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REV.

06/10

Anti-HCV

MTODO:
ELISA

FINALIDADE:
A Hepatite C uma infeco viral do fgado que tem sido referenciada como
hepatite no-A, no-B transmitida por via parenteral at a identificao do agente
causador em 1989. A descoberta e a caracterizao do vrus da hepatite C (HCV)
levou compreenso de seu papel primrio na hepatite ps-transfusacional e sua
tendncia de induzir uma infeco persistente.
O HVC a maior causa de hepatite aguda e doena crnica do fgado, incluindo
cirrose e cncer do fgado. Globalmente, estima-se que 170 milhes de pessoas
esto cronicamente infectadas com HCV e de 3 a 4 milhes de pessoas so
infectadas todo ano. O HCV primariamente disseminado pelo contato direto com o
sangue humano. A principal causa da infeco mundial por HCV o uso de
transfuses sanguneas sem triagem adequada e a reutilizao de seringas que no
foram adequadamente esterilizadas.
Atualmente no existe uma vacina disponvel para a preveno da hepatite C e o
tratamento para a hepatite C crnica muito caro para a maioria das pessoas nos
pases em desenvolvimento. Portanto, a partir de uma perspectiva global, o mximo
de impacto no nus da hepatite C ser provavelmente alcanado pelos esforos
concentrados na reduo do risco de transmisso do HCV de exposies hospitalares
(ex. transfuso de sangue, prticas sem segurana de manuseio de seringas) e
comportamento de alto risco (ex. uso de drogas injetveis).
O uso de diferentes antgenos de HCV (recombinantes) tem mostrado ser mais
efetivo na identificao de hepatite no-A, no-B do que testes de um nico
antgeno.
A finalidade do anti HCV ELISA Human a identificao de amostras potencialmente
infectantes e prevenir o seu uso como material para doao.
Somente para diagnstico de uso in vitro.

PRINCPIO:
O anti-HCV um teste de ELISA indireto de 3 gerao para deteco de anticorpos
IgG anti-HCV. O teste utiliza antgenos recombinantes especficos de HCV (core, NS
3, NS 4, NS 5) revestidos nas cavidades das tiras de microtitulao.
Anticorpos das amostras, se presente, ou controles se ligam no antgeno HCV dos
controles (1 etapa) na fase slida. Aps a incubao, componentes das amostras
no ligados so removidos por lavagem. Na segunda etapa de incubao
adicionado o conjugado anti-humano IgG HRP, que se liga especificamente aos
anticorpos humanos anti-HCV imobilizadas e forma o imunocomplexo. Aps a
segunda etapa de lavagem o excesso de conjugado removido. O Substrato/TMB
adicionado (etapa 3). A colorao azul desenvolvida muda para amarelo aps a
finalizao da reao. A intensidade da cor diretamente proporcional a
concentrao de anticorpo HCV-IgG na amostra.
A absorbncia dos calibradores e amostras determinada pelo uso de leitora de
tiras de ELISA ou sistemas automatizados (como a linha Humareader ou Elisys da
Human). Os resultados das amostras dos pacientes so obtidos pela comparao
com o valor do cut-off.

IDENTIFICAO E ARMAZENAMENTO:
Conservar entre 2 a 8C.
Reagentes:

MIC- 12 Tiras de microtitulao (em um suporte de tiras)
Tiras descartveis com 8 cavidades cobertas com antgenos recombinantes (core, NS
3, NS 4, NS 5) de HCV (E. coli).
NC- 1,5 mL Controle negativo
Soro humano no reativo para anti-HCV. Potencialmente infectante
PC- 1,5 mL Controle Positivo
Soro humano reativo para anti-HCV (inativado). Potencialmente Infectante
DIL- 36 mL Diluente da amostra
pH 7,1 0,1. Tampo Tris 0,1 M; Tween 20 0,2%.
CON- 2,5 mL Conjugado anti-humano-IgG-HRP
pH 7,0 0,1. Conjugado anticorpo IgG anti-humano de cabra-peroxidase; Tampo
fosfato 0,05 M; Albumina Bovina 40%.
C-DIL- 24 mL Diluente de Conjugado
pH 7,1 0,1. Tampo Tris 0,02 M; Tween 20 0,2%.
WS- 110 mL Soluo de lavagem (20x concentrada)
pH 6,5 0,1. Concentrada para 2000 mL; Tampo fosfato salino 1 mol/L, Cloreto de
sdio 18%, Tween 20,0 0,2%.
SA- 12 mL Reagente Substrato A
Perxido de hidrognio 0,03%; Tampo citrato 0,06 mol/L.
SB- 12 mL Reagente Substrato B
3,3,5,5-tetrametilbenzidina 0,6 mg/mL; DMSO 0,7 mol/L.
STOP- 12 mL Soluo Stop
cido sulfrico 1,0 mol/L.

2 tiras adesivas

Nota:
Os seguintes preservativos esto contidos nos reagentes:
Timerosal 0,01% nos reagentes NC, PC, DIL, CON, C-DIL
Gentamicina 0,003% nos reagentes CON, C-DIL
Azida Sdica 0,1% nos reagentes NC, PC, DIL

ESTABILIDADE:
Os reagentes so estveis at o vencimento da data de validade impressa nos
rtulos, quando armazenados entre 2 e 8C.
Depois de abertos, os reagentes devem ser armazenados entre 2 e 8C e usados
dentro de 30 dias.
WS (20x) deve ser armazenado em temperatura ambiente para evitar
cristalizao.
O fabricante garante a qualidade do produto, se este for armazenado como
descrito acima e em sua embalagem original.



TRANSPORTE:
O transporte do kit deve ser feito pela rota mais direta evitando-se as chegadas nos
finais de semana e feriados no local de destino. O kit no afetado pelo transporte
desde que seja entregue ao destinatrio no perodo mximo de 07 dias e em uma
temperatura de at 37C.

PRECAUES:
Cuidados habituais de segurana devem ser aplicados na manipulao sos
reagentes. STOP, NC, SA, SB podem irritar olhos, pele e membranas mucosas. Em
contato, enxaguar abundantemente com gua e consultar um mdico.
NC, PC, DIL contm azida sdica. No ingerir ou aspirar. Evitar contato com a pele
e mucosa.
Todas as amostras e controles do kit devem ser manuseados como capazes de
transmitir infeco. Recomenda-se seguir as normas de biossegurana.
O controle positivo foi inativado pelo calor mas deve ser manuseado como
potencialmente infectante. Os controles positivo e negativo foram checados para
HBsAg e anticorpos anti-HIV 1/2, encontrando-se negativos.
Todo o material contaminado com amostra de paciente e controles deve ser
inativado por autoclavao (60 min a 121C) ou por imerso em soluo de
hipoclorito de sdio a 10% por no mnimo 60 min.
Para descarte seguro dos reagentes e materiais biolgicos, sugerimos utilizar as
regulamentaes normativas locais, estaduais ou federais para a preservao
ambiental.

LIMITAES:
Resultados falso positivos: mulheres grvidas, pessoas vacinadas recentemente
para influenza, portadores de hipergamaglobulinemia, presena de fator reumatide
e anticorpos anti-nucleares podem fornecer resultados falso-positivos.
Resultados falso-negativos: Resultados falso-negativos em pacientes HIV
positivos so observados em um nmero razovel de pacientes. A co-infeco
HIV/HCV pode ser encontrada em at 30% dos pacientes HIV positivos.
O resultado isolado do Hexagon HCV no pode ser usado para um diagnstico
definitivo. Como todos os testes diagnsticos, os resultados obtidos com o Hexagon
HIV devem ser interpretados levando-se em considerao outros achados
laboratoriais e o status clnico do paciente. Um resultado negativo no exclui a
possibilidade de exposio ou infeco com o HIV.

MATERIAIS NECESSRIOS E NO FORNECIDOS:
Leitora de Elisa.
Lavadora automtica.
Pipetas automticas.
Ponteiras descartveis.

PREPARO DOS REAGENTES:
Trazer todos os reagentes para a temperatura ambiente (15-25C) antes do uso.
Os reagentes no devem ser usados na temperatura de 2 a 8C.

Tiras de microtitulao MIC:
So seladas em uma bolsa aluminizada contendo com um dessecante.
A bolsa deve atingir a temperatura ambiente antes de ser aberta. As tiras que no
forem utilizadas devem retornar para a bolsa e devem ser armazenadas entre 2 e
8C. No tocar na borda superior ou no fundo das cavidades com os dedos.

Soluo Conjugado de Uso WCON
-Diluir CON 1 + 20 com C-DIL. Ex.: 50 L de CON + 1000 L de C-DIL para 8
cavidades. (so necessrios 100 L para cada cavidade).
-Fazer o preparo para cada bateria de testes.
-Estabilidade: 6 horas em temperatura ambiente (evitar contaminao).

Soluo de Lavagem de Uso WASH
-Cristais no WS devem ser dissolvidos por aquecimento entre 35 e 37C.
-Diluir WS 1 + 19 com gua deionizada recentemente colhida, ex, 50 mL WS + 950
mL de gua = 1000 mL.
-So necessrios aproximadamente 2,5 mL de WASH necessrio para cada
cavidade.
-Preparar somente a quantidade necessria para a bateria de testes que vai ser
realizada.
-Estabilidade: 1 semana a 2 e 8C.

Soluo Substrato de Uso SUB (Ver tambm A2):
-Preparar o volume necessrio misturando partes iguais de SA e SB em um
recipiente de plstico limpo, enxaguado com gua deionizada antes do uso.
-O SB deve ser incolor a ligeiramente azulado, se diferente, deve ser descartado.
-Manusear o SUB cuidadosamente e evitar contaminao! No us-lo se
apresentar na cor azul.
-Armazenar protegido da luz forte.
-Estabilidade: 120 minutos em temperatura ambiente (15 e 25).

AMOSTRAS, CONTROLES
Soro e plasma com os anticoagulantes citrato, heparina ou EDTA.
No usar amostras fortemente lipmicas, hemolisadas ou ictricas.
Amostras no diludas podem ser armazenadas por 12 horas em temperatura
ambiente (15 a 25C), por 24 horas entre 2 e 8C, ou por um ano a 20C.
Congelar e descongelar somente uma vez. Amostras descongeladas devem ser
cuidadosamente homogeneizadas. Eliminar material particulado por centrifugao ou
filtrao.

Preparo da amostra:
Para diluio na placa ver A1.
Diluir as amostras, o PC e o NC 1 + 20 com DIL Ex: 10 L de amostra, PC ou NC +
200 L de DIL. Homogeneizar por 15 segundos.
So necessrios 100 L para cada cavidade.
O transporte da amostra biolgica, quando necessrio, deve ser feito pela rota mais
direta e evitando sua chegada nos finais de semana e feriados no local de destino. A
amostra biolgica deve ser acondicionada em recipiente hermeticamente fechado,
em seguida embalada de forma a mant-la em temperatura recomendada (2 a 8C
por 24 horas ou a 20C por mais tempo) desde o remetente at a entrega ao
destinatrio. Esta amostra deve ser identificada com o smbolo de amostra biolgica.

REV. 06/10

PROCEDIMENTO DO TESTE:
Seguir os procedimentos exatamente como descritos.
P1: No trocar as tampas dos frascos (risco de contaminao). No usar os
reagentes aps a data de validade.
P2: No usar reagentes que possam estar contaminados, ter a aparncia ou cheiro
diferente do usual.
P3: Identificar as amostras e controles cuidadosamente folha fornecida com o kit
P4: MIC Selecionar o nmero de tiras ou cavidades necessrias.
P5: Realizar duplicata ou triplicata dos controles positivo e negativo. Pipet-los
no fundo das cavidades.
P6. Adicionar sempre os reagentes na mesma ordem, cronometrando para
minimizar a diferena do tempo de reao entre as cavidades. Isto
importante para a reprodutibilidade dos resultados. A pipetagem das amostras
no deve exceder 5 minutos. Se o tempo for superior a 5 minutos, pipetar os
calibradores nas posies indicadas na metade do tempo da pipetagem das
amostras. Se mais de 1 placa for utilizada, realizar uma curva para cada placa.
P7. Evitar/remover bolhas de ar antes das incubaes e leitura.
P8. SUB incubar no escuro. O SUB inicia a reao cintica, que finalizada com a
adio do STOP.

PROCEDIMENTO DE LAVAGEM:
O Procedimento de lavagem crtico. Lavagem insuficiente resulta em pouca
preciso ou absorbncias falsamente elevadas.
L1: Remover as tiras adesivas, aspirar o contedo das cavidades, adicionar WASH a
cada cavidade, aspirar novamente o contedo das cavidades aps 30 segundos de
tempo de espera. Repetir a lavagem 7 vezes.
L2: No caso de lavadoras automticas, realizar um prime com a WASH e lavar as
tiras 8 vezes. Verificar se a lavadora encheu todas as cavidades completamente e
aspirar aps 30 segundos eficientemente (lquido remanescente deve ser < 15 L).
L3: Aps a lavagem, remover o lquido remanescente batendo a placa invertida
em um papel absorvente.

Esquema de Pipetagem:
Seguir os procedimentos exatamente como descritos. Particular ateno no
procedimento de lavagem!
Os reagentes e amostras devem estar na temperatura ambiente antes do uso.
Preparo da amostra: Para placa ver diluio A1
Diluir amostras, PC e NC 1 + 20 DIL Ex: 10 L de amostra, PC ou NC + 200 L.
Homogeneizar por 15 segundos.
100 L so necessrios para cada cavidade.
Etapa 1 Cavidade ( L)
A1
Branco
B1/C1
NC
D1/F1
PC
G1
Amostra
NC diludo em duplicata
PC diludo em triplicata
Amostras diludas
---
---
---
100
---
---
---
100
---
---
---
100
Misturar cuidadosamente (15 segundos)
Cobrir MIC com as tiras adesivas
Incubar 60 min. a 37C
Lavar 8 vezes como descrito (L1 L3)
WASH 350 350 350 350
Etapa 2
WCON --- 100 100 100
Misturar cuidadosamente (15 segundos)
Cobrir MIC com as tiras adesivas
Incubar 30 min. a 37C
Lavar 8 vezes como descrito (L1 L3)
WASH 350 350 350 350
Etapa 3
SUB 100 100 100 100
Incubar 30 min entre 17 e 25C (Ver P8)
STOP 100 100 100 100
Misturar cuidadosamente
Medir a absorbncia em 450 nm o mais rpido possvel ou no mximo dentro de
15 minutos aps o trmino da reao, utilizando como comprimento de onda de
620 nm (se disponvel).

Procedimento alternativo para uso em analisadores automticos de ELISA
A1: -dispensar 200 L DIL em cada cavidade necessria,
Etapa 1 -Adicionar 10 L de NC, PC ou amostra,
-misturar e proceder como descrito.

A2: -dispensar primeiro 50 L de SA e em seguida 50 L de SB em
cada
Etapa 3 cavidade incluindo A1; misturar bem e proceder como descrito.

CLCULO DOS VALORES DOS CONTROLES, CUTT-OFF E NDICE DO CUTT-
OFF:
Mdia da absorbncia dos valores de NC nas cavidades B1 e C1 (MNC) e PC nas
cavidades D1, E1 e F1 (MPC) so calculadas de acordo com:

MNC = A450 (B1) + A450 (C1)/ 2 MPC = A450(D1) + A450 (E1) + A450 (F1)/ 3

Valor de cut-off COV = (0,25 x MPC) + MNC

ndex do cut-off S/Co = Aamostra/COV


VALIDAO DO TESTE:
O teste pode ser considerado vlido desde que os seguintes critrios sejam
encontrados:
1. Abs da cavidade branco < 0,050
2. MNC 0,20
3. MPC 0,60
4. MPC MNC 0,40

O Guia de Problemas e Solues da Linha ELISA Human encontra-se disponvel
na internet, em Publicaes: www.humandobrasil.com.br

INTERPRETAO DOS RESULTADOS:
Resultados Interpretao
A450 (amostra) < COV Anticorpo anti-HCV no reativo
A450 (amostra) COV Anticorpo anti-HCV inicialmente
reativo: testar novamente
Novo teste em duplicata: Anticorpo anti-HCV
Ambos os resultados: S/Co >1,5 Reativo: Fazer teste confirmatrio
Ambos os resultados: S/Co < 1,0 No reativo
Ambos os resultados: 1,0 < S/Co <
1,5
Duvidoso: Monitoramento da amostra;
Fazer teste confirmatrio.
Resultado 1: S/Co < 1,0
Resultado 2: S/Co > 1,5
Invlido, (erro de procedimento):
testar novamente

SENSIBILIDADE DIAGNSTICA:
744 amostras de pacientes positivas para HCV, sendo 482 amostras (pr-
caracterizadas) e 262 membros de painis disponveis comercialmente foram
testados com o kit de anti-HCV Human (lote C54118PT, validade jan/2005). Todas
as amostras foram corretamente determinadas como positivas. A sensibilidade
diagnstica para o HCV resultou em 100%.

SENSIBILIDADE ANALTICA:
A sensibilidade analtica foi avaliada com os painis Pelicheck anti-HCV (S2007
lquido e S2124 liofilizado) que so painis de diluio padro em duplicata. A ltima
diluio do padro positiva detectvel foi comparada com os resultados de 22 kits de
anti-HCV comercialmente disponveis.

SENSIBILIDADE NA SOROCONVERSO:
A sensibilidade na soroconverso foi avaliada em comparao com os resultados
obtidos por um kit competidor comercialmente disponvel em relao a 31 painis de
soroconverso. Os resultados demonstraram que anti-HCV considerado igualmente
sensvel ao kit de referncia.

ESPECIFICIDADE DIAGNSTICA - AMOSTRAS DE DOADORES NO
SELECIONADOS:
5081 amostras, de doadores selecionados aleatoriamente e doadores do painel pela
primeira vez, foram testadas com o anti-HCV ELISA da Human. 28 amostras
(0,52%) encontraram-se inicialmente reativas (S/CO>1) e foram testadas
novamente em duplicata. 11 amostras foram consideradas repetidamente reativas
(0,22%) e 7 questionveis (0,14%) depois de testadas novamente. O intervalo de
confiana de 95% do 0,22% de amostras repetidamente positivas foi de 0,09-
0,35% (distribuio Poisson). Para as amostras reativas e duvidosas juntas o
intervalo de confiana foi de 0,19 0,52%. Estas determinaes resultaram em uma
especificidade diagnstica de 99,6%.

ESPECIFICIDADE DIAGNSTICA PACIENTES HOSPITALIZADOS:
Foram testadas 299 amostras de pacientes hospitalizados (Mononucleoses). Uma
amostra apresentou-se como duvidosa depois de testada novamente, mas no
negativa. A especificidade diagnstica correspondente foi determinada para 99,7%
(298/299).

INTERFERENTES:
Nenhuma interferncia foi observada com as substncias abaixo at a concentrao
indicada.
Substncia Concentrao
Bilirrubina At 0,2 mg/mL
Hemoglobina At 5 mg/mL
Triglicrides At 5 mg/mL
FR At 500 mg/mL

REPRODUTIBILIDADE:
Corrida 1 N. amostras Mdia (DO) CV (%)
HCV, nvel 1 26 2,282 4,89
HCV, nvel 2 28 1,698 6,42

Corrida 2 N. amostras Mdia (DO) CV (%)
HCV, nvel 1 26 2,549 3,66
HCV, nvel 2 28 1,909 5,43

Corrida 3 N. amostras Mdia (DO) CV (%)
HCV, nvel 1 26 2,439 6,28
HCV, nvel 2 28 1,831 7,95

REPETIBILIDADE:
N. amostras Mdia (DO) CV (%)
HCV, nvel 1 78 2,439 6,28
HCV, nvel 2 84 1,831 7,95

APRESENTAO DO KIT:
Cat. N N Teste
51250 96

BIBLIOGRAFIA:
1. Uyttendaele S. et al., Vox Sang 66, 122-129 (1994)
2. Mc Farlane I. G. et al., Lancet 335, 754-757 (1990)
3. Tsutsumt M. et al., Hepatology 19, 265-272 (1994)
4. Claeys H. et al., J. Med. Virol. 36, 259-264 (1992)
5. Kuog G. et al., Science 244, 362-364 (1989)
DEPARTAMENTO DE SERVIOS ASSOCIADOS:
Para esclarecimentos de dvidas do consumidor quanto ao produto:
Telefax (31) 3067-6400 E-mail: invitroms@invitro.com.br
N. DO LOTE, DATA DE FABRICAO, DATA DE VALIDADE VIDE RTULO DO
PRODUTO.


REV. 06/10

Produzido por Human GmbH Max-Planck-Ring 21, D 65205, Wiesbaden, Alemanha
e Distribudo por In Vitro Diagnstica Ltda
Rua Cromita, 278, Distrito Industrial Itabira/MG. CEP: 35903-053
Telefone: 31-3067-6400 Fax: 31-3067-6401
e-mail: invitroms@invitro.com.br
Resp. Tc.: Patrcia C. C. Vilela CRF 4463
Reg. M.S. 10303460222

SIGNIFICADO DOS SMBOLOS UTILIZADOS NOS RTULOS DO PRODUTO


O contedo suficiente para <n> testes



Data limite de utilizao



Limite de temperatura (conservar a)



Nmero do Catlogo



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Nmero do lote



Produto Diagnstico In Vitro



Data de Fabricao