3 METODE PENELITIAN

3.1 Waktu dan Tempat

Penelitian dilakukan pada bulan Agustus sampai dengan September 2010,
bertempat di PT. Lautan Niaga Jaya, Muara Baru Jakarta Utara, dan Balai
Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan DKI Jakarta
(BPMPHPK DKI Jakarta).

3.2 Alat dan Bahan
Alat yang digunakan untuk analisis histamin dengan spektrofluorometri
dan Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) (SNI 2354.10:2009) adalah labu
erlenmeyer, gelas ukur, pisau, homogenizer (blender), water bath, labu ukur,
kertas saring Whattmann, spektrofluorometer tipe Varian Cary Eclipse
FL0811M007, glass wool, pipet volumetrik, pipet tetes, kolom kromatografi,
timbangan analitik dan buret. Alat yang digunakan pada analisis TVB (SNI
2354.8:2009) adalah blender, buret, corong gelas, erlenmeyer, gelas piala, kertas
saring Whattman, labu takar, seperangkat alat destilasi uap, dan timbangan
analitik dengan ketelitian 0,0001 gram. Alat yang digunakan untuk analisis Total
Plate Count (TPC) (SNI 01-2332.3-2006) dan analisis bakteri penghasil histamin
dengan media Niven (Modifikasi Niven 1981) adalah laminar, pipet volumetrik,
Homogenizer, plastik steril, cawan petri, inkubator, autoklaf, talenan, water bath,
dan stopwatch.
Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah ikan laut
jenis tuna (Thunnus sp.), sedangkan bahan-bahan lainnya adalah metanol, resin
penukar ion (dowex 1-x800-100-mesh), aquades, HCl, NaOH, H
3
PO
4
,
ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT), larutan TCA, asam borat, K
2
CO
3
, vaseline,
indikator conway, larutan Butterfields Phospate Buffered, Plate Count Agar
(PCA), Media niven (0.1% trypton, 0.2% yeast ekstrak, 0.1% L-histidin, 0.1%
CaCO
3,
2% NaCl, 2.5% agar, 0.01% phenol red).



14

3.3 Alur Penelitian
Penelitian dimulai dengan tahapan pengambilan sampel di PT. LNJ,
Muara Baru, Jakarta Utara. Sampel diambil dari ikan tuna segar yang baru tiba
sebanyak 300 gram per bagian tubuh yang akan diuji, yakni bagian tubuh depan,
perut, dan ekor ikan tuna. Sampel dimasukkan ke dalam plastik High Density Poly
Etylen (HDPE) yang telah disterilkan dengan autoklaf untuk menghindari
kontaminasi. Kemudian dimasukkan ke dalam cool box berukuran 25 liter yang
telah diisi es berbentuk flake.
Setelah sampel tersimpan baik di dalam cool box, sampel ikan tuna
kemudian dibawa menuju ruang preparasi sampel, laboratorium organoleptik
Balai Pengujian Mutu dan Pengolahan Hasil Perikanan dan Kelautan DKI Jakarta
(BPMPHPK DKI Jakarta) dengan menempuh waktu perjalanan 15 menit dari
PT.LNJ.
Preparasi sampel dilakukan secara aseptik dan terbagi ke dalam beberapa
kelompok sampel. Pertama adalah sampel kontrol yang tidak mendapatkan
perlakuan perbedaan suhu dan lama penyimpanan, diuji pada hari yang sama.
Kedua adalah sampel untuk perlakuan suhu penyimpanan (0-1)

C selama 24 jam,
ketiga adalah sampel untuk perlakuan suhu penyimpanan 4

C selama 24 jam, dan

terakhir adalah sampel untuk perlakuan suhu penyimpanan 30

C selama 24 jam.
Setelah dipreparasi, sampel kontrol segera diuji Total Plate Count (TPC)
dan uji bakteri penghasil histamin, dan diuji kadar histamin dan Total Volatile
Base (TVB). Sampel untuk pengujian hasil perlakuan perbedaan suhu
penyimpanan disimpan pada masing-masing suhu uji akan diuji setelah 24 jam
penyimpanan.

3.4 Prosedur Pengujian Sampel
Prosedur kerja analisis dalam pengujian sampel pada penelitian ini
meliputi analisis kadar histamin, kadar Total Volatile Base (TVB), Total Plate
Count (TPC), dan analisis jumlah bakteri pembentuk histamin.



15

3.4.1 Analisis kadar histamin (SNI 2354.10: 2009)
Prinsip penentuan kadar histamin adalah zat histamin dalam contoh
dikonversikan ke dalam bentuk OH, kemudian diisolasi dengan resin penukar
ion dan diubah ke bentuk derivatnya dengan ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT)
dan diukur secara fluorometris. Hasil yang diperoleh dinyatakan dalam ekuivalen
kadar histamin. Prosedur kerja analisis kadar histamin terdiri atas tiga tahap, yaitu
sebagai berikut :
a) Tahap ekstraksi
Sepuluh gram sampel ditimbang lalu ditambahkan dengan metanol
sebanyak 50 ml kemudian dihomogenkan dengan homogenizer (blender) kurang
lebih selama 1-2 menit. Sampel yang sudah dipanaskan dalam water bath pada
suhu 60

C selama 15 menit, kemudian didinginkan pada suhu ruang. Sampel

tersebut dimasukkan ke dalam labu ukur 100 ml, kemudian ditambahkan metanol
sampai tanda tera lalu dikocok agar homogen. Setelah itu, larutan sampel disaring
menggunakan kertas saring dan dimasukkan ke dalam erlenmeyer. Filtrat dari
hasil penyaringan akan digunakan pada proses clean up.
b) Tahap clean up atau tahap elusi
Pertama-tama disiapkan kolom kromatografi (panjang 20 cm dan diameter
7 mm) kemudian ke dalam kolom tersebut dimasukkan glass wool secukupnya
(tingginya 1 cm). Selanjutnya resin penukar ion (dowex 1-x800-100-mesh)
dimasukkan ke dalam kolom sampai tingginya kurang lebih 8 cm (diusahakan
resin tidak sampai kering dengan cara dibilas dengan akuades karena akan
mempengaruhi daya kerja penukar ion tersebut). Selanjutnya sampel filtrat hasil
penyaringan pada tahap ekstraksi dilewatkan ke dalam kolom sebanyak 1 ml dan
ditampung hasilnya dalam labu ukur yang telah diberi 5 ml HCl 1 N.
c) Tahap pembentukan
Sebanyak 10 ml HCl 0,1 N dipipet dan dimasukkan ke dalam tabung
reaksi kemudian ditambahkan 5 ml sampel hasil tahap celan up/elusi, 5 ml
standar histamin (sebagai larutan standar), dan 5 ml HCl 0,1 N (sebagai blanko).
Setelah itu, ditambahkan 3 ml NaOH 1 N ke dalam tabung reaksi lalu
dihomogenkan dan dibiarkan selama 5 menit. Kemudian ditambahkan lagi
ortoptalatdikarboksilaldehide (OPT) 1% sebanyak 1 ml lalu dihomgenkan dan
16

didiamkan selama 4 menit. Selanjutnya ditambahkan 3 ml H
3
PO
4
3,57 N dan
dihomogenkan. Setelah selesai, sampel yang telah melalui tahap pembentukan
siap untuk dibaca menggunakan spektrofluorometer pada panjang gelombang
eksitasi 350 nm dan panjang gelombang emisi 444 nm. Rumus perhitungan kadar
histamin (ppm) adalah sebagai berikut :

Histamin (ppm) =
[
IU sameI-A
B
x Pp
bobot sampcI

Keterangan :
IU = Absorban sampel
A = Intersep
B = Slope
Fp = Faktor pengencer

3.4.2 Analisis kadar Total Volatile Base (TVB) (SNI 2354.8:2009)
Analisis ini bertujuan untuk menentukan jumlah kandungan senyawa-
senyawa basa volatil yang terbentuk akibat degradasi protein. Prosedur kerja
analisis kadar TVB terbagi atas 3 tahap sebagai berikut :
a) Tahap ekstraksi
Pertama-tama sampel ditimbang sebanyak 10 gram dengan gelas piala, lalu
ditambahkan 90 ml asam perklorat (PCA) 6%. Sampel dihomogenkan
menggunakan homogenizer selama 2 menit. Selanjutnya sampel disaring dengan
menggunakan kertas saring kasar dan menghasilkan filtrat yang akan digunakan
pada tahapan selanjutnya.
b) Tahap destilasi
Sebanyak 50 ml sampel filtrat dimasukkan ke tabung destilasi, kemudian
ditambahkan beberapa tetes indikator Fenolftalein dan ditambahkan beberapa
tetes silikon anti foaming. Tabung destilasi dipasang pada destilator dan
ditambahkan 10 ml NaOH 20% sampai basa yang ditandai dengan warna merah.
Kemudian disiapkan penampung erlenmeyer yang berisi 100 ml H
3
BO
4
3% dan
3-5 tetes indikator tashiro yang berwarna ungu. Setelah itu sampel didestilasi uap
kurang lebih 10 menit sampai memperoleh destilat 100 ml sehingga pada volume
akhir mencapai kurang lebih 200 ml larutan berwarna hijau. Larutan blanko
17

disiapkan dengan mengganti ekstrak sampel dengan 50 ml asam perklorat (PCA)
6% dan dikerjakan dengan proses yang sama dengan sampel
c) Tahap titrasi
Larutan destilat sampel dan blanko kemudian dititrasi dengan
menggunakan larutan HCl 0,02 N. Titik akhir titrasi ditandai dengan terbentuknya
kembali warna ungu. Perhitungan kadar TVB dapat dilakukan dengan perumusan
berikut ini :

Kadar TVB (mgN/100g) =
(Vc-Vb) x N HCI x Ar N x Ip x 100
bobot sampcI


Keterangan :
Vc = volume larutan HCl pada titrasi contoh/sampel
Vb = volume larutan HCl pada titrasi blanko
Ar N = berat atom nitrogen (14,007)
Fp = faktor pengenceran

3.4.3 Analisis total mikroba (Total Plate Count) (SNI 01-2332.3-2006)
Prinsip kerja analisis TPC adalah pertumbuhan mikroorganisme setelah
contoh diinkubasi dalam media agar pada suhu 35

C selama 48 jam, maka

mikroorganisme tersebut akan tumbuh berkembang biak dengan membentuk
koloni yang dapat langsung dihitung.
Prosedur kerja analisis TPC adalah sebagai berikut: sampel ditimbang
secara aseptik sebanyak 25 gram dan ditambahkan 225 ml larutan Butterfields
Phospate Buffered, kemudian dihomogenkan slama 2 menit. Homogenat ini
merupakan larutan pengenceran 10
-1
. Sebanyak 1 ml homogenat diambil
menggunakan pipet steril dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml larutan
Butterfields Phospate Buffered sehingga diperoleh contoh dengan pengenceran
10
-2
. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25 kali. Kemudian
dilakukan hal yang sama untuk pengenceran 10
-3
, 10
-4
, 10
-5
, dan seterusnya sesuai
kondisi sampel. Selanjutnya untuk metode cawan agar tuang (pour plate method),
dipipet sebanyak 1 ml dari setiap pengenceran dan dimasukkan ke dalam cawan
petri steril secara duplo menggunakan pipet steril. Ke dalam masing-masing
cawan yang sudah berisi sampel, ditambahkan 12-15 ml media Plate Count Agar
18

(PCA) yang sudah didinginkan hingga mencapai suhu 45

C. Setelah agar menjadi

padat, cawan petri yang telah berisi agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan
ke dalam inkubator dengan posisi terbalik selama 48 jam pada suhu 35

C.
Selanjutnya dilakukan pengamatan dengan menghitung jumlah koloni bakteri
yang ada di dalam cawan petri menggunakan alat penghitung koloni. Jumlah
koloni yang dihitung adalah cawan petri yang mempunyai koloni bakteri antara
25-250 koloni.

3.4.4 Analisis jumlah bakteri pembentuk histamin (Niven et al. 1981)
Prinsip analisis bakteri pembentuk histamin adalah enterobactericeae akan
mengubah histidin menjadi histamin melalui proses dekarboksilase yang akan
menaikkan pH dan merubah warna pada media.
Media modifikasi niven agar dipersiapkan dengan cara mencampurkan
semua bahan, yaitu 0,1% trypton, 0,3% yeast extract, 1,8% L-histidin
monohydrochlorid monohydrat, 0,1% CaCO
3
, 0,5% NaCl, 2,5% agar, dan 0,003%
phenol red, kemudian dimasukkan ke dalam erlenmeyer lalu diencerkan
menggunakan aquades hingga 1000 ml. Selanjutnya dipanaskan hingga mendidih
dan diatur pH 6,4 kemudian disterilisasi menggunakan otoklaf pada suhu 121

C
selama 15 menit.
Sampel sebanyak 25 gram dimasukkan ke dalam botol yang berisi 225 ml
larutan Butterfields Phospate Buffered, kemudian dilumatkan dengan blender
hingga larutan homogen. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10
-1
.
Dari campuran tersebut diambil 1 ml dan dimasukkan ke dalam botol berisi 9 ml
larutan Butterfields Phospate Buffered sehingga diperoleh contoh dengan
pengenceran 10
-2
, kemudian dikocok sampai homogen. Pengenceran dilakukan
hingga 10
-4
. Satu ml larutan sampel hasil setiap pengenceran dimasukkan ke
dalam cawan petri, lalu 12-15 ml media niven agar cair yang sudah didinginkan
hingga mencapai suhu 45

C dituangkan ke dalam masing-masing cawan yang

sudah berisi sampel. Setelah agar menjadi padat, cawan petri yang telah berisi
agar dan larutan sampel tersebut dimasukkan ke dalam inkubator dengan posisi
terbalik selama 48 jam pada suhu 35

C. Selanjutnya dilakukan penghitungan
jumlah koloni berwarna merah muda dengan halo pink pada latar belakang
19

berwarna kuning atau orange. Koloni tersebut merupakan koloni bakteri
pembentuk histamin. Hasil penghitungan jumlah koloni bakteri pembentuk
histamin tersebut kemudian dibandingkan dengan nilai TPC sehingga diperoleh
persentase jumlah bakteri pembentuk histamin terhadap nilai TPC.

3.5 Analsis Data (Steel dan Torrie 1991)
Data hasil analsis kadar histamin, TVB, TPC, dan jumlah bakteri
pembentuk histamin dianalisis menggunakan program Microsoft Excel 2007 dan
SPSS. Rancangan percobaan yang digunakan adalah Rancangan Acak Lengkap
Faktorial, yakni menunjukkan pengaruh perlakuan suhu dan kelompok bagian
tubuh tuna (bagian depan, perut, dan ekor) terhadap kadar histamin, TVB, TPC,
dan jumlah bakteri penghasil histamin, serta interaksi keterkaitan antara suhu
perlakuan dan perbedaan bagian tubuh yang diuji. Ulangan yang digunakan dalam
penelitian ini adalah 3 kali ulangan. Model Rancangan Acak Lengkap Faktorial
adalah sebagai berikut :
Y
|jk
= + u
|
+
j
+(u)
|j
+ s
|jk

Keterangan :
Y
ijk
= Pengamatan pada satuan percobaan ke k yang memperoleh kombinasi
perlakuan taraf ke i dari faktor dan taraf ke j dari faktor
= Mean populasi

i
= Pengaruh taraf ke i dari faktor

j
= Pengaruh taraf ke j dari faktor
()
ij
= Pengaruh taraf ke i dari faktor dan taraf ke j dari faktor

ijk
= Pengaruh acak satuan ke k yang memperoleh kombinasi perlakuan

Apabila hasil analisis data menunjukkan hasil yang berbeda nyata, maka
dilakukan uji lanjut tukey atau uji Beda Nyata Jujur (BNJ) yang bertujuan untuk
mengetahui perlakuan mana yang memberikan pengaruh yang berbeda nyata
terhadap parameter yang dianalisis. Rumus pengujian dengan Uji Tukey (BNJ)
adalah sebagai berikut:


20

BNJ = q(Lp dhx u)
_
ktx
r


Keterangan :
q = Nilai pada tabel q
p = Perlakuan
dbs = Derajat bebas sisa
= 0,05
kts = Kuadrat tengah sisa