(PO) CLONACIN Y SECUENCIACIN DEL GEN aroA DE Flavobacterium psychrophilum lvarez, B.; Secades, P.; Guijarro, J.A.

rea de Microbiologa, Departamento de Biologa Funcional, Facultad de Medicina, Universidad de Oviedo, c/ Julin Clavera s/n, 33006 Oviedo

Resumen Flavobacterium psychrophilum es el agente etiolgico de la enfermedad denominada cold water disease (CWD) que afecta a salmones y truchas en las piscifactoras de todo el mundo. La patologa causada por esta bacteria Gram negativa, aerobia estricta y psicrotrofa, es recurrente y causa un alto grado de mortalidad entre alevines de trucha y salmn con la consiguiente prdida econmica. Hasta el momento no se ha desarrollado ningn tratamiento eficaz, en consecuencia, cuando se presenta la enfermedad en una piscifactora los daos econmicos son ya inevitables. La enfermedad afecta a alevines con un sistema inmunolgico inmaduro, es por ello que hasta ahora los intentos de vacunacin con microorganismos muertos se han visto frustrados. La estrategia a seguir es infectar a los alevines con una cepa viva atenuada, que mediante su crecimiento lento en el pez, y sin ocasionar la enfermedad, permita el desarrollo progresivo de una respuesta inmune capaz de contrarrestar infecciones futuras Para el desarrollo de este sistema de profilaxis se interrumpir el gen aroA de la cepa salvaje. Este gen codifica la enzima 5-enolpiruvilsiquimato-3-fosfato sintasa, necesaria para la sntesis de aminocidos aromticos y cuya funcin es esencial para la supervivencia y crecimiento de la bacteria y por tanto, para poder causar la enfermedad. Justificacin El proceso de obtencin de la cepa atenuada tiene los siguientes pasos: 1. Clonacin y secuenciacin del gen aroA de F. psychrophilum. 2. Obtencin por interrupcin gnica de una cepa mutante aroA de F. psychrophilum. 3. Determinacin de la virulencia de la cepa mutante aroA en relacin con la cepa salvaje y su posible uso como vacuna. En la comunicacin que se llevar al congreso se describe el primer paso en el desarrollo de la vacuna que es la clonacin y secuenciacin del gen aroA. Resultados y discusin Para lograr la clonacin del gen aroA de F. psychrophilum se utiliz la cepa mutante auxotrofa para dicho gen Escherichia coli AB2829. La clonacin se realiz mediante la complementacin de la mutacin de la cepa de E. coli con un fragmento de DNA de F. psychrophilum. El posterior anlisis de este fragmento revel la presencia de una pauta abierta de lectura cuya secuencia deducida de aminocidos presentaba un grado de homologa significativo con las secuencias de aminocidos de la protena codificada por los genes aroA de diversos microorganismos. Se pudo observar que la secuencia de F. psychrophilum tena un mayor grado de similitud con las secuencias de Haemophilus influenzae y de Pasteurella multocida (35 % de homologa en ambos casos). El anlisis de los dominios conservados de esta protena se realiz utilizando los programas informticos Pileup (programas GCG de anlisi de secuencias) y Boxshade de la pgina de internet http://www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html.