Você está na página 1de 14

Quim. Nova, Vol. 31, No.

3, 623-636, 2008 O ESTADO DA ARTE DA CROMATOGRAFIA ASSOCIADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS NA ANLISE DE COMPOSTOS TXICOS EM ALIMENTOS Mariza C. Chiaradia*, Carol H. Collins e Isabel C. S. F. Jardim Departamento de Qumica Analtica, Instituto de Qumica, Universidade Estadual de Campinas, CP 6154, 13084-971 Campinas SP, Brasil Recebido em 7/11/06; aceito em 10/8/07; publicado na web em 26/2/08

THE STATE OF THE ART OF CHROMATOGRAPHY ASSOCIATED WITH THE TANDEM MASS SPECTROMETRY FOR TOXIC COMPOUND ANALYSES IN FOOD. Chromatography combined with several different detection systems is one of the more used and better performing analytical tools. Chromatography with tandem mass spectrometric detection gives highly selective and sensitive analyses and permits obtaining structural information about the analites and about their molar masses. Due to these characteristics, this analytical technique is very efficient when used to detect substances at trace levels in complex matrices. In this paper we review instrumental and technical aspects of chromatography-tandem mass spectrometry and the state of the art of the technique as it is applied to analysis of toxic substances in food. Keywords: tandem mass spectrometry; chromatography; food.

INTRODUO A cromatografia pode ser combinada a diferentes sistemas de deteco, tratando-se de uma das tcnicas analticas mais utilizadas e de melhor desempenho. O acoplamento de um cromatgrafo com o espectrmetro de massas combina as vantagens da cromatografia (alta seletividade e eficincia de separao) com as vantagens da espectrometria de massas (obteno de informao estrutural, massa molar e aumento adicional da seletividade)1. Para que o acoplamento seja possvel, idealmente, necessrio que as caractersticas de cada instrumento no sejam afetadas pela sua conexo, assim como no devem ocorrer modificaes qumicas no controladas do analito e perda de amostra durante a sua passagem do cromatgrafo para o espectrmetro de massas2. As tcnicas cromatogrficas mais comumente acopladas espectrometria de massas (mass spectrometry) - EM so a cromatografia gasosa (gas chromatography) - CG e a cromatografia lquida de alta eficincia (high performance liquid chromatography) - CLAE. A combinao com outras tcnicas de separao, como a eletroforese capilar, a cromatografia em camada delgada e a cromatografia de permeao em gel possvel, mas usada com menor freqncia. CROMATOGRAFIA GASOSA ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CG-EM) A combinao da cromatografia gasosa com a espectrometria de massas relativamente simples, uma vez que as caractersticas de funcionamento do cromatgrafo a gs so suficientemente compatveis com a necessidade de alto vcuo do espectrmetro de massas2. Quando so utilizadas colunas capilares em CG possvel conectar a sada da coluna diretamente fonte do espectrmetro, uma vez que, em condies normais de operao, o sistema de bombeamento do espectrmetro de massas capaz de captar todo o eluente da coluna3. Quando so utilizadas colunas recheadas, a vazo do eluente deve ser reduzida antes da sua entrada na fonte de
*e-mail: chiaradia@iqm.unicamp.br

ionizao do espectrmetro. Para isto, podem ser utilizados divisores de fluxo, mas seu desempenho no to satisfatrio, uma vez que podem gerar perdas na detectabilidade3. O interfaceamento, neste caso, pode ser feito por meio de um separador de jato, que constitudo por dois capilares alinhados e separados por uma distncia de cerca de 1 mm, tendo vcuo estabelecido entre eles por meio de uma bomba. Desta maneira, quando o eluente da coluna atravessa o primeiro capilar, grande parte do gs carregador (geralmente He), que possui baixa massa atmica, bombeado para fora dos capilares, enquanto as molculas de analito (com maior massa) mantmse em fluxo linear e penetram no segundo capilar que as direciona para a fonte de ons do espectrmetro de massas3. Os mtodos de ionizao mais empregados em CG-EM so ionizao por impacto de eltrons (electron ionization) - IE e a ionizao qumica (chemical ionization) - IQ1,3. Na IE o analito de interesse, em fase gasosa, bombardeado com eltrons de alta energia (geralmente 70 eV). As molculas do analito absorvem esta energia desencadeando vrios processos, dentre os quais o mais simples aquele em que o analito ionizado pela remoo de um nico eltron (M+). Este processo requer tipicamente 10 eV e o restante da energia gera fragmentao dos analitos2,3. Isto consiste em um dos maiores problemas encontrados na aplicao de IE, pois a fragmentao rpida pode conduzir a no observao do on molecular no espectro, perdendo-se, portanto, uma das mais importantes informaes analticas oferecidas pela EM2. A IQ a tcnica que foi desenvolvida especialmente para aumentar a produo do on molecular e reduzir as fragmentaes associadas ionizao por eltrons. Nesta tcnica, as molculas do analito, em fase gasosa, so introduzidas na cmara de ionizao do espectrmetro de massas, que contm um gs reagente. Esta mistura (molculas do analito + gs reagente) bombardeada com eltrons, assim como na IE. Mas, como o gs reagente est em excesso em relao ao analito (geralmente em proporo maior que 1000:1), ele ionizado quase que exclusivamente e passam a ocorrer reaes entre os ons em fase gasosa do gs reagente e as molculas neutras do analito, dando origem aos ons pseudomoleculares do analito [M+H]+. Por este processo ser relativamente de baixa energia, quase no observada fragmentao1,2.

Reviso

624

Chiaradia et al.

Quim. Nova

A CG-EM aplicvel a compostos volteis e termicamente estveis nas temperaturas relativamente elevadas empregadas durante o processo de separao cromatogrfica. Estes requisitos so semelhantes queles necessrios para que compostos sejam ionizados por meio de IE e IQ2. CROMATOGRAFIA LQUIDA DE ALTA EFICINCIA ACOPLADA A ESPECTROMETRIA DE MASSAS (CL-EM) Quando se utiliza a CL-EM, so encontradas incompatibilidades relacionadas vazo do eluente do sistema cromatogrfico com relao velocidade de bombeamento do sistema de vcuo e o projeto da fonte de ons do espectrmetro de massas1. As vazes utilizadas em CLAE so relativamente grandes (da ordem de 1,0 mL min-1), de maneira que no possvel bombear o eluente de um cromatgrafo a lquido diretamente para o interior da fonte do espectrmetro, que opera a presses de cerca de 1,3 x 10-4 Pa2. Assim, uma das mais importantes funes de uma interface empregada em CL-EM remover toda ou, pelo menos, uma parte significativa da fase mvel (FM)2. Alm do problema existente com relao vazo, os compostos que so separados por CLAE so relativamente pouco volteis e/ou sensveis temperatura, de maneira que no possvel ionizlos utilizando as tcnicas de ionizao mais comumente aplicadas na EM2. Desta forma, para o acoplamento da CLAE EM foi necessrio o desenvolvimento de interfaces e de formas de ionizao alternativas. Na tentativa de minimizar os problemas encontrados no interfaceamento do sistema CLAE com EM foram desenvolvidas vrias interfaces, nas quais, muitas vezes, tambm realizada a ionizao do analito por mtodos que permitem a obteno de ons a partir de molculas sensveis temperatura e/ou pouco volteis2. Por esse motivo muitos autores referem-se a algumas dessas interfaces simplesmente como fontes de ionizao. Dentre as fontes de ionizao desenvolvidas, as mais empregadas so ionizao por eletronebulizao (electrospray ionization) - IEN, ionizao qumica presso atmosfrica (atmospheric pressure chemical ionization) - IQPA e, mais recentemente, a fotoionizao presso atmosfrica (atmospheric pressure photoionization) - FIPA1,4-7. Em IEN, o lquido no qual o analito de interesse se encontra dissolvido (na FM, no caso do eluente da CLAE) passa atravs de um capilar, presso atmosfrica, mantido sob alta voltagem. Na sada do capilar so formadas pequenas gotas altamente carregadas (spray) que so dessolvatadas ao se deslocarem em sentido contrrio ao posicionamento de um eletrodo em uma regio de presso atmosfrica. A dessolvatao assistida por um fluxo contnuo de gs seco (geralmente N2) na regio do spray. medida que ocorre a dessolvatao, o tamanho das gotas reduzido at o ponto em que a fora de repulso entre as cargas similares fica maior que as foras de coeso da fase lquida (tenso superficial). Neste momento ocorre a chamada exploso coulmbica, que gera gotas com tamanhos equivalentes a 10% do tamanho das gotas a partir das quais se originaram. Uma srie de exploses passa ento a ocorrer at que so produzidos ons do analito a partir destas gotas, os quais so transferidos para o interior do espectrmetro de massas por uma srie de dispositivos de focalizao1,2,4. Como em IEN a ionizao ocorre diretamente na soluo, compostos sensveis temperatura podem ser ionizados sem sofrer degradao1,2. Uma vez que em IEN so gerados ons com mltiplas cargas, esta tcnica pode ser aplicada a compostos com massas molares relativamente grandes pois, como o espectrmetro de massas mede a razo massa/carga (m/z) dos ons, o intervalo de

massa de aplicabilidade do instrumento pode ser expandido por um fator equivalente ao nmero de cargas do on, isto , um on com m/z 1000 e com 20 cargas representa um composto com uma massa molar de 20 000 Da2. Devido ao modo de obteno dos ons por esta fonte de ionizao, a sua aplicao a compostos ionizveis em soluo e compostos altamente polares que podem ser facilmente ionizados favorecida1. Uma vez que a IEN dependente da concentrao do analito no eluente da coluna cromatogrfica, o uso de divisores de fluxo, para diminuir a vazo do eluente para o interior da interface, no afeta, de forma notvel, sua detectabilidade6. H a necessidade de uso desses divisores de fluxo somente quando a vazo utilizada no cromatgrafo ultrapassar 1 ou 0,5 mL min-1 no caso de FM com elevada porcentagem de gua em sua composio1. Na IQPA, o eluente da coluna cromatogrfica passa atravs de um nebulizador pneumtico no qual gotas so geradas e dessolvatadas. O spray formado passa por uma regio aquecida na qual o vapor seco, formando espcies neutras que passam atravs de uma corona de descarga. Um campo suficiente para gerar ionizao aplicado na corona. Como o solvente (proveniente da FM) encontra-se em maior concentrao no spray que o analito, este ionizado preferencialmente e passam a ocorrer reaes entre estes ons em fase gasosa e as molculas neutras do analito, o que d origem aos ons do analito (IQ)1,2,4. A IQPA pode ser considerada uma fonte de ionizao complementar IEN, pois aplicvel a compostos apolares ou de mdia polaridade, volteis e termicamente estveis, uma vez que a ionizao ocorre em fase gasosa2,6 e tambm porque IQPA aplicvel a vazes de eluente cromatogrfico maiores que as suportadas por IEN (0,5 a 2,0 mL min-1)2. Tanto na IEN quanto na IQPA ocorre a denominada ionizao suave, isto , so formados ons pseudo-moleculares intactos, [M+H]+ no modo positivo ou [M-H]- no modo negativo, porque a energia empregada nestas fontes de ionizao no suficiente para gerar uma fragmentao significativa das molculas do analito1,2,6. Nestas fontes de ionizao, mais comumente na IQPA, tambm pode ocorrer a formao de adutos entre os ons moleculares e Na+, K+, NH4+, HCOO- e CH3COO-, que so espcies inicas presentes nas FM provenientes dos modificadores adicionados a elas2,6. A FIPA uma tcnica de ionizao relativamente nova, introduzida por Bruins e colaboradores8 em 2000, que pode ser considerada complementar s outras tcnicas de ionizao presso atmosfrica (IEN e IQPA), uma vez que certos grupos de compostos apolares e de baixa polaridade, como hidrocarbonetos policclicos aromticos, s podem ser analisados por CL-EM quando se aplica a fotoionizao7. A fonte de FIPA muito semelhante de IQPA, sendo constituda por um nebulizador aquecido que transforma o eluente da coluna cromatogrfica em um spray e gera sua dessolvatao parcial. Entretanto, no lugar da corona de descarga da IQPA a FIPA possui uma lmpada UV com potncia de 10,2 eV, cuja funo ocasionar a ionizao das molculas do analito presentes nas gotculas do spray7. A detectabilidade em FIPA comparvel em IQPA, quando so empregadas altas vazes do eluente e superior, quando utilizadas baixas vazes. Esta fonte de ionizao tambm menos suscetvel supresso inica induzida pela matriz e interferncias qumicas ocasionadas pela presena de tampes no eluente que a IEN e a IQPA7. A FIPA baseia-se na formao de um on molecular radical a partir da absoro de um fton por uma molcula, seguida da ejeo de um eltron, como pode ser observado na Equao 1. Isto s possvel quando a energia do fton irradiador (h) maior que o potencial de ionizao (PI) da molcula. Este processo denominado fotoionizao direta7.

Vol. 31, No. 3

O estado da arte da cromatografia associada espectrometria de massas

625

M + h M+ + e-

(1)

A probabilidade de ocorrer a fotoionizao direta baixa, uma vez que os ftons de UV tm uma baixa penetrao numa mistura densa de gases e vapores presso atmosfrica. Entretanto, se for empregada uma alta concentrao de uma substncia que facilmente ionizada (um dopante) possvel aumentar significativamente o nmero de ons gerados pela fotoionizao inicial do dopante e subseqente troca de carga com o analito (Equaes 2 e 3, respectivamente), desde que a afinidade eletrnica (AE) do analito seja maior que a do dopante. Mas, se a afinidade protnica (AP) do analito maior que a AP do on dopante desprotonado, molculas do solvente ou clusters podem agir como intermedirios entre o on dopante e o analito pela abstrao de um prton do on dopante (Equao 4), passando este para o analito (Equao 5)7. D + h D+ + eD++ AB D + AB+ D++ S [D - H] + [S + H]+ [S + H]+ + AB S + [AB + H]+ (2) (3) (4) (5)

ca amplamente empregada na deteco de compostos presentes em baixas concentraes em matrizes complexas, acoplada cromatografia, uma vez que possibilita um aumento na detectabilidade e reduz a interferncia espectral de compostos presentes na matriz, alm de aumentar a quantidade de informao estrutural que se pode obter1. ANALISADORES DE MASSAS Quadrupolo O quadrupolo constitudo de 4 hastes. Os pares opostos das hastes esto conectados eletricamente e uma voltagem com radiofreqncia de 180o fora de fase aplicada entre eles. Em um valor especfico de voltagem, ons de uma determinada razo m/z atravessam o quadrupolo descrevendo uma trajetria estvel2. O esquema de um analisador quadrupolar encontra-se na Figura 1.

Mas a FIPA no limitada ao modo de ionizao positivo. A formao de ons negativos na FIPA iniciada pela formao de eltrons trmicos durante a fotoionizao do solvente (Equao 6) e do gs oxignio (Equao 7) por meio da transferncia de prton (Equaes 8 e 9 a,b) ou troca de carga (10), ou ainda por captura de eltons (11) ou reaes de substituio (12)7. S + e- S- O2 + e- O2- M + O2- [M - H]- + HO2 S + O2- [S - H]- + HO2 M + [S- H]- [M - H]- + S M + O2- M- + O2 M + e- M- MX2 + O2- [M - X + O]- + OX onde: X = H, halognios, NO2. Portanto, tanto na formao de ons positivos quanto negativos por FIPA, o analito analisado de forma indireta, por meio de reaes qumicas foto-iniciadas7. ESPECTROMETRIA DE MASSAS ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS (EM-EM) A EM-EM a tcnica espectromtrica que, ao invs de utilizar apenas um analisador de massas para separar os ons de mesma razo m/z gerados na fonte de ionizao, utiliza dois estgios de espectrometria de massas (MS1 e MS2), em que um deles usado para isolar o on de interesse e o outro usado para estabelecer uma relao entre este on de interesse isolado e outros ons que foram gerados a partir da sua decomposio induzida2. Esta tcni(6) (7) (8) Analisador de tempo de vo (Time-of-Flight Analiser) - ATV (9a) (9b) (10) (11) (12) Os ATV baseiam-se no princpio de que, como os ons so gerados na mesma fonte de ionizao do espectrmetro de massas, eles possuem a mesma energia cintica, de maneira que as suas velocidades sero apenas diferenciadas pelas suas massas (velocidade inversamente proporcional raiz quadrada da massa do on). Por isto, neste analisador de massas, os ons produzidos na fonte de ionizao do espectrmetro so acelerados atravs de um tubo de vo para serem identificados, uma vez que o tempo que levam para atravess-lo est relacionado com a razo m/z de cada on2. Na Figura 2 pode ser visualizado o ATV.
Figura 1. Esquema de um analisador quadrupolar, onde rf indica radiofreqncia e dc corrente contnua

Figura 2. Esquema de um analisador de tempo de vo

Ion-trap O ion-trap um quadrupolo tridimensional que captura todos os ons que so introduzidos em seu interior e os mantm aprisionados at que uma determinada radiofreqncia seja aplicada e torna os ons de certa razo m/z instveis, de forma que so libertados do trap2,9. O analisador de massas ion-trap est mostrado na Figura 3.

626

Chiaradia et al.

Quim. Nova

Figura 4. Esquema de um analisador triplo quadrupolo

tubo de vo em um tempo especfico, o que s possvel devido sua alta velocidade de varredura2,11. Na Figura 5 pode ser visualizado o analisador Q-ATV.

Figura 3. Esquema de um analisador ion-trap, onde RF indica radiofreqncia e DC corrente contnua

ANALISADORES DE MASSAS EM EM-EM Triplo quadrupolo Este instrumento constitudo por trs quadrupolos em srie, sendo que o segundo quadrupolo no utilizado para separar ons de mesma razo m/z, mas sim como cela de coliso, na qual ocorre a fragmentao dos ons selecionados no primeiro quadrupolo geralmente por dissociao induzida por coliso com um gs inerte (collision-induced dissociation) - DIC, e tambm empregado como direcionador dos ons produzidos ao terceiro quadrupolo. Na DIC, o on precursor proveniente do primeiro quadrupolo acelerado por um potencial eltrico para uma regio de alto vcuo no interior do segundo quadrupolo, onde sofre repetidas colises com um gs inerte de elevada energia (geralmente Ar, He ou N2), o que leva a um aumento na energia potencial deste on at ocasionar sua fragmentao, conduzindo formao dos ons produto. Quando DIC realizada em baixa energia, as reaes de fragmentao levam geralmente perda de fragmentos neutros (H2O, MeOH, CO, CO2 etc.), dependendo da natureza do on precursor. Esta perda de fragmentos neutros muito importante na determinao estrutural da molcula do analito, uma vez que fornece informaes acerca de grupos funcionais presentes na molcula. Quando DIC realizada sob elevada energia, as reaes de fragmentao geram informaes estruturais mais significativas, uma vez que pode levar quebra das molculas em posies caractersticas. Porm, quando a energia muito elevada pode levar a uma fragmentao descontrolada10. Alm de informaes estruturais, DIC pode melhorar a detectabilidade do mtodo quando usada para gerar um on caracterstico de uma molcula e assim realizar sua deteco a partir deste on fragmento quando a molcula do analito de interesse se encontra em presena de outras molculas de mesma massa molar nominal, uma vez que reduz o rudo e aumenta a detectabilidade. Todos os quadrupolos so controlados para transmitir ons de uma nica razo m/z ou de um intervalo de razes m/z para gerar informao analtica mais exata2,9. Na Figura 4 encontra-se esquematizado um triplo quadrupolo. Quadrupolo-ATV (Q-ATV) um instrumento em que o ltimo estgio do triplo quadrupolo substitudo por um ATV disposto ortogonalmente ao segundo quadrupolo. Este instrumento, ao invs de varrer seqencialmente um intervalo de razes m/z selecionadas e gerar o espectro EMEM das massas selecionadas, detecta todos os ons que entram no

Figura 5. Esquema de um analisador de massas Q-ATV

Ion-trap Neste instrumento a seleo, a decomposio e a subseqente anlise dos ons realizada na mesma parte do instrumento, de maneira que estes processos ocorrem separados apenas pelo tempo. Para isso, o trap ajustado para capturar todos os ons que entram no espectrmetro de massas e os ons de m/z que no so de interesse so levados instabilidade para ocasionar sua ejeo do trap. O(s) on(s) remanescente(s) no trap (so) dissociado(s). Os ons produzidos na dissociao do on de m/z selecionado tornam-se seqencialmente instveis e so liberados do trap para gerar o espectro de massas2. TCNICAS DE VARREDURA PARA OBTENO DO ESPECTRO DE MASSAS EM EM-EM2 Varredura dos ons produzidos (product-ion scan) Nesta varredura, considerando-se um espectrmetro de massas do tipo triplo quadrupolo, no primeiro estgio (EM1) isolado o on de interesse que, em seguida, fragmentado na cela de coliso. No segundo estgio do espectrmetro de massas (EM2) feita a varredura dos ons produzidos a partir da fragmentao do on de interesse isolado em EM1 para obteno do espectro de massas. Esta tcnica tambm pode ser realizada no ion-trap. Varredura do on precursor (precursor-ion scan) No triplo quadrupolo, este tipo de varredura realizado quando o EM1 ajustado para transmitir ons dentro de um intervalo de m/z de interesse, os quais so fragmentados na cela de coliso, para que em EM2 sejam transmitidos ons de uma nica razo m/z (on produto de fragmentao). O sinal s gerado no detector quando EM1 e EM2 esto transmitindo, isto , quando um on transmitido por EM1 se fragmenta na cela de coliso gerando o on produto selecionado que atravessa EM2.

Vol. 31, No. 3

O estado da arte da cromatografia associada espectrometria de massas

627

Varredura da constante perda de fragmentos neutros (constant-neutral-loss scan) Esta varredura permite observar ons que se fragmentam perdendo uma massa de estrutura qumica especfica e neutra. realizada no triplo quadrupolo varrendo-se todos os estgios da EM-EM simultaneamente para comparar as diferenas entre as massas varridas por eles, isto , se em EM1 est sendo transmitido um on de m/z 100 ao mesmo tempo em que EM2 transmite um on de m/z 58 e, em seguida, EM1 muda para m/z 101 e EM2 transmite m/z 59, e assim por diante, porque est havendo uma perda constante de massa neutra de 42 Da. Monitoramento seletivo de reaes (selected-reaction monitoring) - MSR Neste tipo de varredura monitorada a fragmentao de um on precursor selecionado no triplo quadrupolo por EM1 aos seus correspondentes ons produtos que atravessam EM2. No ion-trap o on precursor selecionado da mesma forma que na varredura dos ons produzidos mas, neste caso, um on produto de uma nica razo m/z de interesse confinado. Quando se monitora a fragmentao de vrios ons precursores simultaneamente, este modo de varredura denominado monitoramento de reaes mltiplas (multiple-reaction monitoring) MRM. CROMATOGRAMAS DE MASSAS Quando se faz o acoplamento da cromatografia com a EM obtm-se o chamado cromatograma de massas que assim denominado por se tratar de um cromatograma constitudo de todos os ons produzidos pelo espectrmetro de massas ou apenas pelos ons de interesse produzidos por este12. O cromatograma contendo todos os ons produzidos pelo espectrmetro de massas denominado cromatograma de ons totais (total ion chromatogram) - CIT12. O cromatograma constitudo apenas pelos ons de interesse pode ser obtido pelo monitoramento dos ons selecionados (selected ion monitoring) MIS, ajustando-se o detector de massas para que sejam observados apenas os ons de razo m/z de interesse ou selecionando-os a partir de um banco de dados que contenha os espectros de massas completos12. UTILIZAO DA CROMATOGRAFIA COM DETECO POR ESPECTROMETRIA DE MASSAS ACOPLADA ESPECTROMETRIA DE MASSAS NA DETERMINAO DE SUBSTNCIAS TXICAS EM ALIMENTOS Substncias txicas so aquelas que impactam negativamente o metabolismo normal dos seres vivos, podendo levar ao estabelecimento de anormalidades fisiolgicas e/ou anatmicas13. A presena de substncias txicas em alimentos pode ser ocasionada por diversas fontes de contaminao. Uma das principais fontes de contaminao de alimentos a utilizao de agroqumicos, que so substncias empregadas para aumentar a qualidade e a quantidade de alimentos necessrios ao sustento da populao13. Dentre os agroqumicos utilizados esto os agrotxicos (herbicidas, inseticidas, fungicidas, acaricidas, fumigantes), que so aplicados a frutas e vegetais em vrios estgios de cultivo e ps-colheita, para proteg-los do ataque de pestes e mant-los prprios para o consumo14. Outro tipo de agroqumico empregado, que pode gerar contaminao de alimentos de origem animal (carne, leite e ovos), so os medicamentos veterinrios14.

Alm da contaminao por agroqumicos os alimentos tambm podem ser contaminados por toxinas geradas por microorganismos, como bactrias ou fungos (micotoxinas), por compostos txicos produzidos durante o preparo dos alimentos (acrilamidas, aminas heterocclicas), por compostos presentes na composio de embalagens (estirenos, ftalatos), ou ainda por exposio dos alimentos a contaminantes ambientais (hidrocarbonetos polialogenados, hidrocarbonetos policclicos aromticos, organometlicos)6,14. Existem poucos trabalhos na literatura relatando estes dois ltimos tipos de contaminao15,16. Para garantir a segurana da populao quanto ao consumo de alimentos, agncias governamentais no mundo todo realizam um controle da presena dos contaminantes nos alimentos para que no gerem danos sade dos consumidores estabelecendo, para tanto, os limites mximos de resduos (maximun residue levels) - LMR6,14,17,18. Para garantir que os LMR sejam respeitados, as metodologias analticas utilizadas para a determinao de substncias txicas em alimentos devem ser capazes de quantificar resduos dessas substncias em concentraes muito baixas, assim como identific-los de maneira inequvoca. Devido complexidade das matrizes de alimentos (mistura de gua, protenas, lipdios, carboidratos, vitaminas e minerais14), freqentemente necessria uma preparao intensiva da amostra, como tambm o acoplamento de tcnicas analticas para obteno de maior seletividade e detectabilidade6. Neste sentido, mostra-se vantajoso o emprego da cromatografia com deteco por espectrometria de massas acoplada a espectrometria de massas, uma vez que por EM-EM possvel obter uma grande quantidade de informao estrutural acerca do analito, o que assegura sua identificao com maior exatido do que quando ela feita apenas com base nas caractersticas de reteno dos compostos analisados, como ocorre nas outras tcnicas de deteco cromatogrficas1. Alm disso, quando existem compostos que no podem ser totalmente separados pela tcnica cromatogrfica empregada, usando EM-EM possvel detect-los individualmente se possurem diferentes massas molares ou gerarem diferentes espectros de massas1. Graas a essa elevada seletividade, os efeitos da interferncia de componentes da matriz sobre o sinal obtido so minimizados, de forma que procedimentos mais simples de preparo das amostras podem ser empregados, eliminando, muitas vezes, a necessidade de realizar vrias etapas de limpeza da amostra (clean-up). Isto diminui o custo e o tempo necessrios para a realizao das anlises, de forma que possam ser aplicadas como procedimentos de rotina em laboratrios de controle da qualidade de alimentos19,20. Quando se utiliza a EM-EM possvel obter maior detectabilidade e menores limites de deteco e quantificao do que quando se utiliza EM, devido aos modos de varreduras possveis de serem realizados, o que favorece a sua aplicao anlise de traos20. APLICAO DE CG-EM-EM E CL-EM-EM NA DETERMINAO DE AGROTXICOS EM ALIMENTOS Arrebola et al.21 desenvolveram um mtodo para determinao de resduos de agrotxicos de 81 classes diferentes em vegetais frescos com grande contedo de gua, como pepino, utilizando CG-EM-EM. Os agrotxicos analisados foram: acefato, acrinatrina, azoxistrobina, betalaxil, bifentrina, bromopropilato, bupirimato, buprofezina, carbofenotiom, cialotrim, ciflutrina, cipermetrina, ciproconazol, clorfenvinfs, cloropirifs, cloropirifs metlico, clortalonil, clozolinato, deltametrina, diazinona, diclorvs, dicofol, difenoconazol, dimetoato, dissulfotom, -endossulfam, endossulfam, endossulfam-sulfato, esfenvalerato, etiofencarbe,

628

Chiaradia et al.

Quim. Nova

etiona, etoprofs, etrinfs, fenamifs, fenarimol, fenitrotiona, fenpropatrina, fentiona, flucitrinato, fludioxinil, forato, formotiom, fosalona, furatiocarbe, heptenofs, hexaconazol, iprodiona, isofenfs, lindano, malationa, metalaxil, metamidofs, mevinfs, miclobutanil, nuarimol, ometoato, oxadixil, parationa metlico, penconazol, pendimetalina, permetrina, pirazofs, piridabem, pirifenox, pirimetanil, pirimicarbe, pirimifs metlico, piriproxifem, procimidona, propargito, propiconazol, propoxur, quinometionato, tebuconazol, tebufenozide, tetraconazol, tetradifona, triadimefom, triadimenol, triflumizol e vinclozolina. Para a extrao dos agrotxicos das matrizes de interesse foi utilizado apenas diclorometano e para eliminar a gua, sulfato de sdio anidro. O extrato obtido foi redissolvido em cicloexano, seguido pela adio de padro interno (cafena) e injetado diretamente no cromatgrafo. Isto s foi possvel devido utilizao de um filtro de carbono na linha de gs, posicionado antes da coluna, pois este reduz a entrada, nos instrumentos, de substncias de baixa volatilidade e de interferentes, levando a um aumento da seletividade do sinal na EM-EM e evitando que houvesse a necessidade de realizar etapas de clean-up no procedimento de extrao21. Para deteco foi utilizado um ion-trap no modo EM-EM, empregando-se a IE. Quando se utiliza o ion-trap, a detectabilidade maximizada pela otimizao da quantidade de ons aprisionados no trap e dos parmetros envolvidos na dissociao dos ons precursores com um gs inerte (He) por DIC para obteno de ons ou clusters de ons com grande abundncia relativa no espectro, os quais so empregados na quantificao e identificao dos analitos. Assim, quando se faz a anlise de diferentes compostos utilizando EMEM, vrios parmetros tm que ser otimizados para cada um deles, como amplitude de excitao, nvel de excitao para armazenamento (excitation storage level), quais ons sero selecionados para quantificao e a partir de qual on precursor eles sero gerados e as janelas de tempo de reteno (retention time window) - JTR. Neste trabalho a JRT foi definida como o tempo de reteno mdio mais ou menos trs vezes a estimativa do desvio padro dos tempos de reteno de 10 amostras no contaminadas, fortificadas a um nvel mdio com padres de calibrao de cada composto21. A identificao dos agrotxicos foi realizada com base nas JTR e na comparao com espectros de referncia, obtidos a partir de um extrato de pepino no contaminado e fortificado com a concentrao do segundo ponto da curva analtica. Foram obtidos limites de deteco (LD) e de quantificao (LQ) entre 0,02 e 4 g kg-1 e entre 0,06 e 13 g kg-1, respectivamente, para os 81 agrotxicos. Uma curva analtica foi construda para determinao da linearidade utilizando extratos da matriz livres de contaminao e fortificados com solues padro dos agrotxicos e com a adio de padro interno, sendo que o primeiro ponto da curva foi determinado a uma concentrao entre o LQ e o menor LMR encontrado para os agrotxicos estudados. A regresso linear foi feita utilizando-se a razo entre a rea ou a altura do pico analito/padro interno versus a concentrao. Na validao do mtodo desenvolvido, os autores obtiveram boa linearidade no intervalo de concentraes estudado e tambm boas preciso e exatido21. Este procedimento de anlise foi aplicado a amostras reais consumindo-se a metade do tempo gasto em relao a procedimentos j descritos na literatura, o que o torna adequado s anlises de rotina21. Na Figura 6 possvel observar o cromatograma obtido a partir de uma amostra real de pimenta contendo 0,05 mg kg-1 de metalaxil, o espectro de massas da amostra e o espectro de referncia do metalaxil. Procedimento semelhante foi aplicado, por este mesmo grupo de pesquisadores19,20, na anlise de 71 agrotxicos de diversas classes (acefato, acrinatrina, amitraz, azoxistrombina, benalaxil, bifen-

Figura 6. Cromatograma e espectro EM-EM de uma amostra real de pimenta contendo 0,05 mg kg-1 de metalaxil e o espectro EM-EM de referncia do metalaxil. Adaptado da ref. 21

trina, bromopropilato, bupirimato, buprofezina, carbofenotiona, cialotrina, ciflutrina, cipermetrina, clorfenvinfs, cloropirifs, cloropirifs-m, clortalonil, clozolinato, deltametrina, diclorvs, dicofol, difenoconazol, dimetoato, dissulfotom, -endossulfam, -endossulfam, endossulfam sulfato, esfenvalerato, etiofencarbe, etion, etoprofs, etrinfs, fenaminfs, fenitrotiona, fenpropatrina, fentiona, flucitrinato, fludioxinil, formotiom, fosalona, furatiocarbe, heptenofs, hexaconazol, iprodiona, isonfenfs, lindano, malationa, metalaxil, nuarimol, oxadixil, parationa-metlica, penconazol, pendimetalina, permetrina, pirazofs, piremetanil, piridabem, pirifenox, pirimicarbe, pirimifs-metlico, piriproxifem, procimidona, propargito, propiconazol, propoxur, quinometionato, tebuconazol, tetraconazol, tetradifona, triadimefom e vinclozolina) em frutas (melo e melancia) e vegetais (ervilha, berinjela, abbora, pepino, pimenta e tomate), com a diferena de que dois modos de ionizao, dependendo do analito, foram empregados em CG-EM-EM (IQ e IE) e foram obtidos resultados semelhantes quanto ao desempenho do mtodo. A anlise de agrotxicos em matrizes vegetais gordurosas como abacate foi realizada por Moreno et al.22 utilizando CG-EM-EM. Os agrotxicos estudados neste trabalho foram: acefato, acrinatrina, azoxistrobina, benalaxil, bifentrina, bromopropilato, bupimirato, buprofezina, carbofenotiona, cialotrina, ciflutrina, cipermetrina, clorfenvinfos, cloropirifos, cloropirifos-metlico, clortalonil, clozolinato, deltrametrim, dicofol, diclorvs, difenoconazol, dimetoato, endossulfam I, endossulfam II, endossulfam III, esfenvaralato, etiona, etoprofs, etrinfs, fenpropatrina, fenaminfs, fenitrotiona, fentiona, flucitrinato, fludioxinil, formotiom, fosalona, furatiocarbe, heptenofs, hexaconazol, iprodiona, isonfenfs, lindano, malationa, metalaxil, metamidofs, nuarimol, oxadixil, parationametlica, penconazol, permetrina, pirazofs, piridabem, pirifenox, pirimifs-metlico, piriproxifem, procimidona, propargito, propiconazol, propoxur, quinometionato, tebuconazol, tetradifona, triadimefom e vinclozolina.

Vol. 31, No. 3

O estado da arte da cromatografia associada espectrometria de massas

629

Nesse trabalho, os autores avaliaram vrias tcnicas de extrao nas quais utilizaram etapas de limpeza, devido ao grande contedo lipoflico dos extratos obtidos por extrao com solvente orgnico assistida por homogeneizador de alta velocidade ou por extrao lquida sob alta presso e alta temperatura. Eles tambm avaliaram o uso da cromatografia por permeao em gel (gel permeation chromatography) - CPG e da extrao em fase slida (solid phase extraction) - EFS para a limpeza dos extratos22. Apesar de terem sido obtidas boas recuperaes com as duas tcnicas de extrao, a extrao com solvente orgnico assistida por homogeneizador de alta velocidade foi escolhida devido s vrias vantagens que ela apresenta, como tempo de extrao reduzido, baixo custo, simplicidade e menor manuseio da amostra, o que a torna mais adequada s anlises de rotina. Dentre as tcnicas de limpeza, a CPG apresentou melhor desempenho, uma vez que com a EFS no foram obtidos valores de preciso e recuperao satisfatrios, alm de no eliminar suficientemente impurezas lipoflicas, que causam danos ao sistema cromatogrfico, saturao do filtro de carbono, levando obteno de sinais analticos incoerentes22. Foi utilizado um ion-trap operando com IE ou IQ, dependendo do analito, conectado ao sistema cromatogrfico. A identificao dos agrotxicos foi realizada com base nas JTR e comparando os espectros obtidos a partir das amostras analisadas com espectros de referncia obtidos sob as mesmas condies cromatogrficas. Para quantificao foi utilizada uma curva analtica construda com padres aplicados ao branco da matriz, na qual o primeiro ponto correspondia concentrao do menor LMR estabelecido. Porm, certos agrotxicos, como os piretrides, no tiveram boa recuperao quando as amostras no foram processadas por CPG, pois eles possuem elevadas massas molares, de maneira que coeluiram com interferentes lipdicos da matriz. Devido a estes efeitos de matriz, a quantificao dos agrotxicos foi feita utilizando uma curva analtica que foi construda com o branco da matriz fortificada com os padres e submetida etapa de limpeza22. Outro trabalho de determinao de agrotxicos em matrizes com alto teor lipdico foi realizado por Patel et al.23, que empregaram CG-EM-EM na determinao de agrotxicos organoclorados (aldrim, clordano (cis), o,p-DDT, -endossulfam, endossulfam-sulfato, HCH, -HCH, -HCH, heptacloro, heptacloro epxido (trans), hexaclorobenzeno, oxiclordane e p,p-TDE) em leos e gorduras. Para isto as amostras foram limpas por CPG, como no trabalho citado anteriormente22, e analisadas por CG-EM-EM empregando um triplo quadrupolo ajustado ao modo MRM e utilizando IE. Para evitar a interferncia da matriz nos resultados foram selecionados os ons precursores de maior intensidade. Em alguns casos foram selecionados ons de menores intensidades, mas com maiores massas. Fragmentos de ons com m/z menores que 150 foram descartados. Tambm foi otimizada a energia empregada na cela de coliso para a realizao da DIC23. Nesse trabalho, os autores realizaram a anlise de dois agrotxicos (-endosulfan e cis-clordano) que coeluiram nas condies de separao utilizadas em CG e que geraram os mesmos ons fragmentos. Mas, foi possvel analisar estes agrotxicos selecionandose as transies em EM-EM que no foram afetadas pela coeluio destes compostos. Os autores tambm conseguiram intensificar o sinal dos agrotxicos que apresentaram elevados valores de sinal/ rudo, dividindo o mtodo de aquisio de dados MRM em vrias JTR, de acordo com os tempos de reteno dos compostos. Foi estabelecido um nmero de transies por JTR que garantisse uma detectabilidade adequada s baixas concentraes dos analitos de interesse23. Os autores tambm observaram que as respostas obtidas para os padres dos agrotxicos em solventes foram menores que as obtidas

com padres aplicados ao branco da matriz. Portanto, os padres aplicados na matriz foram utilizados para construo da curva analtica, que se apresentou linear no intervalo de interesse (de 0,75 a 30 ng mL-1, com coeficientes de correlao maiores que 0,980) para todos os agrotxicos avaliados exceto para o o,p-DDT, o que foi atribudo a uma possvel extrao incompleta da matriz por CPG. Segundo os autores, a tcnica de anlise por CG-EM-EM empregada nesse trabalho apresentou excelentes seletividade e LD na identificao e quantificao simultnea dos agrotxicos organoclorados encontrados em baixos nveis de concentrao em gorduras e leos23. Gonzlez-Rodrguez et al.24 determinaram agrotxicos e alguns metablitos em diferentes tipos de leite, inclusive materno, utilizando microextrao em fase slida e CG-EM-EM. Os agrotxicos e metablitos analisados foram: aldrim, clorfenvinfs, clorpirifs, clorpirifs metlico, clorotanlonil, p,p-DDD, p,pDDE, o,p-DDT, p,p- DDT, diclorana, dieldrim, -endossulfam, -endossulfam, endossulfam-ter, endossulfam lactona, endossulfam-sulfato, endrim, endrim aldedo, etiona, fanfur, fenaminfs, heptacloro epxido, etrinfs, fentiona, heptacloro, hexaclorobenzeno, isofenfs, -lindano, , -lindano, -lindano, malationa, metoxicloro, mirex, paratiom, paratiom-metlico, pentaclorobenzeno, pentacloronitrobenzeno, pirimifs metlico, quinalfs, sulfotepe e vinclosolina. Nesse trabalho, os autores ressaltaram a importncia de se determinar a presena de agrotxicos no leite, uma vez que, devido a sua natureza lipoflica, o leite pode ser utilizado para monitorar a bioconcentrao de poluentes orgnicos, como esses agrotxicos organoclorados. Tambm importante no sentido de garantir a segurana dos consumidores de produtos lcteos, uma vez que tm sido estabelecidos LMR para agrotxicos no leite, por rgos responsveis no mundo todo24. A tcnica de anlise empregada possibilitou a anlise de compostos pouco volteis e sensveis temperatura, pois empregou temperaturas de eluio mais baixas (50-80 oC). As condies de isolamento, fragmentao e estocagem no ion-trap foram otimizadas para cada agrotxico. A identificao dos agrotxicos foi feita de maneira semelhante apresentada nos outros trabalhos descritos, por meio das JTR e por comparao com espectros obtidos para os compostos estudados sob as mesmas condies de anlise utilizadas. Para evitar interferncia da matriz, a curva analtica foi construda com o branco da matriz fortificado com os padres e usando padro interno. O mtodo desenvolvido mostrou-se adequado em termos de linearidade, LD e LQ, recuperao e preciso24. Granby et al. 5 desenvolveram um mtodo para anlise de carbamatos e outros agrotxicos relativamente polares (acefato, aldicarbe, aldicarbe-sulfona, aldicarbe-sulfxido, benfuracarbe, carbaril, carbendazim, etiofencarbe, fenexamida, imazalil, linurom, metamidofs, metiocarbe, metomil, oxamil, pirimetanil, propoxur, tiabendazol e tiofanato-metlico) em diversas matrizes (ma, abacate, cenoura, alface, laranja, batata e trigo) por CL-EM-EM com IEN. No mtodo de extrao empregado, a amostra triturada, misturada com um tampo de acetato metanlico - cido actico, foi submetida ao ultra-som e, em seguida, centrifugao. Para compensar as variaes na resposta do detector, na quantificao foi utilizado padro interno marcado isotopicamente ([13C6]-carbaril) e o branco da matriz fortificado. O espectrmetro de massas utilizado foi um triplo quadrupolo ajustado para que a deteco fosse feita no modo MRM, e para isso, 4 JTR foram selecionadas com 3 a 6 substncias cada. Quanto mais substncias so includas no mtodo, mais JTR devem ser selecionadas para que se obtenha a deteco com detectabilidade instrumental suficiente. Como foi aplicada a IEN, os autores otimizaram a voltagem a que foi submetida a amostra quando introduzida no espectrmetro

630

Chiaradia et al.

Quim. Nova

(cone voltage) e, tambm, a energia de coliso necessria para fragmentar os ons precursores para que fossem obtidos ons produtos com abundncias relativas significativas5. Nesse trabalho, os autores verificaram o efeito da matriz comparando-se as respostas obtidas para solues padro dos agrotxicos em solvente (acetato de amnio - cido actico em metanol gua 95:5 v/v) com solues padro dos agrotxicos no branco da matriz. Como a resposta relativa para a maioria dos agrotxicos investigados foi por volta de 1, concluiu-se que a matriz no causou supresso ou aumento na resposta obtida no EM-EM. Outro ponto importante desse trabalho foi que no foram observadas diferenas significativas entre as matrizes estudadas, de forma que uma delas pde ser escolhida para construo das curvas analticas. Isto muito importante para que o mtodo seja adequado aplicao em anlises de rotina, nas quais o tempo de anlise no deve ser muito longo, para que uma maior quantidade de amostras possa ser analisada5. Foram obtidas recuperaes entre 70 e 120% em trs nveis de fortificao (0,02, 0,04 e 0,2 mg kg-1) e LD entre 0,01 e 0,02 mg kg-1 para frutas e vegetais, mas para cereais, 2 dos 19 agrotxicos avaliados apresentaram LD maiores. A exatido do mtodo foi avaliada em trs testes de proficincia que mostraram uma boa concordncia entre os valores obtidos5. Outro mtodo rpido para deteco e identificao de 38 agrotxicos (aldicarbe, aldicarbe sulfona, aldicarbe sulfxido, azoxistrobina, 2,4-D, bendiocarbe, butocarboxim, butocarboxim sulfona, butocarboxim sulfxido, carbaril, carbendazim, carbofuram, carbofuram 3-hidrxi, cresoxim-metlico, diclofluanida, dietofencarbe, etiofencarbe, fenexamida, 2-fenilfenol, furatiocarbe, imazalil, isoprocarbe, metiocarbe, metiocarbe sulfona, metiocarbe sulfxido, metomil, metolcarbe, miclobutanil, oxamil, penconazol, propiconazol, pimetrozina, pirimetanil, tebuconazol, tiabendazol, tiodicarbe, tiofanato-metlico e trifloxistrobina) em frutas e vegetais utilizando CL-EM-EM com IEN foi desenvolvido por Taylor et al.17. Este mtodo no utiliza etapas de limpeza aps o procedimento de extrao da amostra com solvente (neste caso foi utilizado acetato de etila) que, aliado ao uso da eluio isocrtica em CLAE (requer um menor tempo para o equilbrio da coluna aps a corrida), torna o mtodo de anlise mais rpido. Uma vazo de 0,5 mL min-1 foi utilizada no sistema cromatogrfico, sendo necessrio o uso de um divisor de fluxo em formato de T para reduzir a vazo da fase mvel do cromatgrafo para aproximadamente 20 L min-1 antes da introduo no interior do espectrmetro. A maioria dos agrotxicos avaliados apresentaram em seus espectros ons pseudo-moleculares ([M+H]+, [M+NH4]+ ou [M+Na]+) no modo de ionizao positivo, e aqueles que no foram detectados no modo positivo foram observados no negativo ([M-H]-). Aps a aplicao da DIC, utilizando argnio, foram identificados estruturalmente ons produtos para todos os compostos, com exceo de apenas um agrotxico (diclofluanida), de forma que puderam ser monitorados utilizando MRM17. Uma caracterstica particular da deteco por EM-EM que foi explorada nesse estudo foi a capacidade de diferenciar entre analitos isobricos, especialmente os que coeluem. As diferenas entre o espectro de massas do on produto gerado por ons precursores comuns foram decisivas na determinao dos seguintes pares de agrotxicos estudados: aldicarbe e butocarboxim; aldicarbe sulfxido e butocarboxim sulfxido e, carbaril e tiabendazol17. Os espectros de massas do on produto do carbaril e tiabendazol so mostrados na Figura 7. O carbaril caracterizado pela perda de CH3NCO, formando um on de m/z 145 e o tiabendazol pela perda de HCN, resultando em um on de m/z 175 a partir de um on precursor comum de m/z 20217.

Figura 7. Espectros de massas do on produto dos agrotxicos A) Carbaril e B) Tiabendazol. Adaptado da ref. 17

Sannino et al.25 desenvolveram um mtodo para determinao de 24 agrotxicos (azoxistrobina, benfuracarbe, bromuconazol, cresoxim-metlico, difenoconazol, dimetomorfe, etofemprox, fenbunconazol, fenazaquim, fenexamida, fenotiocarbe, fenpiroximato, flusilazol, furatiocarbe, hezitiazoxi, imidacloprido, indoxacarbe, paclobutrazol, piridabem, tebuconazol, tetraconazol, trifloxistrobina, tebufenozida e tebufenpirade) em pur de ma, tomate e em suco concentrado de limo. Este mtodo extrai os agrotxicos de interesse da amostra utilizando apenas uma mistura de solventes (acetato de etila - cicloexano 50:50 v/v) e filtrando a amostra para evitar a entrada de material particulado nos instrumentos. Para identificao e quantificao dos agrotxicos foi utilizado um sistema CLAE acoplado a um triplo quadrupolo equipado com uma interface IEN. Simultaneamente, 55 transies foram monitoradas por EM-EM durante a separao por cromatografia lquida, no modo de varredura MRM, utilizando apenas uma JTR, aps a otimizao das condies de operao instrumentais realizada pela injeo de solues individuais de cada agrotxico em metanol25. Nesse trabalho, tambm foi estudado o efeito da matriz sobre o sinal detectado, comparando-se o sinal obtido para os padres de agrotxicos em solvente e no branco da matriz, no sendo observado efeito de supresso significativo no sinal, exceto para o etofenproxi. Um aumento no sinal foi observado para dois dos agrotxicos avaliados, fenpiroximato e indoxacarbe. Os autores relataram que a melhor forma para compensar os efeitos da matriz seria utilizar padres internos marcados isotopicamente, porm, para muitos agrotxicos no existe este tipo de composto disponvel. Mesmo assim, com o uso de padronizao externa, empregando o branco da matriz fortificado, foi possvel analisar 102 amostras reais de frutas processadas, nas quais no foram encontrados resduos de agrotxicos acima de 10 g kg-1 25. Ferrer et al.26 determinaram resduos de agrotxicos (cipermetrina, deltametrina, endossulfam I, endossulfam II, endossulfam sulfato, paratiom-metlico, pirimifs-metlico, simazina e terbutilazina) em azeitonas e azeite por disperso da matriz em fase slida, com uma etapa de limpeza realizada pela eluio do extrato atravs de uma coluna de Florisil, que foi, em seguida, submetido anlise por CL-EM-EM. Os autores ressaltaram a importncia de se determinar agrotxicos em azeite uma vez que sua obteno realizada apenas por processos fsicos e/ou mecnicos, sem nenhuma etapa posterior de tratamento ou purificao, de maneira que muito provvel a incidncia de resduos de agrotxicos nesta matriz.

Vol. 31, No. 3

O estado da arte da cromatografia associada espectrometria de massas

631

Para realizao da CL-EM-EM foi utilizada uma coluna de fase reversa C8, com eluio por gradiente e um ion-trap operando no modo positivo com IEN. Os autores enfatizaram que quando se utilizou apenas CL-EM foram detectados sinais de interferentes isobricos da matriz nos espectros de massas, da a necessidade de se empregar EM-EM. Isto possibilitou isolar o on precursor e otimizar a fragmentao, gerando um aumento na detectabilidade e na seletividade, assim como menores razes sinal/rudo. Mesmo assim, para o agrotxico dimetoato houve supresso do sinal por interferentes da matriz e sua anlise s foi possvel utilizando espectrometria de massas em multi estgios (EMn), pois EMn possibilitou a remoo total da interferncia da matriz, mas foi acompanhada de um aumento na razo sinal/rudo gerando, conseqentemente, maior LD 26. APLICAO DA CL-EM-EM DETERMINAO DE MEDICAMENTOS VETERINRIOS EM ALIMENTOS Fagerquist et al.27 realizaram a determinao quantitativa e qualitativa de antibiticos (em especfico as -lactamas: amoxilina, ampicilina, cefazolina, cloxacilina (clox), deacetil-cefapirim, desfuroilseftiofur cistena dissulfeto (dcd), dicloxacilina (diclox), naficilina, oxacilina (ox) e penicilina G (pen G)) em carne bovina proveniente do Servio de Segurana e Inspeo de Alimentos dos Estados Unidos da Amrica (EUA), utilizando a extrao em fase slida e CL-EM-EM. No sistema cromatogrfico foi utilizada uma vazo de 0,3 mL min-1 para gerar uma linha de base estvel e uma ionizao eficiente dos analitos por IEN. A anlise por EM-EM foi realizada utilizando um triplo quadrupolo ajustado ao modo de varredura MRM, para monitorar as 4 transies mais abundantes do on precursor - on produto de cada analito. A Figura 8 mostra um cromatograma tpico da corrente total de ons, que representa a soma dos sinais gerados por todas as transies do on precursor on fragmento obtidas em cada JTR.

no necessariamente na condio tima para cada analito. Assim, a diminuio da voltagem atravs do detector poderia resultar na perda de detectabilidade para as transies menos abundantes dos analitos com menor eficincia de ionizao, de maneira que foi concludo que as curvas analticas no lineares poderiam ser usadas para a determinao da concentrao, uma vez que a interpolao das curvas no lineares era suficientemente exata27. O mtodo desenvolvido foi comparado ao ensaio microbiolgico utilizado pelo Servio de Segurana e Inspeo de Alimentos dos EUA para determinao destas drogas veterinrias em carne. O mtodo utilizando CL-EM-EM foi capaz de detectar antibiticos em nveis de concentrao mais baixos que o ensaio microbiolgico e tambm foi capaz de determinar a identidade de cada antibitico presente, o que no foi possvel no ensaio microbiolgico. Com este mtodo, tambm foi possvel determinar quantitativamente os antibiticos abaixo dos nveis de tolerncia estabelecidos por lei27. Outro mtodo de determinao de -lactamas (amoxilina e ampicilina) em leite e carne bovina foi descrito por Bogialli et al.28, no qual foi adicionado s amostras um padro interno (penicilina V) e, posteriormente, realizada a extrao por disperso da matriz em fase slida com eluio utilizando gua aquecida. Depois de ajustado o pH do extrato, este foi filtrado e analisado por CL-EM-EM utilizando coluna de fase reversa C18 no sistema cromatogrfico, IEN e varredura MSR. O espectro MSR obtido por CL-EM-EM para o leite fortificado com 4 g kg-1 com as lactamas estudadas encontra-se na Figura 9.

Figura 8. Cromatograma de corrente total de ons obtida por CL-EM-EM para um padro aplicado sobre o branco da matriz, a uma concentrao de 250 ng g-1. As barras verticais delimitam as JTR. Os smbolos dcd, penG, penV, ox, clox e diclox indicam, respectivamente, desfuroilseftiofur cistena dissulfeto, penicilina G, penicilina V, oxacilina, cloxacilina e dicloxacilina. Adaptado da ref. 27

Figura 9. Cromatograma MSR obtido por CL-EM-EM para leite fortificado com 4 g kg-1 de amoxilina, ampicilina e do padro interno (penicilina V). As linhas verticais demarcam as JTR. Adaptado da ref. 28

Nesse trabalho os autores observaram que a naficilina gerou saturao do detector em sua transio mais abundante, devido alta eficincia de ionizao apresentada por este composto. Isso foi observado devido a uma no linearidade pronunciada na sua curva analtica. Segundo os autores, este problema poderia ser facilmente resolvido diminuindo-se a voltagem atravs do detector. Porm, para um mtodo de determinao multirresidual com deteco por EM, o instrumento tem que ter os seus parmetros ajustados de forma adequada para monitorar todos os analitos, mas

Os autores observaram um entupimento parcial da coluna de guarda C18 utilizada no sistema cromatogrfico, o que foi atribudo presena de sais insolveis em gua nos produtos de extrao do fgado e dos rins bovinos. Mesmo assim o mtodo apresentou boa preciso, exatido e LD < 1 g kg-1 para ambos os analitos nas matrizes avaliadas28. Matabudul et al.29 desenvolveram um mtodo para a determinao simultnea de antibiticos ionforos (lasalocide, monensina, narasina e solinomina) em fgado de animais de diferentes espci-

632

Chiaradia et al.

Quim. Nova

es e em leite, previamente extrados com acetonitrila e por EFS utilizando cartuchos de slica e analisados por CL-EM-EM utilizando IEN no modo positivo e varredura MRM. Os antibiticos ionforos complexam com ctions (K+, Na+, Ca2+ e Mg2+) e so lipossolveis. A voltagem da IEN para obteno de ons produto [M+Na]+ foi ajustada utilizando solues de padres dos agrotxicos dissolvidos na FM (acetonitrila, metanol, tetraidrofurano, gua e cido trifluoractico 67:10:10:13:0,1 v/v). No foram observados interferentes nos espectros e recuperaes semelhantes foram obtidas para as diferentes matrizes, de forma que foi possvel considerar o mtodo desenvolvido robusto e verstil. Como o tempo de preparo das amostras neste mtodo foi menor que 3 h, ele pode ser empregado na anlise de mais de 40 amostras por dia29. Andersen et al.30 desenvolveram um mtodo para determinao de algumas tetraciclinas, antibiticos veterinrios tambm utilizados em aquacultura, em amostras de camaro e leite integral usando CLAE, com deteco por ultravioleta e a confirmao do resduo por EM e EM-EM. As amostras de leite e camaro foram extradas adicionando-se cido succnico e, em seguida, foi realizada uma etapa de limpeza por EFS. O espectrmetro de massas, um triplo quadrupolo usando IEN no modo positivo, foi ajustado para realizar a varredura no modo MSR, de maneira que foi possvel confirmar a presena do resduo de trs tetraciclinas (tetraciclina, oxitetracilina e clorotetraciclina) em concentraes entre 25 e 400 ng g-1. Nicolich et al.31 desenvolveram um mtodo para determinao de cloranfenicol em leite por LC-EM-EM no modo MRM, com IEN e utilizando padro interno marcado isotopicamente (deuterado - D5). O cloranfenicol um antibitico de largo espectro que capaz de causar doenas sanguneas fatais em seres humanos. Alm disso, no possvel estabelecer um limite para a presena de seus resduos e de seus metablitos nos alimentos que garantam a segurana dos consumidores, ou seja, o LMR do cloranfenicol no pode ser determinado. Desta maneira, o uso do cloranfenicol em animais geradores de alimentos proibido em diversos pases, inclusive no Brasil. As amostras de leite foram fortificadas com o padro interno e submetidas extrao lquido-lquido com acetato de etila e uma soluo de cido frmico (10 mmol L-1). A separao cromatogrfica foi realizada empregando-se uma coluna cromatogrfica Varian Pursuit em combinao com uma coluna de guarda Varian MetaGuard e, como FM, foram utilizadas solues de 0,1% de cido frmico em gua e 0,1% de cido frmico em acetonitrila. A curva analtica foi obtida utilizando-se o branco da matriz fortificado com solues de padro de cloranfenicol. O mtodo desenvolvido apresentou limite de deciso de 0,05 ng mL-1 e capacidade de deteco de 0,09 ng mL-1, os quais foram calculados a partir das curvas analticas, assim como boa exatido e preciso, de forma que este mtodo pode ser aplicado no monitoramento do cloranfenicol em amostras de leite obtidas em supermercados brasileiros31. Mottier et al.32 realizaram a determinao quantitativa de quatro metablitos de nitrofurano (furaltadona, furazolidona, nitrofurantona e nitrofurazona) em carne por CL-EM-EM com IEN, utilizando padres internos marcados isotopicamente. Os nitrofuranos so utilizados como aditivos em rao animal para o tratamento profiltico e teraputico de doenas causadas por bactrias e protozorios e alguns deles foram proibidos na Europa por serem mutagnicos e carcinognicos. As amostras foram primeiramente extradas com acetato de etila e, em seguida, foram submetidas a uma etapa de limpeza por EFS para posterior injeo no sistema CLAE, no qual foi utilizado gradiente linear para eluio dos analitos em fase reversa.

Para quantificao dos analitos foi empregada a padronizao externa utilizando padres dos agrotxicos em gua e no branco da matriz com adio de padres internos dos analitos marcados isotopicamente. Alguns dos padres internos marcados isotopicamente (deuterados) no se comportaram da mesma forma que os compostos endgenos durante o processo de anlise e por isso, no foram considerados apropriados32. No foram observados picos de interferentes nas transies monitoradas quando se utilizou o branco da matriz contendo apenas os analitos e os padres internos. Quando se compararam as curvas analticas com os padres dos agrotxicos em gua e no branco da matriz, foi verificado que no houve uma completa compensao dos efeitos da matriz pelo uso dos padres internos. Porm, como os resultados obtidos para ambas as curvas analticas no foram significativamente diferentes, utilizou-se a curva analtica empregando padres em gua para a validao do mtodo. O mtodo proposto foi considerado seletivo e confirmatrio para deteco dos analitos em nveis abaixo dos LMR32. Heller et al . 33 realizaram a quantificao de resduos de sulfonamidas (sulfacetamida, sulfacloropiridazina, sulfadiazina, sulfadimetoxalina, sulfadimetoxina, sulfaganidina, sulfamerazina, sulfametazina, sulfametiazol, sulfametoxazol, sulfametoxipiridazina, sulfamonometoxina, sulfanilamida, sulfapiridina, sulfatiazol e sulfisoxazol) em ovos por CLAE com deteco ultravioleta e confirmao por EM-EM. As amostras foram extradas com acetonitrila, seguida de uma etapa de limpeza por EFS utilizando um cartucho de C18. Os analitos foram separados por CLAE em fase reversa (coluna C18) utilizando eluio por gradiente, ionizao por IEN e deteco por EM-EM em um espectrmetro de massas ion-trap. Os ons moleculares protonados foram isolados e dissociados para obteno do espectro de massas a partir da varredura de todos os ons produtos33. Duas das sulfonamidas analisadas nesse trabalho (sulfametoxipiridazina e sulfamonometoxina) possuem a mesma massa molar e geraram espectros que continham os mesmos ons produtos e por isso no puderam ser diferenciadas uma da outra33. A anlise de quatro 5-nitroimidazis (dimetridazol, ipronidazol, metronidazol e ronidazol) e seus correspondentes metablitos hidroxilados em ovos, ovos processados e carne de frango foi realizada por Mottier et al.34 utilizando CL-EM-EM e padres internos marcados isotopicamente. Os 5-nitromidazis so antibiticos de uso veterinrio suspeitos de serem carcinognicos e mutagnicos em seres humanos. Estes compostos so metabolizados rapidamente e alguns de seus metablitos so carcinognicos e mutagnicos em certas espcies de animais, da a importncia de se monitorar no s os antibiticos, mas tambm seus metablitos. As amostras de ovos foram fortificadas com padres internos dos analitos deuterados e depois submetidas extrao com acetonitrila e posterior etapa de limpeza por EFS. As amostras de carne foram tambm fortificadas com os padres internos deuterados, mas foram extradas com acetato de etila e apenas filtradas aps a extrao, antes de serem injetadas no cromatgrafo. No sistema cromatogrfico foi utilizada a eluio por gradiente linear em fase reversa para separar os analitos. O espectrmetro de massas, um triplo quadrupolo, foi ajustado ao modo MRM para o monitoramento de duas transies para cada 5-nitroimidazol e seus correspondentes padres internos. Os analitos foram ionizados por IEN no modo positivo34. O mtodo de extrao utilizado permitiu que mais de 150 injees de amostras fossem realizadas sem perdas no desempenho da coluna cromatogrfica ou contaminao excessiva do espectrmetro de massas. Como no foram observadas diferenas significativas entre as curvas analticas obtidas com padres dos analitos em gua

Vol. 31, No. 3

O estado da arte da cromatografia associada espectrometria de massas

633

e no branco da matriz, a calibrao com padres aquosos foi utilizada, permitindo que a quantificao de 5 dos 7 analitos avaliados fosse realizada de maneira precisa e exata. Estes 5 compostos possuam um padro interno anlogo, isotopicamente marcado, os demais no34. APLICAO DE CL-EM-EM E CG-EM-EM NA DETERMINAO DE TOXINAS EM ALIMENTOS Chen et al.35 desenvolveram um mtodo para determinao de aflatoxinas em leite lquido e em p, utilizando EFS com alta vazo e CL-EM-EM. As aflatoxinas so metablitos secundrios da Aspergillus flavus e Aspergillus parasiticus, sendo encontradas freqentemente em cereais contaminados e frutas secas. A aflatoxina B1 (AFB1) a que possui maior toxicidade, uma vez que pode causar cncer de fgado quando um indivduo exposto por longo tempo a esta toxina, principalmente quando se tratam de pessoas com hepatite B. O principal metablito da AFB1 a aflatoxina M1 (AFM1), que menos carcinognica que AFB1 e pode ser encontrada na urina, sangue, leite e rgos internos de animais infectados. Os autores utilizaram um triplo quadrupolo com IEN no modo MSR. Como em IEN o pH da FM crtico para a intensidade do sinal, foram testadas solues aquosas de cido frmico (pH 2,9) e 4-metilmorfolina (pH 9,7) para os modos negativo e positivo, respectivamente, com a injeo de 30 ng de AFM 1 no sistema cromatogrfico. Os picos produzidos a partir dos ons negativos foram melhores que do on protonado, tanto em relao forma, quanto proporo sinal/rudo. Observaram que os diferentes materiais utilizados na etapa de limpeza por EFS (colunas de imunoafinidade Afla M1 - IAC e Mycosep 226 - MFC) tiveram influncia sobre os efeitos da matriz no sinal, uma vez que quando se utilizou a coluna IAC no foram observados efeitos de matriz, mas utilizando a coluna MFC foi observada a supresso do sinal em amostras reais. De acordo com os resultados obtidos, os autores afirmaram no haver a necessidade de utilizar o branco da matriz para construo da curva analtica, uma vez que o mtodo foi linear35. A utilizao da deteco por EM-EM possibilitou a obteno de LD at 85 vezes menores que os limites reguladores da Unio Europia (50 ng L-1) para o leite lquido e at 3 vezes mais sensveis que o nvel mximo estabelecido para bebs (25 ng kg-1) no leite em p, determinado pela Unio Europia35. O desenvolvimento de uma metodologia para determinao de azaspiracide em mariscos por CL-EM-EM foi realizado por Draisci et al.36. A azaspiracide uma toxina responsvel por casos de intoxicao de seres humanos resultante do consumo de mariscos na Europa. Este analito foi extrado de mexilho utilizando acetona e, a seguir, foi submetido anlise cromatogrfica usando uma microcoluna C18 (fase reversa) e eluio isocrtica, a uma vazo de 30 L min-1, com acetonitrila:gua (85:15 v/v) contendo 0,03% de cido trifluoractico. A toxina foi ionizada numa interface IEN operando no modo positivo, sendo gerada somente, como on precursor, a molcula protonada. Por DIC, em um triplo quadruplo, o on precursor foi dissociado em trs ons produto, [M+H-nH2O]+ com n = 1-3, os quais foram identificados utilizando MSR. Com o mtodo desenvolvido foi possvel obter boa linearidade no intervalo de concentrao entre 0,1 e 1 g mL-1 (padronizao externa) e LQ instrumental consideravelmente menor que o limite obtido em ensaios biolgicos. Rundberget e Wilkins37 realizaram a determinao de micotoxinas do Penicillium (cido micofenoltico, chaetoglobosina B, griseofulvina, penitrem A, roquefortine C e verruculogena) em alimentos utilizando LC-MS-MS. Os autores ressaltaram que, devido grande toxicidade das micotoxinas do Penicillinum, h a necessi-

dade do uso de tcnicas de anlise com as quais se consiga atingir baixos limites de deteco. Para algumas destas toxinas, na Unio Europia, legalmente aceitvel concentraes de 5 ng g-1 em gros. Os alimentos selecionados para realizao da anlise foram extrados primeiramente com uma mistura de acetonitrila/gua e, em seguida, com hexano para eliminar a gordura. O extrato aquoso filtrado foi injetado no sistema cromatogrfico, no qual foi empregada uma coluna C18 (fase reversa) e eluio por gradiente iniciada com uma mistura de metanol e gua na proporo de 40:60 v/v e terminada, aps 15 min, com a proporo de 95:5 v/v da mesma mistura de solventes. O sistema cromatogrfico encontrava-se acoplado a um espectrmetro ion-trap operando com interface IEN ou IQPA, no qual foi utilizado o modo MSR para obteno do espectro de massas. Nesse trabalho, os autores observaram que a altura e a rea dos picos obtidos para as micotoxinas por CL-EM-EM dependem da matriz, pois numa mistura das matrizes analisadas elas foram at 40% menores que as obtidas com padres das micotoxinas em metanol:gua. Ficou, portanto, evidente o efeito da supresso dos componentes das matrizes sobre a ionizao das diferentes espcies de micotoxinas analisadas. Por esse motivo, os autores realizaram a quantificao utilizando o branco da matriz e padro interno. O mtodo desenvolvido foi capaz de determinar as micotoxinas de interesse em concentraes abaixo de 5 ng g-1, como desejado37. Lau et al.38 desenvolveram um procedimento para a determinao de micotoxinas da Alternaria (alternariol e monometil ter alternariol) em sucos de frutas e bebidas alcolicas por CLAE-UV, CL-EM e CL-EM-EM. Estas micotoxinas so apontadas como possveis causadoras de cncer no esfago de seres humanos. As amostras foram submetidas extrao em fase slida, na qual foram empregados cartuchos de C18 e aminopropil em srie. Os eluatos das bebidas alcolicas foram evaporados em um rotaevaporador para eliminao do etanol. No sistema CL-EM o modo de varredura utilizado foi o MIS e no sistema CL-EM-EM foi empregado um triplo quadrupolo com ionizao por IQPA ou IEN, no modo negativo e varredura MRM38. Os autores observaram que os sinais obtidos na anlise por CLAE-UV foram mais intensos que os obtidos por CL-EM e CLEM-EM, o que mostra que o sinal em CLAE-UV sofre uma maior interferncia da matriz. Em CL-EM, no foi possvel detectar os analitos presentes em baixos nveis de concentrao em certas matrizes, devido a uma elevada interferncia da matriz. Mas em CL-EM-EM, a alta detectabilidade obtida permitiu a determinao de sub ng mL-1 das micotoxinas analisadas38. Outro trabalho de determinao de micotoxinas em alimentos foi realizado por Hubl et al.39, que utilizaram CL-EM-EM para determinao de dioxinivalenol em milho, empregando um padro interno marcado isotopicamente (13C). Aps a adio de padro interno amostra, esta foi submetida extrao com uma mistura de acetonitrila:gua (84:16 v/v) para posterior filtrao, evaporao e redissoluo do extrato em gua. O produto da extrao foi injetado em um sistema cromatogrfico operando em fase reversa com eluio por gradiente linear, empregando uma mistura de metanol:gua como fase mvel. O sistema cromatogrfico foi acoplado a um ion-trap com ionizao por IEN no modo negativo e varredura MRM39. Foram utilizadas solues padro dos agrotxicos em gua contendo padro interno e foram construdas duas curvas analticas: uma com o padro interno e outra por padronizao externa. Utilizou-se um material de referncia contendo (470 30) g kg-1 da micotoxina, para avaliar as duas curvas analticas. Para a curva construda considerando-se os padres internos obteve-se uma concentrao de (463 16) g kg-1 da micotoxina com recuperao de 99% para n=7 e

634

Chiaradia et al.

Quim. Nova

para a curva com padronizao externa obteve-se uma concentrao de (176 22) g kg-1 da micotoxina com recuperao de 37% para n=7. Esta diferena significativa observada nos resultados mostra que o uso de padro interno capaz de compensar variaes experimentais e instrumentais, mas compensa principalmente a supresso inica ocasionada pela matriz que ocorre em CL-EM-EM, apesar da grande seletividade e detectabilidade desta tcnica39. Eppe et al.40, numa tentativa de aumentar a detectabilidade em um sistema CG-EM-EM, utilizaram um injetor no sistema cromatogrfico que possibilitava a injeo de grandes volumes de amostra, para analisar dioxinas do gnero policlorodibenzo-p-dioxina/furano (PCDD/F) em alimentos. Os resultados foram comparados aos obtidos para as mesmas amostras analisadas por CG com deteco por um espectrmetro de massas de alta resoluo. As amostras de alimentos analisadas, carne bovina gordurosa, gema de ovo e leite em p, foram submetidas extrao em fase lquida sob alta presso com uma mistura de diclorometano:pentano (1:1 v/v), passando em seguida por uma etapa de limpeza em um sistema no qual foi empregada uma coluna de slica cida de alta capacidade, uma pequena coluna com mltiplas camadas de slica, uma coluna de alumina alcalina e uma coluna de carbono PX-21. No sistema CG-EM-EM, foi utilizado um ion-trap com ionizao por IE, empregando gs hlio para promover a dissociao dos analitos por DIC. Os resultados obtidos mostraram uma boa concordncia entre as tcnicas utilizadas, de maneira que a CG-EM-EM com injeo de maiores volumes pode ser atrativa para deteco de g kg-1 de toxinas em alimentos devido ao seu menor custo em comparao tcnica que utiliza o espectrmetro de massas de alta resoluo40. APLICAO DE CG-EM-EM E CL-EM-EM DETERMINAO DE SUBSTNCIAS TXICAS GERADAS DURANTE O PREPARO DOS ALIMENTOS Hoenicke et al.41 realizaram a anlise de acrilamida em diferentes tipos de alimentos utilizando CL-EM-EM e CG-EM-EM. Atribu-se a presena de acrilamida em alimentos reao de Maillard, que responsvel pelos sabores e colorao marrom caractersticos de alimentos fritos e assados. Segundo os autores, o monitoramento da presena de acrilamida em alimentos se faz necessria por ser considerada um composto potencialmente carcinognico. Nesse trabalho foram utilizadas duas tcnicas de extrao, sendo que uma delas foi realizada com iso-hexano, seguida por uma etapa de purificao com hexacianoferrato de potssio e sulfato de zinco (precipitao de Carrez). Na outra tcnica, a extrao foi feita com gua em banho de ultra-som, seguida de purificao empregando a precipitao de Carrez e uma etapa de extrao com acetato de etila. Segundo os autores, o uso da precipitao de Carrez para purificao da amostra permitiu que mais de 60 amostras fossem preparadas por dia. Porm, esta etapa foi insuficiente para purificar amostras de matrizes muito complexas, como caf solvel e cacau, da a necessidade de se realizar uma etapa extra de extrao. Esta etapa adicional foi capaz de eliminar as interferncias espectrais. A anlise por CL-EM-EM foi realizada utilizando IEN no modo positivo e um triplo quadrupolo ajustado para obteno dos espectros por MRM. No sistema cromatogrfico foi empregada eluio por gradiente utilizando como fase mvel uma mistura de acetonitrila:cido actico 1% em fase reversa (coluna LiChrospher 100 CN), numa vazo de 0,7 mL min-1. No sistema CG-EM-EM o cromatgrafo a gs foi acoplado a um triplo quadrupolo, sendo utilizada a IQ para ionizao do analito no modo positivo e MSR para obteno dos espectros de massas. Com CL-EM-EM foi possvel obter um LD de 10 g kg-1 e com CG-EM-EM, o LD foi de 5 g kg-1 41.

Outro trabalho visando a determinao de acrilamida em alimentos por CL-EM-EM foi realizado por Bermudo et al.42. Para isso foi empregado um espectrmetro ion-trap e a ionizao do analito foi realizada no modo positivo por IQPA. No sistema cromatogrfico foi utilizada fase reversa e uma FM com 100% de gua, a uma vazo de 0,3 mL min-1. Antes da etapa de extrao foi adicionado s amostras um padro interno de acrilamida marcada isotopicamente para posterior quantificao. A extrao foi feita com gua, por agitao e, em seguida, a limpeza foi realizada por EFS. O mtodo desenvolvido por Bermudo et al.42 foi aplicado a 30 amostras de alimentos coletadas em supermercados de Barcelona e quando a acrilamida estava presente nas amostras em concentraes inferiores ao LD de 45 ng g-1, obtido utilizando o ion-trap, empregava-se um triplo quadrupolo ajustado ao modo de varredura MRM para efetuar a determinao. Os maiores teores de acrilamida foram encontrados em batatas fritas (500 a 9250 ng g-1). Zhang et al.43 determinaram acrilamida em alimentos infantis base de cereais por CL-EM-EM, empregando, para isto, um triplo quadrupolo e ionizao por IEN no modo positivo. A gordura presente nas matrizes analisadas foi extrada com ter de petrleo e, em seguida, a extrao foi realizada com uma soluo aquosa de cloreto de sdio (2 mol L-1) e acetato de etila. A etapa de limpeza do extrato foi realizada por EFS. Antes de serem submetidas extrao, as amostras receberam a adio de um padro interno de acrilamida marcada isotopicamente, com o objetivo de verificar a ocorrncia de perdas durante o pr-tratamento da amostra e tambm para seu emprego na quantificao, uma vez que as curvas analticas foram obtidas pela razo entre a rea do pico cromatogrfico da acrilamida no marcada e a marcada presente nos padres utilizados. Aps a validao, os autores concluram que o mtodo desenvolvido seletivo, preciso e robusto e pode ser empregado na determinao de acrilamida em baixos nveis de concentrao em alimentos (LQ de 3 g kg-1). Andrzejwski et al.44 otimizaram um mtodo para determinao de acrilamida em caf solvel, pronto e em gros por CL-EMEM. Foi adicionado padro interno marcado isotopicamente (13C) s amostras para sua posterior extrao com gua, seguida de uma etapa de limpeza por EFS, com colunas Oasis HBL. A anlise por CL-EM-EM foi realizada em fase reversa no sistema cromatogrfico, empregando-se uma coluna Synergi Hydro-RP, com partculas de 4 m. Foi usada eluio isocrtica, com fase mvel de 0,5% de metanol em gua, acoplado a um triplo quadrupolo com ionizao por IEN e varredura MRM. Graas ao emprego de um padro interno estvel, os autores puderam observar a perda do sinal da acrilamida aps sucessivas injees do extrato de caf. Este problema pde ser solucionado ajustando-se a temperatura da coluna. Foi tambm observada a presena de interferentes co-extrados nos cromatogramas obtidos, porm, estes sinais no interferiram no sinal da acrilamida ou do padro interno graas boa resoluo cromatogrfica obtida. O mtodo desenvolvido apresentou boa linearidade e possibilitou verificar a presena de acrilamida em diversas marcas populares de caf43. CONCLUSES Considerando as aplicaes da cromatografia com deteco por espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas apresentadas nesta reviso, certifica-se que esta tcnica mostrou-se bastante eficiente na anlise de substncias txicas, em nvel de traos em alimentos, no sentido de terem sido atingidos, na maioria das tcnicas de anlise desenvolvidas, LQ abaixo dos LMR dos compostos de interesse, de ter sido possvel detectar a maioria dos compostos que se desejou analisar, de ter sido detec-

Vol. 31, No. 3

O estado da arte da cromatografia associada espectrometria de massas

635

tado um grande nmero de analitos de diferentes classes simultaneamente, no caso de anlises multirresiduais, e da possibilidade de confirmar a identidade dos compostos analisados com exatido, graas aos diferentes modos de varredura e ionizao que podem ser utilizados. Em alguns dos trabalhos descritos, ficou evidente a dificuldade em obter o sinal do analito livre de interferncias geradas pela matriz analisada. Apesar da grande seletividade da tcnica EM-EM, alimentos so matrizes muito complexas, das quais nem sempre possvel extrair o analito sem que interferentes estejam presentes nos extratos obtidos. Este problema mostrou-se mais grave quando os analitos de interesse esto presentes em matrizes com grande teor de gordura, como carnes, leite e leos, para as quais foi necessrio empregar etapas de limpeza por EFS ou CPG no processo de preparo da amostra. Entretanto, muitas das tcnicas de extrao utilizadas so trabalhosas e demoradas, de forma que a sua aplicao em anlises de rotina se torna difcil. Outra limitao da aplicao da cromatografia com deteco por espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas em anlises de rotina que vrios parmetros instrumentais tm que ser otimizados para cada analito, como energia de ionizao, ajuste das JTR, energia de dissociao (quando se utiliza DIC), para que sejam obtidos espectros de massas com abundncias relativas dos ons de interesse adequadas. Porm, para um mtodo de determinao multirresidual com deteco por EM, o instrumento tem que ter seus parmetros ajustados de forma adequada para monitorar todos os analitos simultaneamente, mas no necessariamente na condio tima para cada analito. Isto pode levar a uma deteco pouco sensvel de alguns compostos, principalmente quando pertencem a classes diferentes. A capacidade desta tcnica de fornecer informao estrutural com exatido permite que se realize a distino entre compostos isobricos de interesse ou provenientes da matriz, quando estes produzem um espectro de massas com ons fragmentos distintos. Mas, alguns compostos isobricos geram espectros de massas com ons fragmentos de mesma massa. Neste caso, EM-EM no capaz de distingu-los. Em alguns casos, a aplicao de EMn possibilita diferenciar entre estes tipos de analitos, porm, na maioria dos casos causa uma diminuio da detectabilidade, seletividade e aumento na razo sinal/rudo. A maior seletividade de EM-EM reduz a necessidade de se obterem separaes cromatogrficas com grande resoluo, uma vez que esta tcnica permite identificar e, muitas vezes quantificar, compostos que coeluem. Os dados obtidos com EM-EM no so mais complexos que aqueles provenientes da EM convencional, de forma que os analistas que dominam a tcnica de EM podem obter resultados com maior seletividade utilizando EM-EM. Espectrmetros como o iontrap apresentam a versatilidade de poderem ser ajustados para operar nos dois modos, EM e EM-EM, dispensando maiores investimentos na parte instrumental para obteno de maior seletividade. Tanto espectrmetros ion-trap quanto triplos quadrupolos so, com maior freqncia, empregados na anlise de compostos txicos em alimentos. Porm, os triplos quadrupolos permitem a obteno de menores LD, de forma que podem ser mais adequados em casos de compostos com menores LMR. Uma das principais vantagens de se acoplar a cromatogrefia EM-EM que a EM-EM permite a identificao de compostos com alto grau de confiana, o que no seria possvel apenas com base nas caractersticas de reteno/eluio dos compostos, fornecidas por outros detectores utilizados em CLAE e CG. Outra vantagem muito importante que, quando os analitos de interesse fazem parte de uma mistura, apenas utilizando a tcnica espectromtrica, o espec-

tro de massas obtido apresentaria ons de todos os componentes desta mistura e a identificao dos analitos seria feita com maior dificuldade. Mas, graas combinao da espectrometria com a capacidade de separao da cromatografia, na maioria das vezes compostos puros so introduzidos no espectrmetro de massas, de maneira que podem ser identificados de forma inequvoca. O alto custo do equipamento empregado em EM-EM torna sua utilizao invivel em muitos laboratrios. Porm, hoje, seu valor j se encontra menor devido concorrncia de mercado e muitas das vantagens associadas ao uso da EM-EM podem compensar o alto investimento inicial. SMBOLOS AE AP ATV CG CG-EM CG-EM-EM afinidade eletrnica afinidade protnica analisador de tempo de vo (Time-of-Flight Analiser) cromatografia gasosa (gas chromatography) cromatografia gasosa acoplada espectrometria de massas cromatografia gasosa com deteco por espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas cromatografia de ons totais (total ion chromatogram) cromatografia lquida de alta eficincia (high performance liquid chromatography) cromatografia lquida de alta eficincia com deteco por ultra-violeta cromatografia lquida acoplada espectrometria de massas cromatografia lquida com deteco por espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas cromatografia por permeao em gel (gel permeation chromatography) dissociao induzida por coliso com um gs inerte (collision-induced dissociation) extrao em fase slida (solid phase extraction) espectrometria de massas (mass spectrometry) primeiro estgio de espectrometria de massas na espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas segundo estgio de espectrometria de massas na espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas espectrometria de massas acoplada espectrometria de massas fotoionizao em presso atmosfrica (atmospheric pressure photoionization) fase mvel energia do fton irradiador ionizao por impacto de eltrons (electron ionization) ionizao por eletronebuilizao (electrospray ionization) ionizao qumica presso atmosfrica (atmospheric pressure chemical ionization) ionizao qumica (chemical ionization) janela de tempo de reteno (retention time window) limite de deteco

CIT CLAE CLAE-UV CL-EM CL-EM-EM

CPG DIC EFS EM EM1

EM2

EM-EM FIPA FM h IE IEN IQPA IQ JTR LD

636

Chiaradia et al.

Quim. Nova

MIS LMR LQ MIS MRM MSR m/z PI Q-ATV

monitoramento de ons selecionados (selected ion monitoring) nveis mximos de resduo (maximum residue levels) limite de quantificao monitoramento dos ons selecionados (selected ion monitoring) monitoramento de reaes mltiplas (multiple-reaction monitoring) monitoramento seletivo de reaes (selected-reaction monitoring) razo entre a massa e a carga de um on potencial de ionizao (ionization potencial) instrumento em que o ltimo estgio de um triplo quadrupolo substitudo por um analisador de tempo de vo

REFERNCIAS
1. Vkey, K.; J. Chromatogr., A 2001, 921, 227. 2. Ardrey, R. E.; Liquid Chromatography-Mass Spectrometry: An Introdution, Wiley: Huddersfield, 2003. 3. Kitson, F. G.; Larsen, B. S.; McEwen, C. N.; Gas Chromatography and Mass Spectrometry - A Pratical Guide, Academic: London, 1996. 4. Smeraglia, J.; Baldrey, S. F.; Watson, D.; Chromatographia 2002, 55, 95. 5. Granby, K.; Andersen, J. H.; Christensen, H. B.; Anal. Chim. Acta 2004, 520, 165. 6. Nez, O.; Moyano, E.; Galceran, M. T.; Tr AC, Trends Anal. Chem. 2005, 24, 683. 7. Bos, S. J.; van Leeuwen, S. M.; Karst, U.; Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 85. 8. Robb, D. B.; Covey, T. R.; Bruins, A. P.; Anal. Chem. 2000, 72, 3653. 9. Hager, J. W.; Le Blanc, J. C. Y.; J. Chromatogr., A 2003, 1020, 3. 10. http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/cid-fragmentation.html, acessada em Agosto 2006. 11. Borchers, C.; Parker, C. E.; Deterding, L. J.; Tomer, K. B.; J. Chromatogr., A 1999, 854, 119. 12. Aquino Neto, F. R.; Nunes, D. S. S.; Cromatografia: Princpios e Tcnicas Afins, Editora Intercincia: Rio de Janeiro, 2003. 13. Veja, P. V.; Florentino, B. L.; Toxicologia de Alimentos, Centro Nacional de Salud Ambiental: Mxico, 2000. 14. Lehotay, S. J.; Hajslov, J.; Tr AC, Trends Anal. Chem. 2002, 21, 686. 15. Sorensen, L. K.; Rapid Commun. Mass Spectrom. 2006, 20, 1135. 16. Kuklenyik, Z.; Reich, J. A.; Tully, J. S.; Needham, L. L.; Calafat, A. M.; Environ. Sci. Technol. 2004, 38, 3698. 17. Taylor, M. J.; Hunter, K.; Hunter, K. B.; Lindsay, D.; Bouhellec, S. L.; J. Chromatogr., A 2002, 982, 225.

18. Frenich, A. G.; Vidal, J. L.; Lpez, T. L.; Aguado, S. C.; Salvador, I. M.; J. Chromatogr., A 2004, 1048, 199. 19. Arrebola, F. J.; Vidal, J. L. M.; Gonzlez-Rodrguez, M. J.; Frenich, A. G.; Morito, N. S.; J. Chromatogr., A 2003, 1005, 131. 20. Vidal, J. L. M.; Arrebola, F. J.; Mateu-Snchez, M.; J. Chromatogr., A 2002, 959, 203. 21. Arrebola, F. J.; Vidal, J. L. M.; Mateu-Snchez, M.; lvarez-Castelln, F. J.; Anal. Chim. Acta 2003, 484, 167. 22. Moreno, J. L. F.; Libanas, F. J. A.; Frenich, A. G.; Vidal, J. L. M.; J. Chromatogr., A 2006, 1111, 97. 23. Patel, K.; Fussel, R. J.; Hetmanski, M.; Goodal, D. M.; Keely, B. J.; J. Chromatogr., A 2005, 1068, 289. 24. Gonzlez-Rodrguez, M. J.; Libanas, F. J. A.; Frenich, A. G.; Vidal, J. L. M.; Lpez, F. J. S.; Anal. Bioanal. Chem. 2005, 382, 164. 25. Sannino, A.; Bolzoni, L.; Bandini, M.; J. Chromatogr., A 2004, 1036, 161. 26. Ferrer, C.; Gmez, M. J.; Garca-Reyes, J. F.; Ferrer, I.; Thurman, E. M.; Fernndez-Alba, A. R.; J. Chromatogr., A 2005, 1069, 183. 27. Fagerquist, C. K.; Lightfield, A. R.; Lehotay, S. J.; Anal. Chem. 2005, 77, 1473. 28. Bogialli, S.; Capitolino, V.; Curini, R.; Di Corcia, A.; Nazzari, M.; Sergi, M.; J. Agric. Food. Chem. 2004, 52, 3286. 29. Matabudul, D. K.; Conway, B.; Lumley, I.; Sumar, S.; Food Chem. 2001, 75, 345. 30. Andersen, W. C.; Roybal, J. E.; Gonzales, S. A.; Turnipseed, S. B.; Pfenning, A. P.; Kuck, L. R.; Anal. Chim. Acta 2005, 529, 145. 31. Nicolich, R. S.; Werneck-Barroso, E.; Marques, M. A. S.; Anal. Chim. Acta 2006, 565, 97. 32. Mottier, P.; Khong, S. P.; Gremaud, E.; Richoz, J.; Delatour, T.; Goldmann, T.; Guy, P. A.; J. Chromatogr., A 2005, 1067, 85. 33. Heller, D. N.; Ngoh, M. A.; Donoghue, D.; Podhorniak, L.; Righter, H.; Thomas, M. H.; J. Chromatogr., B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2002, 774, 39. 34. Mottier, P.; Hur, I.; Gremaud, E.; Guy, P. A.; J. Agric. Food Chem. 2006, 54, 2018. 35. Chen, C. Y.; Li, W. J.; Peng, K. Y.; J. Agric. Food Chem. 2005, 53, 8474. 36. Draisci, R.; Palleschi, L.; Ferretti, E.; Fuery, A.; James, K. J.; Satake, M.; Yasumoto, T.; J. Chromatogr., A 2000, 871, 13. 37. Rundberget, T.; Wilkins, A. L.; J. Chromatogr., A 2002, 964, 189. 38. Lau, B. P. Y.; Scott, P. M.; Lewis, D. A.; Kanhere, S. R.; Clrox, C.; Roscoe, V. A.; J. Chromatogr., A 2003, 998, 119. 39. Hubl, G.; Berthiller, F.; Krska, R.; Schuhmacher, R.; Anal. Bioanal. Chem. 2006, 384, 692. 40. Eppe, G.; Focant, J. F.; Pirard, C.; Pauw, E.D.; Talanta 2004, 63, 1135. 41. Hoenicke, K.; Gatermann, R.; Harder, W.; Hartig, L.; Anal. Chim. Acta 2004, 520, 207. 42. Bermudo, E.; Moyano, E.; Puignou, L.; Galceran, M.T.; Anal. Chim. Acta 2006, 559, 207. 43. Zhang, Y.; Jiao, J.; Ren, Y.; Wu, X.; Zhang, Y.; Anal. Chim. Acta 2005, 551, 150. 44. Andrzejewski, D.; Roach, J. A. G.; Gay, M. L.; Musser, S. M.; J. Agric. Food Chem. 2004, 52, 1996.