Reaccin en cadena de la polimerasa

Gel de agarosa teido con bromuro de etidio que muestra varios productos de PCR obtenidos mediante distintos cebadores, con un bajo nivel de especificidad.

La reaccin en cadena de la polimerasa, conocida como PCR por sus siglas en ingls (polymerase chain reaction), es una tcnica de biologa moleculardesarrollada en 1987 por Kary Mullis,1 cuyo objetivo es obtener un gran nmero de copias de un fragmento de ADN particular, partiendo de un mnimo; en teora basta partir de una nica copia de ese fragmento original, o molde. Esta tcnica sirve para amplificar un fragmento de ADN; su utilidad es que tras la amplificacin resulta mucho ms fcil identificar con una muy alta probabilidad,virus o bacterias causantes de una enfermedad, identificar personas (cadveres) o hacer investigacin cientfica sobre el ADN amplificado. Estos usos derivados de la amplificacin han hecho que se convierta en una tcnica muy extendida, con el consiguiente abaratamiento del equipo necesario para llevarla a cabo.
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1 Fundamento e importancia 2 Reactivos 3 Conceptos de la PCR 4 Ciclo de amplificacin

o o o o o o

4.1 Inicio 4.2 Desnaturalizacin 4.3 Alineamiento o unin del cebador 4.4 Extensin o elongacin de la cadena 4.5 Elongacin final 4.6 Conservacin

5 Optimizacin de la PCR 6 Tipos de PCR

o o o o o o

6.1 PCR anidada 6.2 PCR de extensin solapada (Mutagnesis) 6.3 PCR in situ 6.4 PCR mltiple 6.5 PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR) 6.6 PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)

6.7 Variaciones de la PCR bsica

7 Aplicaciones

o o o o

7.1 Investigacin 7.2 Medicina 7.3 Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses 7.4 Agronoma y diversidad

8 Historia

8.1 Guerras de patentes

9 Vase tambin 10 Referencias 11 Bibliografa 12 Enlaces externos

Fundamento e importancia[editar editar cdigo]

Esta tcnica se fundamenta en la propiedad natural de los ADN polimerasas para replicar hebras de ADN, para lo cual se emplean ciclos de altas y bajas temperaturas alternadas para separar las hebras de ADN recin formadas entre s tras cada fase de replicacin y, a continuacin, dejar que las hebras de ADN vuelvan a unirse para poder duplicarlas nuevamente. La reaccin en cadena de la polimerasa fue perfeccionada por Kary Mullis perteneciente a la Cetus Corporation en California, en la dcada de 1980. Inicialmente la tcnica era lenta, ya que las polimerasas se desnaturalizaban al realizar los cambios de temperatura y era necesario agregar nuevas polimerasas en cada ciclo. Puesto que las temperaturas del ciclo (95 C en las fases dedesnaturalizacin del ADN) suponen la inmediata desnaturalizacin de toda protena, se emplean ADN polimerasas termoestables, extradas de microorganismos adaptados a vivir a esas temperaturas, restrictivas para la mayora de los seres vivos. Dichos microorganismos, generalmente arqueas, son: Thermus aquaticus (polimerasa Taq), Pyrococcus furiosus(Pfu), Thermococcus litoralis (Vent) y Thermus thermophilus (Tth). Generalmente se emplean mezclas de polimerasas muy procesivas (Taq) con otras capaces de hacer correccin de errores (Pfu, Vent).

Termociclador: aparato en el que se efecta la PCR convencional.

Hoy, todo el proceso de la PCR est automatizado mediante un aparato llamadotermociclador, que permite calentar y enfriar los tubos de reaccin para controlar la temperatura necesaria para cada etapa de la reaccin. Muchos termocicladores modernos

hacen uso del efecto Peltier, que permite tanto calentar como enfriar los tubos simplemente invirtiendo la corriente elctrica. Los tubos usados para PCR tienen una pared muy fina, lo que favorece una buena conductividad trmica, permitiendo que se alcance rpidamente el equilibrio trmico. Casi todos los termocicladores tienen un sistema que calienta la tapa de cierre con el fin de evitar la condensacin sobre los tubos de reaccin. Los termocicladores ms antiguos carecan de este sistema y solucionaban el problema de la condensacin con una capa de aceite en la parte superior de la mezcla de reaccin o con un poco de cera dentro de los tubos. Por lo general, la PCR es una tcnica comn y normalmente indispensable en laboratorios de investigacin mdica y biolgica para una gran variedad de aplicaciones. Entre ellas se incluyen la clonacin de ADN para la secuenciacin, la filogenia basada en ADN, el anlisis funcional de genes, el diagnstico de trastornos hereditarios, la identificacin dehuellas genticas (usada en tcnicas forenses y test de paternidad) y la deteccin y diagnstico de enfermedades infecciosas.

Reactivos[editar editar cdigo]

Tubos de PCR que albergan la mezcla en un volumen total de 100 L.

Para realizar la tcnica se necesitan:2

Los 4 desoxirribonucletidos-trifosfato (dNTP), sustratos para polimerizarnuevo ADN. Dos cebadores o iniciadores (en ingls, primers), oligonucletidos que son, cada uno, complementarios a una de las dos hebras del ADN. Son secuencias cortas, de entre seis y cuarenta nucletidos, normalmente de dieciocho a veintids, que permiten que la polimerasa inicie la reaccin. Deben estar enfrentados y a no mucha distancia. Delimitan la zona de ADN a amplificar, es decir, corresponden a los nucletidos que definen los extremos de la secuencia que se desea replicar.

Iones divalentes. Se suele usar magnesio (Mg2+), agregado comnmente como cloruro de magnesio (MgCl2), o algn otro catin divalente. Tambin se puede emplear manganeso (Mn2+), para mutagnesis de ADN mediante PCR, ya que altas concentraciones de Mn2+ incrementan la tasa de error durante la sntesis de ADN. Actan como cofactoresde la polimerasa.

Iones monovalentes, como el potasio. Una solucin tampn o buffer que mantiene el pH adecuado para el funcionamiento de la ADN polimerasa.

ADN polimerasa o mezcla de distintas polimerasas con temperatura ptima alrededor de 70 C (la ms comn es lapolimerasa Taq).

ADN molde, que contiene la regin de ADN que se va a amplificar. Termociclador, el aparato que mantiene la temperatura necesaria en cada una de las etapas que conforman un ciclo.

Conceptos de la PCR[editar editar cdigo]

Sensibilidad: se refiere a la cantidad mnima de ADN necesaria para que se produzca la amplificacin, es decir, para obtener una banda. Se relaciona con los falsos negativos, ya que puede que una muestra sea positivas pero sea dada como negativa porque no se ha amplificado por no tener suficiente cantidad de ADN.

Especificidad: se refiere a la obtencin de un solo producto amplificado. Viene determinada por los oligos y la especificidad con la que se unen al ADN molde. De esta forma, si los oligos tienen ms de un sitio al que se pueden unir aparecer ms de un producto amplificado.

Eficiencia: se refiere a la amplificacin mxima que se puede obtener en un nmero determinado de ciclos.

Fidelidad: se refiere a los errores que comete la ADN polimerasa durante la amplificacin. Este concepto es de especial importancia en la secuenciacin, pero en otros casos no es tan importante. Una buena fidelidad permite evitar falsos positivos y/o negativos.

Ciclo de amplificacin[editar editar cdigo]

Esquema general de la PCR.

Grado de amplificacin segn el nmero de ciclos empleados. A: gel de agarosa (1: ladder, 2: producto especfico, 3: producto inespecfico); B concentracin de ADN respecto del tiempo; C logaritmo de la concentracin de ADN respecto del tiempo.

El proceso de PCR por lo general consiste en una serie de 20 a 35 cambios repetidos de temperatura llamados ciclos; cada ciclo suele consistir en 2-3 pasos a diferentes temperaturas. La PCR comn se realiza con ciclos que tienen tres pasos de temperatura. Los pasos de ciclos a menudo estn precedidos por un choque trmico (llamado "hold") a alta temperatura (> 90 C), y seguido por

otro hold al final del proceso para la extensin de producto final o el breve almacenaje. Las temperaturas usadas y el tiempo aplicado en cada ciclo dependen de gran variedad de parmetros. stos incluyen la enzima usada para la sntesis de ADN, la concentracin de iones divalentes y de los dNTP en la reaccin, y la temperatura de unin de los cebadores, as como la longitud del ADN que se desea amplificar. 2 Actualmente, casi todos los termocicladores dan la opcin de realizar la reaccin de PCR con la llamada " tapa caliente". Es decir, que el sistema del termociclador aplicar calor a la parte de arriba del vial que contiene la mezcla de PCR. Al comienzo, los laboratorios que empezaron a usar los primeros aparatos que se comercializaron y que no incluan este sistema tenan que poner unas gotas de aceite dentro del vial. El objetivo de este procedimiento, al igual que el de la tapa caliente, es evitar la condensacin de la muestra, ya que en el eppendorf se encuentran dos fases:lquido y gas. Al condensarse la muestra, perdemos volumen de la mezcla. Sin embargo, calentando la tapa o poniendo las gotas de aceite evitamos este proceso fsico, conservando casi intacto el volumen de la muestra.

Inicio[editar editar cdigo]

Este paso consiste en llevar la reaccin hasta una temperatura de 94-96 C ( 98 C si se est usando una polimerasa termoestable extrema), que se mantiene durante 1-9 minutos. Esto slo es necesario para ADN polimerasas que requieran activacin por calor.

Desnaturalizacin[editar editar cdigo]

En primer lugar, se desnaturaliza el ADN (se separan las dos cadenas de las cuales est constituido). Este paso puede realizarse de diferentes modos, siendo el calentamiento (94-95 C) de la muestra la forma ms habitual. La temperatura a la cual se decide realizar la desnaturalizacin depende, por ejemplo, de la proporcin de G+C que tenga la cadena, como tambin del largo de la misma. Otros mtodos, raramente empleados en la tcnica de la PCR, seran la adicin de sales o agentes qumicos capaces de realizar la desnaturalizacin.

Alineamiento o unin del cebador[editar editar cdigo]

A continuacin se producir la hibridacin del cebador, es decir, el cebador se unir a su secuencia complementaria en el ADN molde. Para ello es necesario bajar la temperatura a 40-68 C durante 20-40 segundos (segn el caso), permitiendo as el alineamiento. Los puentes de hidrgeno estables entre las cadenas de ADN (unin ADN-ADN) slo se forman cuando la secuencia del cebador es muy similar a la secuencia del ADN molde. La polimerasa une el hbrido de la cadena molde y el cebador, y empieza a sintetizar ADN. Los cebadores actuarn como lmites de la regin de la molcula que va a ser amplificada.

Extensin o elongacin de la cadena[editar editar cdigo]

Acta la ADN polimerasa, tomando el ADN molde para sintetizar la cadena complementaria y partiendo del cebador como soporte inicial necesario para la sntesis de nuevo ADN. La polimerasa sintetiza una nueva hebra de ADN complementaria a la hebra molde aadiendo los dNTP complementarios en direccin 5' 3', uniendo el grupo 5'-fosfato de los dNTP con el grupo 3'-hidroxilo del final de la hebra de ADN creciente (la cual se extiende). La temperatura para este paso depende de el ADN polimerasa que usemos. Para la polimerasa Taq, la temperatura de mxima actividad est en 75-80 C (comnmente 72 C). El tiempo de extensin depende tanto de el ADN polimerasa usada como de la longitud del fragmento de ADN que se va a amplificar. Hay una regla comnmente usada: en su temperatura ptima, la polimerasa de ADN polimerizar mil bases en un minuto.

Elongacin final[editar editar cdigo]

Etapa nica que se lleva a cabo a una temperatura de 70-74 C durante 5-15 minutos tras el ltimo ciclo de PCR. Con ella se asegura que cualquier ADN de cadena simple restante sea totalmente ampliado.

Conservacin[editar editar cdigo]

Este es un paso que se lleva a cabo a 4-15 C durante un tiempo indefinido para conservar la reaccin a corto plazo. La PCR normalmente se realiza con un volumen de reaccin de 15-100 L, en pequeos tubos de 0.2-0.5 mL que se colocan en el termociclador. Para verificar que la PCR ha generado el fragmento de ADN previsto, se emplean tcnicas de electroforesis, que separan los fragmentos de ADN generados de acuerdo a su carga, esto es, longitud, y, en menor medida y dependiendo de la matriz empleada, a su tamao: tpicamente se emplean la electroforesis en gel de agarosa, para fragmentos grandes; en acrilamida, para los ms pequeos; y, de forma ms rpida y aplicable a la PCR asociada a marcaje fluorescente, la electroforesis capilar.3 El/los tamao/s de los productos de la PCR vienen determinados por un marcador de peso molecular de ADN, el cual contiene fragmentos de ADN de tamao conocido, y que se corre en el gel junto con los productos de PCR.

Optimizacin de la PCR[editar editar cdigo]

En la prctica, la PCR puede fallar por varias razones, entre ellas:

La PCR es una tcnica de gran sensibilidad, es decir, necesita una mnima cantidad de ADN para obtener un gran nmero de copias. Adems, puede ser muy propensa a errores si se lleva a cabo en condiciones inadecuadas de esterilidad, que conduzcan a la amplificacin de ADN no correspondiente a la muestra a analizar (y por tanto a conclusiones inciertas). Se han de tomar una serie de precauciones para evitar la contaminacin con ADN extrao. Ejemplos en los que es especialmente importante evitar la amplificacin son la deteccin de enfermedades (para no diagnosticar errneamente a los pacientes) o el diagnstico de identidad y parentesco. Posibles precauciones son:

Tener especial cuidado durante los pasos previos a la amplificacin: recogida, envo, custodia y procesado de muestras.

Limpieza exhaustiva y esterilizacin (leja, etanol, luz UV, psoralenos...) de la superficie de trabajo entre la realizacin de una PCR y la siguiente.

En laboratorios de diagnstico gentico, se suelen tener reas separadas de trabajo: un laboratorio para la preparacin de la mezcla madre para la PCR, otro para la adicin del ADN a amplificar, otro donde se encuentra la maquinaria para realizar la PCR y otro donde se abre y analiza la muestra ya amplificada.

Cabinas de seguridad biolgica para reducir vapores cargados de amplicones de enfermedades.

Proteccin adecuada de los operarios que manipulen las muestras y los instrumentos del laboratorio: guantes, bata, cubrezapatos, gafas de seguridad, pelo recogido... En el diagnstico molecular es conveniente que se cambien estos elementos al pasar de una zona de trabajo a otra.

Controles positivos y negativos.

Tipado de todo el personal del laboratorio. En el caso de encontrar una amplificacin no esperada se podr comprobar si proviene de uno de los operarios.

Las tcnicas de diseo de cebadores son importantes en la mejora de la obtencin de productos de PCR y en evitar la formacin de productos falsos. Algunas consideraciones al disear estos cebadores son:

Se recomienda usar primers de ms de 15 nucletidos (18-30 nn) Normalmente, se suelen disear de 20 nucletidos. Los cebadores muy cortos hacen que nuestra PCR no sea muy especfica, y los que se excedan en longitud harn que perdamos rendimiento en la reaccin.

Los primers no deben diferir en ms de 3 bases. La proporcin entre bases pricas y pirimidnicas de los dos oligos sea 1:1 (40-60% a lo sumo), y que empiecen y terminen con 1 2 bases pricas.

Se requiere una distribucin homognea de los cuatro nucletidos en la secuencia, evitando los poliT/A/G/C.

La Tm (melting temperature) de los oligos no puede diferir en ms de 5 C. Los cebadores no deben incluir en su secuencia regiones que sean complementarias entre s, o se formarn dmeros entre ellos.

Existe una gran variedad de polimerasas disponibles, pudiendo elegir la que ms se ajuste a nuestras necesidades. Por ejemplo, algunas tienen actividades inexistentes en otras o las realizan de forma ms eficiente, o funcionan en intervalos de temperatura en los cuales otras se desnaturalizan o pierden funcionalidad. Las ms habituales son la taq y la pfu.

Los componentes del tampn de reaccin debern ajustarse a las exigencias de nuestras enzimas.

El termociclador, por supuesto, debe ser capaz de reproducir correctamente los ciclos de la PCR: para ello, diversas casas comerciales nos ofrecern termocicladores elaborados con materiales que hagan ms eficaces el desarrollo y el transcurso de las etapas, adems de diversas facilidades de manejo. Dentro del laboratorio, su manejo, mantenimiento y ubicacin ser clave.

Aparte de aspectos como la contaminacin y algn fallo en la hibridacin de primers, puede haber otras complejidades que afecten a la PCR, como son:

Degradacin del ADN: esto puede ocurrir cuando se manipula la muestra en condiciones subptimas o cuando se hace una autopsia, por ejemplo, y resulta en ausencia de amplificacin o resultados parciales. Un caso particular es el "allele dropout", o bien prdida de un alelo, que se puede llegar a confundir con ser homocigtico para dicho alelo.

Inhibicin de la PCR: puede haber agentes que interfieran en el correcto transcurso de la PCR. Requerir un procesamiento adicional de la muestra para eliminar estos compuestos del medio antes de preparar la mezcla de PCR. Tanto la sangre como el semen contienen este tipo de inhibidores, por lo que es necesario una purificacin previa.

Modificacin del ADN: las sustancias como el formol (empleado en conservacin de tejidos) o la luz ultravioletamodifican el ADN, alterando as los resultados de la amplificacin.

Artefactos: pueden darse situaciones como las bandas "stutter" o "shadow", que consisten en que la polimerasa amplifica una repeticin de ms de un microsatlite o repeticin en tndem.

Alelo fuera de patrn: un alelo amplificado puede no coincidir con el patrn de picos de la referencia. Esto es seal de que algo ha ido mal durante la PCR.

Mezclas: es posible que dos muestran se mezclen de alguna forma y el resultado sea una combinacin del patrn de picos que cabe esperar tras la amplificacin de cada una de ellas por separado. Esto y el caso anterior dificulta la interpretacin de los resultados.

Tipos de PCR[editar editar cdigo]

PCR anidada[editar editar cdigo]
Tcnica muy sensible de PCR en la que el producto de una amplificacin es utilizado como molde para realizar una segunda amplificacin con cebadores que se ubican dentro de la primera secuencia amplificada, es decir, cuando tenemos el primer amplicn se pueden unir los cebadores y se hace de nuevo una amplificacin dentro del amplicn inicial. Este tipo de PCR tiene la ventaja de brindar alta sensibilidad y especificidad. La especificidad aumenta porque como es amplificacin de un amplicn obtenido previamente, los cebadores slo van a hibridar en un sitio dentro de la molcula y el resultado ser una nica banda. As, evitamos posibles hibridaciones inespecficas de los cebadores. La desventaja de sta tcnica es que no nos permite cuantificar la muestra.

PCR de extensin solapada (Mutagnesis)[editar editar cdigo]

Se introducen cambios de secuencia dentro de fragmentos (clonados) de ADN. Se requieren 2 cebadores (primmers) mutagnicos y otros 2. Se amplifica un fragmento 5' y un fragmento 3' que se solapan portando ambos la mutacin. Se usan los productos en otra reaccin para producir el ADN mutado de longitud completa

PCR in situ[editar editar cdigo]

La PCR in situ consiste en una reaccin de PCR en secciones histolgicas o clulas, donde los productos generados pueden visualizarse en el sitio de amplificacin. Es realizada sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la tcnica de PCR in situ se realiza una primera amplificacin de ADN blanco y luego deteccin mediante hibridacin in situ convencional con sondas de ADN/ARN. De esta manera pueden detectarse cantidades pequesimas de genoma. Esta tecnologa es de gran alcance en la capacidad de amplificar especficamente una poblacin de secuencias de menor representacin.

PCR mltiple[editar editar cdigo]

PCR en la cual se amplifica simultneamente ms de una secuencia. Para ello, se combinan dos o ms pares de cebadores en un mismo tubo, junto con el resto de los reactivos de la reaccin en cantidades suficientes, para amplificar simultneamente varios segmentos de ADN. Ventajas: informacin sobre varios locus en una sola reaccin, menor cantidad de molde para el anlisis, menor cantidad de reactivos, rpida construccin de bases de datos. Desventajas: para llevarla a cabo adecuadamente y sin errores, se requiere de una cuidadosa optimizacin del proceso.

PCR con transcriptasa inversa (RT-PCR)[editar editar cdigo]

Es una variante de la PCR en la que usamos ARN como molde inicial en vez de ADN, y emplea una transcriptasa inversa(como Tth) para realizar la sntesis de un ADN complementario al ARN (ADNc). De esta forma, el desarrollo inicial de una RT-PCR sera:

1er paso: retrotranscripcin a partir del ARN. 2 paso: amplificacin a partir de la primera hebra de ADNc. 3er paso: PCR estndar.

PCR en tiempo real o PCR cuantitativo (qPCR)[editar editar cdigo]

Artculo principal: PCR en tiempo real.

Reaccin de PCR cuya principal caracterstica es que permite cuantificar la cantidad de ADN o ARN presente en la muestra original, o para identificar con una muy alta probabilidad, muestras de ADN especficas a partir de su temperatura de fusin(tambin denominado valor Tm, del ingls melting temperature). Se puede dividir en las tcnicas basadas en fluorocromos no especficos y en las tcnicas basadas en sondas especficas. En las tcnicas basadas en fluorocromos el ADN, que ve multiplicada su cantidad con cada ciclo, se une al fluorocromo (generalmente SYBR Green) produciendo fluorescencia que es medida por el termociclador apto para PCR en tiempo real. Permite cuantificar slo una secuencia por reaccin pero tiene la ventaja de utilizar cebadores normales para su realizacin. Es mucho ms econmica que la que usa sondas especficas. Las tcnicas basadas en sondas especficas utilizan una sonda unida a dos fluorocromos que hibrida en la zona intermedia entre el cebador directo (forward) y el inverso (reverse); cuando la sonda est intacta, presenta una transferencia energtica de fluorescencia por resonancia (FRET). Dicha FRET no se produce cuando la sonda est daada y los dos fluorocromos estn distantes, producto de la actividad 5'-3' exonucleasa de la ADN polimerasa. Esto permite monitorizar el cambio del patrn de fluorescencia y deducir el nivel de amplificacin del gen. La mayora de estos inconvenientes se han solucionado con la introduccin de la PCR realizada en tiempo real (Q-PCR), que elimina cualquier proceso post-PCR puesto que monitoriza la progresin de la amplificacin en el momento en que ocurre. A diferencia de la PCR convencional (en punto final), que mide la acumulacin del ADN al final de un nmero predeterminado de ciclos, con Q-PCR esto se hace durante el proceso de amplificacin usando fluorescencia, de forma que su aumento es proporcional a la cantidad de ADN formada. El proceso se puede automatizar fcilmente usando un sistema que realice la amplificacin (termociclador) y que a su vez sea capaz de leer fluorescencia. Existe una amplia oferta de aparatos en el mercado. La mayora pueden trabajar con las diversas opciones de marcado fluorescente y son "abiertos", es decir, permiten programar las condiciones de amplificacin y lectura de forma que su uso no queda limitado a unos reactivos determinados.

Variaciones de la PCR bsica[editar editar cdigo]

PCR especfica de alelo: esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs).

PCR "assembly": consiste en la sntesis artificial de largas secuencias de ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucletidos largos con secuencias solapantes cortas.

PCR asimtrica: usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra.

PCR de colonia: mediante esta tcnica, colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rpidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN.

Amplificacin dependiente de helicasa: esta tcnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de hibridacin-elongacin.

PCR hot-start: esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica durante las etapas iniciales de la PCR: mientras que la mquina alcanza la temperatura de la primera etapa (unos 95) puede que ocurra la unin de los cebadores y se produzca amplificacin, ya que en el camino para alcanzar estos 95 se pasa por la temperatura de anillamiento (que es ms baja). Para evitar esto, la PCR hot-start se basa en que la reaccin comience cuando la mquina ya est a 95, debido a que antes no se encuentran presentes la polimerasa o el cloruro de magnesio, lo que podemos conseguir mediante varias tcnicas: - Aadir la polimerasa o el cloruro de magnesio tras el periodo de calentamiento - Separar por una capa de cera los distintos componentes de la reaccin. La cera se funde al alcanzar los 95 y es entonces cuando los componentes entran en contacto - Anticuerpos anti-polimerasa que estn bloqueando a la polimerasa. Al alcanzar los 95 estos anticuerpos se inactivan debido a que se desnaturalizan y la polimerasa puede actuar

PCR especfica de intersecuencia (ISSR): se trata de un mtodo de PCR para su uso en huella gentica, que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella gentica nica de longitudes de fragmento amplificadas.

PCR inversa: es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es conocida una secuencia interna. Muy til en la identificacin de secuencias que flanquean insertos genmicos.

PCR mediada por ligacin: este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al ADN de inters y mltiples cebadores hibridando estos linkers.

PCR especfica de metilacin (MSP): se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN genmico.

Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification o MLPA): permite amplificar varias secuencias objetivo con un nico par de cebadores, evitando as las limitaciones de resolucin de la PCR multiplex.

PCR cuantitativa: se usa para medir la cantidad de un producto de PCR. En la tcnica clsica de PCR, se cuantifica por aproximacin con diluciones y amplificacin de concentraciones conocidas de la secuencia diana. Tambin se puede cuantificar por mtodo competitivo: se trabaja con concentraciones crecientes conocidas de un fragmento que puede ser amplificado por los mismos oligos que la muestra de estudio, pero de menor tamao que sta, de forma que con los resultados obtenidos se puede estimar qu concentracin del competidor es equivalente a la de la muestra de cantidad desconocida. La cuantificacin en PCR est optimizada en la tcnica de PCR en tiempo real.

PCR-TAIL: la PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.

PCR touchdown: se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la secuencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada en el alineamiento cebador-secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de la PCR.

PAN-AC: este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede ser usado en clulas vivas.

Ciclo trmico rpido para PCR: 4 La amplificacin del DNA puede llevarse a cabo rpidamente, como completar 30 ciclos en menos de 30 minutos: ciclo trmico rpido. Normalmente se ha considerado que las etapas de cada ciclo son tres reacciones que ocurren en tres periodos separados y a tres temperaturas diferentes. Este paradigma del equilibrio secuencial no tiene en cuenta que la temperatura de la muestra no cambia instantneamente, de hecho, durante una PCR la muestra est la mayora del tiempo en temperaturas de transicin. El ciclo trmico rpido aprovecha la ventaja de la instantnea desnaturalizacin e hibridacin, cuyas temperaturas necesitan alcanzarse, pero no mantenerse. Adems, para productos cortos, la extensin puede llevarse a cabo durante la transicin a la temperatura de extensin, y por lo tanto, tampoco es necesario mantenerla. Un ciclo rpido podra entonces describirse como 94C, 0 seg; 55C, 0 seg y 72C, 0 seg. Como vemos, este modelo no ayuda, porque nos lleva solo a temperaturas extremas y no nos da informacin sobre lo que pasa entre ellas. En cambio, en el paradigma cintico para PCR de ciclo rpido se describe completamente el historial de temperaturas de la muestra. Se considera que desnaturalizacin, hibridacin y elongacin ocurren en un rango de temperaturas y adems pueden solapar temporalmente. Hay termocicladores que permiten que un ciclo se complete en 20-60 segundos, por lo que 30 ciclos tardan de 10 a 30 minutos.

Aplicaciones[editar editar cdigo]

La tcnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: ya en ciencia bsica, como herramienta de deteccin y/o generacin de acervos de fragmentos de ADN de inters; ya en ciencia aplicada, como elemento resolutivo en s mismo, por ejemplo en diagnstico clnico.

Investigacin[editar editar cdigo]

La PCR convencional, se emplea como base para multitud de tcnicas en el laboratorio debido a su robustez y rapidez. De este modo, la PCR de punto final permite controlar y detectar los fragmentos de ADN de inters.

Clonacin de un segmento de ADN mediante amplificacin con cebadores que contienen una secuencia apta para larecombinacin dirigida con un plsmido.

Una aplicacin de la PCR de extrema importancia es la clonacin de secuencias de ADN en vectores, como pueden ser los plsmidos. Para ello, se emplean cebadores que contienen en su extremo 5' una corta secuencia que permite la interaccin posterior con otra complementaria situada en el vector de clonacin a emplear. Por ejemplo, se puede incluir una diana de restriccin en dichos cebadores, de modo que, y si sta no exista previamente en el fragmento y es nica en el vector, pueda efectuarse una ligacin mediante la ligasa de T4 tras la digestin con la enzima de restriccin apropiada de ambos elementos. Otro mtodo asimilable a esta va es el empleo de la recombinacin dirigida; esto es, se adapta al 5' de los cebadores una secuencia que faculta a una recombinasa la recombinacin dirigida con un vector dado.5

Medicina[editar editar cdigo]

En medicina, la PCR se emplea fundamentalmente como herramienta dediagnosis (Coleman y Tsongalis, 2006):

Permite el genotipar la especie o especies que provocan un determinado cuadro infeccioso: para ello, se amplifica una zona del genoma bacteriano cuyo producto de PCR posea unas caractersticas de tamao o temperatura de fusin que permitan identificarlo de forma inequvoca. En el caso de infecciones virales que implican la integracin del genoma del

patgeno en el ADN del hospedador, como es el de la infeccin por VIH, la PCR cuantitativa posibilita la determinacin de la carga viral existente y por tanto, del estadio de la enfermedad.6

La PCR tambin se puede usar en revisiones mdicas rutinarias, como en los servicios de donantes de sangre, para test de rutina. A travs de esta tcnica se pueden detectar infecciones peligrosas en el donante (como VIH o Hepatitis B) mientras an estn en el periodo de incubacin. Dada la sensibilidad de los test de PCR se pueden tomar muestras colectivas o "pools" (por ejemplo, 96 pruebas individuales). Si una de estas muestras colectivas da positivo, se toman a partir de ella muestras progresivamente menores hasta que se encuentra el causante.

El diagnstico de enfermedades hereditarias presentes en el genoma es un proceso largo y complicado que puede acortarse significativamente gracias a la PCR. Cada uno de los genes prueba se pueden amplificar mediante sus correspondientes cebadores y posteriormente secuenciar para detectar la existencia de mutaciones.

Paleontologa, antropologa biolgica, y ciencias forenses[editar editar cdigo]

Los campos de la paleontologa, antropologa biolgica y la medicina y antropologa forense se han visto enormemente beneficiados por esta tcnica, puesto que todas ellas construyen con frecuencia el conocimiento de sus correspondientes disciplinas gracias a restos o huellas de seres vivos. Uno de los materiales biolgicos que ms informacin puede proporcionar es el ADN. La relativa estabilidad de ste permite que, aunque fragmentado, se conserve durante largos perodos si las condiciones son propicias.5 En ocasiones las muestras intactas con las que se puede contar son extraordinariamente pequeas o estn deterioradas. La PCR soluciona ambos problemas y proporciona cantidades tiles para posteriores pasos de anlisis. En primer lugar aumenta la cantidad de material recuperado a partir de muestras escasas, puesto que como ya se dijo anteriormente, en teora basta una sola molcula para que el proceso pueda tener lugar. Tambin debido a la naturaleza de la tcnica y su propsito de amplificacin de fragmentos pequeos, esta fragmentacin no impide que este ADN pueda ser empleado como molde para una reaccin de PCR.

En paleontologa y Antropologa la PCR permite recuperar las escasas cantidades de ADN que an no se han degradado. Algunos lugares en que el ADN podra preservarse son la brea las cenizas volcnicas, el mbar, hielos histricos polares o glaciares y ambientes ridos, sedimentos, as como en los cristales de apatita de restos de esqueleto,7 siendo posible de ese modo caracterizar cadveres, fsiles u otros restos mediante genotipado por anlisis de microsatlites o incluso genomas de taxones extintos, amplificados de este modo, como pueden ser los realizados mediante el ADN genmico del hombre de Neanderthal.8 El propsito sera utilizar este ADN amplificado para posteriormente realizar estudiosfilogenticos o etnogrficos o de poblaciones mediante la comparacin de secuencias de ADN, o el estudio de las causas de la separacin evolutiva de dos especies.

En las ciencias forenses se emplea para establecer la filiacin de una persona o para obtener pruebas a partir de muestras mnimas dejadas por el autor de un crimen como saliva, semen u otros restos de tejidos (Butler, 2005).

Agronoma y diversidad[editar editar cdigo]

Tal y como la PCR multiplex permite producir huellas genticas de individuos concretos, dentro del marco de la gentica forense, existen mtodos basados en la PCR que permiten discernir entre grupos infraespecficos de cultivos de inters agronmico; por ejemplo, de cultivares.9 Para ello, se emplean oligonucletidos de un tamao lo suficientemente pequeo como para que ceben de forma relativamente inespecfica, aunque siempre de tal forma que produzcan un patrn de bandas discreto e interpretable. De este modo, la pauta obtenida tras la electroforesis de los fragmentos tiende a agrupar a los individuos de mayor semejanza, que poseen un comportamiento similar, de los que divergen...

Historia[editar editar cdigo]

Electroforesis de protenas SDS-PAGEresolviendo la polimerasa Taq.

En 1971, un artculo publicado por Kleppe et al. en Journal of Molecular Biologydescribi por primera vez un mtodo que usaba enzimas para replicar una secuencia pequea de ADN con cebadores in vitro.10 Sin embargo, este temprano ejemplo del principio bsico de la PCR no recibi mucha atencin, y la invencin de la reaccin en cadena de la polimerasa en 1983 es generalmente atribuida a Kary Mullis.11 12 Mullis gan el Premio Nobel por su trabajo en PCR. Algo muy a tener en cuenta en la PCR es que la ADN polimerasa que se use sea capaz de soportar las altas temperaturas de >90 C necesarias para la separacin de las dos hebras de ADN de la doble hlice tras cada ciclo de replicacin. Las ADN polimerasas que se utilizaron originariamente para los experimentos in vitroprevios a la PCR no eran capaces de soportar estas altas temperaturas, por lo que los primeros procedimientos para replicar el ADN eran muy ineficientes, largos y requeran grandes cantidades de ADN polimerasa. El descubrimiento en 1976 de la polimerasa Taq, una polimerasa de ADN extrada de la bacteria termfila Thermus aquaticus que habita medios de muy alta temperatura (50-80 C), elimin los grandes inconvenientes del mtodo de la PCR. Este ADN polimerasa es estable a altas temperaturas, permaneciendo activa hasta despus de la desnaturalizacin del ADN, eliminando la necesidad de aadir a la reaccin nueva polimerasa tras cada ciclo. Este descubrimiento permiti automatizar el proceso, antes tan tedioso, acoplndolo al uso del termociclador.

Al mismo tiempo que desarrollaba la PCR en 1983, Mullis trabajaba en Emeryville, California (EE UU), para una de las primeras empresas biotecnolgicas, Cetus Corporation, donde era responsable de sintetizar cadenas cortas de ADN. Mullis afirma que concibi la idea para la PCR una noche mientras cruzaba la Autopista de la Costa Pacfica (EE UU) en su coche.11Estaba imaginando una nueva forma de analizar mutaciones en el ADN cuando se percat de que, en lugar de eso, haba inventado un mtodo para amplificar regiones especficas de ADN mediante ciclos de duplicacin repetidos usando ADN polimerasas. Mullis atribuye la invencin de esta tcnica a los efectos de la droga psicodlica y alucingena LSD.13 En la revista Scientific American, Mullis resumi el procedimiento: "Comenzando con una nica molcula del material gentico ADN, la PCR puede generar 100 billones de molculas iguales en una tarde. La reaccin es fcil de hacer, no requiere ms que un tubo de pruebas, unos pocos reactivos simples y una fuente de calor."14 Fue premiado con el Premio Nobel de Qumica en 1993 por su invencin, y siete aos despus, l y sus colegas del Cetus llevaron a la prctica su propuesta. Sin embargo, han aparecido controversias y diferentes versiones sobre las contribuciones intelectuales y prcticas de otros cientficos al trabajo de Mullis, y sobre si l fue el inventor nico del principio de la PCR.

Guerras de patentes[editar editar cdigo]

La tcnica de la PCR fue patentada por Cetus Corporation, donde Mullis trabajaba cuando invent la tcnica en 1983. La enzima polimerasa Taq fue tambin cubierta de patentes. Tuvieron lugar varios pleitos relacionados con la tcnica, incluyendo un pleito fracasado generado por DuPont. La compaa farmacutica Hoffmann-La Roche adquiri los derechos de las patentes en 1992 y actualmente mantiene las que an estn protegidas.15 16

Vase tambin[editar editar cdigo]

NASBA (Nucleic acid sequence based amplification o amplicacin isotrmica de cidos nucleicos)

Referencias[editar editar cdigo]

1. Jump up Bartlett & Stirling (2003)A Short History of the Polymerase Chain Reaction. In: Methods Mol Biol. 226:3-6 2. Jump up to:a b Joseph Sambrook and David W. Russel (2001). Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3rd ed. edicin). Cold Spring Harbor, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press. ISBN 087969-576-5.

3.

Jump up Mathews, C. K.; Van Holde, K.E et Ahern, K.G (2003). 6. Bioqumica (3 edicin). pp. 204 y ss. ISBN 84-7892-053-2.

4.

Jump up PCR Applications. Protocols for functional genomics. Captulo 14. Edited by Michael A. Innis, David H. Gelfand, John J. Sninsky. ISBN: 0-12-372186-5, Academic Press 1999

5.

Jump up to:a b Watson, J, D.; Baker, T. A.; Bell, S. P.; Gann, A.; Levine, M. et Losick, R (2004). Molecular Biology of the Gene (Fifth edition edicin). San Francisco: Benjamin Cummings. ISBN 0-321-22368-3.

6.

Jump up Scott L. Butler, Mark S.T. Hansen & Frederic D. Bushman (2007). A quantitative assay for HIV DNA integration in vivo. Nature Medicine (7): pp. 631-634. doi:10.1038/87979.

7. 8.

Jump up Museo Victora de Melbourne sobre la preservacin del ADN Jump up James P. Noonan,Graham Coop, Sridhar Kudaravalli, Doug Smith, Johannes Krause, Joe Alessi, Feng Chen, Darren Platt, Svante Pbo, Jonathan K. Pritchard, Edward M. Rubin (17 de noviembre de 2006). Sequencing and Analysis of Neanderthal Genomic DNA. Nature Medicine 314 (5802): pp. 1113 - 1118. DOI: 10.1126/science.1131412.

9.

Jump up Jinguo Hu1 and Carlos F. Quiros (1991). Identification of broccoli and cauliflower cultivars with RAPD markers.Plant Cell Reports 10 (10). DOI: 10.1007/BF00234583.

10. Jump up Kleppe K, Ohtsuka E, Kleppe R, Molineux I, Khorana HG (1971). Studies on polynucleotides. XCVI. Repair replications of short synthetic DNA's as catalyzed by DNA polymerases.J. Mol. Biol. 56: pp. 341-361. 11. Jump up to:a b Mullis, Kary (1998). Dancing Naked in the Mind Field. New York: Pantheon Books. ISBN 0-679-44255-3. 12. Jump up Rabinow, Paul (1996). Making PCR: A Story of Biotechnology. Chicago: University of Chicago Press. ISBN 0-226-70146-8. 13. Jump up MullisKarry Mullis, Kary (1998). Dancing Naked in the Mind Field. New York: Pantheon Books. pp. 18. ISBN 0-679-44255-3. 14. Jump up Mullis, Kary (1990). The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American 262 (4): pp. 56-61, 64-5. 15. Jump up PR Newswire 16. Jump up Consejos sobre cmo sobrevivir a la guerra de las patentes de Taq: GEN Genetic Engineering News Biobusiness Channel: Artculos. 1 de mayo de 2006 (Vol. 26, No. 9).

Bibliografa[editar editar cdigo]

Saiki RK, Gelfand DH, Stoffel S, Scharf SJ, Higuchi R, Horn GT, Mullis KB, et al.(1988) Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239: 487491

Griffiths, J.F. A. et al. (2002). Gentica. McGraw-Hill Interamericana. ISBN 84-486-0368-0. Coleman, WB y Tsongalis, GJ (2006). Molecular Diagnostics: For the Clinical Laboratorian. Humana Press. ISBN 1-58829-356-4.pgs. 47-56 y 65-74

Butler, JM (2005). Forensic DNA Typing: Biology, Technology, and Genetics of STR. Academic Press pgs 63-84. ISBN 0-12-147952-8.

Enlaces externos[editar editar cdigo]

Wikimedia Commons alberga contenido multimedia sobre Reaccin en cadena de la polimerasa.

Animacin PCR Artculos sobre PCR Nueva tcnica ms eficiente en PCR Please find all details about real-time PCR here: http://www.gene-quantification.info - The reference in real-time PCR

Simulation online de reacciones de PCR frente a procariotas secuenciados. Ejercicio online en el que se disean y simulan experimentos de PCR y PCR-RFLP.

Categoras: Gentica Tcnicas analticas en biologa molecular

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