanze cancerogene

Marcatori di Suscettibilit
Geni a bassa penetranza ed elevata frequenza Gli enzimi di fase I, quali ad esempio gli enzimi della superfamiglia dei p450, sono coinvolti nellattivazione (usualmente tramite lossidazione) degli agenti endogeni o esogeni: sono fattori di rischio per il cancro Gli enzimi di fase II, quali ad esempio il glutatione Stransferasi (GST) sono coinvolti nella inattivazione degli intermedi ossigenati mediante un processo di coniugazione: fattori protettivi per il cancro

I polimorfismi da delezione dei geni GSTM1 e GSTT1, che in caso di omozigosi (genotipo nullo) portano allassenza dellattivit enzimatica, sarebbero capaci di rendere pi suscettibili allo sviluppo del cancro

Case 1

Case 2

Case 3

Case 4

Case 5

GSTT1

beta-globin GSTM1

Figure. GSTM1 and GSTT1 genotyping from buccal cell DNA. Case 5 is null for the GSTT1 genotype. Case 2 is null for the GSTM1 genotype

Polimorfismi e riparazione del DNA

Oltre ai polimorfismi nei geni deputati al metabolismo dei cancerogeni, una fonte di variabilit potenzialmente importante costituita dai geni coinvolti nei processi di riparazione del DNA, che determinano le sindromi da instabilit cromosomica Atassia-teleangectasia e Xeroderma pigmentosum Estrema suscettibilit al cancro alla pelle indotto dai raggi UV

Esempio: la suscettibilit genetica al Cervico-carcinoma

Il cervico-carcinoma il secondo tumore pi frequente fra le donne in tutto il mondo 471.000 donne sviluppano il cancro alla cervice e 233.000 muoiono ogni anno (dato stimato nel 2000) La malattia colpisce principalmente giovani donne, con unet compresa tra i 30 e i 50 anni Linfezione sostenuta da alcuni tipi di Human Papilloma Virus (HPV) il fattore di rischio principale per lo sviluppo del cervico-carcinoma LHPV una causa necessaria ma non sufficiente per lo sviluppo del cervico-carcinoma

Human Papilloma Virus (HPV)

La World Health Organization (WHO), International Agency for Research on Cancer (IARC) ha classificato gli HPV in tre gruppi: carcinogenic (HPV 16 e 18) HR probably carcinogenic (HPV 31 e 33) LR possibly carcinogenic (6 e 11)

only a fraction of women with an HPV infection eventually develop cervical neoplasia (Lee et al., 2004)
fumo di sigaretta altre infezioni genitali caratteristiche del virus (alto e basso rischio) caratteristiche biologiche dellospite (recettivit epiteliale e immunoreazione)

Rischio di cancro Markers genetici (SNPs)

Componente ereditaria

Polimorfismi del p53 (TP53)

Nella popolazione umana sono stati identificati numerosi polimorfismi del gene p53, molti di questi sono localizzati in introni, al di fuori di sequenze di siti di splicing Solo due polimorfismi, da serina a prolina nel residuo 47 e da arginina a prolina in posizione 72, alterano la sequenza amminoacidica della p53. La variante Pro47 un raro polimorfismo che colpisce un codone altamente conservato. Per il residuo 72, sono state osservate precise differenze etniche

 suscettibilit genetica allHPV: polimorfismo del gene p53

due principali forme polimorfiche al codone 72, ove vi pu essere larginina o la prolina le proteine contenenti residui di arginina in posizione 72 costituiscono un target ottimale per la degradazione da parte della proteina E6 dellHPV 16 (Storey et al., 1998) gli individui omozigoti pel lallele codificante larginina possono avere una maggiore suscettibilit al cancro correlato allinfezione da HPV

 Alcuni studi mostrano che non esiste una relazione tra il polimorfismo del codone 72 del p53 e il CC Altri studi mostrano una sovra-espressione dellomozigosi p53Arg nel CC confrontata con leterozigosi o lomozigosi p53Pro, suggerendo che questi individui omozigoti p53Arg sono geneticamente suscettibili al CC

 Lo sviluppo del cancro alla cervice un processo multistadi, in cui molti fattori genetici dellospite e fattori ambientali possono essere coinvolti; ci potrebbe spiegare la discrepanza dei risultati dei vari studi condotti sullargomento E possibile che in presenza di fattori di rischio addizionali, il contributo dei polimorfismi diventi irrilevante per lo sviluppo del cancro